Summary
cultures sont un bon Neuronal modèle pour l'étude des techniques nouvelles de stimulation du cerveau par leurs effets sur les neurones individuels ou une population de neurones. Présentés ici sont des méthodes différentes pour la stimulation des cultures de neurones à motifs par un champ électrique produit par des électrodes directement de bain ou induite par un champ magnétique variant dans le temps.
Abstract
Un neurone se déclenche un potentiel d'action lorsque son potentiel de membrane dépasse un certain seuil. Dans l'activité typique du cerveau, cela se produit à la suite d'intrants chimiques à ses synapses. Cependant, les neurones peuvent également être excités par un champ électrique imposé. En particulier, les applications cliniques récentes activent des neurones en créant un champ électrique externe. Il est donc intéressant d'étudier comment le neurone répond au champ extérieur et ce qui cause le potentiel d'action. Heureusement, une application précise et contrôlée d'un champ électrique extérieur est possible pour les cellules neuronales embryonnaires qui sont excisés, dissocié et cultivées dans des cultures. Cela permet à l'enquête sur ces questions dans un système hautement reproductible.
Dans cet article, quelques-unes des techniques utilisées pour l'application contrôlée de champ électrique externe sont passés en revue sur les cultures neuronales. Les réseaux peuvent être soit une dimension, à savoir un motif en lineaR forme ou autorisées à se développer sur tout le plan du substrat, et donc deux dimensions. De plus, l'excitation peut être créé par l'application directe du champ électrique par des électrodes immergées dans le fluide (électrodes de bain) ou en induisant le champ électrique à l'aide de la création à distance d'impulsions magnétiques.
Introduction
L'interaction entre les neurones et les champs électriques externes a des implications fondamentales et des aspects pratiques. Bien qu'il soit connu depuis les temps de Volta qu'un champ électrique appliqué de l'extérieur peut exciter le tissu, les mécanismes responsables de la production d'un potentiel d'action résultant dans les neurones ne commencent qu'à se dévoiler 1 , 2 , 3 , 4 . Cela comprend la recherche de réponses aux questions concernant le mécanisme qui provoque la dépolarisation du potentiel membranaire, le rôle des propriétés membranaires et des canaux ioniques, et même la région dans le neurone qui répond au champ électrique 2 , 5 . Neurostimulation thérapeutique 6 , 7 , 8 , 9 , La mesure de l'interaction dans le cerveau in vivo ajoute une composante importante à cette compréhension, mais elle est entravée par l'imprécision et la faible maîtrise des mesures au sein du crâne. En revanche, les mesures dans les cultures peuvent être facilement réalisées en volume élevé avec une grande précision, une excellente performance signal à bruit et un degré élevé de reproductibilité et de contrôle. En utilisant des cultures, une grande variété de propriétés neuronales du comportement du réseau collectif peut être élucidée 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . De même, on s'attend à ce que ce système bien contrôlé soit très efficace pour élucider le mécanisme par lequel d'autres méthodes de stimulation fonctionnent, par exemple, comment l'ouverture de canal pendant la stimulation optique dans les neurones optogénétiquement actifs 17 , 18 , 19 est responsable de créer un potentiel d'action. Ici, l'accent est mis sur la description du développement et la compréhension des outils qui peuvent exciter efficacement le neurone via un champ électrique externe. Dans cet article, nous décrivons la préparation de cultures hippocampiques bidimensionnelles et unidimensionnelles à motifs, la stimulation utilisant différentes configurations et l'orientation d'un champ électrique directement appliqué par des électrodes de bain et enfin la stimulation de cultures bidimensionnelles et à motifs unidimensionnels par un Champ magnétique variable dans le temps, qui induit un champ électrique5 , 20 , 21 .
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Protocol
Déclaration d'éthique: les procédures concernant le traitement des animaux ont été effectuées conformément aux directives du Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) de l'Institut Weizmann des sciences, et la loi israélienne appropriée. L'Institut Weizmann est accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation du laboratoire international de protection des animaux (AAALAC). Le Institutional Animal Care Weizmann et utilisation Comité a approuvé cette étude, menée avec les neurones hippocampiques.
1. Préparation de deux dimensions (2D) et unidimensionnels (1D) Cultures hippocampiques
- Préparation des cultures pour 2D lamelles.
- Préparer le milieu de plaquage (PM), composée de 0,9 ml minimum médias essentiel (MEM) + 3G, 0,05 ml de sérum de veau foetal (FCS), 0,05 ml de sérum de cheval inactivé à la chaleur (HI HS) et 1 pl de complément B27. Remarque: MEM + 3G contient pour chaque 500 ml de MEM x 1, 1 ml de gentamycine, 5 ml de 100x de L-glutamine stabilisée (voir
- Préparer du tampon borate composée de 1,9 g de borax (tetraborate de sodium décahydraté) dans 200 ml d'eau bidistillée (DDW) (mélange à 60 ° C) et 1,24 g d'acide borique dans 200 ml de DDW. Titrer la solution finale à un pH de 8,5 en utilisant du HCl 1 M. Remarque: La solution finale est de 400 ml 0,1 M tampon borate.
- Immerger des lamelles de verre à 65% d'acide nitrique pendant 2 h. Rinçage trois fois dans DDW, suivi par trois rinçages avec du réactif analytique absolue (ABS AR) dans l'éthanol.
- Passer chaque lamelle brièvement à travers la flamme d'un brûleur Bunsen deux ou trois fois pendant 1 - 2 s, et ensuite laisser à incuber pendant une nuit dans des plaques de 24 puits avec 1 ml de poly-L-lysine solution à 0,01% dilué 1: 5 dans du tampon borate ( 0,1 M, pH 8,4). Ensuite , rincez à DDW trois lamelles fois et repartez avec 1 ml par puits PM dans un incubateur standard 37 ° C, 5% de CO 2 pendant la nuit.
- Préparer le milieu de plaquage (PM), composée de 0,9 ml minimum médias essentiel (MEM) + 3G, 0,05 ml de sérum de veau foetal (FCS), 0,05 ml de sérum de cheval inactivé à la chaleur (HI HS) et 1 pl de complément B27. Remarque: MEM + 3G contient pour chaque 500 ml de MEM x 1, 1 ml de gentamycine, 5 ml de 100x de L-glutamine stabilisée (voir
- Préparation des cultures pour 1D lamelles.
- Clean glass lamelles par immersion dans une solution piranha de base constituée de 75 ml DDW, 25 ml 25% de solution d'ammoniac et 25 ml de 30% de peroxyde d'hydrogène. solution de place avec les lamelles de verre sur une plaque chauffante à environ 50 ° C pendant 30 min, puis sécher les lamelles de verre avec de l'azote.
- Manteau de lamelles d'abord avec une couche mince de chrome (99,999%) de 6 Å d'épaisseur suivie par une couche de 30 Å d'or (99,999%), en utilisant de la vapeur ou de dépôt par pulvérisation cathodique.
- Pour parvenir à une vitesse de pulvérisation de 0,05 à 1 Å / s utiliser une machine de pulvérisation cathodique avec 2 e-faisceaux et un système d'aspiration de 260 l / s avec des tailles de cible 2" et 4" . Utilisez une étape de rotation qui peut aller de 0 - 100 tours par minute (RPM). Utiliser un courant continu (CC) par pulvérisation cathodique puissance de 0 - 750 Watts.
- Utiliser une rotation de 30 tours par minute et d'argon 99,999% pour obtenir le plasma à pression 10 mTorr dans la chambre.
- Faire fonctionner l'alimentation électrique des pistolets de pulvérisation à 40 W de puissance à courant continu de pulvérisation cathodique pour le chrome, conduisant à ~ 0,12 Taux de couverture s Å / et à 10 W DC par pulvérisation cathodique puissance pour l'or, ce qui conduit à ~ 0,28 Å / s.
- Dissoudre 0,1 g de 1-octadécanethiol dans 100 ml d'éthanol ABS AR en utilisant des ultrasons pendant 30 min. Placez les lamelles recouvertes Cr-Au pendant 2 h dans cette solution, puis laver avec de l'éthanol ABS AR et sec avec de l'azote.
- Préparer une solution de 100 ml de phosphate de Dulbecco tamponnée saline (D-PBS) et 3,5 g d'un co-polymère tri-séquencé (voir le tableau des Matériaux / réactifs) par agitation pendant 1 - 2 h à 600-700 tours par minute. Placez dans la solution des lamelles pendant 1 h. avec de l'azote sec des lamelles.
- Gravure mécanique de la configuration désirée en grattant la couche bio-rejet 22. Pour ce faire, en utilisant un traceur à plume, lorsque le stylo est remplacée par une aiguille de gravure. Gratter le motif à travers les couches de métal pour atteindre le verre sous-jacent. Contrôler ce processus par un ordinateur pour obtenir un motif souhaité répliqué. Motifs formés par ce procédé sont démontrent d sur la figure 2 et la figure 3.
- Préparer une couche de bio-compatible de 100 ml de D-PBS, 3,5 g de tri-bloc co-polymère, 35,7 uL / mL de fibronectine et 29 ul / ml de laminine.
- Stériliser les lamelles à la lumière ultra-violet pendant au moins 10 min. Incuber dans la nuit des lamelles de solution bio-compatible préparé.
NOTE: La couche bio-compatible formera que lorsque la couche bio-rejet a été éliminé par attaque à l'étape précédente. - Sur le lavage lendemain deux fois avec des lamelles couvre-P-DBS. Incuber PM dans la nuit des lamelles. Les lamelles couvre sont maintenant prêts pour le placage cellulaire.
- Stériliser les lamelles à la lumière ultra-violet pendant au moins 10 min. Incuber dans la nuit des lamelles de solution bio-compatible préparé.
- Effectuer la dissection selon les procédures standard qui ont été publiées abondamment auparavant 23, 24.
- En bref, l' hippocampe extrait ou cortex d'embryons de rat, généralement au jour E19 ou de souris, généralement au jour E17 23,class = "xref"> 24.
- Cellules Dissocier première en solution de papaïne pour 20 - 30 min, suivie d' une trituration mécanique 24 avec des pipettes en verre dont les pointes sont polies au feu.
NOTE: Si les cellules proviennent de souris génétiquement modifiées ensuite le tissu à partir de chaque embryon doit être maintenue dans un tube de 1,5 ml en matière plastique séparée pendant tout le processus. - Compter les cellules avec du bleu trypan avant l'ensemencement.
NOTE: Pour les animaux génétiquement modifiés le comptage doit être effectué séparément pour chaque embryon. - Pour les cultures 2D, des neurones de souris de semences à 750.000 et les neurones de rat à 850.000 cellules par puits. Pour 1D, des semences à 650.000 cellules par puits. Agiter légèrement la plaque immédiatement après le semis, pour assurer une couverture homogène de la lamelle.
- L'entretien des cultures de neurones.
- Préparer le milieu changeant (CM), composée de (par ml). 0,9 ml de MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 ul de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUDR) avec uridine 100x </ Li>
- Préparer moyen final (FM), composée de (par ml): 0,9 ml MEM + 3G et 0,1 ml HI SH.
- Remplacer PM avec 1-1,5 ml CM après 4 jours in vitro (DIV). A 6 DIV, remplacer 50% de la CM CM avec frais. A DIV 8, changer le milieu à 1,5 ml FM, suivi d'un changement de 50% de FM tous les 2 jours. Après environ une semaine l'activité synchrone spontanée émerge.
- L'imagerie de l'activité spontanée ou évoquée dans les cultures neuronales avec des colorants fluorescents.
- Préparer une solution de colorant fluorescent sensible 50 pg de calcium (voir le tableau des Matériaux / réactifs) dans 50 ul de DMSO (diméthylsulfoxyde).
- Préparer la solution d'enregistrement extracellulaire (EM) contenant (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, CaCl 2 2, MgCl 2 1, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 le saccharose (pH 7,4).
- Incuber la culture neuronale dans 2 mL EM avec 8 ul de la solution de colorant fluorescent sensible au calcium pendant 1 h. Protéger de la lumière et tourner doucement pour assurer homogenDe la teinture aux cellules.
- Remplacez la solution par EM frais avant l'imagerie. L'imagerie fluorescente est démontrée à la figure 4 .
- Image dans un microscope à fluorescence avec des filtres optiques pour l'imagerie par fluorescence de calcium (pic d'excitation à 488 nm, pic d'émission à 520 nm), en utilisant une caméra et un logiciel capable de quantifier l'intensité de toute région d'intérêt (ROI) dans le champ de vision de Le microscope.
2. Stimulation électrique des cultures
REMARQUE: la configuration de base pour la stimulation électrique est illustrée à la figure 1 . Un slip de couverture sur lequel la culture neuronale a été cultivée pendant environ 14 jours est placé dans une boîte de Pétri sous un microscope à fluorescence. L'activité électrique des neurones est imagée en utilisant des colorants sensibles au calcium alors qu'une tension est appliquée via deux paires d'électrodes de bain qui sont positionnées en dehors de la culture. Les électrodes sont guidées parGénérateur ignal dont la sortie est amplifiée par un amplificateur à deux canaux. Réglage de la tension de stimulation est préférée à la commande de courant plus standard 25, 26 parce que les vecteurs de champ électrique sont déterminés directement, permettant ainsi plus simple vecteur et la combinaison. Cela exige un contrôle minutieux de l'uniformité du champ électrique, qui peut être réalisée sur l'ensemble de l'échantillon pour le cas de contrôle de la tension. Lors de l'utilisation des soins de contrôle de tension doivent être prises pour éviter les boucles de masse et l'homogénéité du champ électrique doit être vérifiée (voir 2.2 ci-dessous).
- Pour la stimulation électrique avec un champ électrique homogène en utilisant une paire de fils d'électrodes parallèles.
- Utiliser des électrodes en platine d'une épaisseur de l'ordre de 0,005 « » (127 um). Lorsqu'il est utilisé avec les lamelles 13 mm, en sorte que la distance entre les deux électrodes est d'environ 11 mm, et la position de l'électrodes 1 mm au-dessus de la culture.
NOTE: Pour que le porte-électrode (figures 5A et 6A) utiliser le polytétrafluoroéthylène (PTFE). Percer des trous étroits à travers le PTFE pour insérer les électrodes. Le dispositif doit être supérieure à la solution extracellulaire de sorte que l'extrémité supérieure, où les électrodes sont exposées, ne sera jamais en contact avec la solution. Pour l'isolation, en utilisant de la colle époxy sur une partie des conducteurs d'électrode qui pourraient être exposées. - Utiliser une forme d'impulsion carrée avec 50% de cycle, sans composante de courant continu afin d'éviter l'électrolyse. Varier la durée d'impulsion comprise entre 10 ms et 4 ms pour provoquer une stimulation efficace sans brûler la culture. Assurez -vous que l'amplitude est de l'ordre de ± 22 V (voir la figure 5). L'impulsion carrée peut être observée sur un oscilloscope branché en parallèle aux électrodes.
REMARQUE: Pour faciliter la programmation de toute forme d' onde souhaitée, utilisez un logiciel d'édition de forme d'onde commerciale (voir la liste des matériaux
- Utiliser des électrodes en platine d'une épaisseur de l'ordre de 0,005 « » (127 um). Lorsqu'il est utilisé avec les lamelles 13 mm, en sorte que la distance entre les deux électrodes est d'environ 11 mm, et la position de l'électrodes 1 mm au-dessus de la culture.
- Pour tester l'homogénéité de champ utiliser une électrode de sonde. Utilisation d'une grille d'au moins 1 mm x 1 mm pour permettre à la sonde d'être déplacée dans la zone entre les électrodes et mesurer le potentiel électrique.
- Mesurer le potentiel électrique. Utilisation
pour calculer le champ électrique. Utiliser une des électrodes comme une électrode de référence. Mesurer le champ électrique variant avec des durées d'impulsion comprise entre 100 us à 4 ms (voir la figure 5B un exemple de durée d'impulsion de 100 ms) pour vérifier que le champ est homogène dans la plage de durées de stimulation.
REMARQUE: voir la figure 5D pour un exemple d'une homogénéité du champ électrique mesuré lorsque la durée d'impulsion est de 1 ms.
- Mesurer le potentiel électrique. Utilisation
- Utiliser 2 paires d'électrodes perpendiculaires de bain pour produire des formes de champ électrique plus complexes, etêtre capable d'orienter le champ dans différentes directions (Fig. 6B). Dispositif de 2 paires d'électrodes sera utilisé, et le signal sur chaque paire d'électrodes est observé sur deux oscilloscopes séparés.
- Placer les électrodes 1 mm au-dessus de la culture et à une distance de 10 - 11 mm les unes des autres. Assurez-vous que les deux paires d'électrodes sont flottantes (avoir aucune connexion à la terre), et ne possède pas de motif commun en mesurant la résistance entre un ensemble d'électrodes et la vérification de l'absence de courts-circuits entre une quelconque des électrodes. Vérifiez que tout le matériel utilisé, qui est relié aux électrodes (tels que les oscilloscopes, les amplificateurs, les générateurs de signaux, etc.) est flottante par rapport à la masse en vérifiant que tout le matériel est flottant et qu'aucune des électrodes de référence est en contact avec tout équipement mis à la terre.
- Pour modifier l'orientation du champ, faire varier l'amplitude de la tension introduite dans les deux paires d'électrodes avec respect à l'autre (voir la figure 7A). Par exemple, pour une utilisation 0 ° ± 22 V sur la paire d'électrodes qui sont perpendiculaires à la configuration et à 0 V pour l'autre électrode. Pour 45 °, utiliser ± 15,6 V sur les deux paires d'électrodes sans décalage de phase, pour une somme d' amplitude de vecteur de 15,6 2 15,6 2 = 22 2.
- Pour appliquer un champ tournant à utiliser une seule forme d' onde d'une impulsion de tension sinusoïdale et une seule forme d' onde d'une impulsion de tension de cosinus pour les deux paires d'électrodes pour produire un champ électrique d' amplitude fixe en rotation (voir figure 6B).
Remarque: Comme on peut le voit sur la figure 6B, en utilisant un cycle d'une onde sinusoïdale avec ± 22 V à une électrode et un cycle d'une onde cosinusoïdale à ± 22 V dans l'autre électrode, la somme vectorielle est un champ électrique tournant avec la durée du cycle même que les ondes sinus et cosinus, et avec une amplitude de ± 22 V.
- Pour mesurer et calculer ChronAxie et Rhéobase des axones dans la culture neuronale contre dendrites dans la même culture effectuer les étapes suivantes.
- Utilisation d' un colorant fluorescent sensible au calcium pour l' imagerie du calcium , comme décrit dans le tableau des Matériaux / réactifs et 1,5) avec une culture 1D à motifs sur les lignes fines (170 pm), longue (10 mm). colorant sensible au calcium sera appliquée à la culture, et mis en incubation pendant 45 minutes. Le colorant sera lavé par le remplacement d'une solution d'enregistrement frais.
- Débranchez le réseau pour obtenir des statistiques de la population de la réponse directe à la stimulation électrique, sans l'effet de la transmission synaptique. Pour ce faire, appliquer une combinaison de 40 pM de bicuculline, qui bloque l'action inhibitrice de l' acide A-gamma-aminobutyrique (GABA A) récepteurs, 10 uM de 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) , pour bloquer l'α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) et les récepteurs kainate et 20 uM de (2R) -amino-5-phosphonovaleacide ric (APV), qui bloque les récepteurs de N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Les bloqueurs seront ajoutés à la solution d'enregistrement.
- Appliquer une impulsion carrée comme décrit dans 2.1 et 2.3 avec des durées variables de temps comprise entre 100 ms et 4 ms. Le signal peut être observé sur l'oscilloscope.
- Utiliser un microscope à fluorescence avec un programme d'acquisition d'image (voir 1.5) pour contrôler l'intensité des transitoires de calcium à plusieurs régions d'intérêt, contenant chacun quelques centaines de neurones. Acquérir des images à l'aide d'une caméra EMCCD sensibles (voir la liste des matériaux), capables d'un taux d'acquisition d'images d'au moins 20 images par seconde. La variation de l'intensité lumineuse est proportionnelle à la quantité de neurones qui ont été stimulés. Estimer la fraction de neurones stimulées à l'aide de la variation relative de l'intensité.
- Pour chaque durée d'impulsion (100 ms à 4 ms), de changer l'amplitude de la tension appliquée aux électrodes à partir d'une tension ou aucun changement d'intensité est considéré (quelques Volts), à la ièmeE tension où les variations d'intensité dues à la tension appliquée sont saturées (jusqu'à ± 22 V).
NOTE: Le changement d'intensité sera distribué en Gaussian cumulatif 5 par rapport à la tension appliquée pour la stimulation pour chaque durée de l'impulsion de tension. - Ajuster une distribution gaussienne cumulative pour l'intensité par rapport à la tension appliquée pour chaque durée et extraire le moyen gaussien de cet ajustement.
NOTE: Cette moyenne est la tension représentative à laquelle les neurones ont répondu. - À la fin de ce processus, obtenir pour chaque durée de stimulation une tension moyenne à laquelle les neurones ont répondu. Utilisez ces paires de durées et de forces pour tracer les courbes force-durée (voir la figure 7 ).
pour calculer le champ électrique. Utiliser une des électrodes comme une électrode de référence. Mesurer le champ électrique variant avec des durées d'impulsion comprise entre 100 us à 4 ms (voir la figure 5B un exemple de durée d'impulsion de 100 ms) pour vérifier que le champ est homogène dans la plage de durées de stimulation. 3. Stimulation magnétique des cultures
Remarque: La configuration de base pour la stimulation magnétique est illustrée à la Figure 2 . En haut à droite s'afficheUn microscope à fluorescence inversée qui sert à imaginer des colorants sensibles au calcium dans les neurones. La bobine magnétique (cercles bleus) est positionnée d'environ 5 mm concentriquement au-dessus d'une culture de cycle neuronal (contour bleu). Une bobine de ramassage (cercle rouge) sur la circonférence de la boîte de Petri surveille la tension induite par l'impulsion magnétique. En haut à gauche, on montre la dynamique mesurée de la bobine de stimulateur magnétique (MS) avec une charge de tension de condensateur de 5 000 kV, intégrée à partir de la bobine de prélèvement. Le champ électrique induit (calculé pour un rayon annulaire de 14 mm) est représenté en vert alors que le champ magnétique est représenté en bleu. En bas, on retrouve des images de la culture neuronale. Au bas à gauche est une image de champ lumineux d'une lamelle de 24 mm à motifs. Les zones blanches sont les neurones. Le motif photographié se compose de cultures d'anneaux concentriques avec différents rayons. En bas à droite, un zoom sur un court segment des anneaux, montrant des neurones individuels. Pour une échelle, les anneaux 'wide est d'environ 200 um.
- Cultiver les neurones dans un profil en anneau de cercle (gravé comme décrit dans 1.2.5) pour la stimulation de la culture 1D. Utilisation d'un colorant fluorescent sensible au calcium pour l'imagerie du calcium (comme décrit dans la section 1.5) avec une culture 1D motif sur des lignes fines (170 pm), de longues (10 mm).
- Utiliser une bobine magnétique circulaire et positionner une boîte de Petri à environ 5 mm au-dessous et concentrique à la bobine. Utiliser une bobine bobine personnalisée d'environ 30 mm (diamètre intérieur, diamètre extérieur de 46 mm) avec une inductance de L = 90 mH entraîné par un MS maison ou commerciales chargées avec une tension maximale de 5 kV.
- Décharger une haute tension et de courant à travers une bobine conductrice à l'aide d'un interrupteur à haute tension à courant élevé pour stimuler magnétiquement des cultures de neurones. Peut être construit Le stimulateur magnétique (MS) comme décrit dans 21 l' aide de gros condensateurs, de l'ordre de 100 mF, pour obtenir une haute tension de 1 à 5 kV. En variante utiliser un commercialementMS disponible (voir Table des matières / réactifs).
REMARQUE: utiliser un fil de cuivre rectangulaire large revêtu polyester d' une épaisseur de 6,35 mm et 0,254 mm pour fabriquer une bobine 21 fait maison. Tournez fils sur des cadres sur mesure, isolés avec des fibres de verre et moulé en résine époxy (voir le tableau des Matériaux / réactifs). En variante utiliser des bobines disponibles dans le commerce (voir le tableau des Matériaux / réactifs).
- Utiliser des champs magnétiques rotatifs pour stimuler les cultures 2D.
- Maintenant, utilisez les champs magnétiques rotatifs pour stimuler les cultures 2D. Feu le TMS sans culture dans le plat, à des intensités différentes, pour montrer la corrélation linéaire de la lecture de la bobine avec les intensités.
- Ensuite, lors de l'enregistrement des transitoires de calcium avec une culture neuronale, commencer à tirer le TMS à augmenter l'intensité lors de l'enregistrement les transitoires de calcium et la bobine. Dans un premier temps, des rafales de réseau ont observé que les transitoires de calcium, shoULD ne se synchronise pas avec des pointes ramasser bobine de TMS. Continuer à augmenter l'intensité, à un moment donné, les transitoires de calcium commencent à se synchroniser avec les pointes TMS. En variante, ou en outre, après l'obtention d'une réponse synchronisée, commencer à diminuer l'intensité jusqu'à ce que la synchronisation est supprimée, afin de déterminer le seuil de TMS.
NOTE: Les conditions doivent être maintenues strictement fixées pour chacune des configurations, en utilisant le volume exact à chaque fois, les mêmes navires et positions de bobine exactes et orientations.- Monter la bobine de détection sur la base de la cuvette d'enregistrement afin qu'elle se trouve dans un plan parallèle à la culture neuronale et dans une position fixe par rapport à la culture.
NOTE: Cela garantit que la dépendance du positionnement de la bobine de capteur par rapport à l'aimant est fidèle à la position de la culture et que toute divergence dans le positionnement sera négligeable sur les lectures de la bobine de pick-up.- Utiliser deux bobines indépendantes,positionné perpendiculairement à l'autre (figure 8B) pour générer un champ électrique et magnétique induit rotatif. Connectez chaque bobine à ses propres MS. Assurez -vous que les stimulateurs déchargent des courants semblables à un décalage de phase de 90 degrés (figure 10A), ayant pour résultat un champ magnétique rotatif qui balaie 270 degrés de l'espace réel à un champ maximum de ~ 270 V / m (Figure 10B).
- Positionner la culture neuronale à l'intérieur d'un récipient en verre sphérique remplie de la solution d'enregistrement externe (EM).
- surveiller stimulation (changement d'intensité de fluorescence des neurones) avec l'appareil comme décrit dans l'étape 2.4.4.
- Dans le cas des bobines croisées (figure 8B), positionner la bobine de détection et parallèlement à une certaine distance en dessous de la culture des neurones. Maintenir soigneusement cette configuration à travers les expériences.
- Monter la bobine de détection sur la base de la cuvette d'enregistrement afin qu'elle se trouve dans un plan parallèle à la culture neuronale et dans une position fixe par rapport à la culture.
- Calculer analytiquement le champ électrique pour 1D CONFIGURAtion par E max = k 1 Br, dans laquelle E max est l'amplitude maximale du champ électrique induit et est dirigé le long de la tangente des anneaux de rayon r. B est l'amplitude de l'impulsion magnétique et k 1 est une constante de proportionnalité dimensionnelle qui peut être mesurée en utilisant la bobine de détection (Figure 8A).
- Utilisez un logiciel de simulation numérique (voir la liste des matériaux) pour simuler numériquement le champ électrique 21.
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Representative Results
Le protocole présenté permet un modelage facile des cultures neuronales. Lorsqu'il est combiné avec plusieurs méthodes, nous avons développé pour la stimulation, il permet de mesurer certaines propriétés intrinsèques du neurone telles que Chronaxie et Rheobase 5 , pour comparer les propriétés des neurones sains et malades 27 , pour trouver des moyens optimaux de stimuler les cultures en fonction de Leur structure et beaucoup d'autres approches novatrices. Quelques exemples sont présentés dans les chiffres suivants.
La figure 3 montre le Configurations à motifs 1D qui sont gravées dans la couche de bio-rejet. Des lignes minces d'environ 170 μm de largeur sont généralement inscrites qui peuvent, par exemple, être des anneaux concentriques avec des rayons variables ( Figure 3A ) ou des lignes parallèles, généralement de ~ 11 mm de long ( Figure 3B ).
Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Le panneau supérieur de la figure 4 montre une image typique de l'activité fluorescente dans la culture, prise avec un dispositif à couplage de charge (CCD) et montrant une image marquée par fluorescence Neurones dans une culture 2D. Dans cet exemple, trois ROI différents sont affichés, marqués en noir, vert et rouge. Les traces intégrées d'intensité de fluorescence sont représentées dans le panneau inférieur de la Figure 4 , mesuré dans ces trois ROI (les traces sont dans la couleur correspondante Des ROI). Comme le montre l'insertion, dans la résolution de 200 ms du temps d'acquisition de la trame à laquelle ces données particulières ont été prises, tous les neurones des trois ROIs différents éclatent simultanément.L'appareil de base utilisé pour la stimulation par un champ électrique unidirectionnel et constant est représenté sur la figure 5A . Les fils d'électrode sont immergés dans le support d'enregistrement, environ 1 mm au-dessus de la culture neuronale.La forme d'impulsion de base utilisée pour la stimulation électrique est représenté sur la figure 5B. Lorsque cette impulsion de tension est appliquée, il crée un champ électrique constant qui bascule son orientation de 180 ° après la moitié du cycle. Le changement de direction du champ après un demi-cycle est utilisé pour éviter l'électrolyse et des dommages aux électrodes. tensions typiques appliquées aux électrodes sont de ± 22 V, et la durée d'impulsion typique pour la stimulation des cultures 2D est de l'ordre de 100 - 500 ps.
Pour tenir compte de toute anisotropie dans la croissance des axones, nous avons vérifié que la stimulation des cultures 2D est isotrope. En faisant tourner manuellement les électrodes dans l' ensemble de résolution de 360 ° à 15 ° (figure 5C) , on voit qu'il n'y a pas de préférence d'orientation pour la stimulation. Chaque couleur représente la figure 5C la stimulation d'une culture différente. La distance de l'origine représente le minimum duration nécessaire pour la stimulation avec une amplitude constante. Il est évident que, à une bonne approximation, les cultures 2D ne sont pas une orientation préférée pour la stimulation électrique.
Etant donné que la seule paire d'électrodes est limitée en ayant une direction définie par le champ (même si elle peut être retournée), nous avons développé un appareil pour la stimulation électrique avec deux paires d'électrodes (figure 6A). Un schéma de la culture (fond gris circulaire, des taches plus foncées sont des corps cellulaires) et des électrodes (lignes épaisses parallèles) est représentée sur la figure 6B. Lorsque les formes d' ondes, représentées par des inserts bleus et verts sur la figure 6B, sont des cosinus et des ondes sinusoïdales et sont appliqués ensemble , puis un champ tournant E vecteur est produit. Lorsque les impulsions de tension sont de forme carrée, ont des amplitudes différentes et avoir un retard de phase zéro entre eux alors qu'ils créent un champ constant avec l'orientation souhaitée déterminée par la ramplitude élatif entre les deux paires d'électrodes. Cette rotation électrique est une amélioration évidente sur la rotation manuelle, mécanique qui a été utilisé pour obtenir la distribution angulaire des forces de stimulation de la figure 5C. Bien sûr, comme la figure 6C montre, il est également possible d'utiliser cette configuration pour exciter une seule direction fixe, peut - être comme témoin, en activant une seule paire d'électrodes.
Ces configurations ont été utilisés pour exciter les cultures neuronales 2D avec soit un champ tournant ou dans un domaine à angle fixe, avec la même racine moyenne tension carré (RMS), puis de comparer la durée d'impulsion nécessaire pour exciter la culture lorsque l'amplitude est fixe. Nous avons constaté que lorsqu'on utilise un champ électrique tournant avec une amplitude constante de ± 22 V, une durée moyenne de 150 ± 14 ps était nécessaire pour obtenir une stimulation, alors qu'avec un champ électrique unique direction d'une durée moyenne de290 ± 30 μs étaient nécessaires. Le rapport entre les durées nécessaires pour exciter la culture avec un champ rotatif par rapport à un angle fixe est donc de 0,53 ± 0,02.
Comme dans une culture en 2D, les axones s'étendent dans toutes les directions, le champ tournant peut exciter beaucoup d'axones. En revanche, avec le champ d'orientation unique, il n'y a que quelques axones orientés dans cet angle spécifique et l'excitation axonale n'est pas atteinte. Lorsque la durée augmente, il est possible d'exciter d'autres parties du neurone, en particulier les dendrites. Ceci est expliqué plus en détail ci-dessous en décrivant les mesures de Chronaxie. Le fait que des durées beaucoup plus courantes soient nécessaires pour l'excitation de la même culture lorsque l'utilisation d'un champ rotatif est d'une grande importance lors de l'utilisation de champs externes pour la stimulation cérébrale, car il existe souvent des limitations techniques sur la durée des impulsions.
figure 7. Sur la figure 7A un réseau déconnecté 1D est stimulé avec le champ électrique soit le long de la ligne de la culture (à 0 ° C pour la stimulation des axones) ou perpendiculairement à la ligne de la culture (à 90 ° pour la stimulation dendritique) par deux paires d'électrodes. Comme la tension augmente, plus les neurones seront stimulés, et cela se reflète par la grippeintensité de orescence, qui est proportionnelle au nombre de neurones stimulées (voir la figure 7B). L'augmentation des amplitudes de tension sont utilisés pour stimuler progressivement toute la culture. Chaque neurone a une tension de seuil minimal (pour une durée d'impulsion spécifique) qu'il répondra, et par la loi du grand nombre, la répartition de ces seuils devrait être gaussienne. Par conséquent, si nous regardons le nombre de neurones qui ont répondu et l' intrigue contre la tension appliquée, la distribution sera une distribution gaussienne cumulative, qui est une fonction d'erreur (ERF) 5. Le nombre de neurones qui répondent à une amplitude déterminée de champ électrique a approximativement une distribution gaussienne, et donc la fluorescence est bien décrite par son intégrale - une fonction d'erreur de l'amplitude du champ de stimulation (Figure 7C).
Figure 7C est utilisé pour eXtract un paramètre, l'attente (moyenne) de la distribution. Cela se fait en ajustant une répartition gaussienne cumulative et en obtenant le meilleur ajustement. Cette attente est la tension appliquée à laquelle 50% des cellules réagiront. Ce processus est répété pour plusieurs durées d'impulsion (allant de 100 μs à 4 ms). La tension moyenne à laquelle la culture a répondu est tracée par rapport à la durée d'impulsion pour obtenir la courbe Force-Durée. Deux séries de mesures ont été effectuées. Dans le premier, le champ était parallèle au motif et, dans le second, il était perpendiculaire à celui-ci. On a déjà montré 15 , 23 que les axones s'alignent avec le motif, tandis que les dendrites poussent dans toutes les directions. Cela donne deux courbes différentes de Force-Durée, qui sont très utiles pour obtenir une nette différence entre l'excitation axonale et la dureté dendritique. La séparation complète des contributions dendritiques et axonales est obtenue par le fait connu que l'axonetemps al constant pour l' excitation est beaucoup plus courte que celles dendritiques 2, 3, 4.
Les courbes force-durée sont alors aptes à l'équation de décroissance Chronaxie 
Où V est la tension rh Rhéobase et C est le Chronaxie. A des durées d'impulsion de t <1 ms, ce sont les axones qui sont excités première et la cause du neurone au feu, ayant une valeur plus faible pour la tension d'excitation de la courbe force-durée. Axonale Chronaxie a été calculée à 110 ms. En contraste frappant, par une excitation à de longues durées (T> 1 ms) du compartiment dendritique est la source d'excitation pour le neurone avec un Chronaxie dendritique calculé à 900 us.
Les principes qui sous-tendent la stimulation des cultures 2D et 1D avec un circulier bobine sont décrits sur la figure 8. Pour obtenir une meilleure compréhension de la situation physique, les simulations numériques des champs électriques et magnétiques induits sont produites en utilisant le paquet COMSOL. Pour stimuler les cultures 1D une bobine magnétique circulaire est utilisé, positionnés de manière concentrique au-dessus de la boîte de Petri. Les neurones sont cultivés dans des anneaux circulaires sur une lamelle ronde qui est placé à l'intérieur de la boîte de Petri pour l'enregistrement. Dans ce cas , le champ électrique induit peut être calculée analytiquement et est égal à E max = k 1 Br, dans laquelle E max est l'amplitude maximale du champ électrique induit et est dirigé le long de la tangente des anneaux de rayon r. B est l'amplitude de l'impulsion magnétique et k 1 est une constante de proportionnalité dimensionnelle qui peut être mesurée en utilisant une bobine de détection.
Le calcul numérique COMSOL du champ magnétique créé par la bobine dans la culture 1D est représentée dans le panneau supérieur de la figure 8A (Les lignes de courant rouge). Dans le panneau du bas de la figure 8A , le calcul est présenté pour le champ électrique induit. La stimulation d'une culture 2D avec une configuration de bobines croisées est représenté sur la figure 8B. Pour stimuler les cultures 2D d'une bobine croisée a été utilisé qui produit des champs magnétiques rotatifs, positionnés avec une culture neuronale 2D à l'intérieur, placé dans un récipient en verre sphérique qui est rempli avec un milieu d'enregistrement (EM). Dans ce cas, le champ électrique induit ne peut plus être calculé analytiquement. La bobine transversale est représentée dans le panneau supérieur de la figure 8B, avec le récipient sphérique placé à l' intérieur des deux bobines et la lamelle de verre supportant la culture 2D placé dans le fond du récipient. Pour l'échelle, le diamètre intérieur de la bobine intérieure est de 65 mm. Des simulations numériques à l'aide COMSOL avec les courants de Foucault modèle 3D sont présentés dans le panneau inférieur,En dépeignant le champ électrique induit dans la surface interne du conteneur sphérique. Une image de microscope en champ lumineux d'une lamelle de verre avec des cultures neuronales 1D typiques utilisées pour la stimulation est illustrée à la figure 8C . Les lignes blanches montrent des neurones sur les lignes à motifs, orientés à la fois de manière tangentielle et radiale pour une comparaison et un contrôle expérimental sur l'effet de la directionnalité.
La géométrie de la culture 1D joue un rôle important dans la détermination de la culture qui déclenchera en réponse à la stimulation magnétique. Seulement 22% des cultures en anneau 1D ont répondu à la stimulation magnétique. Le taux d'excitation réussi dépend fortement de la longueur linéaire de la culture et, comme le montre la figure 9A , plus de 60% des cultures de plus de 80 mm répondent à la stimulation magnétique. Cela implique que des conditions spéciales sont nécessaires pour la réponse magnétique. Pour enquêter sur ces cultures de dépendance géométriques wOnt été développés dans des configurations qui sont des parties des anneaux - ayant le même rayon mais des longueurs différentes en les modelant sur des arcs plutôt que sur des cercles complets (voir la figure 8C )
Une étude approfondie des seuils du champ magnétique en fonction du rayon des cultures en anneau 1D est illustrée à la figure 9B . Les cercles blancs représentent des mesures expérimentales des seuils de stimulation, tandis que le codage des couleurs indique la probabilité calculée pour mesurer un seuil d'excitation. Un seuil de stimulation est défini comme le champ le plus faible qui provoque encore une réponse pour une culture neuronale donnée.
La figure 9B souligne la tendance selon laquelle les anneaux plus gros ont des seuils de stimulation inférieurs, avec une corrélation inverse claire entre le rayon des anneaux et le seuil de stimulation. Par exemple, l'anneau moyen de 14 mm répond à la magnitudeétique impulsions avec une amplitude de 1,5 T tandis que l'anneau moyenne de 7 mm ne répond qu'à 3 T ou plus. On prévoit dans le calcul théorique du champ électrique induit, qui est représenté comme un code de couleur prédit la probabilité de tirer. En effet, le champ électrique induit par 3T à un rayon de 7 mm est égale à celle induite par 1,5 T à deux fois le rayon. En résumé, le seuil de champ électrique moyen est de 301 ± 128 (écart - type) V / m, indépendant du rayon des cultures cycliques.
Contrairement à la bobine circulaire unique, qui ne pouvait pas obtenir une réponse dans les cultures 2D 15 30 2D cultures qui ont été stimulées par champ tournant stimulation magnétique a répondu à l'éclatement excitation neuronale. Les deux bobines indépendantes qui sont positionnées perpendiculairement les unes aux autres (Figure 8B) génèrent des champs électriques magnétiques tournant et induits. Chaque bobine est reliée à ses propres MS, tous deux DischOnt des courants similaires à un décalage de phase de 90 degrés. L'amplitude du champ électrique induite par chacune des deux bobines dans la configuration de la bobine transversale est tracée sur la figure 10A , et les mêmes traces sont représentées sur la figure 10B par une représentation polaire de la direction et de l'amplitude du champ électrique superposé des deux bobines . Le champ électrique induit résultant analyse 270 degrés de l'espace réel à un champ maximal de ~ 270 V / m.
Figure 1: schéma de la configuration utilisée pour la stimulation électrique des cultures neuronales. Le signal désiré est produit par un générateur de signal avec deux sorties qui n'ont pas de terrain commun. Ces signaux sont amplifiés pour donner une tension de sortie allant jusqu'à ± 30 V. Les signaux électriques sont ensuite alimentés par deux paires séparées d'électrodes, stimulant une culture neuronale en deuxo orthogonale et directions indépendantes. La stimulation des neurones peut être visualisé et contrôlé par des colorants de calcium. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Schéma de configuration utilisées pour la stimulation magnétique des cultures Neuronal. R. En haut est représentée la bobine magnétique (cercles bleus), qui est situé à 5 mm de manière concentrique au-dessus de la culture de la bague neuronale, placé dans une boîte de Petri (contour bleu). Une bobine de détection (cercle rouge) positionné sur la circonférence de la boîte de Petri mesure la tension induite par l'impulsion magnétique. Au fond de la dynamique de mesure de la bobine magnétique du stimulateur est signalée (en utilisant une charge de tension de condensateur PM de 5000 kV), qui a été intégré à partir de la bobine de détection. champ électrique induit (calculated pour un rayon de cercle de 14 mm) est représenté en vert lorsque le champ magnétique est représenté en bleu B. Une des images au microscope inversé colorants fluorescents sensibles aux transitoires calciques de neurones réagissant à des impulsions magnétiques. C. Neurones cultivé sur un motif d'anneaux concentriques, utilisée pour une stimulation efficace par le stimulateur magnétique annulaire. D. image de microscope en champ clair de neurones cultivés sur une ligne du motif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Exemples de formes de cultures 1D Neuronal Utilisé pour Orienter le champ électrique avec la Direction de la croissance axonale. A. motif circulaire est utilisé pour la bobine magnétique circulaire, lorsque l'induit ele ctric champ a une orientation circulaire. B. modèles de ligne sont utilisés lorsque le champ électrique induit ou directe a une seule orientation.
Figure 4: Exemple de traces Transitoires de calcium imagés Au cours de réseau synchrone Eclats. A. Une image de neurones qui ont été teints à l'expérience précédente avec un colorant de calcium. B. traces d'intensité en fonction du temps des régions d' intérêt en A avec la couleur de la trace représentant la couleur de la bordure de la ROI en A. Une forte augmentation de l'intensité synchronisée dans les trois régions d' intérêt représente une salve de réseau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
54357fig5.jpg »/>
Figure 5: Configuration de base pour la stimulation électrique, en utilisant une paire d'électrodes parallèles de bain pour déterminer que les cultures 2D ont pas une orientation préférentielle de stimulation électrique. A. Les appareils utilisés pour la stimulation de la culture. Le champ électrique est produit en appliquant une tension aux électrodes de fil de platine. La distance entre les deux fils est de 13 mm. B. Un exemple d'un signal de tension à appliquer sur les électrodes en A. La forme de l'impulsion bipolaire permet de prévenir l' électrolyse de la solution d'enregistrement au niveau des électrodes. C. Lorsque la stimulation d' une culture 2D dans différentes rotations des électrodes, il y a isotropie de la réponse neuronale. D. Un exemple de la mesure du champ électrique en utilisant la sonde décrite dans l' étape 2.2. Le champ électrique est uniforme d'une erreur pouvant atteindre 10%. Ce chiffre a été modifié de 5.Upload / 54357 / 54357fig5large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: La stimulation électrique avec deux paires d'électrodes permet la rotation du champ électrique et pour la stimulation dans n'importe quel angle désiré. A. Pour produire des formes plus compliquées du champ électrique, deux paires d'électrodes indépendantes sont nécessaires. B. Appliquer une impulsion en forme de tension de cosinus à une électrode et une impulsion sinusoïdale à la seconde électrode crée un champ électrique rotatif à amplitude constante. C. L'application d'une impulsion de tension carrée à une paire d'électrodes crée un champ électrique uniforme unidirectionnel. Ce chiffre a été modifié de 5 . Clbeurk ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: Réseau de blocage par Débranchement synaptiques Entrées (tel que décrit dans 2.4.2) permet l' observation de la population totale de cellules individuelles qui sont Stimulée par un champ électrique donné. A. En appliquant différentes amplitudes des impulsions de tension aux deux paires d'électrodes, le champ électrique peut être orienté de tous les angles sans qu'il soit nécessaire de tourner manuellement la culture. B. Exemple d' enregistrements de transitoires de calcium avec une stimulation électrique à des tensions différentes appliquées. Quatre traces sont montrées, légèrement décalé verticalement pour permettre le visionnement. Les valeurs de tension sont écrits sous les traces bleues. C. Lors de l' application d' une durée constante de champ électrique, le nombre de neurones qui se déclenche en réponse au champ électrique a un dist cumulatiffonction ribution (CDF) qui est une distribution gaussienne cumulative (ou une fonction erf) en fonction de l'amplitude de la tension (qui est proportionnelle à l'intensité du champ). D. Un exemple d'une courbe force durée obtenue tout en utilisant ce protocole. Ce chiffre a été modifié de 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8: Configuration de la bobine magnétique et calcul du champ électrique induit. A. Au sommet est une bobine circulaire (cercles bleus) est positionné au-dessus de 5 mm cultures cycliques de neurones à une dimension (disque bleu). Les anneaux sont parallèles et concentriques avec la bobine, ce qui crée une impulsion magnétique qui est orienté le long des lignes rouges. Par la loi de Faraday, le champ électrique induit se trouve sur des plans qui sont parallèles à la bobine le long d'anneaux concentriques avec elle. Au fond est une coupe horizontale le long du plan des cultures cycliques. La valeur relative du champ électrique est un code de couleur, avec la direction représentée par les flèches. anneaux plus grands enferment une plus grande surface de flux et donc le champ électrique induit, il est plus élevé. B. Image du stimulateur magnétique bobine croisée ( en haut) et une simulation du champ électrique qui est induit par celle - ci. C. Motif utilisé pour la culture des neurones qui peuvent être stimulées soit avec un champ électrique circulaire ou un champ électrique radial. Ce chiffre a été modifié de 21, 28. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 9: Réponse des cultures à anneau champ magnétique. A. Le taux de réussite de la stimulation augmente avec le rayon de la culture. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard (SE). B. La relation entre la taille de l' anneau et l' intensité du champ magnétique est représenté. La probabilité d'exciter la culture est un code couleur. En effet, les excitations les plus réussis de cultures se trouvent dans le chevauchement entre l'espace de phase expérimentalement accessible (rectangle blanc) et la région de haute probabilité (rouge). Ce chiffre a été modifié de 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 10: Rotation de champ magnétique d'installation sur le terrain. </ strong> A. Afin d'induire un champ électrique tournant lors de la stimulation avec le stimulateur magnétique traverse la bobine, un décalage de phase de 90 degrés est nécessaire entre les deux bobines. Indiqué est un champ électrique induit dans une bobine de détection positionnée sur 2 ailes voisines de la bobine de feuille de trèfle. Les bobines sont entraînées séparément par 2 stimulateurs commerciaux. B. Une reconstruction, en utilisant les courbes représentées en A, de l'amplitude du champ électrique résultant et de la direction pendant une impulsion de la bobine de feuille de trèfle. Ce chiffre a été modifié de 21, 28. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
1D motif est un outil important qui peut être utilisé pour une variété d'applications. Par exemple, nous avons utilisé 1D motifs pour créer des portes logiques à partir des cultures de neurones 29 et plus récemment pour mesurer la Chronaxie et Rhéobase des neurones hippocampiques de rat 5, et le ralentissement de la vitesse de propagation du signal d'activité de mise à feu dans les neurones hippocampiques du syndrome de Down par rapport à la type sauvage (WT) neurones hippocampiques 27. Le protocole suggéré pour un motif 1D est robuste et il est facile de former un motif désiré quelconque. Nous vous proposons d'observer la culture 1D avant que les mesures soient au courant des déconnexions possibles du réseau, ce qui peut affecter sa fonction.
Patterning chimique des configurations neuronales a une histoire remarquable 30, 31, 32. Nous avons constaté que notre rendement d'approches résultats similaires à patterning chimique, mais ils sont plus robustes et plus faciles à atteindre. Récemment , l'option pour la formation de motifs microfluidique de neurones est devenu une alternative intéressante à l'approche que nous proposons, avec une simplicité comparable et facilité d'utilisation 33, 34. L'approche microfluidique est utilisée dans notre laboratoire en parallèle avec la méthode de gravure décrite ici.
Comme nous l' avons montré 5, cultures 2D ont aucune orientation préférée et leur stimulation est isotrope et ne dépend pas de l'orientation du champ appliqué. des durées plus courtes sont nécessaires pour la stimulation des cultures 2D lorsque le champ est en rotation. En revanche, les cultures 1D sont très dépendants de l'orientation du champ. Lorsque le champ est orienté avec le motif (et donc avec la direction de la croissance axonale), la durée d'un champ d'amplitude fixe nécessaire pour la stimulation est beaucoup plus court que lorsque le champ est oriented perpendiculaire au motif. De même, si la durée est maintenue constante alors le champ nécessaire pour exciter la culture est plus petit si le champ et le modèle sont parallèles. Lorsque la stimulation perpendiculairement, l'impulsion de champ doit être beaucoup plus longue (de l'ordre de la milliseconde lorsque le réseau est déconnecté), puis principalement les dendrites sont stimulées. Lorsque les champs électriques (directs et induits par un champ magnétique) sont utilisés pour la stimulation cérébrale, cela est d'une extrême importance. Si la zone du cerveau ciblé est connu pour avoir des faisceaux d'axones, ces axones peuvent être excités par l'orientation du champ dans leur direction et ont besoin moins d'énergie ou une durée plus courte du champ pour la stimulation. Si la région du cerveau ciblé ne dispose pas d'orientation préférée, puis un champ tournant est plus efficace pour la stimulation. Si dendrites sont la cible de la stimulation, des impulsions plus longues sont plus efficaces.
Les champs magnétiques peuvent stimuler l'activité neuronale lorsqu'une impulsion magnétique induces un champ électrique qui excite les neurones. Étant donné que les impulsions magnétiques sont actuellement réalisables microsecondes de durée, dendrites, dont le temps de réponse est de l'ordre de millisecondes, ne devraient pas être sensibles à la stimulation magnétique. En revanche, les axones, dont le temps de réponse est plus rapide, sont la cible de la stimulation 2, 3. La réponse d'axones à l' excitation électrique est maximal quand ils sont parallèles au champ électrique et diminue quand ils sont perpendiculaires à ce 1, 35; Par conséquent, dans l'excitation magnétique, nous nous efforçons de mettre en place des systèmes où le champ électrique induit parallèlement aux oriente axones ciblés. Par conséquent, lorsque la stimulation d'une bague 1D, le champ doit être orienté parallèlement aux axones et la taille de la bague détermine le seuil de stimulation. Pareil pour la stimulation directe par des électrodes de bain, pour stimuler une culture 2D, une rotation induite par eLe champ électoral est beaucoup plus efficace.
La combinaison du modelage des neurones et de l'excitation externe avec le champ électrique ou magnétique est une technologie puissante avec de nombreuses applications futures possibles. Chronaxie et Rheobase, ainsi que le seuil de dynamique et de dynamique de propagation et d'activation, sont tous des paramètres qui racontent les propriétés intrinsèques d'une culture neuronale. En particulier, les traitements thérapeutiques et l'effet des médicaments ou du traitement pharmacologique peuvent être immédiatement testés directement sur les neurones. Cela permettrait une étude efficace des neurones du modèle de la maladie et des protocoles pour la stimulation du TMS. Sur une direction plus conceptuelle, la capacité à stimuler les cultures neuronales conduit précisément à de nouvelles possibilités concernant les aspects du traitement de l'information des configurations neuronales et nous permet d'envisager des circuits micro-imprimés qui combinent la stimulation électronique avec les réseaux neuronaux vivants pour fournir de nouveaux calculsdispositifs et al nouveaux dispositifs d'interface du cerveau.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef et Eitan Reuveny des discussions très utiles. Les auteurs remercient Ilan Breskin et Jordi Soriano pour développer les premières versions de la technologie. Les auteurs remercient Tsvi Tlusty et Jean-Pierre Eckmann aide les concepts théoriques. Cette recherche a été soutenue par la Fondation Minerva, le Ministère de la Science et de la technologie, Israël et par Israël pour la science subvention 1320-1309 et la science binationale Fondation subvention 2.008.331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
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