Summary
Neuronale Kulturen sind ein gutes Modell für die Untersuchung Schwellen Hirnstimulation Techniken über ihre Wirkung auf die einzelnen Neuronen oder einer Population von Neuronen. Dargestellt hier sind verschiedene Verfahren zur Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein elektrisches Feld erzeugt wird direkt durch Badelektroden oder induziert durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.
Abstract
Ein Neuron wird ein Aktionspotential ausgelöst, wenn dessen Membranpotential einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. In typischer Aktivität des Gehirns, tritt dies als Ergebnis chemischer Eingänge seine Synapsen. Allerdings Neuronen können auch durch ein auferlegtes elektrisches Feld angeregt werden. Insbesondere aktivieren bisherige klinische Anwendungen Neuronen, die durch ein elektrisches Feld von außen zu schaffen. Es ist daher von Interesse, zu untersuchen, wie das Neuron zum äußeren Feld reagiert und was bewirkt, dass das Aktionspotential. Glücklicherweise ist eine präzise und kontrollierte Anwendung eines externen elektrischen Feldes möglich ist, für die embryonale neuronale Zellen, die herausgeschnitten werden, dissoziiert und in Kulturen gezüchtet. Dies ermöglicht die Untersuchung dieser Fragen in hochreproduzierbarer System.
In diesem Papier einige der Techniken für die kontrollierte Anwendung von externem elektrischem Feld auf neuronalen Kulturen verwendet werden, überprüft. Die Netzwerke können entweder eindimensional sein, dh in linea gemustertr Formen oder auf der gesamten Ebene des Substrats wachsen gelassen, und somit zweidimensional. Darüber hinaus kann die Anregung durch das direkte Anlegen des elektrischen Feldes über die Elektroden in dem Fluid (Badelektroden) oder durch Induzieren des elektrischen Felds unter Verwendung der Fern Schaffung magnetischer Impulse erzeugt wird eingetaucht.
Introduction
Die Wechselwirkung zwischen Neuronen und externen elektrischen Feldern hat sowohl grundlegende Implikationen als auch praktische. Während es seit den Zeiten von Volta bekannt ist, dass ein extern angelegtes elektrisches Feld Gewebe anregen kann, sind die Mechanismen, die für die Produktion eines resultierenden Aktionspotentials in Neuronen verantwortlich sind, erst vor kurzem aufgefangen 1 , 2 , 3 , 4 . Hierbei handelt es sich um Antworten auf Fragen, die den Mechanismus betreffen, der die Depolarisation des Membranpotentials, die Rolle der Membraneigenschaften und der Ionenkanäle und sogar die Region im Neuron, die auf das elektrische Feld 2 , 5 reagiert, verursacht. Therapeutische Neurostimulation 6 , 7 , 8 , 9 , Messen der Wechselwirkung innerhalb des in - vivo - Gehirns fügt eine wichtige Komponente dieses Verständnisses, sondern wird durch die Ungenauigkeit und niedrige Steuerbarkeit der Messungen innerhalb des Schädels behindert. Im Gegensatz dazu können die Messungen in den Kulturen mit hohen Präzision leicht, exzellenten Signal-Rausch-Leistung und einem hohen Grad an Reproduzierbarkeit und der Kontrolle in hohem Volumen durchgeführt werden. Mit Kulturen eine große Vielfalt von neuronalen Eigenschaften des kollektiven Verhalten des Netzwerks können 11 aufgeklärt werden, 12, 13, 14, 15, 16. In ähnlicher Weise ist dies gut kontrolliert werden , um hocheffiziente System erwartet , dass der Mechanismus in Aufklären , durch die anderen Stimulationsverfahren arbeiten, wie zum Beispiel Kanalöffnung während der optischen Stimulation in optogenetically aktiven Neuronen 17, 18, 19 ist verantwortlich für die Erstellung von Aktionspotential. Hier liegt der Schwerpunkt auf der Beschreibung der Entwicklung und das Verständnis von Werkzeugen, die effizient das Neuron über ein externes elektrisches Feld anregen kann. In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung von zweidimensionaler und eindimensionalen gemusterten hippocampalen Kulturen, Stimulation verschiedene Konfigurationen und Orientierung eines direkt angelegten elektrischen Feld von Badelektroden verwenden und schließlich Stimulation von zweidimensionalen und bemustert eindimensionalen Kulturen nach a zeitlich veränderliches Magnetfeld, das ein elektrisches Feld induziert,5, 20, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierische Handhabung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) des Weizmann Institute of Science und dem entsprechenden israelischen Rechts getan. Das Weizmann Institut wird von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert. Das Weiz Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt diese Studie mit Hippocampus-Neuronen durchgeführt.
1. Herstellung von zweidimensionalen (2D) und eindimensional (1D) Hippocampal Cultures
- Herstellung von Deck für 2D-Kulturen.
- Bereiten Plattierungsmedium (PM), bestehend aus: 0,9 ml Minimum Essential Medium (MEM) + 3G, 0,05 ml fötalen Kälberserum (FCS), 0,05 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum (HS HALLO) und 1 ul B27 Ergänzung. Hinweis: MEM + 3G enthält für jede 500 ml MEM x 1, 1 ml Gentamycin, 5 ml stabilisiert L-Glutamin 100x (siehe
- Bereiten Boratpuffer, bestehend aus: 1,9 g Borax (Natriumtetraboratdecahydrat) in 200 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW) (bei 60 ° C mischte) und 1,24 g Borsäure in 200 ml DDW. Titrieren Endlösung auf pH 8,5 unter Verwendung von 1 M HCl. Anmerkung: Die Endlösung ist 400 ml 0,1 M Boratpuffer.
- Tauchen Deckgläser in 65% iger Salpetersäure 2 Stunden. Spülen dreimal in DDW, gefolgt von drei Spülungen mit absolutem analytischem Reagens (ABS AR) ethanol.
- Übergeben jedes Deckglas kurz durch die Flamme eines Bunsenbrenners zwei- oder dreimal mit 1 - 2 s, und verlassen dann über Nacht in 24-Well-Platten mit 1 ml Poly-L-Lysin 0,01% ige Lösung inkubieren, verdünnt 1: 5 in Boratpuffer ( 0,1 M, pH 8,4). Dann spülen Deckgläser in DDW dreimal und läßt mit 1 ml PM pro Vertiefung in einem Standard - 37 ° C, 5% CO 2 über Nacht Inkubator.
- Bereiten Plattierungsmedium (PM), bestehend aus: 0,9 ml Minimum Essential Medium (MEM) + 3G, 0,05 ml fötalen Kälberserum (FCS), 0,05 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum (HS HALLO) und 1 ul B27 Ergänzung. Hinweis: MEM + 3G enthält für jede 500 ml MEM x 1, 1 ml Gentamycin, 5 ml stabilisiert L-Glutamin 100x (siehe
- Herstellung von Deck für 1D-Kulturen.
- saubere glass Deckgläser durch Eintauchen in eine Lösung, bestehend aus Basis Piranha 75 ml DDW wurden 25 ml 25% ige Ammoniaklösung und 25 ml 30% iges Wasserstoffperoxid. Ort Lösung mit den Deckgläsern aus Glas auf einer Heizplatte bei ~ 50 ° C für 30 min und dann trocknen die Deckgläser mit Stickstoff.
- Coat Deck zunächst mit einem dünnen Chromfilm (99,999%) 6 mit einer Dicke, gefolgt von einer 30-Å-Schicht aus Gold (99,999%), unter Verwendung von entweder Dampf oder Sputter-Abscheidung.
- Um eine Sputter-Rate von 0,05 zu erreichen - 1 Å / s eine Sputter-Maschine mit 2 E-Strahlen verwenden, und ein Vakuumsystem von 260 l / s mit den Zielgrößen 2" und 4" . Verwenden Sie eine Rotationsstufe, die von 0 gehen kann - 100 Umdrehungen pro Minute (RPM). Verwenden Sie einen Gleichstrom (DC) Sputter-Leistung von 0-750 Watt.
- Verwenden, um eine Rotation von 30 Umdrehungen pro Minute und Argon von 99,999% Plasma bei 10 mTorr Druck in der Kammer zu erhalten.
- Betreiben Sie die Stromversorgung der Sputter-Kanonen bei 40 W DC-Sputter-Leistung für das Chrom, was zu ~ 0,12 Å / s Deckungsrate und bei 10 W DC Sputter-Leistung für das Gold, was zu ~ 0,28 Å / s.
- Man löst 0,1 g 1-Octadecanthiol in 100 ml Ethanol ABS AR für 30 min unter Verwendung von Ultraschall. Platzieren Cr-Au-beschichtete Deckgläser für 2 h bei dieser Lösung, dann waschen mit Ethanol ABS AR und mit Stickstoff trocken.
- Es wird eine Lösung von 100 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) und 3,5 g einem Tri-Block - Co-Polymer (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien) durch Rühren für 1 bis 2 h bei 600 bis 700 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie Deckgläser in der Lösung für 1 h. Dry Deck mit Stickstoff.
- Mechanisch ätzt das gewünschte Muster durch die bio-Abstoßungsschicht 22 zu verkratzen. Tun Sie dies mit einem Stift Plotter, wo der Stift durch eine Ätz-Nadel ersetzt wird. Zerkratzen das Muster durch den Metallschichten die darunter liegende Glas zu erreichen. Steuert diesen Prozess durch einen Computer ein replizierte gewünschten Muster zu erzielen. Muster, die durch dieses Verfahren gebildet sind, zeigen, d in Abbildung 2 und Abbildung 3.
- Vorbereiten einer biokompatiblen Schicht aus 100 ml D-PBS, 3,5 g Tri-Block-Copolymer, 35,7 & mgr; l / ml Fibronektin und 29 & mgr; l / mL Laminin.
- Sterilisieren Deckgläser in ultraviolettem Licht für mindestens 10 min. Inkubieren Deckgläser in der hergestellten biokompatible Lösung über Nacht.
HINWEIS: Die biokompatible Schicht wird nur bilden, wenn die Bio-Abstoßungsschicht im vorherigen Schritt weggeätzt wurde. - Am nächsten Tag waschen Deckgläser zweimal mit P-DBS. über Nacht inkubieren Deckgläser in PM. Die Deckgläser sind nun bereit für Zellplattierung.
- Sterilisieren Deckgläser in ultraviolettem Licht für mindestens 10 min. Inkubieren Deckgläser in der hergestellten biokompatible Lösung über Nacht.
- Führen Sie Dissektion nach Standardverfahren , die ausführlich zuvor 23, 24 veröffentlicht wurden.
- Kurz gesagt, Extrakt Hippocampus oder Cortex von Rattenembryonen, in der Regel am Tag E19, oder von Mäusen, in der Regel am Tag E17 23,Class = "xref"> 24.
- Dissoziieren Sie die Zellen zuerst in der Papain-Lösung für 20 - 30 min, gefolgt von der mechanischen Verreibung 24 mit Glaspipetten, deren Spitzen feuerpoliert sind.
HINWEIS: Wenn die Zellen aus genetisch veränderten Mäusen kommen, dann sollte das Gewebe von jedem Embryo in einem separaten 1,5 ml Plastikschlauch während des gesamten Prozesses gehalten werden. - Zähle Zellen mit Trypanblau vor dem Aussaat.
HINWEIS: Bei genetisch veränderten Tieren sollte die Zählung für jeden Embryo separat erfolgen. - Für 2D-Kulturen, Seed-Maus-Neuronen bei 750.000 und Ratten-Neuronen bei 850.000 Zellen pro Brunnen. Für 1D, Saatgut bei 650.000 Zellen pro Brunnen. Schütteln Sie die Platte leicht nach dem Aussaat, um eine homogene Abdeckung des Deckglases zu gewährleisten.
- Pflege der neuronalen Kulturen.
- Vorbereitung des Wechselmediums (CM) aus (pro ml): 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 μl 5-Fluor-2'-desoxyuridin (FUDR) mit Uridin 100x/ Li>
- Bereiten Endmedium (FM), bestehend aus (pro ml): 0,9 ml MEM + 3G und 0,1 ml HALLO HS.
- Ersetzen PM mit 1-1.5 ml CM nach 4 Tagen in vitro (DIV). Bei 6 DIV, ersetzen 50% des CM mit frischem CM. Bei DIV 8 Ändern des Mediums auf 1,5 ml FM, gefolgt von einer 50% igen Änderung der FM alle 2 Tage. Nach etwa einer Woche spontan synchrone Aktivität entsteht.
- Imaging spontaner oder evozierten Aktivität in neuronalen Kulturen mit Fluoreszenzfarbstoffen.
- Bereiten eine Lösung von 50 & mgr; g calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien) in 50 & mgr; l DMSO (Dimethylsulfoxid).
- Bereiten extrazelluläre Aufzeichnungslösung (EM) , die (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 139 NaCl, 10 D-Glucose, 45 Sucrose (pH 7,4).
- neuronal Kultur in 2 ml EM Inkubieren mit 8 & mgr; l der calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstofflösung für 1 h. Vor Licht und sanft drehen homogen, um sicherzustellen,ous Ausbreitung des Farbstoffs an die Zellen.
- Ersetzen Lösung mit frischer EM vor der Bildgebung. Die Fluoreszenz - Bildgebung ist in 4 gezeigt.
- Bild in einem Fluoreszenzmikroskop mit einem optischen Filter für Calcium Fluoreszenzbildgebung (Anregungspeak bei 488 nm, Emissionspeak bei 520 nm) unter Verwendung einer Kamera und Software, die die Quantifizierung der Intensität jeder Region von Interesse (ROI) im Gesichtsfeld des das Mikroskop.
2. Elektrische Stimulation der Kulturen
HINWEIS: Der Grundaufbau für Elektrostimulation ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Deckglas, auf dem das neuronale Kultur wurde für etwa 14 Tage lang wachsen gelassen worden ist, in einer Petrischale unter einem Fluoreszenzmikroskop gelegt. Elektrische Aktivität der Neuronen abgebildet wird unter Verwendung von Calcium-sensitiven Farbstoffen während eine Spannung über zwei Paare von Badelektroden aufgebracht wird, die außerhalb der Kultur positioniert sind. Die Elektroden werden angetrieben, indem sie alsignal Generator, dessen Ausgang durch einen Zweikanalverstärker verstärkt. Spannungsregelung für die Stimulation wird über die weiteren Standard - Stromsteuer bevorzugt 25, 26 , da die elektrischen Feldvektoren direkt bestimmt werden, so dass einfache Vektoraddition und Kombination ermöglicht. Dies erfordert eine sorgfältige Prüfung der Gleichförmigkeit des elektrischen Feldes, das über die gesamte Probe für den Fall einer Spannungssteuerung durchgeführt werden kann. Wann sollte mit Spannungssteuer Pflege keine Masseschleifen und die Homogenität des elektrischen Feldes zu vermeiden genommen werden sollte überprüft werden (siehe unten 2.2).
- Für elektrische Stimulation mit einem homogenen elektrischen Feld ein Paar paralleler Elektrodendrähte verwenden.
- Verwenden Elektroden aus Platin mit einer Dicke in der Größenordnung von 0,005 ‚‘ (127 & mgr; m). In Verbindung mit den 13 mm Deckgläsern verwendet, sicherzustellen, dass der Abstand zwischen den beiden Elektroden etwa 11 mm, und die Elektrodenpositions 1 mm über der Kultur.
ANMERKUNG: Um den Elektrodenhalter (5A und 6A) verwenden , Polytetrafluorethylen (PTFE). Bohrt schmale Löcher durch das PTFE der Elektroden einzusetzen. Das Gerät sollte höher sein als die extrazelluläre Lösung sein, so dass das obere Ende, wo die Elektroden ausgesetzt sind, wird nie mit der Lösung in Kontakt kommen. Zur Isolierung verwenden Epoxidkleber auf jedem Teil der Elektrodenleitungen, die freigelegt werden könnten. - Verwenden Sie ein Rechteckimpulsform mit einem Tastverhältnis von 50%, ohne Gleichstromkomponente der Elektrolyse zu vermeiden. Variieren Pulsdauer zwischen 10 & mgr; s und 4 ms effektive Stimulation zu verursachen, ohne die Kultur zu verbrennen. Stellen Sie sicher , dass die Amplitude in der Größenordnung von ± 22 V ist (siehe Abbildung 5). Der Rechteckimpuls kann an die Elektroden parallel geschaltet sind auf einem Oszilloskop beobachtet werden.
HINWEIS: Für eine einfache Programmierung beliebiger Wellenform, eine kommerzielle Wellenform - Bearbeitungs - Software (siehe Materialliste
- Verwenden Elektroden aus Platin mit einer Dicke in der Größenordnung von 0,005 ‚‘ (127 & mgr; m). In Verbindung mit den 13 mm Deckgläsern verwendet, sicherzustellen, dass der Abstand zwischen den beiden Elektroden etwa 11 mm, und die Elektrodenpositions 1 mm über der Kultur.
- Um Feldhomogenitätstest eine Sondenelektrode verwendet werden. Verwenden mindestens 1 mm x 1 mm ein Raster der Sonde zu ermöglichen, in dem Bereich zwischen den Elektroden zu messen und elektrisches Potential bewegt werden.
- Messen Sie elektrisches Potential. Benutzen
das elektrische Feld zu berechnen. Verwenden einer der Elektroden als Referenzelektrode. Messung des elektrischen Feldes mit unterschiedlichen Pulsdauern zwischen 100 & mgr; s bis 4 ms (siehe 5B für ein Beispiel von 100 & mgr; s Impulsdauer) , um zu überprüfen , dass das Feld im Bereich von stimulierenden Dauern homogen ist.
HINWEIS: Siehe Abbildung 5D für ein Beispiel einer gemessenen elektrische Feldhomogenität , wenn die Impulsdauer 1 ms ist.
- Messen Sie elektrisches Potential. Benutzen
- Verwendung 2 senkrechte Paare von Badelektroden komplizierteren elektrischen Feldformen zu erzeugen, undin der Lage , das Feld in verschiedenen Richtungen (siehe Fig. 6B) zu orientieren. Das Gerät ist mit 2 Paaren von Elektroden verwendet werden, und das Signal auf jedem Paar der Elektroden auf zwei getrennten Oszilloskope beobachtet werden.
- Position, um die Elektroden 1 mm über der Kultur und in einer Entfernung von 10 - 11 mm voneinander. Stellen Sie sicher, dass die beiden Elektrodenpaare sind schwimmende (keine Erdverbindung haben), und haben keine gemeinsame Masse durch den Widerstand zwischen jedem Satz von Elektroden gemessen und in Abwesenheit von Kurzschlüssen zwischen irgendeiner der Elektroden zu überprüfen. Stellen Sie sicher , dass alle Geräte verwendet, die an die Elektroden (wie die Oszilloskope, die Verstärker, die Signalgeneratoren, etc.) verbunden ist , ist in Bezug auf Masse floating durch Überprüfung , dass alle Geräte schwimmt , und dass keine der Referenzelektroden berührt jedes geerdetes Gerät.
- Um Feldorientierung zu ändern, variiert die Amplitude der an die beiden Elektrodenpaare mit res Spannung gespeistpect zueinander (siehe 7A). Zum Beispiel für den Einsatz 0 ° ± 22 V an dem Elektrodenpaar, die senkrecht zu dem Muster und 0 V für die andere Elektrode. 45 °, ± 15,6 V auf beiden Elektrodenpaare ohne Phasenverzögerung verwenden, für einen Amplitudenvektorsumme von 15,6 2 15,6 2 22 = 2.
- Ein Drehfeld eine einzige Wellenform einer Sinusspannungsimpuls und eine einzige Wellenform eines Cosinus Spannungsimpulses an die zwei Paare von Elektroden verwenden , um eine feste Amplitude rotierende elektrisches Feld zu erzeugen (siehe 6B) anzuwenden.
HINWEIS: Wie in 6B gesehen werden, wenn sie mit ± 22 V in einer Elektrode und einen Zyklus einer Cosinuswelle mit ± 22 V in der anderen Elektrode einen Zyklus einer Sinuswelle verwendet wird , die Vektorsumme ist ein rotierendes elektrisches Feld mit die Zyklusdauer gleich wie die Sinus- und Kosinus-Wellen und mit einer Amplitude von ± 22 V.
- Zur Messung und Berechnung ChronAXIe Rheobase und von Axonen in der neuronalen Kultur vs. Dendriten in der gleichen Kultur die folgenden Schritte durch.
- Verwenden eines calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff für Calcium - Bildgebung , wie in der Tabelle der Materialien / Reagenzien und in 1.5) mit einem Muster versehen 1D Kultur auf dünnen (170 & mgr; m) beschrieben, lang (10 mm) Linien. Calcium-empfindlichen Farbstoff wird auf die Kultur angewendet werden, und für 45 Minuten inkubiert. Der Farbstoff wird durch das Ersetzen mit einer neuen Aufzeichnungslösung gewaschen werden.
- Das Netzwerkbevölkerungsstatistik der direkten Reaktion auf eine elektrische Stimulation zu erzielen, ohne die Wirkung der synaptischen Übertragung. Zu tun , so gelten, die eine Kombination von 40 & mgr; M Bicucullin, die blockieren die hemmende Wirkung von Gamma-Aminobuttersäure-A (GABA A) -Rezeptoren, 10 uM 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) die α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) und Kainat-Rezeptoren und 20 & mgr; M von (2R) -Amino-5-phosphonovale zu blockierenric Säure (APV), die die Blöcke N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) -Rezeptoren. Die Blocker wird auf die Aufzeichnungslösung zugesetzt werden.
- Anwenden eine Rechteckimpuls, wie in 2.1 und 2.3 mit unterschiedlichen Zeitdauern zwischen 100 & mgr; s und 4 ms beschrieben. Das Signal kann auf dem Oszilloskop beobachtet werden.
- Verwenden, um ein Fluoreszenzmikroskop mit einem Bildakquisitionsprogramm (siehe 1.5), die Intensität der Calciumtransienten an mehreren ROIs zu überwachen, die jeweils ein paar hundert Neuronen enthalten. Acquire Bilder, die eine sensitive EMCCD Kamera (siehe Materialien Liste) verwendet wird, fähig ist, eine Bilderfassungsrate von mindestens 20 Bildern pro Sekunde. Die Änderung der Lichtintensität ist auf die Menge der Neuronen proportional, die stimuliert wurden. Schätzen, den Anteil der stimulierten Neuronen die relative Intensitätsänderung verwendet wird.
- Für jede Impulsdauer (100 & mgr; s bis 4 ms), um die Amplitude der Spannung an die Elektroden angelegt, verändert bei einer Spannung ausgehend, wo keine Änderung in der Intensität gesehen wird (einige Volt), the Spannung, wo die Änderungen in der Intensität aufgrund der angelegten Spannung gesättigt sind (bis 22 V bis zu ±).
HINWEIS: Die Intensitätsänderung als kumulatives Gaussian 5 in Bezug auf die angelegte Spannung für die Stimulation für jede Zeitdauer des Spannungsimpulses verteilt wird. - Fit eine kumulative Gaußschen Verteilung für die Intensität gegenüber der angelegten Spannung für jede Dauer und extrahiert die Gaußsche Mittelwert aus dieser Passform.
HINWEIS: Dieser Mittelwert ist die repräsentative Spannung, auf die die Neuronen reagiert. - Am Ende dieses Prozesses für jede Stimulationsdauer Spannung eines Mittelwert erhalten, auf die die Neuronen reagiert. Verwenden diese Paare von Dauer und Stärke der Stärke-Dauer - Kurven zu zeichnen (siehe Abbildung 7).
das elektrische Feld zu berechnen. Verwenden einer der Elektroden als Referenzelektrode. Messung des elektrischen Feldes mit unterschiedlichen Pulsdauern zwischen 100 & mgr; s bis 4 ms (siehe 5B für ein Beispiel von 100 & mgr; s Impulsdauer) , um zu überprüfen , dass das Feld im Bereich von stimulierenden Dauern homogen ist. 3. Magnetische Stimulation der Kulturen
Hinweis: Die Grundeinrichtung für magnetische Stimulation wird in Figur 2 gezeigt. Oben rechts wird gezeigtein invertiertes Fluoreszenzmikroskop, das Bild mit calciumsensitiven Farbstoffen in den Neuronen verwendet wird. Die Magnetspule (blaue Kreise) ist etwa 5 mm konzentrisch über einer neuronalen Ring Kultur, (blue outline) positioniert ist. Eine Aufnehmerspule (roter Kreis) auf dem Umfang der Petrischale überwacht die Spannung, die durch den magnetischen Impuls induziert. Links oben ist die gemessene Dynamik der magnetische Stimulator (MS) Spule mit einer Kondensatorspannung Last von 5.000 kV gezeigt, wie aus der Aufnehmerspule integriert. Das induzierte elektrische Feld (für einen Ringradius von 14 mm berechnet) wird in grün dargestellt, während das Magnetfeld in blau dargestellt. Auf der Unterseite sind die Bilder der neuronalen Kultur gezeigt. Unten links ist ein Hellfeldbild eines strukturierten 24 mm Deckglas. Die weißen Flächen sind die Neuronen. Die fotografierten Muster bestehen aus konzentrischen Ring Kulturen mit unterschiedlichen Radien. An der rechten unteren Ecke ist ein Zoom auf ein kurzes Segment der Ringe, die zeigen einzelne Neuronen. Für eine Skala, wid die Ringeth ist etwa 200 um.
- Wächst die Neuronen in einer kreisförmigen Ringstruktur (geätzt, wie in 1.2.5 beschrieben) für 1D-Kultur Stimulation. Verwenden einen calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff für Calcium-Bildgebung mit einer 1D-Kultur (wie in Abschnitt 1.5 beschrieben) strukturiert auf dünnem (170 & mgr; m), lang (10 mm) Linien.
- Verwenden, um eine kreisförmige Magnetspule und positioniert, um eine Petrischale mit ca. 5 mm unter und konzentrisch zu der Spule. Verwenden , um eine kundenspezifische Spule von ca. 30 mm (Innendurchmesser, 46 mm Außendurchmesser) Spule mit einer Induktivität von L = 90 mH , angetrieben durch einen hausgemachten oder kommerziell MS geladen mit einer maximalen Spannung von 5 kV.
- Entladung eine hohe Spannung und Strom durch eine leitende Spule eine Hochstromhochspannungsschalter magnetisch neuronalen Kulturen zu stimulieren. Magnetischer Stimulator (MS) in 21 unter Verwendung große Kondensatoren, in der Größenordnung von 100 mF, wie beschrieben , aufgebaut werden , um eine hohe Spannung von 1 zu erhalten - 5 kV. Alternativ verwenden Sie einen im Handelverfügbar MS (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien).
HINWEIS: Verwenden einer 0,254 mm dick und 6,35 mm breit polyesterbeschichteten rechteckigen Kupferdraht 21 mit einer hausgemachten Spule herzustellen. Schalten Drähte auf Maß Rahmen, isoliert mit Glasfasern und gossenen Epoxy (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Alternativ verwenden Sie handelsübliche Spulen (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien).
- Verwenden Sie rotierende magnetische Felder in 2D Kulturen anregen.
- Verwenden Sie nun die rotierenden Magnetfelder 2D-Kulturen zu stimulieren. Feuer die TMS ohne Kultur in der Schale, mit unterschiedlicher Intensität, mit den Intensitäten der lineare Korrelation der Spule Lese zu zeigen.
- Als nächstes, während sie mit einer neuronalen Kultur Kalzium Transienten Aufzeichnung starten Sie die TMS Brennen bei Intensitäten erhöht wird, während beide Transienten Calcium Aufnahme und die Spule. Zunächst Netzwerk platzt so groß Kalzium Transienten beobachtet, shoIch kann nicht mit Pick-up-Spule TMS-Spikes synchronisieren. Fortsetzung der Intensität zu erhöhen, irgendwann beginnen die Kalzium-Transienten mit den TMS-Spikes synchronisiert werden. Alternativ oder zusätzlich, nach dem Erreichen einer synchronisierten Antwort, beginnen Sie, die Intensitäten zu verringern, bis die Synchronisation abgeschafft wird, um die TMS-Schwelle zu bestimmen.
HINWEIS: Die Bedingungen sollten für jede der Setups streng fixiert werden, wobei die genaue Lautstärke jedes Mal, die gleichen Schiffe und exakte Spulenpositionen und Ausrichtungen verwendet werden.- Montieren Sie die Aufnahmespule auf der Unterseite des Aufzeichnungsbeckens, so dass sie in einer Ebene parallel zur neuronalen Kultur und in einer festen Position in Bezug auf die Kultur ist.
HINWEIS: Dies stellt sicher, dass die Abhängigkeit der Positionierung der Aufnahmespule in Bezug auf den Magneten der Position der Kultur treu ist und dass jegliche Abweichungen bei der Positionierung bei den Aufnahmespulen-Messungen vernachlässigbar sind.- Verwenden Sie zwei unabhängige Spulen, die sindpositioniert senkrecht zueinander sind (8B) eine sich drehende magnetische und induzierte elektrische Feld zu erzeugen. Schließen Sie jede Spule ihren eigenen MS. Sicherstellen , dass die Stimulatoren Ähnliche Ströme bei einer Phasenverzögerung von 90 Grad (10A) auszustoßen, in einem rotierendes Magnetfeld führt , die bei einem maximalen Feld von ~ 270 V / m (10B) um 270 Grad von dem realen Raum abtastet.
- Platzieren Sie die neuronale Kultur innerhalb eines sphärischen Glasbehälters mit der externen Aufzeichnungslösung gefüllt (EM).
- Überwachen Stimulation (Änderung der Fluoreszenzintensität der Neuronen) mit der Kamera, wie in Schritt 2.4.4 beschrieben.
- Im Fall der Kreuzspulen (8B), Anordnung der Aufnahmespule parallel und in einem bestimmten Abstand unterhalb der neuronalen Kultur. diese Konfiguration während der gesamten Experimente sorgfältig pflegen.
- Montieren Sie die Aufnahmespule auf der Unterseite des Aufzeichnungsbeckens, so dass sie in einer Ebene parallel zur neuronalen Kultur und in einer festen Position in Bezug auf die Kultur ist.
- Berechnen analytisch das elektrische Feld für 1D- Configuration von E max = k 1 Br, wobei E max die maximale Amplitude des induzierten elektrischen Feldes und wird entlang der Tangente der Ringe mit dem Radius r gerichtet. B ist die Amplitude des magnetischen Impulses und k 1 ist ein dimensions Proportionalitätskonstante , die mit der Aufnahmespule (8A) gemessen werden kann.
- Verwenden Sie ein numerisches Simulationspaket (Materialliste) , um numerisch das elektrische Feld 21 zu simulieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das dargestellte Protokoll ermöglicht eine einfache Strukturierung von neuronalen Kulturen. Wenn es mit mehreren Methoden kombiniert wird, die wir für die Stimulation entwickelt haben, ermöglicht es, Messungen von einigen intrinsischen Neuroneigenschaften wie Chronaxie und Rheobase 5 durchzuführen, um die Eigenschaften von gesunden und kranken Neuronen zu vergleichen, um optimale Wege zu finden, um Kulturen als Funktion von zu stimulieren Ihre Struktur und viele neuere Ansätze. In den folgenden Figuren werden einige Beispiele vorgestellt.
Abbildung 3 zeigt die 1D gemusterte Konfigurationen, die in die Bioabweisungsschicht eingeätzt werden. Dünnlinien von etwa 170 μm Breite sind typischerweise eingeschrieben, die beispielsweise konzentrische Ringe mit variierenden Radien ( Fig. 3A ) oder parallele Linien sein können, typischerweise ~ 11 mm lang ( Fig. 3B ).
Die obere Tafel von Fig. 4 zeigt ein typisches Bild der Fluoreszenzaktivität in der Kultur, genommen mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) und zeigt ein Bild von fluoreszenzmarkierten. Deutsch:. Englisch: v3.espacenet.com/textdoc? DB = EPODOC & ... PN = Neuronen in einer 2D-Kultur In diesem Beispiel werden drei verschiedene ROIs gezeigt, die in schwarz, grün und rot markiert sind. In den unteren Tafeln von Abbildung 4 sind integrierte Fluoreszenzintensitätsspuren dargestellt, die in diesen drei verschiedenen ROIs gemessen werden (Spuren sind in der entsprechenden Farbe Der ROIs) .Die Inset zeigt, dass innerhalb der 200 ms Auflösung der Frame-Erfassungszeit, bei der diese besonderen Daten aufgenommen wurden, alle Neuronen in den drei verschiedenen ROIs gleichzeitig platzen.Die Grundvorrichtung, die für die Stimulation durch ein unidirektionales, konstantes elektrisches Feld verwendet wird, ist in Fig. 5A gezeigt . Die Elektrodendrähte werden in das Aufzeichnungsmedium eingetaucht, etwa 1 mm über der neuronalen Kultur.Die Grundimpulsform für die elektrische Stimulation verwendet wird in 5B gezeigt. Wenn dieser Spannungsimpuls angelegt wird es erzeugt ein konstantes elektrisches Feld, das um 180 ° nach der Hälfte des Zyklus seine Ausrichtung kippt. Die Änderung in der Feldrichtung nach einem halben Zyklus wird verwendet, Elektrolyse und Schäden an den Elektroden zu vermeiden. Typische Spannungen, die an die Elektroden angelegt sind, ± 22 V, und die typische Impulsdauer für die Stimulation von 2D-Kulturen ist in der Größenordnung von 100 bis 500 & mgr; s.
Um zu steuern, für jede Anisotropie in dem Wachstum von Neuriten, überprüften wir, dass die Stimulation von 2D-Kulturen isotrop ist. Durch manuelle bei 15 ° Auflösung der Elektroden in allen 360 ° drehen (Figur 5C) ist zu sehen , dass es keine Präferenz der Orientierung für die Stimulation. Jede Farbe in Figur 5C stellt die Stimulation einer anderen Kultur. Der Abstand vom Ursprung stellt den minimal michRation, die für die Stimulation mit einer konstanten Amplitude. Es ist offensichtlich, dass in guter Näherung, 2D-Kulturen keine bevorzugte Orientierung für die elektrische Stimulation haben.
Da das einzelne Paar von Elektroden in mit einer definierten Richtung für das Feld begrenzt ist (wenn es umgedreht werden kann), haben wir eine Vorrichtung zur elektrischen Stimulation mit zwei Paaren von Elektroden (6A) entwickelt. Eine schematische Darstellung der Kultur (grau kreisförmigen Hintergrund, dunkle Flecken sind die Zellkörper) und der Elektroden (parallel dicke Linien) ist in 6B gezeigt. Wenn die Wellenformen, wie Blau und Grün - Einsätze in 6B gezeigt, sind Cosinus- und Sinuswellen und werden gemeinsam dann ein rotierendes E Vektorfeld erzeugt wird , angewandt. Wenn die Spannungsimpulse quadratisch sind, haben unterschiedliche Amplituden und weisen Null-Phasenverschiebung zwischen ihnen dann werden sie durch den r bestimmt einen konstanten Feld mit der gewünschten Ausrichtung schaffenelative Amplitude zwischen den beiden Paaren von Elektroden. Dieser elektrische Dreh ist eine offensichtliche Verbesserung gegenüber der manuellen, mechanischen Drehung , die verwendet wurde , um die Winkelverteilung von Stimulationsstärken in 5C zu erhalten. Natürlich, wie 6C zeigt, ist es auch möglich , diese Konfiguration zu verwenden , nur eine feste Richtung zu erregen, die möglicherweise als eine Kontrolle, durch nur ein Elektrodenpaar aktiviert wird .
Diese Konfigurationen wurden verwendet, 2D neuronalen Kulturen entweder mit einem Drehfeld oder einem Festwinkel-Bereich, mit den gleichen quadratischer Mittelwert (RMS) Spannung zu erregen, und dann die Impulsdauer zu vergleichen, notwendig, um die Kultur zu erregen, wenn die Amplitude festgelegt ist. Wir fanden, dass, wenn ein rotierendes elektrisches Feld mit einer konstanten Amplitude von ± 22 V, eine durchschnittliche Dauer von 150 ± 14 & mgr; s verwendet wurde, benötigt Anregung zu erreichen, während sie mit einer einzigen Richtung elektrisches Feld eine durchschnittliche Dauer vonEs wurden 290 ± 30 μs benötigt. Das Verhältnis zwischen den für die Anregung der Kultur benötigten Dauern mit einem Rotations- und einem Feld mit festem Winkel beträgt daher 0,53 ± 0,02.
Da in einer 2D-Kultur die Axone sich in alle Richtungen erstrecken, kann das rotierende Feld viele der Axone anregen. Im Gegensatz dazu sind mit dem einzigen Orientierungsfeld nur wenige Axone in diesem spezifischen Winkel orientiert und eine axonale Erregung wird nicht erreicht. Wenn die Dauer erhöht ist, besteht die Möglichkeit, auch andere Teile des Neurons zu erregen, insbesondere die Dendriten. Dies wird im Folgenden weiter beschrieben, um die Chronaxie-Messungen zu beschreiben. Die Tatsache, dass viel kürzere Dauern für die Erregung der gleichen Kultur bei der Verwendung eines rotierenden Feldes benötigt werden, ist von großer Bedeutung bei der Verwendung von externen Feldern für die Hirnstimulation, da es oft technische Einschränkungen für die Pulsdauern gibt.
7 gezeigt . In Fig. 7A wird ein 1D-getrenntes Netzwerk mit dem elektrischen Feld entweder entlang der Linie der Kultur (bei 0º für die axonale Stimulation) oder senkrecht zur Linie der Kultur (bei 90º für die dendritische Stimulation) durch zwei Paare von Elektroden stimuliert. Wenn die Spannung erhöht wird, werden mehr Neuronen angeregt, und dies spiegelt sich in der Grippe widerorescence Intensität, die zu der Anzahl von Neuronen stimuliert proportional ist (siehe 7B). Zunehmende Spannungsamplituden verwendet werden, um nach und nach der gesamten Kultur zu anregen. Jedes Neuron hat eine minimale Schwellwertspannung (für eine bestimmte Pulsdauer), die darauf reagieren wird, und durch das Gesetz der großen Zahlen, die Verteilung dieser Schwellenwerte wird erwartet Gaussian zu sein. Wenn wir also auf der Anzahl der Neuronen suchen , die sie gegen die angelegte Spannung reagiert und plotten, wird die Verteilung eine kumulative Gauß - Verteilung sein, die eine Fehlerfunktion (erf) 5. Die Anzahl der Neuronen , die auf eine bestimmte Amplitude des elektrischen Feldes reagieren , hat etwa eine Gaußsche Verteilung, und daher wird die Fluoreszenz auch durch seine integrale beschrieben - eine Fehlerfunktion der Amplitude des Stimulationsfeldes (Figur 7C).
7C wird verwendet , um EXtract einen Parameter, die Erwartung (Mittelwert) der Verteilung. Dies geschieht durch eine kumulative Gaußsche Verteilung und erhält die beste Passform. Diese Erwartung ist die angelegte Spannung, auf die 50% der Zellen antworten werden. Dieser Vorgang wird für mehrere Pulsdauern (von 100 μs bis 4 ms) wiederholt. Die mittlere Spannung, auf die die Kultur reagiert, ist gegen die Pulsdauer aufgetragen, um die Stärke-Duration-Kurve zu erhalten. Es wurden zwei Sätze von Messungen durchgeführt. Im ersten war das Feld parallel zum Muster, und im zweiten war es senkrecht dazu. Es wurde zuvor gezeigt, 15 , 23 , dass die Axone mit dem Muster übereinstimmen, während Dendriten in alle Richtungen wachsen. Dies ergibt zwei verschiedene Stärke-Durations-Kurven, die sehr nützlich sind, um einen deutlichen Unterschied zwischen der axonalen und dendritischen Erregung zu erhalten. Eine vollständige Trennung zu dendritischen und axonalen Beiträgen wird durch die bekannte Tatsache erreicht, dass das Axonal Zeitkonstante für die Anregung ist viel kürzer als dendritische die 2, 3, 4.
Die Stärke-Dauer-Kurven sind dann fit in der Chronaxie Zerfall Gleichung 
, Wobei V rh ist die Rheobase Spannung und C die Chronaxie. Bei Pulsdauern von t <1 ms ist es die Axone, die erregt werden, erste und bewirken, dass das Neuron feuern, einen niedrigeren Wert für die Anregungsspannung in der Stärke-Dauer-Kurve hat. Axonalen Chronaxie wurde berechnet 110 & mgr; s sein. In auffälligem Gegensatz dazu für die Anregung bei langen Laufzeiten (t> 1 ms) das dendritische Fach ist die Quelle der Erregung für das Neuron mit einem dendritischen Chronaxie bei 900 & mgr; s berechnet.
Die zugrunde liegenden Prinzipien Stimulation von 2D- und 1D-Kulturen mit einem circular Spule ist in Abbildung 8 beschrieben. Um ein besseres Verständnis der physikalischen Lage, numerische Simulationen der magnetischen und elektrischen Felder induzierten erhalten werden unter Verwendung des COMSOL Paket erzeugt. Zur Stimulierung 1D Kulturen eine kreisförmige Magnetspule verwendet wird, konzentrisch über der Petrischale. Neurone sind in kreisförmigen Ringen auf einem runden Deckglas gezüchtet, die in der Petrischale für die Aufnahme platziert wird. In diesem Fall wird das induzierte elektrische Feld kann analytisch berechnet werden und ist gleich E max = k 1 Br, wobei E max die maximale Amplitude des induzierten elektrischen Feldes und wird entlang der Tangente der Ringe mit dem Radius r gerichtet. B ist die Amplitude des magnetischen Impuls und k 1 ist ein dimensions Proportionalitätskonstante , die mit einer Aufnehmerspule gemessen werden kann.
Die COMSOL numerische Berechnung des Magnetfeldes created durch die Spule in der 1D - Kultur wird in der Deckelplatte von 8A (rot Stromlinien) gezeigt ist . In der Bodenplatte von 8A wird die Berechnung für das induzierte elektrische Feld dargestellt. Stimulation einer 2D - Kultur mit einer gekreuzten Spulenkonfiguration ist in 8B gezeigt. Zur Stimulierung 2D Kulturen eine Querspule verwendet wurde, die magnetische Felder erzeugen dreht, positioniert mit einer 2D-neuronaler Kultur darin, in einem kugelförmigen Glasbehälter gegeben, der mit Aufzeichnungsmedium (EM) gefüllt ist. In diesem Fall wird das induzierte elektrische Feld nicht mehr analytisch berechnet werden. Die Kreuzspule ist im Innern der beiden Spulen und das Deckglases Unterstützung der 2D - Kultur in dem Boden des Behälters platziert mit dem kugelförmigen Behälter in der oberen Platte von Figur 8B dargestellt ist . Für Skala, ist das Innendurchmesser der inneren Spule 65 mm. Numerische Simulationen mit COMSOL mit dem Eddy Currents 3D-Modell sind in der Bodenplatte gezeigt,Darstellung des elektrischen Feldes in der inneren Oberfläche des kugelförmigen Behälters induziert. Eine Hellfeldmikroskopische Aufnahme einer Deckglas mit typischen 1D neuronalen Kulturen für die Stimulation verwendet wird in 8C gezeigt. Die weißen Linien zeigen Neuronen auf der strukturierten Linien, die sowohl tangential ausgerichtet sind und sich radial zum experimentellen Vergleich und die Kontrolle über die Wirkung der Direktionalität.
Geometrie der 1D-Kultur spielt eine große Rolle bei der Bestimmung, ob eine Kultur, in Reaktion auf die magnetische Stimulation ausgelöst wird. Nur 22% der 1D Ringkulturen reagierten auf magnetische Stimulation. Die erfolgreiche Anregungsrate hing stark von der linearen Länge der Kultur, und wie 9A zeigt, mehr als 60% der Kulturen , die länger als 80 mm reagieren auf magnetische Stimulation sind. Dies bedeutet, dass besondere Bedingungen für die magnetische Reaktion erforderlich sind. Um dies zu untersuchen geometrische Abhängigkeit Kulturen were in Konfigurationen aufgewachsen , die Teile von Ringen sind , - den gleichen Radius, aber unterschiedliche Längen , indem sie auf Kreisbögen Strukturieren anstatt auf Vollkreis (siehe Abbildung 8C)
Eine umfassende Untersuchung der Magnetfeld Schwellenwerte als Funktion des Radius von 1D Ring Kulturen ist in Figur 9B gezeigt. Weißen Kreise stellen experimentelle Messungen von Stimulationsschwellen, während die Farbcodierung der berechnete Wahrscheinlichkeit bezeichnet eine Erregungsschwelle zu messen. Ein Stimulationsschwelle wird wie der schwächste Bereich definiert, der nach wie vor eine Antwort für eine gegebene neuronale Kultur hervorruft.
9B betont die Tendenz , die größeren Ringe untere Stimulationsschwellen haben, mit einer klaren inversen Korrelation zwischen dem Radius der Ringe und der Stimulationsschwelle. Beispielsweise reagiert der Mittelwert 14 mm Ring MagnWDV-Impulse mit einer Amplitude von 1,5 T, während der mittlere Ring 7 mm bis 3 T oder mehr reagiert nur. Dies wird aus der theoretischen Berechnung des induzierten elektrischen Feldes zu erwarten, die dargestellt wird als die farbcodierten Wahrscheinlichkeit vorhergesagt abzufeuern. Tatsächlich ist das elektrische Feld induziert durch 3T auf einem Radius von 7 mm gleich demjenigen von 1,5 T bei der doppelten Radius induziert. Zusammenfassend ist die durchschnittliche elektrische Feldschwelle 301 ± 128 (Standardabweichung) V / m, unabhängig von dem Radius der Ring Kulturen.
Im Gegensatz zu der einzelnen kreisförmigen Spule, die nicht die Reaktion in 2D Kulturen hervorrufen könnte, 15 von 30 2D-Kulturen, die durch Drehfeld magnetische Stimulation stimuliert wurden mit Bersten neuronale Erregung reagiert. Die beiden voneinander unabhängigen Spulen , die senkrecht zueinander sind (8B) angeordnet sind , erzeugen magnetische und elektrische Felder induziert drehen. Jede Spule ist mit einem eigenen MS, die beide discharge bei einer Phasenverzögerung von 90 Grad Ähnliche Ströme. Die Amplitude des elektrischen Feldes , die von jedem der beiden Spulen in der Kreuzspulenkonfiguration ist in 10A, und die gleichen Spuren dargestellt in 10B durch eine polare Darstellung der Richtung und die Amplitude des überlagerten elektrischen Feldes der beiden Spulen induzierte geplottet . Das sich ergebende induzierte elektrische Feld abtastet 270 Grad von dem realen Raum bei einem maximalen Feld von ~ 270 V / m.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der zur elektrischen Stimulation von Neuronal Kulturen verwendet Einrichtung. Das gewünschte Signal wird durch einen Signalgenerator mit zwei Ausgängen erzeugt, die keinen gemeinsamen Nenner haben. Diese Signale werden verstärkt, um eine Ausgangsspannung zu verzichten 30 V bis ± Die elektrischen Signale werden dann durch zwei getrennte Paare von Elektroden zugeführt werden, eine neuronales Kultur in tw stimulierendeno orthogonal und unabhängige Richtungen. Die Stimulation von Neuronen kann durch Calcium Farbstoffe betrachtet und überwacht werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der für Magnetstimulation neuronaler Kulturen verwenden Einstellvorgänge. A. Oben wird die Magnetspule (blaue Kreise) dargestellt, die 5 mm konzentrisch über der neuronalen Ring Kultur in einer Petrischale (blau outline) angeordnet befindet. Eine Aufnehmerspule (roter Kreis) auf dem Umfang der Schale positioniert Petri misst die Spannung durch den magnetischen Impuls induziert. Im Grunde ist die gemessene Dynamik der magnetischen Stimulators Spule gezeigt (eine MS Kondensatorspannung Last von 5000 kV verwendet wird), wie es aus der Aufnahmespule integriert. Induzierte elektrische Feld (calculated für einen Ringradius von 14 mm) wird in grün dargestellt , während das Magnetfeld in blauen B. ein inverses Mikroskop Bilder fluoreszierender Farbstoffe empfindlich auf Calciumtransienten von Neuronen reagieren auf magnetische Impulse dargestellt ist. C. Neurons auf einem Muster von konzentrischen Ringen gewachsen, für eine effektive Stimulation durch den Ring Magnetischer Stimulator verwendet. D. Hellfeld - Mikroskop Bild von Neuronen in einer Zeile des Musters gewachsen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Beispiele von Mustern der Kulturen 1D Neuronal Verwendeten für Orientieren des elektrischen Feldes mit der Richtung des axonalen Wachstums. A. Kreismuster für die kreisförmige Magnetspule verwendet wird , wenn die induzierten ele ctric Bereich hat eine kreisförmige Ausrichtung. B. Linienmuster verwendet werden , wenn das induzierte oder direkte elektrische Feld eine einzige Orientierung hat.
Abbildung 4: Beispiel Spuren von Calciumtransienten Abgebildete Während synchrones Netzwerk platzt. A. Ein Bild von Neuronen , die mit einem Calcium - Farbstoff zum Experiment vorherigen gefärbt wurden. B. Spuren von Intensität gegenüber der Zeit des ROIs in A mit der Farbe der Spur , die Farbe der Grenze des ROI in A. Einer große Zunahme der Intensität repräsentierte synchronisiert innerhalb der drei ROIs repräsentiert ein Netzwerk burst. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
54357fig5.jpg“/>
Abbildung 5: Basis - Setup für elektrische Stimulation, Ein Paar paralleler Bad Elektroden zu bestimmen , die 2D - Kulturen haben keine bevorzugte Ausrichtung der Elektrostimulation. A. Vorrichtung zur Stimulation Kultur verwendet. Das elektrische Feld wird durch Anlegen einer Spannung an die Platindrahtelektroden erzeugt wird. Der Abstand zwischen den beiden Drähten beträgt 13 mm. B. Ein Beispiel eines Spannungssignal an den Elektroden hilft bei der Elektrolyse der Aufzeichnungslösung zu verhindern die bipolare Form des Impulses auf den Elektroden in A. angewandt werden. C. Wenn eine 2D - Kultur in verschiedenen Drehungen der Elektroden anregend, gibt es Isotropie der neuronalen Antwort. D. Ein Beispiel der elektrischen Feldmessung unter Verwendung der Sonde in Schritt 2.2 beschrieben. Das elektrische Feld gleichförmig ist, um einen Fehler von bis zu 10%. Diese Zahl wurde von 5 modifiziert.upload / 54357 / 54357fig5large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Elektrische Stimulation mit zwei Paaren von Elektroden Ermöglicht Rotation des elektrischen Feldes und für Stimulation in jedem gewünschten Winkel. A. Um kompliziertere Formen des elektrischen Feldes, zwei unabhängige Elektrodenpaar nötig sind , um zu erzeugen. B. Anwenden eines Kosinus - Spannung förmigen Impuls an eine Elektrode und eine Sinus - Impuls an die zweite Elektrode erzeugt ein rotierendes elektrisches Feld mit konstanter Amplitude. C. Anlegen einer Rechteckspannungsimpuls an ein Paar der Elektroden eine unidirektionale gleichmäßiges elektrisches Feld erzeugt. Diese Zahl wurde von 5 modifiziert. Bitte clIck hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Netzwerkunterbrechung durch Blockierung von synaptischen Eingängen (wie in 2.4.2 beschrieben) Ermöglicht die Beobachtung der Gesamtbevölkerung einzelner Zellen, die durch ein gegebenes elektrisches Feld stimuliert werden. A. Durch Anlegen unterschiedlicher Amplituden von Spannungsimpulsen an die beiden Elektrodenpaare kann das elektrische Feld auf jeden Winkel ausgerichtet werden, ohne dass man die Kultur manuell drehen muss. B. Beispielaufzeichnungen von Calcium-Transienten mit elektrischer Stimulation bei verschiedenen angelegten Spannungen. Es werden vier Spuren gezeigt, die leicht vertikal verschoben werden, um das Betrachten zu ermöglichen. Spannungswerte werden unter den blauen Spuren geschrieben. C. Bei Anwendung einer konstanten Dauer des elektrischen Feldes hat die Anzahl der Neuronen, die in Reaktion auf das elektrische Feld feuern, eine kumulative distRippenfunktion (CDF), die eine kumulative Gaußsche Verteilung (oder eine erf-Funktion) in Abhängigkeit von der Amplitude der Spannung (die proportional zur Feldstärke ist) ist. D. Ein Beispiel für eine Stärke-Duration-Kurve, die bei Verwendung dieses Protokolls erhalten wird. Diese Zahl wurde von 5 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Magnetische Spulenkonfiguration und Berechnung des induzierten elektrischen Feldes A. Oben ist eine Kreisspule (blaue Kreise) 5 mm über eindimensionale neuronale Ringkulturen (blaue Scheibe) positioniert. Die Ringe sind parallel zu und konzentrisch mit der Spule, die einen magnetischen Puls erzeugt, der entlang der roten Linien orientiert ist. Durch Faradayschen Gesetz, das induzierte elektrische Feld liegt in Flugzeugen, die mit ihr entlang Ringe konzentrisch zu der Spule parallel sind. Im Grunde ist ein horizontaler Querschnitt entlang der Ebene des Rings Kulturen. Der relative Wert des elektrischen Feldes ist farbcodiert, mit Richtung, die durch Pfeile dargestellt. Größere Ringe umschließen einen größeren Bereich des Flusses und damit das elektrische Feld induziert dort höher ist. B. Bild der Kreuzspule Magnetischer Stimulator (oben) und einer Simulation des elektrischen Feldes , das durch sie induziert wird. C. Muster verwendete Neuronen zu wachsen , die entweder mit einem kreisförmigen elektrischen Feld oder einem radialen elektrischen Feld angeregt werden können. Diese Zahl wurde von 21 modifiziert, 28. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
9" src = "/ files / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg" />
Abbildung 9: Antwort von Ring Kulturen zu Magnetic Field. A. Die Erfolgsrate der Stimulation wächst mit dem Radius der Kultur. Die Fehlerbalken stellen die Standardfehler (SE). B. Die Beziehung zwischen der Ringgröße und der Magnetfeldstärke dargestellt. Die Wahrscheinlichkeit, die Kultur zu begeistern ist farblich codiert. Tatsächlich erfolgreichsten Erregungen der Kulturen liegen in der Überlappung zwischen dem experimentell zugänglichen Phasenraum (weißes Rechteck) und dem hohen Wahrscheinlichkeit Bereich (rot). Diese Zahl wurde von 21 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 10: rotierende Magnetfeld - Setup - Feld. </ Strong> A. Um ein rotierendes elektrisches Feld zu induzieren, wenn es mit dem Kreuzspulen-Magnetstimulator stimuliert wird, wird eine Phasenverschiebung von 90 Grad zwischen den beiden Spulen benötigt. Dargestellt ist das elektrische Feld, das in einer Aufnahmespule induziert wird, die auf zwei benachbarten Flügeln der Kleeblattspule positioniert ist. Die Spulen wurden separat von 2 kommerziellen Stimulatoren angetrieben. B. Eine Rekonstruktion unter Verwendung der in A dargestellten Kurven der resultierenden elektrischen Feldamplitude und -richtung während eines Pulses der Kleeblattspule. Diese Zahl wurde von 21 , 28 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1D Musterung ist ein wichtiges Werkzeug, das für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann. Zum Beispiel haben wir 1D Musterung für die Erstellung von Logikgattern aus neuronalen Kulturen 29 und in jüngerer Zeit zu messen , die Chronaxie und die Rheobase von Ratten - Hippocampus - Neuronen 5, und die Verlangsamung der Signalausbreitungsgeschwindigkeit des Brennen Aktivität in Down - Syndrom - Hippocampus - Neuronen im Vergleich zu dem verwendeten Wildtyp (WT) Hippocampus - Neuronen 27. Das vorgeschlagene Protokoll für 1D Musterung ist robust und es ist leicht, jedes gewünschte Muster zu bilden. Wir schlagen vor, die 1D-Kultur zu beobachten, bevor Messungen Kenntnis von einem möglichen Abschaltungen des Netzes zu sein, die ihre Funktion beeinträchtigen können.
Chemische Strukturierung von neuronalen Konfigurationen hat eine lange Geschichte 30, 31, 32. Wir fanden, dass unser Ansatz Ausbeutes um ähnliche Ergebnisse zu chemischer Strukturierung, doch sind sie robuster und einfacher zu erreichen. Vor kurzem hat die Option für mikrofluidische Strukturierung von Neuronen hat eine interessante Alternative zu dem Ansatz werden wir anbieten, mit vergleichbarer Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit 33, 34. Der Mikrofluidik-Ansatz wird in unserem Labor parallel zu dem Ätzverfahren hier beschrieben ist, verwendet.
Wie wir 5 gezeigt, haben 2D - Kulturen keine bevorzugte Ausrichtung und deren Stimulation ist isotrop und hängt nicht von der Orientierung des angelegten Feldes. Kürzere Laufzeiten sind für die Stimulation von 2D-Kulturen erforderlich, wenn das Feld dreht. Im Gegensatz dazu sind 1D Kulturen auf der Ausrichtung des Feldes sehr abhängig. Wenn das Feld mit dem Muster (und somit mit der Richtung des Axon-Wachstums) ausgerichtet ist, ist die Dauer eines fest Amplitude Feldes zur Stimulation benötigte viel kürzer, als wenn das Feld Oriented senkrecht zum Muster. Und falls die Dauer konstant gehalten wird, dann benötigt das Feld, um die Kultur zu erregen ist kleiner, wenn das Feld und Muster parallel sind. Wenn senkrecht stimulierend, muss der Feldpuls viel länger (in der Größenordnung von einer Millisekunde, wenn das Netzwerk nicht angeschlossen ist), und dann vor allem der Dendriten stimuliert werden. Wenn elektrische Felder (entweder direkt oder durch ein Magnetfeld induziert) für Hirnstimulation verwendet werden, ist dies von großer Bedeutung. Wenn der Bereich des Gehirns bekannt zielte Bündel von Axonen haben, können diese Axone durch Orientieren des Feldes in ihre Richtung angeregt werden und dann brauchen weniger Strom oder eine kürzere Dauer des Feldes für die Stimulation. Wenn die Hirnregion gezielt hat Orientierung nicht bevorzugt wird, dann ist ein Drehfeld effizienter für die Stimulation. Wenn Dendriten das Ziel der Stimulation, sind längere Impulse effektiver.
Magnetfelder können neuronale Aktivität stimulieren, wenn ein magnetischer Impuls induces ein elektrisches Feld, das Neuronen anregt. Da zur Zeit erreichbare magnetische Impulse Mikrosekunden Dauer sind, Dendriten, deren Reaktionszeit ist in der Größenordnung von Millisekunden, werden nicht als empfindlich auf magnetische Stimulation erwartet. Im Gegensatz dazu Axone, deren Reaktionszeit schneller ist , ist das Ziel der Stimulation 2, 3. Die Reaktion der Axone elektrische Erregung maximal ist, wenn sie mit dem elektrischen Feld parallel sind und verringert sich, wenn sie es sind , die senkrecht 1, 35; Deshalb bei Magneterregung sind wir bestrebt, Systeme einzurichten, wo das induzierte elektrische Feld auf die gezielte Axone parallel ausrichtet. Wenn daher einen 1D Ring stimulierende, sollte das Feld parallel zu den Axonen ausgerichtet werden, und die Größe des Rings bestimmt den Schwellenwert für die Stimulation. Ähnliches gilt für die direkte Stimulation von Bad Elektroden, eine 2D-Kultur zu stimulieren, eine sich drehende induzierte electric Feld ist viel effizienter.
Die Kombination von Mustern von Neuronen und externer Anregung mit elektrischem oder magnetischem Feld ist eine potente Technik mit vielen möglichen zukünftigen Anwendungen. Chronaxie und Rheobase sowie Schwelle für die Aktivierung und die Aktivierung Ausbreitungsdynamik und Geschwindigkeiten sind alle Parameter, die von einer neuronalen Kultur der intrinsischen Eigenschaften erzählen. Insbesondere therapeutische Behandlungen und die Wirkung von Medikamenten oder pharmakologische Behandlung kann sofort direkt auf die Neuronen getestet werden. Dies würde eine effiziente Erhebung beider Krankheitsmodelle Neuronen und die Protokolle für TMS Stimulation ermöglichen. Auf einer konzeptionellen Richtung, die Fähigkeit, neue Möglichkeiten in Bezug auf die Informationsverarbeitung Aspekte neuronaler Konfigurationen neuronalen Kulturen genau führt zu stimulieren, und es uns ermöglichen, Mikro gedruckte Schaltung vorzustellen, die mit lebenden neuronalen Netzen elektronische Stimulation kombiniert neue Berechnung zur Verfügung zu stellenal Geräte und neuartige Hirnschnittstellenvorrichtungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef und Eitan Reuveny für sehr hilfreiche Diskussionen. Die Autoren danken Ilan Breskin und Jordi Soriano für frühe Versionen der Technologie zu entwickeln. Die Autoren danken Tsvi Tlusty und Jean-Pierre Eckmann für die Hilfe bei den theoretischen Konzepten. Diese Forschung wurde von der Minerva-Stiftung, das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Israel, und Israel Science Foundation Grant 1320-1309 und die Bi-National Science Foundation Grant 2.008.331 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
- Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
- Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
- Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
- Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
- Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
- Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
- Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
- Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
- Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
- Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
- Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
- Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
- Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
- Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
- Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
- Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
- Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
- Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
- Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
- Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).
