Summary
Neuronale kulturer er en god model til at studere nye brain stimulation teknikker via deres effekt på enkelte neuroner eller en population af neuroner. Her præsenteres forskellige metoder til stimulering af mønstrede neuronale kulturer ved et elektrisk felt, der frembringes direkte af bad elektroder eller fremkaldt af en tidsvarierende magnetfelt.
Abstract
En neuron vil fyre et aktionspotentiale når dens membranpotentialet overstiger en vis tærskel. I typiske aktivitet i hjernen, dette sker som et resultat af kemiske input til sine synapser. Dog kan neuroner også ophidset af en pålagt elektrisk felt. Især de seneste kliniske anvendelser aktiverer neuroner ved at skabe et elektrisk felt eksternt. Det er derfor af interesse at undersøge, hvordan den neuron reagerer på det eksterne område og hvad der forårsager aktionspotentialet. Heldigvis, præcis og kontrolleret påføring af et ydre elektrisk felt er muligt for embryonale neuronale celler, som er udskåret, dissocieret og dyrkes i kulturer. Dette giver mulighed for undersøgelse af disse spørgsmål i en meget reproducerbar system.
I dette papir nogle af de teknikker, der anvendes til styret påføring af ydre elektrisk felt på neuronale kulturer gennemgås. Netværkene kan være enten en dimensionel, dvs. mønstrede i linear former eller lov til at vokse på hele substratets plan, og således todimensionale. Desuden kan excitationen skabes ved direkte anvendelse af elektrisk felt via elektroder nedsænket i fluidet (bad elektroder) eller ved at inducere det elektriske felt ved hjælp af fjernbetjeningen skabelse af magnetiske impulser.
Introduction
Samspillet mellem neuroner og eksterne elektriske felter har grundlæggende konsekvenser samt praktiske. Medens det er kendt siden de tider af Volta at et eksternt påført elektrisk felt kan excite væv, er de mekanismer, der er ansvarlige for produktionen af en resulterende virkningspotentiale i neuroner først for nylig begyndt at blive bragt i orden 1, 2, 3, 4. Dette omfatter at finde svar på spørgsmål vedrørende den mekanisme, der forårsager depolarisering af membranpotentiale, rolle membranegenskaber og ionkanaler, og selv region i neuron, der imødekommer det elektriske felt 2, 5. Terapeutisk neurostimulation 6, 7, 8, 9, Måling af interaktionen inden in vivo hjernen tilføjer en vigtig komponent til denne forståelse, men hæmmes af unøjagtighed og ringe styrbarhed af målinger inden kraniet. I modsætning hertil kan målinger i kulturer let udføres i høj volumen med høj præcision, fremragende signal til støj ydeevne og en høj grad af reproducerbarhed og kontrol. Anvendelse af kulturer en lang række af neuronale egenskaber af kollektive netværk adfærd kan belyses 11, 12, 13, 14, 15, 16. Ligeledes forventes denne velkontrolleret system højeffektive til at belyse den mekanisme, hvorved andre stimuleringsmetoder arbejde, for eksempel hvordan kanalåbning under optisk stimulering i optogenetically aktive neuroner 17, 18, 19 er ansvarlig for at skabe aktionspotentiale. Her er fokus på at beskrive den udvikling og forståelse for værktøjer, der effektivt kan ophidse neuron via et eksternt elektrisk felt. I denne artikel beskriver vi fremstilling af todimensionale og endimensional mønstrede hippocampuskulturer, stimulering ved hjælp af forskellige konfigurationer og orientering af en direkte påtrykt elektrisk felt ved bad elektroder og endelig stimulering af todimensional og mønstrede endimensionale kulturer ved en tidsvarierende magnetfelt, som inducerer et elektrisk felt5, 20, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Procedurer, der involverer håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra Weizmann Institute of Science, og det passende Israelsk lov. Den Weizmann Institute er akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC). Den Weizmann Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte denne undersøgelse, udført med hippocampusneuroner.
1. Fremstilling af Todimensional (2D) og Endimensional (1D) hippocampuskulturer
- Fremstilling af dækglas for 2D kulturer.
- Forberede udpladningsmedium (PM) sammensat af 0,9 ml minimum essentielt medium (MEM) + 3G, 0,05 ml føtalt kalveserum (FCS), 0,05 ml varmeinaktiveret hesteserum (HI HS) og 1 pi B27 supplement. Bemærk: MEM + 3G indeholder for hver 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycin, 5 ml stabiliseret L-glutamin 100x (se
- Forberede boratpuffer sammensat af 1,9 g borax (natriumtetraboratdecahydrat) i 200 ml dobbelt destilleret vand (DDW) (mix ved 60 ° C) og 1,24 g borsyre i 200 ml DDW. Titrere endelige opløsning til pH 8,5 ved anvendelse af 1 M HCI. Bemærk: Den endelige opløsning er 400 ml 0,1 M boratpuffer.
- Fordybe dækglas i 65% salpetersyre i 2 timer. Skylles tre gange i DDW efterfulgt af tre skylninger med absolut analysekvalitet (ABS AR) ethanol.
- Passerer hvert dækglas kortvarigt gennem flammen af en bunsenbrænder to eller tre gange i 1 - 2 s, og derefter forlade at inkubere natten over i plader med 24 brønde med 1 ml poly-L-lysin 0,01% opløsning fortyndet 1: 5 i boratbuffer ( 0,1 M, pH 8,4). Derefter skylles dækglas i DDW tre gange og forlade med 1 ml PM per brønd i en standard 37 ° C, 5% CO2-inkubator natten over.
- Forberede udpladningsmedium (PM) sammensat af 0,9 ml minimum essentielt medium (MEM) + 3G, 0,05 ml føtalt kalveserum (FCS), 0,05 ml varmeinaktiveret hesteserum (HI HS) og 1 pi B27 supplement. Bemærk: MEM + 3G indeholder for hver 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycin, 5 ml stabiliseret L-glutamin 100x (se
- Fremstilling af dækglas for 1D kulturer.
- ren glass dækglas ved nedsænkning i en base Piranha opløsning bestående af 75 ml DDW, 25 ml 25% ammoniakopløsning og 25 ml 30% hydrogenperoxid. Sted opløsning med dækglas på en varmeplade ved ~ 50 ° C i 30 minutter og derefter tørre de dækglas med nitrogen.
- Coat dækglas først med en tynd krom film (99,999%) 6 Å tykkelse efterfulgt af en 30 Å lag guld (99,999%), ved anvendelse af enten damp eller sputter deposition.
- At opnå en katodeforstøvningshastighed på 0,05 - 1 A / s bruge en sputtering maskine med 2 e-bjælker og et vakuumsystem på 260 l / s med target størrelser 2" og 4" . Brug en rotation fase, der kan gå fra 0 - 100 skud i minuttet (RPM). Brug en jævnstrøm (DC) sprutte magt 0 - 750 watt.
- Anvende en rotation på 30 rpm og argon 99,999% for at få plasma ved 10 mTorr tryk i kammeret.
- Drive strømforsyningen til sputtering kanoner på 40 W DC sputter strøm til krom, hvilket fører til ~ 0,12 Å / s dækningsgrad, og ved 10 W DC sputter strøm til guld, hvilket fører til ~ 0,28 Å / s.
- Opløs 0,1 g 1-octadecanethiol i 100 ml ABS AR ethanol under anvendelse af ultralyd i 30 minutter. Placere Cr-Au-overtrukne dækglas i 2 timer i denne opløsning, vask derefter med ethanol ABS AR og tør med nitrogen.
- Fremstille en opløsning af 100 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (D-PBS), og 3,5 g af en tri-blokcopolymer (se tabel of Materials / Reagenser) ved omrøring til 1 - 2 timer ved 600 - 700 omdrejninger i minuttet. Placer dækglas i opløsningen i 1 time. Tørre dækglas med nitrogen.
- Mekanisk etch det ønskede mønster ved at ridse den bio-afvisning lag 22. Gør dette ved hjælp af en pen plotter, hvor pennen er erstattet af en ætsning nål. Ridse mønster gennem metallagene at nå den underliggende glas. Kontrollere denne proces ved en computer til at opnå en replikeret ønskede mønster. Mønstre dannet ved denne fremgangsmåde er demonstrere d i figur 2 og figur 3.
- Forberede et biokompatibelt lag af 100 ml D-PBS, 3,5 g tri-blokcopolymer, 35,7 pl / ml fibronectin og 29 pl / ml laminin.
- Sterilisere dækglas i ultraviolet lys i mindst 10 min. Inkubér dækglas i den forberedte bio-kompatibel opløsning natten over.
BEMÆRK: bio-kompatible lag vil danne kun, hvis bio-afvisning lag er blevet ætset væk i det forrige trin. - Den næste dag vask dækglas to gange med P-DBS. Inkubér dækglas i PM natten over. Dækglas er nu klar til celle plating.
- Sterilisere dækglas i ultraviolet lys i mindst 10 min. Inkubér dækglas i den forberedte bio-kompatibel opløsning natten over.
- Udfør dissektion i henhold til standardprocedurer, der i vid udstrækning er blevet offentliggjort tidligere 23, 24.
- I korte, ekstrakt hippocampus eller cortex fra rottefostre, typisk på dag E19, eller fra mus, typisk på dag E17 23,class = "xref"> 24.
- Dissociere celler først i papainopløsning for 20 - 30 minutter, efterfulgt af mekanisk triturering 24 med glaspipetter hvis tip er flammepoleret.
BEMÆRK: Hvis cellerne kommer fra genetisk modificerede mus derefter bør opretholdes vævet fra hver embryo i et separat 1,5 ml plastrør under hele processen. - Tæl celler med trypanblå før såning.
BEMÆRK: For genetisk modificerede dyr optællingen skal ske separat for hver foster. - Til 2D kulturer, frø muse-neuroner på 750.000 og rotteneuroner på 850.000 celler pr. For 1D, frø på 650.000 celler pr. Ryst pladen lidt umiddelbart efter såning for at sikre ensartet dækning af dækglasset.
- Vedligeholdelse af neuronale kulturer.
- Forberede skiftende medium (CM) bestående af (per ml):. 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 pi 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUDR) med uridin 100x </ Li>
- Forberede slutmedium (FM) bestående af (per ml): 0,9 ml MEM + 3G og 0,1 ml HI HS.
- Erstat PM med 1-1,5 ml CM efter 4 dage in vitro (DIV). Ved 6 DIV, erstatte 50% af CM med frisk CM. Ved DIV 8, ændre mediet til 1,5 ml FM, efterfulgt af en ændring på 50% af FM hver 2 dage. Efter omkring en uge spontan synkron aktivitet opstår.
- Billeddannelse af spontan eller fremkaldt aktivitet i neuronale kulturer med fluorescerende farvestoffer.
- Fremstille en opløsning af 50 ug calciumfølsomme fluorescerende farvestof (se tabel Materialer / reagenser) i 50 pi DMSO (dimethylsulfoxid).
- Forberede ekstracellulære optagelse opløsning (EM) indeholdende (i mM) 10 HEPES, 4 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 saccharose (pH 7,4).
- Inkuber neuronal kultur i 2 ml EM med 8 pi af calciumfølsomme fluorescerende farvestof opløsning i 1 time. Beskyttes mod lys og forsigtigt dreje for at sikre homogenskellige spredning af farvestoffet til cellerne.
- Erstat opløsning med frisk EM før billeddannelse. Det fluorescerende billeddannelse er demonstreret i figur 4.
- Billede i et fluorescensmikroskop med optiske filtre for calcium fluorescensimagografi (excitation top ved 488 nm, topemission ved 520 nm) under anvendelse af et kamera og software, der kan kvantificere intensiteten af enhver region af interesse (ROI) inden for synsfeltet af mikroskopet.
2. Elektrisk Stimulering af kulturer
BEMÆRK: Den grundlæggende opsætning for elektrisk stimulation er vist i figur 1. Et dækglas, hvorpå den neuronale kultur er blevet dyrket i ca. 14 dage anbringes i en petriskål under et fluorescensmikroskop. Elektriske aktivitet i neuronerne afbildes under anvendelse calciumfølsomme farvestoffer mens en spænding tilføres via to par bad elektroder, som er anbragt uden for kulturen. Elektroderne er drevet af såignal generator hvis udgang forstærkes af en dual channel forstærker. Spænding kontrol for stimulering foretrækkes i forhold til mere standard strømstyring 25, 26 fordi de elektriske feltvektorer bestemmes direkte, hvilket muliggør enkel vektor tilsætning og kombination. Dette kræver en omhyggelig kontrol af ensartetheden af det elektriske felt, som kan udføres over hele prøven i tilfælde af spænding kontrol. Hvornår bør tages ved hjælp af spænding kontrol omhu for at undgå ground loops og homogeniteten af det elektriske felt skal verificeres (se 2.2 nedenfor).
- For elektrisk stimulering med et homogent elektrisk felt bruge et par parallelle elektrodeledninger.
- Anvende elektroder fremstillet af platin med en tykkelse af størrelsesordenen 0,005 '' (127 um). Når de anvendes med de mm dækglas 13, sikre, at afstanden mellem de to elektroder er omkring 11 mm, og placere elektrodens 1 mm over kulturen.
BEMÆRK: For at gøre elektrodeholderen (figur 5A og 6A) anvender polytetrafluorethylen (PTFE). Bor smalle huller gennem PTFE at indsætte elektroderne. Indretningen bør være højere end den ekstracellulære opløsning, således at den øverste ende, hvor elektroderne er udsat for, aldrig vil komme i kontakt med opløsningen. Til isolering, bruge epoxylim på nogen del af elektrodeledningerne der kan blive udsat. - Brug en firkantet puls form med en cyklus på 50% duty, uden DC-komponent for at undgå elektrolyse. Variere impulsvarighed mellem 10 mikrosekunder og 4 ms at forårsage effektiv stimulering uden at brænde kulturen. Sikre, at amplituden er i størrelsesordenen ± 22 V (se figur 5). Den firkantede puls kan observeres på et oscilloskop forbundet parallelt med elektroderne.
BEMÆRK: For let programmering af en hvilken som helst ønsket bølgeform, skal du bruge en kommerciel software bølgeform redigering (se listen Materialer
- Anvende elektroder fremstillet af platin med en tykkelse af størrelsesordenen 0,005 '' (127 um). Når de anvendes med de mm dækglas 13, sikre, at afstanden mellem de to elektroder er omkring 11 mm, og placere elektrodens 1 mm over kulturen.
- For at teste for feltet homogenitet bruge en sondeelektrode. Anvende et gitter på mindst 1 mm x 1 mm for at tillade sonden at blive bevæget i området mellem elektroderne og måle elektrisk potentiale.
- Mål elektrisk potentiale. Brug
til at beregne det elektriske felt. Brug en af elektroderne som en referenceelektrode. Måle det elektriske felt med varierende impulsvarigheder mellem 100 us til 4 ms (se figur 5B for et eksempel på 100 us pulsvarighed) for at kontrollere, at feltet er homogen inden for området stimulerende varigheder.
BEMÆRK: Se figur 5D for et eksempel på en præcis elektrisk felt homogenitet når impulsvarigheden var 1 ms.
- Mål elektrisk potentiale. Brug
- Bruge 2 vinkelrette par af bad elektroder til frembringelse af mere komplicerede elektriske felt former og tilkunne orientere banen i forskellige retninger (se fig. 6B). Indretningen med 2 par elektroder vil blive anvendt, og signalet på hvert par af elektroderne vil blive observeret på to separate oscilloskoper.
- Placer elektroderne 1 mm over kultur og i en afstand på 10 - 11 mm fra hinanden. Kontroller, at begge elektrodepar er flydende (ikke have nogen jordforbindelse), og har ikke nogen ubestridt ved at måle modstanden mellem et sæt af elektroder og kontrollere fravær af kortslutninger mellem nogen af elektroderne. Kontrollere, at alt udstyr, som er forbundet med elektroderne (såsom oscilloskoper, forstærkerne, signalgeneratorerne osv) flyder i forhold til jord ved at kontrollere, at alt udstyr er variabel og at ingen af referenceelektroderne rører enhver jordet udstyr.
- At ændre feltorientering, variere amplituden af spændingen tilført til de to elektrodepar med resbrystf til hinanden (se figur 7A). For eksempel til 0 ° brug ± 22 V på elektrodeparret der er vinkelrette på det mønster og 0 V for den anden elektrode. For 45 °, brug ± 15,6 V på begge par af elektroder uden faseforsinkelse for en amplitude vektorsummen af 15,6 2 +15,6 2 = 22 2.
- At anvende et drejefelt benytte en enkelt bølgeform af en sinus spændingsimpuls og en enkelt bølgeform af en cosinus spændingsimpuls til de to par elektroder til frembringelse af en fast amplitude roterende elektrisk felt (se figur 6B).
BEMÆRK: Som det kan ses i figur 6B, når der anvendes en cyklus af en sinusbølge med ± 22 V i én elektrode og en cyklus af et cosinusbølge med ± 22 V i den anden elektrode, vektorsummen er en roterende elektrisk felt med cyklusvarigheden samme som sinus og cosinus bølger, og med en amplitude på ± 22 V.
- For at måle og beregne ChronAxie og Rheobase af axoner i den neuronale kultur vs. dendritter i den samme kultur udføre følgende trin.
- Brug en calciumfølsomme fluorescerende farvestof for calcium billeddannelse som beskrevet i tabellen i Materialer / reagenser og i 1,5) med en 1D kultur mønster på tynd (170 um), lang (10 mm) linjer. Calciumfølsomme farvestof vil blive anvendt til kulturen, og inkuberet i 45 minutter. Farvestoffet vil blive vasket ved erstatning med en frisk optagelse løsning.
- Afbryd netværk for at opnå befolkningsstatistik af den direkte reaktion på elektrisk stimulation, uden effekten af synaptisk transmission. At gøre det, anvende en kombination af 40 pM af bicucullin, som blokerer den inhibitoriske virkning af gamma-aminosmørsyre-A (GABA A) receptorer, 10 uM af 6-cyano-7-nitroquinoxalin-2,3-dion (CNQX) , at blokere α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) og kainatreceptorer og 20 uM af (2R) -amino-5-phosphonovaleric acid (APV), som blokerer N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorer. De blokkere vil blive føjet til optagelsen løsning.
- Anvende en firkantet impuls som beskrevet i 2.1 og 2.3 med varierende tidsvarigheder mellem 100 us og 4 ms. Signalet kan observeres på oscilloskopet.
- Bruge et fluorescensmikroskop med en erhvervelse billedprogram (se 1.5) at overvåge intensiteten af calciumtransienter på flere ROI'er, der hver indeholder et par hundrede neuroner. Anskaf billeder ved hjælp af en følsom EMCCD kamera (se listen Materialer), i stand til et billede erhvervelse på mindst 20 billeder i sekundet. Ændringen i lysintensitet er proportional med mængden af neuroner, som blev stimuleret. Estimere den del af stimulerede neuroner under anvendelse af den relative ændring i intensitet.
- For hver impulslængde (100 mikrosekunder til 4 ms), ændre amplituden af den påtrykte spænding til elektroderne, der starter ved en spænding, hvor ingen ændring i intensitet ses (nogle få volt), til the spænding, hvor ændringerne i intensitet som følge af den påførte spænding er mættet (Op til ± 22 V).
BEMÆRK: intensitetsændringsområde vil blive fordelt som en kumulativ Gauss 5 med hensyn til den påførte spænding for stimulation for hvert tidspunkt varighed spændingsimpuls. - Monter en kumulativ Gauss-fordeling for intensitet som funktion af den påtrykte spænding for hver varighed og udtrække den gaussiske middelværdi fra denne pasform.
BEMÆRK: Denne middelværdi er repræsentativ spænding, hvortil neuroner reagerede. - Ved afslutningen af denne proces indhenter for hvert stimulation varighed en gennemsnitlig spænding, hvortil neuronerne reagerede. Bruge disse par af varigheder og styrker at plotte Strength-Varighedskurver (se figur 7).
til at beregne det elektriske felt. Brug en af elektroderne som en referenceelektrode. Måle det elektriske felt med varierende impulsvarigheder mellem 100 us til 4 ms (se figur 5B for et eksempel på 100 us pulsvarighed) for at kontrollere, at feltet er homogen inden for området stimulerende varigheder. 3. magnetisk stimulation of Cultures
Bemærk: Den grundlæggende opsætning for magnetisk stimulation er vist i figur 2. Oven højre visesEt inverteret fluorescensmikroskop, der bruges til at vise kalciumfølsomme farvestoffer i neuronerne. Den magnetiske spole (blå cirkler) er anbragt ca. 5 mm koncentrisk over en neuronal ringkultur (blå omrids). En pickupspole (rød cirkel) på omkredsen af Petri-skålen overvåger spændingen induceret af den magnetiske puls. Øverst til venstre vises den målte dynamik i magnetstimulatorens (MS) -spolen med en kondensator spændingsbelastning på 5.000 kV, som integreret fra pickupspolen. Det inducerede elektriske felt (beregnet for en ringradius på 14 mm) er afbildet i grønt, mens magnetfeltet er afbildet i blåt. På bunden er der vist billeder af neuronalkulturen. Nederst til venstre er et lyst feltbillede af en mønstret 24 mm dæksel. De hvide områder er neuronerne. Det fotograferede mønster består af koncentriske ringkulturer med forskellige radii. Nederst til højre er en zoom på et kort segment af ringene, der viser individuelle neuroner. For en skala er ringernes breddeth er omkring 200 um.
- Vokse neuronerne i en cirkulær ring mønster (ætset som beskrevet i 1.2.5) til 1D kultur stimulation. Brug en calciumfølsomme fluorescerende farvestof for calcium imaging (som beskrevet i afsnit 1.5) med en 1D kultur mønster på tynd (170 um), lange (10 mm) linjer.
- Brug en cirkulær magnetisk spole og positionere en petriskål ca. 5 mm under og koncentriske med spolen. Brug et tilpasset spole på ca. 30 mm (indvendig diameter, 46 mm udvendig diameter) spole med en induktans på L = 90 mH drevet af et hjemmelavet eller kommercielle MS lastet med en maksimal spænding på 5 kV.
- Aflade en høj spænding og strøm gennem en ledende spole ved anvendelse af en høj-strøm-højspændingsledninger skifte til magnetisk stimulere neuronale kulturer. Den magnetiske stimulator (MS) kan bygges som beskrevet i 21 ved anvendelse af store kondensatorer, af størrelsesordenen 100 mF, til opnåelse af en høj spænding af 1 - 5 kV. Alternativt kan en kommercieltLedige MS (se Tabel af materialer / reagenser ).
BEMÆRK: Brug en 0,254 mm tyk og 6,35 mm bred polyesterbelagt rektangulært kobbertråd til fremstilling af en hjemmelavet spole 21 . Drej ledninger på skræddersyede rammer, isoleret med glasfibre og indstøbt epoxy (se Materialebeskrivelse / Reagenser ). Alternativt kan der anvendes kommercielt tilgængelige spoler (se tabel over materialer / reagenser ).
- Brug roterende magnetfelter til at stimulere 2D kulturer.
- Brug nu de roterende magnetfelter til at stimulere 2D-kulturer. Brand TMS uden kultur i skålen, med forskellige intensiteter, for at vise den lineære korrelation af spoleaflæsningen med intensiteterne.
- Derefter begynder man at optage TMS ved stigende intensiteter, mens man optager både calciumtransienter og spolen, mens man registrerer calciumtransienter med en neuronalkultur. I begyndelsen observeres netværksudbrud som store calciumtransienter, should ikke synkronisere med pick up spole TMS pigge. Fortsætter med at stige intensitet, på et tidspunkt, de calciumtransienter begynder at blive synkroniseret med TMS pigge. Alternativt eller som supplement, efter at opnå en synkroniseret svar, begynde at falde intensiteten indtil synkronisering er afskaffet, for at bestemme den tærskel TMS.
BEMÆRK: Betingelser bør opretholdes strengt fastsættes for hvert af de opsætninger, ved hjælp af nøjagtig volumen hver gang, de samme skibe og nøjagtige coil positioner og orienteringer.- Montere opsamlingssløjfen på bunden af optagelsen skålen, så den er i et plan parallelt med den neuronale kultur og i en fast position i forhold til kulturen.
BEMÆRK: Dette sikrer, at afhængigheden af positioneringen af opsamlingssløjfen i forhold til magneten er trofast til positionen af den kultur, og at afvigelser i det positionering vil være ubetydelige på opsamlingssløjfen aflæsninger.- Brug to uafhængige spoler, der eranbragt vinkelret på hinanden (figur 8B) for at generere et roterende magnetfelt og inducerede elektriske felt. Forbinde hver spole til sine egne MS. Sikre, at stimulatorer aflade lignende strømme på et faseforsinkelse på 90 grader (figur 10A), hvilket resulterer i et roterende magnetfelt som scanner 270 grader for den reale rum ved en maksimal felt på ~ 270 V / m (Figur 10B).
- Placer neuronal kultur i en sfærisk glasbeholder fyldt med det udvendige optagelse opløsning (EM).
- Overvåge stimulering (ændring i fluorescensintensitet af neuronerne) med kameraet som beskrevet i trin 2.4.4.
- I tilfældet med de tværgående spoler (figur 8B) skubbes opsamlingssløjfen parallelt og i en bestemt afstand under den neuronale kultur. vedligeholde Omhyggeligt denne konfiguration gennem eksperimenterne.
- Montere opsamlingssløjfen på bunden af optagelsen skålen, så den er i et plan parallelt med den neuronale kultur og i en fast position i forhold til kulturen.
- Beregn analytisk det elektriske felt til 1D Configuration af Emax = k 1 Br, hvor Emax er den maksimale amplitude af det inducerede elektriske felt og er rettet langs tangenten af ringene med radius r. B er amplituden af den magnetiske impuls og k1 er en dimensionel proportionalitetskonstant, der kan måles under anvendelse opsamlingssløjfen (figur 8A).
- Brug en numerisk simulering pakke (se Materiale liste) til numerisk simulere det elektriske felt 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteret tillader let mønsterdannelse af neuronale kulturer. Når den er kombineret med flere metoder vi udviklet til stimulering, det gør det muligt at foretage målinger af nogle iboende neuron egenskaber såsom Chronaxie og Rheobase 5, for at sammenligne egenskaberne af raske og syge neuroner 27, at finde optimale måder at stimulere kulturer som en funktion af deres struktur og mange flere nye tilgange. Nogle eksempler er præsenteret i de næste figurer.
Figur 3 viser 1D mønstrede konfigurationer, der er ætset ind i bio-afvisning lag. Tynde linjer på omkring 170 um bredde typisk indskrevet der kan for eksempel være koncentriske ringe med varierende radier (figur 3A) eller parallelle linjer, typisk ~ 11 mm lang (figur 3B).
nt" fo: keep-together.within-side = '1'> Toppanelet i figur 4 viser en typisk billede af fluorescerende aktivitet i kulturen, taget med en ladningskoblet indretning (CCD), og som viser et billede af fluorescensmærket neuroner i en 2D kultur. i dette eksempel tre forskellige ROI'er er vist, er markeret i sort, grøn og rød. integrerede fluorescensintensitet spor er vist i det nedre panel i figur 4, målt i disse tre forskellige ROI'er (spor er i den tilsvarende farve af ROI'er). som det indsatte viser, inden for 200 ms opløsning af erhvervelsen ramme tidspunkt, hvor denne særlige data blev taget, alle neuroner i de tre forskellige ROIs briste samtidigt.Det grundlæggende apparat anvendt til stimulering af en envejs, konstant elektrisk felt, er vist i figur 5A. Elektrodetrådene nedsænkes i optagemediet, omkring 1 mm over det neuronale kultur.Den grundlæggende impulsform benyttes til elektrisk stimulation er vist i figur 5B. Når denne spænding påtrykkes det skaber en konstant elektrisk felt, som vender sin orientering ved 180 ° efter halvdelen af cyklussen. Ændringen i feltretningen efter et halvt cyklus anvendes til at undgå elektrolyse og skader på elektroderne. Typiske spændingerne tilført til elektroderne er ± 22 V, og den typiske impulsvarighed til stimulering af 2D kulturer er i størrelsesordenen 100 - 500 us.
For at kontrollere for enhver anisotropi i væksten af neuritter, vi bekræftet, at stimulering af 2D-kulturer er isotropisk. Ved manuelt at dreje elektroderne i alle 360 ° ved 15 ° opløsning (figur 5C) ses det, at der ikke er nogen præference for orientering til stimulering. Hver farve i figur 5C betegner stimuleringen af en anden kultur. Afstanden fra oprindelsen repræsenterer det minimale duration nødvendig for stimulering med en konstant amplitude. Det er indlysende, at en god tilnærmelse, behøver 2D kulturer ikke en foretrukken orientering til elektrisk stimulation.
Da enkelt par elektroder er begrænset i at have en defineret retning for feltet (selvom det kan vendes), udviklede vi et apparat til elektrisk stimulering med to par elektroder (figur 6A). En skematisk af kulturen (grå cirkulære baggrund, mørkere pletter er cellelegemerne) og af elektroderne (parallelle tykke linjer) er vist i figur 6B. Når bølgeformerne, der er vist som blå og grønne skær i figur 6B, er cosinus og sinus bølger og anvendes sammen derefter en roterende E vektorfelt produceres. Når spændingsimpulserne er firkantede, har forskellige amplituder og har nul faseforsinkelse mellem dem så de skaber en konstant felt med den ønskede orientering bestemmes af relative amplitude mellem de to par elektroder. Dette elektriske drejning er en indlysende forbedring i forhold til manuel, mekanisk rotation, der blev anvendt til at opnå den vinkelmæssige fordeling af stimulering styrker i figur 5C. Selvfølgelig, som figur 6C viser, er det også muligt at anvende denne konfiguration til at excitere én fast retning, eventuelt som en kontrol, ved at aktivere kun ét par af elektroder.
Disse konfigurationer blev anvendt til at excitere 2D neuronale kulturer med enten et roterende felt eller en fast vinkel felt, med den samme geometriske middelværdi (RMS) spænding og derefter at sammenligne impulsvarighed nødvendig til at excitere kulturen når amplituden er fast. Vi fandt, at når der anvendes en roterende elektrisk felt med en konstant amplitude på ± 22 V, en gennemsnitlig varighed på 150 ± 14 us var nødvendig for at opnå stimulering, mens med en enkelt retning elektrisk felt en gennemsnitlig varighed på290 ± 30 mikrosekunder var nødvendig. Forholdet mellem de varigheder, der er nødvendige for spændende kulturen med en roterende versus en fast vinkel område er således 0,53 ± 0,02.
Da der i en 2D kultur axoner strækker sig i alle retninger, det roterende felt er i stand til at vække mange af axoner. I modsætning hertil med en enkelt orienteringsfelt der er kun få axoner orienteret i den specifikke vinkel og axonal excitation ikke opnås. Når varigheden øges, er der mulighed for spændende andre dele af neuron så godt, især dendritter. Dette er yderligere forklaret nedenfor i beskriver Chronaxie målinger. Det faktum, at der er behov for en langt kortere varigheder for excitation af den samme kultur, når der anvendes en roterende felt er af stor betydning, når der anvendes eksterne felter for brain stimulation, da der ofte er tekniske begrænsninger på pulsen varigheder.
figur 7. I figur 7A et 1D frakoblet netværk stimuleres med det elektriske felt, enten langs linien af kulturen (ved 0 ° i axonal stimulation) eller vinkelret på linje i kultur (ved 90 ° i dendritiske stimulering) af to par elektroder. Da spændingen øges, vil flere neuroner blive stimuleret, og dette afspejles af influenzaorescence intensitet, der er proportional med antallet af neuroner stimulerede (se figur 7B). Stigende spændingsamplituder anvendes til gradvist at stimulere hele kulturen. Hver neuron har en minimal tærskel spænding (for en specifik puls varighed), at det vil reagere på, og ved den store tals lov, forventes fordelingen af disse tærskler for at være Gaussisk. Derfor, hvis vi ser på antallet af neuroner, der reagerede, og plot det mod spænding påføres, vil fordelingen være en kumulativ Gauss fordeling, hvilket er en fejl funktion (ERF) 5. Antallet af neuroner, der reagerer på en bestemt amplitude af elektrisk felt har omtrent en Gauss-fordeling, og derfor fluorescensen godt beskrevet af integralet - Fejl funktion af amplituden af det stimulerende felt (figur 7C).
Figur 7C anvendes til eXtract én parameter, forventningen (middelværdi) af fordelingen. Dette gøres ved at montere en kumulativ Gauss fordeling og opnå den bedste pasform. Denne forventning er den påførte spænding, hvortil 50% af cellerne vil reagere. Denne proces gentages for flere pulsvarigheder (varierende fra 100 us til 4 ms). Den gennemsnitlige spænding, som kulturen reagerede plottes versus impulsvarighed for at opnå styrke-Duration kurve. To sæt målinger blev udført. I den første feltet var parallelt med det mønster, og i det andet var det vinkelret på den. Det er tidligere blevet vist 15, 23, at axoner passer med mønsteret, mens dendritter vokse i alle retninger. Dette giver to forskellige Strength-Varighedskurver, som er meget nyttig til at opnå en klar forskel mellem den axonale og dendritiske excitation. Fuld adskillelse til dendritiske og axonale bidrag opnås ved kendt faktum, at Axonal tidskonstant til excitation er meget kortere end dendritiske dem 2, 3, 4.
Styrken-Varighedskurver derefter tilpasning til Chronaxie henfaldsligning 
, Hvor V rh er Rheobase spænding og C er Chronaxie. Ved puls-varigheder af t <1 ms er det axoner, der er spændt første og forårsager neuron til brand, der har en lavere værdi for excitation spænding i Strength-Duration kurve. Axonal Chronaxie blev beregnet til at være 110 ps. I slående kontrast, for excitation ved lange varigheder (t> 1 ms) den dendritiske rum er kilden til excitation for neuron med en dendritisk Chronaxie beregnet på 900 us.
De principper stimulering af 2D og 1D kulturer med en cirCULAR spole er beskrevet i figur 8. For at opnå en bedre forståelse af den fysiske situation, er numeriske simuleringer af de magnetiske og inducerede elektriske felter fremstillet under anvendelse af COMSOL pakke. At stimulere 1D kulturer anvendes en cirkulær magnetisk spole, placeret koncentrisk over petriskålen. Neuroner dyrkes i cirkulære ringe på en runde dækglas, der er placeret inde i petriskål til optagelse. I dette tilfælde det inducerede elektriske felt kan beregnes analytisk og er lig med Emax = k 1 Br, hvor Emax er den maksimale amplitude af det inducerede elektriske felt og er rettet langs tangenten af ringene med radius r. B er amplituden af den magnetiske impuls og k1 er en dimensionel proportionalitetskonstant, der kan måles ved anvendelse af en pickupspole.
Den COMSOL numerisk beregning af magnetfeltet created af spolen i 1D kultur er vist i toppanelet i fig 8A (røde strømlinier). I det nederste panel af figur 8A beregningen præsenteres for det inducerede elektriske felt. Stimulering af en 2D kultur med en krydset spole konfiguration er vist i figur 8B. At stimulere 2D kulturer indlæg spole blev anvendt som producerer roterende magnetfelter, anbragt med en 2D neuronal kultur inde i det, som er tilføjet i en sfærisk glasbeholder, der er fyldt med optagemedium (EM). I dette tilfælde det inducerede elektriske felt kan ikke længere beregnes analytisk. Krydsspoleinstrumentet er afbildet i det øverste panel i figur 8B, med den sfæriske beholder anbragt inden de to spoler og dækglas understøtter 2D kultur placeret i bunden af beholderen. For skala, den indre diameter af den indre spole er 65mm. Numeriske simuleringer med COMSOL med hvirvelstrømme 3D-model er vist i den nederste panel,skildre det elektriske felt, der induceres i den indre overflade af den sfæriske beholder. En lys felt mikroskopbillede af et dækglas med typiske 1D neuronale kulturer, der anvendes til stimulering er vist i figur 8C. De hvide linjer viser neuroner på de mønstrede linier, som er orienteret både tangentialt og radialt til eksperimentel sammenligning og kontrol af virkningen af retningsbestemmelse.
Geometri af 1D kultur spiller en stor rolle for, om en kultur vil brand som reaktion på magnetisk stimulation. Kun 22% af 1D ring kulturerne reageret på magnetisk stimulation. Den vellykkede excitation rate stærkt afhængig af kulturens lineære længde, og som figur 9A viser mere end 60% af kulturer, der er længere end 80 mm reagerer på magnetisk stimulation. Dette indebærer, at særlige betingelser er nødvendige for magnetisk respons. For at undersøge denne geometriske afhængighed kulturer wførend dyrket i konfigurationer, der er dele af ringe - med samme radius, men forskellige længder ved mønstring dem på buer frem på komplette cirkler (se figur 8C)
En omfattende undersøgelse af de magnetiske tærskelværdier som funktion af radius af 1D ring kulturer er vist i figur 9B. Hvide cirkler repræsenterer eksperimentelle målinger af stimuleringstærskler, mens farvekoderne betegner den beregnede sandsynlighed for at måle en excitation tærskel. En stimulering tærskel er defineret som den svageste felt, der stadig fremkalder en reaktion for en given neuronal kultur.
Figur 9B understreger tendens, større ringe har den nedre stimulation med en klar omvendt korrelation mellem radius af ringene og tærsklen stimulering. For eksempel er den gennemsnitlige 14 mm ring reagerer på MagnETIC pulser med amplitude på 1,5 T mens den gennemsnitlige 7 mm ring kun svarer på 3 T eller mere. Dette forventes fra den teoretiske beregning af det inducerede elektriske felt, der er afbildet som de farvekodede forudsagte sandsynlighed for brand. Faktisk det elektriske felt induceret af 3T ved en radius på 7 mm er lig med den induceret af 1,5 T ved den dobbelte radius. Sammenfattende gennemsnitlige elektriske tærskel felt er 301 ± 128 (standardafvigelse) V / m, uafhængigt af radius af ringen kulturer.
I modsætning til det indre cirkulære spiral, som ikke kunne fremkalde reaktion i 2D kulturer, 15 af 30 2D kulturer, der blev stimuleret med roterende felt magnetisk stimulation reagerede med sprængladning neuronal excitation. De to uafhængige spoler som er anbragt vinkelret på hinanden (figur 8B) generere roterende magnetiske og inducerede elektriske felter. Hver spole er forbundet til sine egne MS, som begge discharge lignende strømme ved en faseforsinkelse på 90 grader. Amplituden af det elektriske felt induceret af hver af de to spoler i indlægget spolekonfiguration er afbildet i figur 10A, og de samme spor er repræsenteret i figur 10B af en polær repræsentation af retningen og amplituden af den overlejrede elektriske felt af begge spoler . Den resulterende inducerede elektriske felt scanner 270 grader for den reale rum ved en maksimal felt på ~ 270 V / m.
Figur 1: Skematisk af Setup Anvendes til elektrisk stimulering af neuronale kulturer. Det ønskede signal frembringes af en signalgenerator med to udgange, der ikke ubestridt. Disse signaler forstærkes for at give en udgangsspænding på op til ± 30 V. De elektriske signaler bliver derefter ført via to separate elektrodepar, stimulere en neuronal kultur i two ortogonale og uafhængige retninger. Stimulering af neuroner kan ses og overvåges af calcium farvestoffer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk af Setup Anvendes til magnetisk stimulation af neuronale kulturer. A. Øverst vises magnetspolen (blå cirkler), som er placeret 5 mm koncentrisk over den neuronale ring kultur, som er tilføjet i en petriskål (blå omrids). En pickup coil (rød cirkel) anbragt på omkredsen af petriskålen måler spændingen induceret af magnetiske impuls. Ved bunden de målte dynamik magnetiske stimulator spole er vist (under anvendelse af en MS kondensator spænding belastning på 5.000 kV), som integreret fra opsamlingssløjfen. Inducerede elektriske felt (calculatEd for en ringradius på 14 mm) er afbildet i grønt, mens magnetfeltet er afbildet i blå B. Et inverteret mikroskop afbilder fluorescerende farvestoffer, der er følsomme for calciumtransienter af neuroner, der reagerer på magnetiske impulser. C. Neuroner dyrket på et mønster af koncentriske ringe, der anvendes til en effektiv stimulering af ringmagnetisk stimulator. D. Lysfeltmikroskopbillede af neuroner vokset på en linje i mønsteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempler på mønstre af 1D neuronale kulturer, der anvendes til orientering af det elektriske felt med retningen af aksonal vækst. A. cirkulært mønster anvendes til den cirkulære magnetiske spole, når den inducerede ele ctric felt har en cirkulær orientering. B. stregmønster anvendes, når den inducerede eller direkte elektrisk felt har en enkelt orientering.
Figur 4: Eksempler Spor af calciumtransienter Trykte Under Synkron Network brister. A. Et billede af neuroner, der blev farvet forud for forsøget med en calcium farvestof. B. Traces af intensitet over tid ROI'er i A med farven på spor, der repræsenterer farven af grænsen af ROI i A. En stor stigning i intensitet synkroniseret inden tre ROI'er repræsenterer et netværk burst. Klik her for at se en større version af dette tal.
54357fig5.jpg"/>
Figur 5: Grundlæggende konfiguration til Elektriske Stimulation, ved hjælp af One par parallelle Bath Elektroder at fastslå, at 2D kulturer har ingen foretrukken orientering af Electric Stimulation. A. Apparater, der anvendes til dyrkning stimulering. Det elektriske felt frembringes ved at påføre spænding til platin trådelektroder. Afstanden mellem de to tråde er 13 mm. B. Et eksempel på et spændingssignal, der skal anvendes på elektroderne i A. Den bipolære form af impulsen til at forhindre elektrolyse af optagelsen opløsning ved elektroderne. C. Når stimulere en 2D kultur i forskellige drejninger af elektroderne, der er isotropi den neuronale respons. D. Et eksempel på det elektriske felt måling ved hjælp beskrevet i trin 2.2 probe. Det elektriske felt er ensartet til en fejl på op til 10%. Dette tal er blevet ændret fra 5.Upload / 54357 / 54357fig5large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Elektrisk stimulering med to par elektroder giver mulighed for rotation af det elektriske felt og for stimulering i enhver ønsket vinkel. A. For at producere mere komplicerede former af det elektriske felt er der brug for to uafhængige elektrodpar. B. Anvendelse af en cosinus spændingsformet puls til en elektrode og en sinuspuls til den anden elektrode skaber et roterende elektrisk felt med konstant amplitude. C. Anvendelse af en firkantspændingsimpuls til et par elektroder skaber et ensrettet ensartet elektrisk felt. Dette tal er blevet ændret fra 5 . Venligst click her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Network Udkobling ved Blokering Synaptic indgange (som beskrevet i 2.4.2) Aktiverer Observation af den samlede population af enkeltceller, der stimuleres af en betragtning Electric Field. A. Ved at anvende forskellige amplituder af spændingsimpulser til de to par elektroder, kan det elektriske felt være orienteret til alle vinkler uden behov for manuelt at dreje kulturen. B. Eksempel optagelser af calciumtransienter med elektrisk stimulation ved forskellige påtrykte spændinger. Fire spor vises, lidt forskudt lodret for at tillade visning. Spænding værdier skrives under de blå spor. C. Ved anvendelse af en konstant varighed af elektrisk felt, antallet af neuroner, der vil brand som reaktion på det elektriske felt har en kumulativ distribution funktion (CDF), som er en kumulativ Gauss-fordeling (eller en erf funktion) som en funktion af amplituden af spændingen (som er proportional med feltstyrken). D. Et eksempel på en Strength-Varighed opnåede kurve mens anvendelse af denne protokol. Dette tal er blevet ændret fra 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Magnetisk Coil Konfiguration og Beregning af det inducerede elektriske felt. A. På toppen er en cirkulær spole (blå cirkler) er placeret 5 mm over endimensionale neuronale ring kulturer (blå disk). Ringene er parallelle med og koncentrisk med spolen, som skaber en magnetisk impuls, der er orienteret langs de røde linjer. Ved Faradays lov, det inducerede elektriske felt ligger i planer, som er parallelle med spolen langs ringe koncentriske med det. Ved bunden er et horisontalt tværsnit langs planet af ringen kulturer. Den relative værdi af det elektriske felt er farvekodet, med retning vist med pile. Større ringe omslutter et større område af flux og dermed det elektriske felt, der induceres der er højere. B. Billede af krydsspoleinstrumentets magnetisk stimulator (øverst) og en simulering af det elektriske felt, der fremkaldes af det. C. Mønster anvendes til dyrkning af neuroner, som kan stimuleres med enten en cirkulær elektrisk felt eller et radialt elektrisk felt. Dette tal er blevet ændret fra 21, 28. Klik her for at se en større version af dette tal.
9 "src =" / files / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg "/>
Figur 9: Svar fra ringkulturer til magnetfelt. A. Succeshastigheden for stimulering vokser med kulturens radius. Fejlstavene repræsenterer standardfejlen (SE). B. Forholdet mellem ringstørrelse og magnetfeltstyrke er afbildet. Sandsynligheden for at excite kulturen er farvekodet. Faktisk ligger de mest vellykkede eksitationer af kulturer i overlapningen mellem det eksperimentelt tilgængelige faseområde (hvidt rektangel) og høj sandsynlighedsregionen (rød). Dette tal er blevet ændret fra 21 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Roterende magnetfelt opsætningsfelt. </ strong> A. For at inducere et roterende elektrisk felt ved stimulering med krydsspoleinstrumentets magnetisk stimulator, der er behov for en faseforskydning på 90 grader mellem de to spoler. Vist er det elektriske felt, der induceres i en pickupspole placeret på 2 nærliggende vinger kløverblad spolen. Spolerne blev drevet separat af 2 kommercielle stimulatorer. B. En rekonstruktion, under anvendelse af de viste kurver i A, af det resulterende elektriske felt amplitude og retning under en impuls af kløverblad spolen. Dette tal er blevet ændret fra 21, 28. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1D mønstring er et vigtigt redskab, der kan anvendes til en lang række applikationer. For eksempel har vi anvendt 1D mønsterdannelse til at skabe logiske porte fra neuronale kulturer 29 og mere for nylig at måle Chronaxie og Rheobase af rotte hippocampale neuroner 5, og opbremsningen i signaludbredelseshastighed af affyringsaktivitet i Down syndrom hippocampale neuroner sammenlignet med den vildtype (WT) hippocampusneuroner 27. Den foreslåede protokol til 1D mønsterdannelse er robust og det er let at danne ethvert ønsket mønster. Vi foreslår at observere 1D kultur før målingerne at være opmærksom på eventuelle afbrydelser af nettet, der kan påvirke dens funktion.
Kemisk mønsterdannelse af neuronale konfigurationer har en fremtrædende historie 30, 31, 32. Vi fandt, at vores tilgang udbyttes lignende resultater kemisk mønster, men de er mere robuste og nemmere at nå. For nylig mulighed for mikrofluid mønster af neuroner er blevet et interessant alternativ til den tilgang, vi tilbyder, med sammenlignelig enkelhed og brugervenlighed 33, 34. Den mikrofluid tilgang bliver brugt i vores laboratorium parallelt med ætsning her beskrevne fremgangsmåde.
Som vi viste 5, 2D kulturer har ingen foretrukken orientering og deres stimulering er isotrop og afhænger ikke af orienteringen af felt påtrykt. Der er behov for kortere varigheder for stimulering af 2D kulturer når feltet roterer. I modsætning hertil 1D kulturer er meget afhængige af orienteringen af banen. Når feltet er orienteret med mønstret (og derfor med retningen af axonal vækst), varigheden af en fast amplitude felt behov for stimulering er meget kortere end når feltet er oriented vinkelret på mønster. Tilsvarende, hvis varigheden holdes konstant derefter feltet nødvendig for at excitere kulturen er mindre, hvis feltet og mønster er parallelle. Ved stimulering vinkelret på feltimpuls skal være meget længere (i størrelsesordenen et millisekund når netværket er afbrudt), og derefter hovedsagelig dendritterne stimuleres. Når der anvendes elektriske felter (enten direkte eller induceret af et magnetisk felt) hvor brain stimulation, dette er yderst vigtigt. Hvis hjernen område målrettet er kendt for at have bundter af axoner, kan disse axoner blive ophidset ved at orientere feltet i deres retning og derefter har brug for mindre strøm eller en kortere varighed af feltet for stimulering. Hvis hjernen region målrettet ikke have foretrukket orientering, så en roterende felt er mere effektiv til stimulering. Hvis dendritter er mål for stimuleringen, længere impulser er mere effektive.
Magnetfelter kan stimulere neuronal aktivitet, når en magnetisk impuls iFremkalder et elektrisk felt, der exciterer neuroner. Fordi øjeblikkelige opnåelige magnetiske impulser er mikrosekunder i varighed, forventes dendritter, hvis responstid er af størrelsesordenen millisekunder, ikke at være følsomme for magnetisk stimulering. I modsætning hertil er axoner, hvis responstid er hurtigere , målet for stimulering 2 , 3 . Axons respons til elektrisk excitation er maksimal, når de er parallelle med det elektriske felt og formindskes, når de er vinkelret på det 1 , 35 ; Derfor stræber vi i magnetisk excitation til at oprette systemer, hvor det inducerede elektriske felt orienterer sig parallelt med de målrettede aksoner. Derfor skal feltet, når det stimulerer en 1D-ring, orienteres parallelt med axonerne, og størrelsen af ringen bestemmer tærsklen for stimulering. Lignende til direkte stimulering af badelektroder, for at stimulere en 2D-kultur, en roterende induceret electric felt er meget mere effektiv.
Kombinationen af mønsterdannelse af neuroner og ekstern excitation med elektrisk eller magnetisk felt er en potent teknologi med mange mulige fremtidige applikationer. Chronaxie og Rheobase samt tærskel for aktivering og aktivering formering dynamik og hastigheder er alle parametre, der fortæller om en neuronal kulturs iboende egenskaber. Især kan terapeutiske behandlinger og virkningen af lægemidler eller farmakologisk behandling straks testet direkte på neuronerne. Dette ville tillade en effektiv undersøgelse af begge sygdomsmodeldyr neuroner og af protokoller for TMS stimulering. På et mere konceptuelt retning, evnen til at stimulere neuronale kulturer præcist fører til nye muligheder med hensyn til de informationsbehandling aspekter af neurale konfigurationer, og tillade os at forestille mikro trykte kredsløb, der kombinerer elektronisk stimulering med levende neurale netværk til at give ny beregningAl enheder og nye hjerneinterfacing enheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef og Eitan Reuveny for meget nyttige diskussioner. Forfatterne takker Ilan Breskin og Jordi Soriano for at udvikle tidlige versioner af teknologien. Forfatterne takker Tsvi Tlusty og Jean-Pierre Eckmann om hjælp med de teoretiske begreber. Denne forskning blev støttet af Minerva Foundation, Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Israel, og af Israel Science Foundation tilskud 1320-1309 og Bi-National Science Foundation tilskud 2.008.331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
- Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
- Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
- Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
- Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
- Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
- Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
- Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
- Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
- Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
- Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
- Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
- Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
- Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
- Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
- Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
- Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
- Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
- Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
- Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
- Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).
