Summary
Neuronala kulturer är en bra modell för att studera nya hjärnstimuleringstekniker via deras effekt på enskilda nervceller eller en population av nervceller. Presenteras här finns olika metoder för stimulering av mönstrade neuronala kulturer från ett elektriskt fält produceras direkt av bad elektroder eller framkallas av ett tidsvarierande magnetfält.
Abstract
En neuron kommer att skjuta en aktionspotential när dess membranpotential överskrider en viss tröskel. I typiska aktiviteten i hjärnan, sker detta som ett resultat av kemiska insignaler till dess synapser. Emellertid kan nervceller också upphetsad av en påtvingad elektriskt fält. I synnerhet, nya kliniska tillämpningar aktivera neuroner genom att skapa ett elektriskt fält externt. Det är därför av intresse att undersöka hur neuron reagerar på det yttre fältet och vad som orsakar aktionspotentialen. Lyckligtvis är möjlig precis och kontrollerad applicering av ett externt elektriskt fält för embryonala neuronala celler som är utskurna, dissocierade och odlade i kulturer. Detta gör det möjligt att undersöka dessa frågor i en mycket reproducerbar system.
I detta dokument några av de tekniker som används för kontrollerad tillämpning av externt elektriskt fält på neuronala kulturer granskas. Nätverken kan vara antingen endimensionell, dvs mönstrad i linear former eller tillåts växa på hela substratets plan, och därmed tvådimensionell. Vidare kan excitationen skapas genom direkt applicering av elektriskt fält via elektroder nedsänkta i fluid (bad elektroder) eller genom att inducera det elektriska fältet med hjälp av fjärrkontrollen skapandet av magnetiska pulser.
Introduction
Interaktionen mellan neuroner och externa elektriska fält har grundläggande konsekvenser såväl som praktiska. Medan det är känt sedan tiden för Volta att ett externt applicerat elektriskt fält kan excitera vävnad, de mekanismer som ansvarar för produktionen av en resulterande verkningspotential i nervceller är först nyligen börjat redas ut en, två, tre, fyra. Detta inkluderar att hitta svar på frågor avseende den mekanism som orsakar depolarisation av membranpotentialen, rollen av membranegenskaper och jonkanaler, och även den region i neuron som svarar på det elektriska fältet 2, 5. Terapeutisk neurostimulering 6, 7, 8, 9, Att mäta interaktionen inom hjärnan in vivo lägger till en viktig komponent för denna förståelse, men hindras av oriktigheten och låg kontrollbarhet av mätningar i skallen. Däremot kan mätningar i kulturer enkelt utföras i hög volym med hög precision, utmärkt signal till brusprestanda och hög grad av reproducerbarhet och kontroll. Med hjälp av kulturer kan en stor variation av neuronala egenskaper hos kollektiva nätverksbeteenden belysas 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . På liknande sätt förväntas detta välkontrollerade system vara mycket effektivt för att belysa mekanismen med vilken andra stimuleringsmetoder fungerar, till exempel hur kanalöppning under optisk stimulering i optogenetiskt aktiva neuroner 17 , 18 , 19 är ansvarig för att skapa åtgärdspotential. Här ligger fokus på att beskriva utveckling och förståelse av verktyg som effektivt kan excitera neuron via ett externt elektriskt fält. I detta dokument beskriver vi förberedelsen av tvådimensionella och endimensionella mönstrade hippocampala kulturer, stimulering med användning av olika konfigurationer och orientering av ett direkt applicerat elektriskt fält av badelektroder och slutligen stimulering av tvådimensionella och mönstrade endimensionella kulturer av en Tidsvarierande magnetfält, vilket inducerar ett elektriskt fält5, 20, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Rutiner som rör djurhantering gjordes i enlighet med riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av Weizmann Institute of Science, och lämplig israelisk lag. Weizmann Institute är ackrediterat av Föreningen för bedömning och ackreditering för laboratorie Animal Care International (AAALAC). Weizmann Institutional Animal Care och användning kommittén godkänt denna studie, som genomfördes med hippocampus nervceller.
1. Framställning av Tvådimensionell (2D) och One-dimensionell (1D) Hippocampus kulturer
- Framställning av täckglas för 2D-kulturer.
- Förbereda plätering medium (PM) sammansatt av 0,9 ml minimalt essentiellt medium (MEM) + 3G, 0,05 ml fetalt kalvserum (FCS), 0,05 ml värmeinaktiverat hästserum (HI HS) och en mikroliter av B27 supplement. Notera: MEM + 3G innehåller för varje 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycin, 5 ml av stabiliserad L-glutamin 100x (se
- Förbereda boratbuffert sammansatt av 1,9 g borax (natriumtetraborat-dekahydrat) i 200 ml dubbeldestillerat vatten (DDW) (blanda vid 60 ° C) och 1,24 g borsyra i 200 ml DDW. Titrera slutliga lösningen till pH 8,5 med användning av 1 M HCl. Obs: Den slutliga lösningen är 400 ml 0,1 M boratbuffert.
- Fördjupa glastäckglas i 65% salpetersyra under 2 timmar. Skölj tre gånger i DDW följt av tre sköljningar med absolut analytisk reagens (ABS AR) etanol.
- Passera varje täckglas kortvarigt genom lågan av en bunsenbrännare två eller tre gånger under 1 - 2 s, och sedan lämna inkubera över natten i plattor med 24 brunnar med 1 ml poly-L-lysin 0,01% lösning späddes 1: 5 i boratbuffert ( 0,1 M, pH 8,4). Skölj sedan täckglas i DDW tre gånger och lämna med en ml PM per brunn i en standard 37 ° C, 5% CO 2 inkubator över natten.
- Förbereda plätering medium (PM) sammansatt av 0,9 ml minimalt essentiellt medium (MEM) + 3G, 0,05 ml fetalt kalvserum (FCS), 0,05 ml värmeinaktiverat hästserum (HI HS) och en mikroliter av B27 supplement. Notera: MEM + 3G innehåller för varje 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycin, 5 ml av stabiliserad L-glutamin 100x (se
- Framställning av täckglas för 1D kulturer.
- ren glass täckglas genom nedsänkning i en bas Piranha-lösning bestående av 75 ml DDW, 25 ml 25% ammoniaklösning och 25 ml 30% -ig väteperoxid. Plats lösning med täckglas på en värmeplatta vid ~ 50 ° C under 30 min och sedan torka glastäckglas med kväve.
- Coat täckglas först med en tunn kromfilm (99,999%) av 6 en tjocklek följt av ett 30 Ett skikt av guld (99,999%), med användning av antingen ånga eller sputtering.
- För att uppnå en förstoftningshastighet av 0,05 - 1 A / s använder en sputtring maskin med 2 e-balkar och ett vakuumsystem av 260 l / s med mål storlekar 2" och 4" . Använda en rotationssteg som kan gå från 0 - 100 varv per minut (RPM). Använd en likström (DC) spotta makt 0 - 750 watt.
- Använda en rotation av 30 rpm och argon 99,999% för att få plasma vid 10 mTorr trycket i kammaren.
- Manövrera strömförsörjningen av de sputtring pistoler vid 40 W DC sputter effekten för krom, vilket leder till ~ 0,12 Å / s täckningsgrad, och vid 10 W DC sputter power för guld, vilket leder till ~ 0,28 Å / s.
- Lös upp 0,1 g 1-octadecanethiol i 100 ml ABS AR etanol med användning av ultraljud under 30 min. Placera Cr-Au-belagda täckglas under 2 timmar i denna lösning, tvätta sedan med etanol ABS AR och torr med kväve.
- Framställa en lösning av 100 ml Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (D-PBS) och 3,5 g av en tri-blocksampolymer (se tabell of Materials / Reagents) genom omrörning i 1 - 2 h vid 600 - 700 rpm. Placera täckglasen i lösningen under 1 h. Torra täck med kväve.
- Mekaniskt etsa det önskade mönstret genom att skrapa det bio-avvisande skiktet 22. Gör detta med hjälp av en penna plotter, där pennan ersätts med en etsning nål. Repa mönstret genom metallskikten för att nå det underliggande glaset. Styra denna process av en dator för att uppnå en replikerad önskat mönster. Mönster som bildas genom detta förfarande är demonstrera d i figur 2 och figur 3.
- Framställa en bio-kompatibel skikt av 100 ml D-PBS, 3,5 g tri-blocksampolymer, 35,7 pl / ml fibronektin och 29 | il / ml laminin.
- Sterilisera täckglas i ultraviolett ljus i minst 10 min. Inkubera täckglas i den preparerade bio-kompatibel lösning över natten.
OBS! Biokompatibla lagret kommer att utgöra endast om bio-avvisande skiktet etsats bort i föregående steg. - På nästa dag tvätta täckglas två gånger med P-DBS. Inkubera täck i PM natten. Täck är nu redo för cell plätering.
- Sterilisera täckglas i ultraviolett ljus i minst 10 min. Inkubera täckglas i den preparerade bio-kompatibel lösning över natten.
- Utför dissektion enligt standardprocedurer som har publicerats i stor utsträckning tidigare 23, 24.
- I korthet, extrahera hippocampus eller cortex från råttembryon, vanligtvis på dag E19, eller från möss, vanligtvis på dag E17 23,Class = "xref"> 24.
- Dissociera celler först i papainlösning i 20 - 30 min, följt av mekanisk trituration 24 med glaspipetter vars tips är brandpolerade.
OBS! Om cellerna kommer från genetiskt modifierade möss ska vävnaden från varje embryo bibehållas i ett separat 1,5 ml plaströr under hela processen. - Räkna celler med trypanblå före sådd.
OBS! För genetiskt modifierade djur ska räkningen göras separat för varje embryo. - För 2D-kulturer, frömus-neuroner vid 750 000 och råttauroner vid 850 000 celler per brunn. För 1D, frö vid 650 000 celler per brunn. Skaka plattan omedelbart efter sådd för att säkerställa en homogen täckning av täckglaset.
- Underhåll av neuronkulturerna.
- Förbered bytesmedium (CM) bestående av (per ml): 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 | il 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUDR) med uridin 100x./ Li>
- Förbereda slutliga mediet (FM) bestående av (per ml): 0,9 ml MEM + 3G och 0,1 ml HI HS.
- Ersätta PM med 1-1,5 ml CM efter 4 dagar in vitro (DIV). Vid 6 DIV, byt 50% av CM med färsk CM. Vid DIV 8, ändra mediet till 1,5 ml FM, följt av en 50% förändring av FM var 2 dagar. Efter ungefär en vecka spontan synkron aktivitet framträder.
- Avbildning av spontan eller framkallad aktivitet i neuronala kulturer med fluorescerande färgämnen.
- Framställa en lösning av 50 | j, g kalciumkänsligt fluorescerande färgämne (se tabell of Materials / Reagents) i 50 mikroliter DMSO (dimetylsulfoxid).
- Förbereda extracellulära inspelning lösning (EM) innehållande (i mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glukos, 45 sukros (pH 7,4).
- Inkubera neuronal kultur i 2 ml EM med 8 mikroliter av det kalciumkänsliga fluorescerande färgämnet lösning för en timme. Skyddas från ljus och försiktigt rotera för att säkerställa homogenOus spridning av färgämnet till cellerna.
- Byt ut lösningen med färskt EM före bildbehandling. Den fluorescerande avbildningen visas i figur 4 .
- Bild i ett fluorescensmikroskop med optiska filter för bildning av kalciumfluorescens (excitationstopp vid 488 nm, utsläppstopp vid 520 nm), med användning av en kamera och programvara som kan kvantifiera intensiteten hos vilken region som helst av intresse (ROI) inom synvinkelområdet Mikroskopet.
2. Elektrisk stimulering av kulturer
OBS! Den grundläggande inställningen för elektrisk stimulering visas i Figur 1 . En täckglida på vilken neuronalkulturen har odlats i omkring 14 dagar placeras i en petriskål under ett fluorescensmikroskop. Elektronisk aktivitet hos neuronerna avbildas med användning av kalciumkänsliga färgämnen medan en spänning appliceras via två par badelektroder som är placerade utanför kulturen. Elektroderna drivs av somignal generator, vars utsignal förstärks av en dubbelkanalsförstärkare. Spänningsstyrning för stimulering är att föredra framför den mer vanliga strömstyr 25, 26 eftersom de elektriska fältvektorerna bestäms direkt, vilket sålunda möjliggör enkel vektoraddition och kombination. Detta kräver en noggrann kontroll av enhetlighet av det elektriska fältet, som kan utföras över hela provet för fallet med spänningskontroll. Vid användning av spänningskontroll försiktighet bör iakttas för att undvika jordslingor och bör verifieras homogeniteten av det elektriska fältet (se 2.2 nedan).
- För elektrisk stimulering med en homogen elektrisk fält använder ett par parallella elektrodtrådar.
- Använda elektroder gjorda av platina med en tjocklek i storleksordningen av 0,005 '' (127 | j, m). När den används med de 13 mm täckglas, se till att avståndet mellan de två elektroderna är cirka 11 mm, och placera elektrodens 1 mm över kulturen.
OBS: För att göra elektrodhållaren (Figurerna 5A och 6A) använda polytetrafluoreten (PTFE). Borra smala hål genom PTFE att sätta elektroderna. Enheten bör vara högre än den extracellulära lösningen så att den övre änden, där elektroderna är utsatta, kommer aldrig att komma i kontakt med lösningen. För isolering, använder epoxilim på någon del av elektrodledningar som kan exponeras. - Använda en fyrkantspuls form med en 50% pulskvot, utan någon DC-komponent för att undvika elektrolys. Variera pulslängd mellan 10 us och 4 ms för att orsaka effektiv stimulering utan att bränna kulturen. Säkerställa att amplituden är i storleksordningen av ± 22 V (se figur 5). Den kvadratiska pulsen kan observeras på ett oscilloskop anslutna parallellt till elektroderna.
OBS: För enkel programmering av önskad vågform, använd en kommersiell vågform redigeringsprogram (se Material lista
- Använda elektroder gjorda av platina med en tjocklek i storleksordningen av 0,005 '' (127 | j, m). När den används med de 13 mm täckglas, se till att avståndet mellan de två elektroderna är cirka 11 mm, och placera elektrodens 1 mm över kulturen.
- För att testa för fält homogenitet använder en sondelektrod. Använda ett rutnät av minst 1 mm x 1 mm för att tillåta sonden att förflyttas i området mellan elektroderna och mäta elektrisk potential.
- Mät elektrisk potential. Använda sig av
att beräkna det elektriska fältet. Använda en av elektroderna som en referenselektrod. Mäta det elektriska fältet med varierande pulsvaraktig mellan 100 us till 4 ms (se figur 5B för ett exempel på 100 ^ s pulslängd) för att verifiera att fältet är homogent inom området av stimulerande löptider.
OBS: Se Figur 5D för ett exempel på en uppmätt elektrisk fälthomogenitet när pulsvaraktigheten var 1 ms.
- Mät elektrisk potential. Använda sig av
- Använda 2 vinkelräta par av bad elektroder för att producera mer komplicerade elektriska fält former, och attkunna orientera fältet i olika riktningar (se fig. 6B). Anordningen med 2 par av elektroder kommer att användas, och signalen på varje par av elektroderna kommer att observeras på två separata oscilloskop.
- Positionera elektroderna 1 mm över kultur och på ett avstånd av 10 - 11 mm från varandra. Se till att de båda elektrodparen är flytande (har ingen jordanslutning), och inte har någon gemensam grund genom att mäta resistansen mellan varje uppsättning av elektroder och verifiera frånvaron av kortslutningar mellan någon av elektroderna. Kontrollera att all utrustning som används, som är ansluten till elektroderna (såsom oscilloskop, förstärkarna, signalgeneratorer, osv) är flytande i förhållande till jord genom att kontrollera att all utrustning är flytande och att ingen av referenselektroderna är i kontakt någon jordad utrustning.
- För att ändra fältorientering, variera amplituden av spänningen som matas till de båda elektrodparen med resbrös till varandra (se figur 7A). Till exempel, för 0 ° användningen ± 22 V på elektrodparet, som är vinkelräta mot mönstret och 0 V för den andra elektroden. För 45 °, använd ± 15,6 V på båda paren av elektroder utan någon fasförskjutning, för en amplitud vektorsumman av 15,6 2 15,6 2 = 22 2.
- Att applicera ett roterande fält använda ett enda vågform för en sinusspänningspuls och en enda vågform för en cosinus spänningspuls till de två paren av elektroder för att producera en fast amplitud roterande elektriskt fält (se figur 6B).
OBS: Som kan ses i Figur 6B, vid användning av en cykel av en sinusvåg med ± 22 V i en elektrod och en cykel av en cosinusvåg med ± 22 V i den andra elektroden, är vektorsumman ett roterande elektriskt fält med programtiden samma som sinus- och cosinus vågorna, och med en amplitud av ± 22 V.
- För att mäta och beräkna ChronAxie och Rheobasen av axoner i den neuronala kultur vs. dendriter i samma odlings utför följande steg.
- Använda ett kalciumkänsligt fluorescerande färgämne för kalcium avbildning, såsom beskrivits i tabellen i Material / Reagens och 1,5) med en 1D kultur mönstrad på tunna (170 um), långa (10 mm) linjer. Kalciumkänsliga färgämnet kommer att tillämpas till odlingen och inkuberades under 45 minuter. Färgen kommer att tvättas genom att ersätta med en ny inspelning lösning.
- Koppla ur nätverks att uppnå befolkningsstatistiken hos direkt svar på elektrisk stimulering, utan effekten av synaptisk transmission. Att göra det, tillämpa en kombination av 40 | iM av bicucullin, som blockerar den hämmande verkan av gamma-aminosmörsyra-A (GABA A) receptorer, 10 ^ M av 6-cyano-7-nitrokinoxalin-2,3-dion (CNQX) , för att blockera α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) och kainat-receptorer och 20 | iM av (2R) -amino-5-phosphonovaleric acid (APV), som blockerar N-metyl-D-aspartat (NMDA) receptorer. De blockerare kommer att läggas till inspelningslösning.
- Tillämpa en fyrkantspuls som beskrivs i 2,1 och 2,3 med varierande tidsvaraktig mellan 100 us och 4 ms. Signalen kan observeras på oscilloskopet.
- Använda ett fluorescensmikroskop med en bildinsamlingsprogram (se 1,5) för att övervaka intensiteten av de kalcium transienter vid flera ROI, vardera innehållande ett par hundra neuroner. Förvärva bilder med hjälp av en känslig EMCCD kamera (se Material lista), som kan ges en bildupptagningshastighet av åtminstone 20 bilder per sekund. Förändringen i ljusintensitet är proportionell mot mängden av neuroner som stimulerades. Uppskatta fraktionen av stimulerade nervceller med hjälp av den relativa förändringen i intensitet.
- För varje puls varaktighet (100 jis till 4 ms), ändra amplituden för den spänning som appliceras på elektroderna som börjar vid en spänning där ingen förändring i intensitet ses (några volt), till the spänning där ändringar i intensitet på grund av den pålagda spänningen har mättade (Upp till ± 22 V).
OBS: intensitetsförändring kommer att distribueras som ett kumulativt gaussisk 5 med avseende på den pålagda spänningen för stimulering för varje tidsvaraktigheten av spänningspulsen. - Passa en kumulativ Gaussfördelning för intensiteten kontra den pålagda spänningen för varje varaktighet och extrahera den gaussiska medelvärdet från denna passform.
OBS: Detta medelvärde är representativ spänning som nervceller svarat. - Vid slutet av denna process uppnås för varje stimuleringsvaraktigheten en medelspänning till vilken de neuroner svarade. Använda dessa par av löptider och styrkor att plotta styrke-varaktighetskurvor (se Figur 7).
att beräkna det elektriska fältet. Använda en av elektroderna som en referenselektrod. Mäta det elektriska fältet med varierande pulsvaraktig mellan 100 us till 4 ms (se figur 5B för ett exempel på 100 ^ s pulslängd) för att verifiera att fältet är homogent inom området av stimulerande löptider. 3. Magnetisk Stimulering av kulturer
Obs: Den grundläggande inställningen för magnetisk stimulering visas i figur 2. Ovanpå höger visasett inverterat fluorescensmikroskop som används för att avbilda kalciumkänsliga färgämnen i neuronerna. Magnetspolen (blå cirklar) är positionerad omkring 5 mm koncentriskt ovanför en neuronal ringkultur, (blå kontur). En upptagande spolen (röd cirkel) på omkretsen av petriskålen övervakar spänningen som induceras av det magnetiska pulsen. Högst upp till vänster visas de uppmätta dynamiken i magnetiska stimulator (MS) spole med en kondensatorspänningen belastning av 5000 kV, som integreras från den upptagande spolen. Det inducerade elektriska fältet (beräknat för en ring radie av 14 mm) är avbildad i grönt medan magnetfältet avbildas i blått. På botten visas bilder av neuronala kultur. På nedre vänstra är ett ljust fält bild av en mönstrad 24-mm täckglas. De vita områdena är nervceller. Den fotograferade Mönstret består av koncentriska ring kulturer med olika radier. Längst ned till höger är en zoom på ett kort segment av ringarna, som visar enskilda nervceller. För en skala, ringarna widTh är ca 200 μm.
- Väx neuronerna i ett cirkulärt ringmönster (etsat enligt beskrivningen i 1.2.5) för 1D-kulturstimulering. Använd ett kalciumkänsligt fluorescerande färgämne för kalciumavbildning (som beskrivs i avsnitt 1.5) med en 1D-kultur mönstrad på tunna (170 μm), långa (10 mm) linjer.
- Använd en cirkulär magnetisk spole och placera en petriskål ca 5 mm nedan och koncentrera med spolen. Använd en specialspole med en inductans av L = 90 mH som drivs av en hemgjord eller kommersiell MS laddad med en maximal spänning på 5 kV.
- Lossa en högspänning och ström genom en ledande spole med hjälp av en högspännings-högspänningsomkopplare för att magnetiskt stimulera neuronkulturer. Den magnetiska stimulatorn (MS) kan byggas som beskrivs i 21 med användning av stora kondensatorer i storleksordningen 100 mF för att erhålla en högspänning på 1 - 5 kV. Använd alternativt ett kommersiellttillgängliga MS (se Tabell of Materials / Reagents).
NOTERA: Använd en 0,254 mm tjock och 6,35 mm bred polyesterbelagd rektangulär koppartråd för att tillverka en hemmagjord spole 21. Vända trådar på skräddarsydda ramar, isolerade med glasfibrer och gjuten i epoxi (se tabell of Materials / Reagents). Alternativt använda kommersiellt tillgängliga spolar (se tabell of Materials / Reagents).
- Använd roterande magnetfält för att stimulera 2D kulturer.
- Nu använder de roterande magnetfält för att stimulera 2D kulturer. Avfyra TMS med ingen kultur i skålen, vid olika intensiteter, för att visa den linjära korrelationen av spolen behandlingen med intensiteter.
- Därefter under inspelning kalcium transienter med en neuronal kultur, börja skjuta TMS öka intensitet under inspelning både kalcium transienter och spolen. Först nätverks skurar observeras som stora kalcium transienter, should inte synkronisera med plocka upp spole TMS spikar. Fortsätter att öka intensiteten, vid något tillfälle, kalcium transienter börjar bli synkroniserad med TMS spikar. Alternativt, eller dessutom, efter att ha uppnått en synkroniserad svar, börja minska intensitet tills synkronisering har avskaffats, för att bestämma tröskel TMS.
OBS: Villkor bör bibehållas strikt fastställts för var och en av de inställningar, med exakt volym varje gång, samma fartyg och exakta spole lägen och orienteringar.- Montera upptagande spolen på basen av registrerings skålen så att den är i ett plan parallellt med den neuronala kultur och i ett fast läge i förhållande till kulturen.
OBS: Detta säkerställer att beroendet av positioneringen av pickup spole med avseende på magneten är trogen positionen av kulturen och att eventuella avvikelser i placeringen kommer att vara försumbar på pickup coil avläsningar.- Använd två oberoende spolar somplacerade vinkelrätt mot varandra (figur 8B) för att generera ett roterande magnetfält och inducerade elektriska fältet. Anslut varje spole sina egna MS. Säkerställa att stimulatorerna urladda liknande strömmar vid en fasfördröjning på 90 grader (Fig 10A), vilket resulterar i ett roterande magnetfält som skannar 270 grader av den verkliga utrymmet vid en maximal fält av ~ 270 V / m (Figur 10B).
- Positionera neuronal kultur inuti en sfärisk glasbehållare fylld med den yttre lösningen inspelning (EM).
- Övervaka stimulering (förändring i fluorescensintensitet av neuronerna) med kameran såsom beskrivs i steg 2.4.4.
- I fallet med tvär spolarna (Figur 8B), placera den upptagande spolen parallellt och på ett bestämt avstånd nedanför den neuronala kulturen. upprätthålla noggrant denna konfiguration under experimenten.
- Montera upptagande spolen på basen av registrerings skålen så att den är i ett plan parallellt med den neuronala kultur och i ett fast läge i förhållande till kulturen.
- Beräkna analytiskt det elektriska fältet för 1D Configurastion av Emax = k 1 Br, där E max är den maximala amplituden av den inducerade elektriska fältet och är riktad längs tangenten av ringarna med radien r. B är amplituden hos den magnetiska pulsen och k 1 är en dimensionell proportionalitetskonstant som kan mätas med den upptagande spolen (figur 8A).
- Använd en numerisk simulering paket (se materiallista) för att numeriskt simulera elektriska fältet 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet presenteras möjliggör enkel mönstring av neuronala kulturer. När det kombineras med flera metoder vi utvecklat för stimulering, gör det möjligt att göra mätningar av vissa inneboende neuron egenskaper såsom Chronaxie och Rheobasen 5, att jämföra egenskaperna hos friska och sjuka nervceller 27, för att hitta optimala sätt att stimulera kulturer som en funktion av deras struktur och många fler nya metoder. Några exempel presenteras i nästa siffror.
Figur 3 visar den 1D mönstrade konfigurationer som är etsade i det bio-avvisande skiktet. Tunna linjer av cirka 170 | j, m bredd är typiskt inskrivet som kan, till exempel, vara koncentriska ringar med varierande radie (figur 3A) eller parallella linjer, typiskt ~ 11 mm long (figur 3B).
nt" fo: keep-together.within-sida = '1'> Den övre panelen i figur 4 visar en typisk bild av fluorescerande aktivitet i odlings, tagna med en laddningskopplad anordning (CCD) och visar en bild av fluorescensmärkt neuroner i en 2D-kultur. i detta exempel tre olika ROI visas, markerade i svart, grönt och rött. integrerade fluorescensintensiteten spår visas i den nedre panelen i figur 4, mätt i dessa tre olika ROI (spår är i motsvarande färg av ROI: er). Såsom de infällda visar, inom 200 ms upplösning av ramen inhämtningstiden vid vilken denna speciella data togs den, alla neuroner i de tre olika ROI brista samtidigt.Den grundläggande apparat som används för stimulering av en enkelriktad, konstant elektriskt fält visas i figur 5A. Elektrodtrådarna är nedsänkta i registreringsmediet, ca 1 mm ovanför den neuronala kulturen.Grundpulsform som används för elektrisk stimulering visas i figur 5B. När denna spänningspuls påläggs den skapar ett konstant elektriskt fält som fälls dess orientering med 180 ° efter halv av cykeln. Förändringen i fält riktning efter en halv cykel används för att undvika elektrolys och skador på elektroderna. Typiska spänningar som påläggs på elektroderna är ± 22 V, och den typiska pulsvaraktigheten för stimulering av 2D kulturer är i storleksordningen 100 - 500 | is.
För att kontrollera för någon anisotropi i tillväxten av neuriter verifierade vi att stimulering av 2D-kulturer är isotrop. Genom att manuellt rotera elektroderna i alla 360 ° vid 15 ° upplösning (figur 5C) kan man se att det inte finns någon preferens av orientering för stimulering. Varje färg i Figur 5C representerar stimuleringen av en annan kultur. Avståndet från origo representerar den minimala duranson som behövs för stimulering med en konstant amplitud. Det är uppenbart att, till en god approximation behöver 2D kulturer inte har en föredragen orientering för elektrisk stimulering.
Eftersom enda elektrodpar är begränsad i att ha en definierad riktning för fältet (även om det kan vändas), utvecklade vi en apparat för elektrisk stimulering med två par av elektroder (Figur 6A). En schematisk av kulturen (grå cirkulär bakgrund, mörkare fläckar är cellkropparna) och av elektroderna (parallella tjocka linjer) visas i Figur 6B. När vågformerna, visade som blå och gröna skär i figur 6B, är cosinus- och sinusvågor och tillämpas tillsammans sedan en roterande E vektorfältet produceras. När spänningspulserna är fyrkantiga, har olika amplituder och har noll fasförskjutningen mellan dem då de skapar ett konstant fält med den önskade orienteringen bestäms av relative amplitud mellan de två paren av elektroder. Denna elektriska rotation är en uppenbar förbättring jämfört med manuell, mekanisk rotation som användes för att erhålla vinkelfördelningen av stimulerings styrka i figur 5C. Naturligtvis, som Figur 6C visar, är det också möjligt att använda denna konfiguration för att excitera endast en fast riktning, möjligen som en kontroll, genom att aktivera endast ett par av elektroder.
Dessa konfigurationer har använts för att excitera 2D neuronala kulturer med antingen ett roterande fält eller en fast vinkel fältet, med samma root mean square (RMS) spänning och därefter för att jämföra pulslängden som behövs för att excitera kulturen när amplituden är fast. Vi funnit att vid användning av ett roterande elektriskt fält med konstant amplitud av ± 22 V, en genomsnittlig varaktighet av 150 ± 14 | is behövdes för att uppnå stimulering, medan med en enda riktning elektriskt fält en genomsnittlig varaktighet för290 ± 30 ^ s behövdes. Förhållandet mellan varaktigheterna som krävs för excitering av kulturen med en roterande kontra en fast vinkel område är således 0,53 ± 0,02.
Eftersom det i en 2D-kultur axoner sträcker sig i alla riktningar, är det roterande fältet kunna väcka många av axoner. Däremot med en enda orienteringsfältet finns bara några axoner orienterade i det specifika vinkel och axonal excitation inte uppnås. När varaktigheten ökar, finns det möjlighet spännande andra delar av neuron också, i synnerhet dendriter. Detta förklaras närmare nedan vid beskrivningen av Chronaxie mätningarna. Det faktum att mycket kortare löptider behövs för excitering av samma kultur när man använder en roterande fält är av stor betydelse vid användning av externa fält för hjärnstimulering, eftersom det ofta finns tekniska begränsningar pulsvaraktigheter.
figur 7. I fig 7A en 1D kopplad nätverk stimuleras med det elektriska fältet antingen längs linjen av kulturen (vid 0 ° under axonal stimulering) eller vinkelrätt mot raden av kulturen (vid 90 ° under dendritiska stimulering) av två par av elektroder. Då spänningen ökas, kommer fler neuroner stimuleras, och detta återspeglas av influensaorescence intensitet, som är proportionell mot antalet neuroner stimulerade (se Figur 7B). Ökande spänning amplituder används för att successivt stimulera hela kulturen. Varje neuron har en minimal tröskelspänning (för en specifik pulsvaraktighet) att det kommer att svara på, och enligt lagen i stort antal, är fördelningen av dessa tröskelvärden förväntas vara Gaussisk. Därför, om vi tittar på antalet neuroner som svarade och plotta den mot den spänning som appliceras, kommer fördelningen vara en kumulativ Gaussfördelning, vilket är ett fel funktion (erf) 5. Antalet neuroner som svarar på en specifik amplitud av elektriskt fält har ungefär en Gaussfördelning, och därför fluorescensen är väl beskriven av dess integral - ett fel funktion av amplituden av den stimulerande fältet (Figur 7C).
Figur 7C används till eXtract en parameter, förväntningen (medelvärde) av fördelningen. Detta görs genom att montera en kumulativ normalfördelning och uppnå bästa passform. Denna förväntan är den pålagda spänningen, till vilken 50% av cellerna kommer att reagera. Denna process upprepas för flera pulsvaraktig (varierande från 100 us till 4 ms). Medelspänningen till vilken kulturen svarade är plottad vs pulsvaraktigheten för att erhålla den Styrka-Varaktighet kurva. Två uppsättningar av mätningar utfördes. I det första fältet var parallellt med det mönster, och i det andra var det vinkelrätt mot den. Det har tidigare visats 15, 23 som axoner linje med mönster, medan dendriter växa i alla riktningar. Detta ger två olika styrke-varaktighetskurvor, som är mycket användbar för att erhålla en klar skillnad mellan axonal och dendritisk excitation. Full separation dendritiska och axonal bidrag uppnås genom det kända faktum att axonetal tidskonstant för excitation är mycket kortare än dendritiska ettor 2, 3, 4.
De styrke-varaktighetskurvorna är därefter passning till Chronaxie sönderfall ekvationen 
, Där V rh är Rheobasen spänning och C är Chronaxie. Vid pulslängder av t <1 ms är det de axoner som exciteras första och orsaka neuron till brand, som har ett lägre värde för exciteringsspänning i Styrka-Varaktighet kurva. Axonal Chronaxie beräknades till 110 us. I slående kontrast, för excitering vid långa löptider (t> 1 ms) den dendritiska facket är källan till excitation för neuronen med en dendritisk Chronaxie beräknat på 900 | is.
Principerna stimulering av 2D och 1D kulturer med en cirCular spole beskrivs i figur 8 . För att få en bättre förståelse för den fysiska situationen produceras numeriska simuleringar av de magnetiska och inducerade elektriska fälten med hjälp av COMSOL-paketet. För att stimulera 1D-kulturer används en cirkulär magnetisk spole, placerad koncentriskt ovanför petriskålen. Neuroner odlas i cirkulära ringar på en rund täckglas som placeras inuti Petriskålen för inspelning. I det här fallet kan det inducerade elektriska fältet beräknas analytiskt och motsvarar Emax = k 1 Br , där Emax är maximal amplitud för det inducerade elektriska fältet och riktas längs tangentens ringar med radie r . B är amplituden för den magnetiska pulsen och ki är en dimensionell proportionalitetskonstant som kan mätas med användning av en uppsamlingsspole.
Den numeriska COMSOL-beräkningen av magnetfältet created av spolen i 1D odlingen visas i den övre panelen i figur 8A (röda strömningslinjer). I den nedre panelen i figur 8A beräkningen presenteras för det inducerade elektriska fältet. Stimulering av en 2D-kultur med en korsspole konfiguration visas i figur 8B. Att stimulera 2D kulturer en tvär spole användes som producerar roterande magnetfält, placerade med en 2D neuronal kultur inuti den, placerades i en sfärisk glasbehållare som är fylld med registreringsmedium (EM). I det här fallet det inducerade elektriska fältet kan inte längre beräknas analytiskt. Tvär spole är avbildad i den övre panelen i figur 8B, med den sfäriska behållaren placeras inuti de två spolarna och glastäckglas stödja 2D kultur placerades i botten av behållaren. För skala, är den inre diametern av den inre spolen 65mm. Numeriska simuleringar med COMSOL med virvelströmmar 3D-modellen visas i den nedre panelen,porträttera det elektriska fältet som induceras i den inre ytan av den sfäriska behållaren. Ett ljust fältmikroskopbild av ett täckglas med typiska 1D neuronala kulturer som används för stimulering visas i figur 8C. De vita linjerna visar neuroner på de mönstrade linjer, som är orienterade både tangentiellt och radiellt för experimentell jämförelse och kontroll på effekten av riktverkan.
Geometri 1D kulturen spelar en stor roll för att avgöra om en kultur kommer att skjuta till följd av magnetisk stimulering. Endast 22% av de 1D ring kulturerna svarade på magnetisk stimulering. Den framgångsrika excitation hastigheten starkt berodde på kulturens linjära längden, och som figur 9A visar, mer än 60% av kulturerna som är längre än 80 mm svarar på magnetisk stimulering. Detta innebär att särskilda villkor är nödvändiga för magnetisk respons. För att undersöka detta geometriska beroendekulturer were odlas i konfigurationer som är delar av ringar - med samma radie men olika längder genom att mönstra dem på bågar snarare än på hela cirklar (se figur 8C)
En omfattande undersökning av de magnetiska tröskelvärden fält som funktion av radien för 1D ring kulturer visas i Figur 9B. Vita cirklar representerar experimentella mätningar av stimuleringströsklar, medan färgkodningen betecknar den beräknade sannolikheten för att mäta en exciteringströskel. Ett stimuleringströskel definieras som den svagaste fältet som fortfarande framkallar ett svar för en given neuronal kultur.
Figur 9B betonar trend som större ringar har lägre stimuleringströsklar, med ett tydligt omvänt samband mellan radien av ringarna och stimuleringströskeln. Till exempel, svarar den genomsnittliga 14 mm ring att MagnETIC pulser med amplitud av 1,5 T medan den genomsnittliga 7 mm ring svarar endast till 3 T eller mer. Detta förväntas från den teoretiska beräkningen av det inducerade elektriska fältet, som är avbildad som den färgkodade predikterade sannolikheten för brand. Indeed, är det elektriska fältet som induceras av 3T vid en radie av 7 mm lika med den som induceras av 1,5 T vid dubbla radien. Sammanfattningsvis är den genomsnittliga fälttröskeln elektriska 301 ± 128 (standardavvikelse) V / m, oberoende av radien av ring kulturer.
I motsats till den enda cirkulär spole, som inte kunde framkalla svar i 2D kulturer, 15 av 30 2D kulturer som stimulerades genom roterande fält magnetisk stimulering svarade med spräng neuronal excitering. De två oberoende spolar som är placerade vinkelrätt mot varandra (figur 8B) generera roterande magnetiska och inducerade elektriska fält. Varje spole är ansluten till sin egen MS, som båda DischArge liknande strömmar vid en faslagring på 90 grader. Amplituden hos det elektriska fältet som induceras av var och en av de två spolarna i tvärspolningskonfigurationen är avbildad i figur 10A och samma spår representeras i figur 10B genom en polär representation av riktningen och amplituden hos det överliggande elektriska fältet hos båda spolarna . Det resulterande inducerade elektriska fältet skannar 270 grader av det verkliga utrymmet vid ett maximalt fält av ~ 270 V / m.
Figur 1: Schematisk av inställningen som används för elektrisk stimulering av neurokulturer. Den önskade signalen produceras av en signalgenerator med två utgångar som inte har någon gemensam mark. Dessa signaler förstärks för att ge en utspänning på upp till ± 30 V. De elektriska signalerna matas sedan genom två separata elektroder, som stimulerar en neuronal kultur i two ortogonala och oberoende riktningar. Stimulering av nervceller kan ses och övervakas av kalcium färgämnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bild av Setup Används för magnetisk stimulering av neuronala kulturer. A. Vid toppen visas den magnetiska spolen (blå cirklar), som ligger 5 mm koncentriskt ovanför den neuronala ringkultur, placerades i en petriskål (blå kontur). En upptagande spolen (röd cirkel) belägen på omkretsen av petriskålen mäter den spänning som induceras av det magnetiska pulsen. Nedtill de uppmätta dynamiken i magnetiska stimulatorn polen visas (med användning av en MS kondensatorspänningen belastning av 5000 kV), som integreras från den upptagande spolen. Inducerade elektriska fältet (erhålliEd för en ringradio på 14 mm) avbildas i grönt medan magnetfältet avbildas i blått B. Ett inverterat mikroskop avbildar fluorescerande färgämnen som är känsliga för kalciumtransienter av neuroner som reagerar på magnetiska pulser. C. Neuroner odlade på ett mönster av koncentriska ringar, som användes för en effektiv stimulering av ringen magnetisk stimulator. D. Ljusfältmikroskopbild av neuroner odlade på en linje i mönstret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på mönster av 1D neuronala kulturer som används för att orientera det elektriska fältet med riktningen för axonal tillväxt. A. Rundmönster används för den cirkulära magnetiska spolen när den inducerade ele ctric fältet har en cirkulär orientering. B. Linje mönster används när den inducerade eller direkt elektriskt fält har en enda orientering.
Figur 4: Exempel Spår av kalcium transienter avbildas Under Synkrona Network Bursts. A. En bild av neuroner som färgats tidigare till experimentet med en kalcium färgämne. B. Spår av intensitet mot tid av de ROI: er i A med färgen på spåret som representerar färgen på gränsen av ROI i A. En stor ökning i intensitet synkroniserade inom de tre ROI representerar en nätverksskur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
54357fig5.jpg"/>
Figur 5: Grundinställningar för Electric stimulering, med hjälp av ett par parallella Bath Elektroder för att fastställa att 2D kulturer har ingen Preferred orientering Electric stimulering. A. Apparat som användes för odling stimulering. Det elektriska fältet alstras genom applicering av spänning till platinatrådelektroder. Avståndet mellan de två trådarna är 13 mm. B. Ett exempel på en spänningssignal som skall appliceras på elektroderna i A. Den bipolära formen av pulsen hjälper till att förhindra elektrolys av registreringslösningen vid elektroderna. C. När stimulering av en 2D-kultur i olika rotationer hos elektroderna, det finns isotropi av det neuronala svar. D. Ett exempel på den elektriska fältmätning med användning av sonden beskrivs i steg 2,2. Det elektriska fältet är enhetligt på ett fel på upp till 10%. Denna siffra har ändrats från 5.ladda upp / 54357 / 54357fig5large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Elektrisk Stimulering med två elektrodpar Möjliggör Rotation av det elektriska fältet och för stimulering i varje önskad vinkel. A. För att framställa mer komplicerade former hos det elektriska fältet, behövs två oberoende elektrodpar. B. Tillämpning av en cosinus spännings formad puls till en elektrod och en sinuspuls till den andra elektroden skapar ett roterande elektriskt fält med konstant amplitud. C. Applicering en fyrkantig spänningspuls till ett par av elektroderna skapar ett ensriktat likformigt elektriskt fält. Denna siffra har ändrats från 5. Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Nätverkskoppling genom Blockering synaptiska inmatningar (som beskrivs i 2.4.2) Aktiverar Observation av den totala populationen av enstaka celler som stimuleras av en tanke Electric Field. A. Genom att tillämpa olika amplituder av spänningspulser till de två paren av elektroder, kan det elektriska fältet vara orienterad till varje vinkel utan att behöva stänga av kulturen manuellt. B. Exempel inspelningar av kalcium transienter med elektrisk stimulering vid olika pålagda spänningar. Fyra spår visas, något skiftat vertikalt för att tillåta visning. Spänningsvärden skrivs under de blå spår. C. Vid tillämpning av ett konstant varaktighet av elektriskt fält, antalet neuroner som avfyras som svar på det elektriska fältet har en kumulativ distribution funktion (CDF), som är en kumulativ Gaussfördelning (eller en erf funktion) som en funktion av amplituden för den spänning (som är proportionell mot fältstyrkan). D. Ett exempel på en styrke-varaktighetskurva som erhållits medan användning av detta protokoll. Denna siffra har ändrats från 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: magnetspole Konfiguration och Beräkning av inducerade elektriska fältet. A. Vid toppen är en cirkulär spole (blå cirklar) är positionerad 5 mm över endimensionella neuronala ringkulturer (blå disk). Ringarna är parallella med och koncentrisk med spolen, vilket skapar en magnetisk puls som är orienterat längs de röda linjerna. Av Faradays lag, det inducerade elektriska fältet ligger i plan som är parallella med spolen längs ringar koncentriska med den. Vid botten är en horisontell tvärsektion längs planet av ring kulturer. Det relativa värdet av det elektriska fältet är färgkodade, med riktning som visas med pilar. Större ringar innesluter en större yta av flussmedel och följaktligen det elektriska fältet inducerade det finns högre. B. Bild av tvär spolen magnetisk stimulator (överst) och en simulering av det elektriska fältet som induceras av den. C. Mönster som används för att odla neuroner som kan stimuleras med antingen ett cirkulärt elektriskt fält eller ett radiellt elektriskt fält. Denna siffra har modifierats 21, 28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
9" src = "/ filer / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg" />
Figur 9: Respons hos ring kulturer till Magnetic Field. A. framgångsrika stimulering växer med radien av kulturen. Felstaplarna representerar standardfelet (SE). B. Förhållandet mellan ringstorlek och magnetisk fältstyrka avbildas. Sannolikheten för att excitera kulturen är färgkodade. Indeed mest framgångsrika excitationer av kulturer ligga i överlappningen mellan den experimentellt åtkomlig fasrummet (vit rektangel) och den höga sannolikheten regionen (röd). Denna figur har modifierats 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: roterande magnetfält Setup Field. </ Strong> A. För att inducera ett roterande elektriskt fält vid stimulering med den magnetiska spolningsstimulatorn krävs en fasskift på 90 grader mellan de två spolarna. Visas är det elektriska fältet inducerat i en uppsamlingsspole placerad på 2 närliggande vingar av klöverbladspolen. Spolarna drivs separat av 2 kommersiella stimulatorer. B. En rekonstruktion, med användning av kurvorna som visas i A, av den resulterande elektriska fältamplituden och riktningen under en puls av klöverbladspolen. Denna siffra har ändrats från 21 , 28 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1D patterning är ett viktigt verktyg som kan användas för en mängd olika applikationer. Till exempel har vi använt 1D-patrering för att skapa logiska grindar från neuronkulturer 29 och mer nyligen för att mäta Chronaxie och Rheobase av råttahippocampala neuroner 5 och sänkning av signalutbredningshastigheten för avfyrningsaktivitet i Downs syndrom hippokampala neuroner jämfört med Vildtyp (WT) hippocampala neuroner 27 . Det föreslagna protokollet för 1D-patrering är robust och det är lätt att skapa önskat mönster. Vi föreslår att man observerar 1D-kulturen innan mätningarna är medvetna om eventuella avstängningar av nätverket, vilket kan påverka dess funktion.
Kemisk patrering av neuronkonfigurationer har en framstående historia 30 , 31 , 32 . Vi fann att vårt tillvägagångssätt gav resultatS liknande resultat till kemisk patterning, men de är mer robusta och lättare att uppnå. Nyligen har alternativet för mikrofluidisk patterning av neuroner blivit ett intressant alternativ till det tillvägagångssätt vi erbjuder, med jämförbar enkelhet och användarvänlighet 33 , 34 . Det mikrofluidiska tillvägagångssättet används i vårt laboratorium parallellt med den etsningsmetod som beskrivs här.
Som vi visade 5 har 2D-kulturer ingen föredragen orientering och deras stimulering är isotrop och beror inte på orienteringen av det applicerade fältet. Kortare varaktighet behövs för stimulering av 2D-kulturer när fältet roterar. I motsats härtill är 1D-kulturer mycket beroende av orienteringen av fältet. När fältet är orienterat med mönstret (och därför med riktningen för axonal tillväxt) är längden av ett fält med fast amplitud som behövs för stimulering mycket kortare än när fältet är orienterated vinkelrätt mot mönstret. På liknande sätt, om varaktigheten hålls konstant då fältet som behövs för att excitera kulturen är mindre om fältet och mönstret är parallella. När stimulering vinkelrätt, behöver fältpulsen att vara mycket längre (i storleksordningen av en millisekund när nätverket är frånkopplad), och sedan i huvudsak dendriterna stimuleras. När elektriska fält (antingen direkta eller induceras av ett magnetiskt fält) används för hjärnstimulering, är detta av yttersta vikt. Om hjärnan området riktade är kända för att ha buntar av axoner, kan dessa axoner exciteras genom att orientera fältet i deras riktning och då behöver mindre effekt eller en kortare fältet för stimulering. Om hjärnan regionen riktade inte ha föredragit orientering, då ett roterande fält är mer effektivt för stimulering. Om dendriter är målet för stimulans, längre pulser är mer effektiva.
Magnetiska fält kan stimulera neuronal aktivitet när en magnetisk puls iInducerar ett elektriskt fält som exciterar neuroner. Eftersom nuvarande uppnåbara magnetiska pulser är mikrosekunder i varaktighet, förväntas dendriter, vars svarstid är i storleksordningen millisekunder, inte vara känslig för magnetisk stimulering. I motsats till detta är axonerna, vars svarstid är snabbare, målet för stimulering 2 , 3 . Svaret från axoner till elektrisk excitation är maximal när de är parallella med det elektriska fältet och minskar när de är vinkelräta mot det 1 , 35 ; Därför strävar vi efter magnetisk excitation till att skapa system där det inducerade elektriska fältet orienterar sig parallellt med de riktade axonerna. Därför bör fältet, när man stimulerar en 1D-ring, vara orienterad parallellt med axonerna, och ringen bestämmer tröskeln för stimulering. Liknande för direkt stimulering av badelektroder, för att stimulera en 2D-kultur, en roterande inducerad eLectric fält är mycket effektivare.
Kombinationen av mönstring av nervceller och av extern excitation med elektriska eller magnetiska fält är en potent teknik med många möjliga framtida tillämpningar. Chronaxie och Rheobasen samt tröskeln för aktivering och aktivering utbrednings dynamik och hastigheter är alla parametrar som berättar om en neuronal kulturens inneboende egenskaper. I synnerhet, kan terapeutiska behandlingar och effekten av läkemedel eller farmakologisk behandling omedelbart testas direkt på neuronerna. Detta skulle möjliggöra en effektiv undersökning av de båda sjukdomsmodell nervceller och protokoll för TMS stimulering. På en mer konceptuell riktning leder förmågan att stimulera neuronala kulturer just nya möjligheter när det gäller de informationsbehandlings aspekterna av neurala konfigurationer och tillåta oss att tänka micro tryckta kretsar som kombinerar elektronisk stimulering med levande neuronala nätverk för att ge ny beräkningal enheter och nya hjärngränssnittsanordningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef och Eitan Reuveny för mycket hjälpsamma diskussioner. Författarna tackar Ilan Breskin och Jordi Soriano för att utveckla tidiga versioner av tekniken. Författarna tackar Tsvi Tlusty och Jean-Pierre Eckmann för att få hjälp med de teoretiska begrepp. Denna forskning stöddes av Stiftelsen Minerva, ministeriet för vetenskap och teknik, Israel, och Israel Science Foundation 1320-1309 och Bi-National Science Foundation 2.008.331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
- Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
- Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
- Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
- Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
- Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
- Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
- Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
- Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
- Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
- Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
- Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
- Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
- Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
- Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
- Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
- Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
- Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
- Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
- Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
- Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).
