Summary
Neuronale kweken zijn een goed model voor het bestuderen van de opkomende hersenstimulatie technieken via hun effect op enkele neuronen of een populatie van neuronen. Hier voorgesteld zijn verschillende methoden voor het stimuleren van neuronale kweken patroon door een elektrisch veld rechtstreeks bad elektroden geproduceerd of geïnduceerd door een in de tijd variërend magnetisch veld.
Abstract
Een neuron een actiepotentiaal wordt geactiveerd wanneer de membraanpotentiaal bepaald maximum overschrijdt. In typische activiteit van de hersenen, dit gebeurt als gevolg van de chemische input zijn synapsen. Echter kunnen neuronen ook worden geëxciteerd door een aangebrachte elektrische veld. In het bijzonder de recente klinische toepassingen activeren neuronen door het creëren van een elektrisch veld extern. Het is daarom van belang om te onderzoeken hoe het neuron reageert op het externe veld en wat de oorzaak van de actiepotentiaal. Gelukkig, nauwkeurige en gecontroleerde toepassing van een extern elektrisch veld mogelijk embryonale neuronale cellen die zijn uitgesneden, gedissocieerd en gekweekt in kweken. Dit maakt het onderzoek van deze vragen in een zeer reproduceerbare systeem.
In dit artikel enkele technieken voor gecontroleerde toepassing van extern elektrisch veld op neuronale kweken worden beoordeeld. De netwerken kan zowel eendimensionale, dat wil zeggen een patroon in linear vormen of laat groeien over het gehele vlak van het substraat, en derhalve tweedimensionaal. Voorts kan de excitatie worden door de directe toepassing van elektrische velden via elektroden ondergedompeld in de vloeistof (bad elektroden) of door het induceren van het elektrische veld met de afstandsbediening ontstaan van magnetische pulsen.
Introduction
De interactie tussen neuronen en externe elektrische velden heeft fundamentele implicaties en praktische degenen. Terwijl bekend sinds de tijden van Volta dat een extern aangeboden elektrisch veld weefsel te exciteren, zijn de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de productie van een resulterende actiepotentiaal in neuronen pas onlangs beginnen ontrafeld 1, 2, 3, 4. Dit omvat het beantwoorden van vragen met betrekking tot het mechanisme dat depolarisatie van de membraanpotentiaal, de rol van membraan eigenschappen en ionenkanalen, en zelfs het gebied veroorzaakt bij de neuron dat reageert op het elektrische veld 2, 5. Therapeutische neurostimulatie 6, 7, 8, 9, Het meten van de interactie binnen de in vivo hersenen voegt hierbij een belangrijk onderdeel toe, maar wordt belemmerd door de onnauwkeurigheid en lage controleerbaarheid van metingen in de schedel. Daarentegen kunnen metingen in culturen eenvoudig worden uitgevoerd in hoog volume met hoge precisie, uitstekende signaal-ruisprestaties en een hoge mate van reproduceerbaarheid en controle. Met behulp van culturen kan een grote verscheidenheid aan neuronale eigenschappen van collectief netwerkgedrag worden toegelicht 11 , 12 , 13 , 14 , 15, 16. Evenzo is dit goed geregeld systeem verwacht zeer efficiënt bij het ophelderen van het mechanisme waarmee andere stimulatiemethoden werken, bijvoorbeeld hoe kanaalopening bij optische stimulatie optogenetically actieve neuronen 17, 18, 19 is verantwoordelijk voor het creëren actiepotentiaal. Hier ligt de nadruk op het beschrijven van de ontwikkeling en het begrip van de instrumenten die efficiënt de neuron kan prikkelen via een extern elektrisch veld. In dit artikel beschrijven we de bereiding van tweedimensionale en eendimensionale patroon hippocampuskweken, stimulatie met verschillende configuraties en oriëntatie van een direkt elektrisch veld met bad elektroden, en ten slotte stimulering van tweedimensionale en gevormde eendimensionale kweken door een tijd variërend magnetisch veld, die een elektrisch veld induceert5 , 20 , 21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Procedures met betrekking tot de behandeling van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van het Weizmann Institute of Science en de juiste Israëlische wet. Het Weizmann Instituut is geaccrediteerd door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC). De Weizmann Institutional Animal Care en gebruik Comite deze studie, uitgevoerd met de hippocampus neuronen.
1. Bereiding van twee-dimensionale (2D) en eendimensionale (1D) hippocampuskweken
- Bereiding van dekglaasjes voor 2D culturen.
- Bereid plaatmedium (PM) samengesteld als volgt: 0,9 ml minimaal essentieel medium (MEM) + 3G, 0,05 ml foetaal kalfsserum (FCS), 0,05 ml door warmte geïnactiveerd paardenserum (HS HI) en 1 pl B27 supplement. Opmerking: MEM + 3G bevat per 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycine, 5 ml gestabiliseerde L-glutamine 100x (zie
- Bereid boraatbuffer samengesteld uit: 1,9 g borax (natriumtetraboraatdekahydraat) in 200 ml dubbel gedestilleerd water (DDW) (meng bij 60 ° C) en 1,24 g boorzuur in 200 ml DDW. Titreer de uiteindelijke oplossing op pH 8,5 met 1 M HC1. Opmerking: De uiteindelijke oplossing is 400 ml 0,1 M boraatbuffer.
- Dompel de glazen dekglazen in 65% salpeterzuur gedurende 2 uur. Spoel drie keer in DDW, gevolgd door drie spoelen met absolute analytische reagens (ABS AR) ethanol.
- Pas elke deksel kort door de vlam van een Bunsen-brander twee of drie keer voor 1 - 2 s, en laat het dan gedurende 1 uur in 24-platen platen met 1 ml poly-L-lysine 0,01% oplossing verdund 1: 5 in boraatbuffer 0,1 M, pH 8,4). Spoel dan de deklagen in DDW drie keer en laat met 1 ml PM per putje in een standaard 37 ° C, 5% CO 2 incubator overnacht.
- Bereid plaatmedium (PM) samengesteld als volgt: 0,9 ml minimaal essentieel medium (MEM) + 3G, 0,05 ml foetaal kalfsserum (FCS), 0,05 ml door warmte geïnactiveerd paardenserum (HS HI) en 1 pl B27 supplement. Opmerking: MEM + 3G bevat per 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycine, 5 ml gestabiliseerde L-glutamine 100x (zie
- Voorbereiding van coverlips voor 1D culturen.
- Reinig glass dekglaasjes door onderdompeling in een basis piranha-oplossing bestaande uit 75 ml DDW, 25 ml 25% ammonia-oplossing en 25 ml 30% waterstofperoxide. Plaats oplossing met dekglaasjes op een verwarmingsplaat bij -50 ° C gedurende 30 minuten en droog de dekglaasjes met stikstof.
- Coat dekglaasjes eerst met een dunne chroomfilm (99,999%) 6 een dikte gevolgd door 30 een laag goud (99,999%), met behulp van dampfase of sputteren.
- Een sputteren van 0,05 te bereiken - 1 A / s gebruiken verstuivingsmachine met 2 e-stralen en een vacuümsysteem van 260 l / s met doel maten 2" en 4" . Gebruik een rotatie fase die kan gaan 0-100 omwentelingen per minuut (RPM). Gebruik een gelijkstroom (DC) het door verstuiving kracht van 0-750 Watt.
- Met een rotatie van 30 rpm en argon 99,999% aan plasma krijgen op 10 mTorr druk in de kamer.
- Bedien de voeding van de sputterkanonnen 40 W DC sputteren vermogen voor de chroom leidt tot -0,12 A / S dekkingsgraad, en bij 10 W DC sputteren vermogen voor het goud, wat leidt tot ~ 0,28 A / S.
- Los 0,1 g 1-octadecaanthiol in 100 ml absolute ethanol AR met ultrageluid gedurende 30 min. Plaats Cr-Au beklede dekglaasjes gedurende 2 uur in deze oplossing, daarna wassen met ethanol ABS AR en droge met stikstof.
- Bereid een oplossing van 100 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en 3,5 g tri-blokcopolymeer (zie Tabel Materialen / Reagentia) door roeren gedurende 1-2 uur bij 600-700 rpm. Plaats dekglaasjes in de oplossing gedurende 1 uur. Droge dekglaasjes met stikstof.
- Mechanisch etsen het gewenste patroon door krabben de bio-afstoting laag 22. Doe dit met een pen plotter, wanneer de pen wordt vervangen door een ets naald. Krassen het patroon door de metalen lagen aan het onderliggende glas bereiken. Besturen dit proces door een computer een gerepliceerde gewenst patroon te bereiken. Patronen gevormd door deze werkwijze worden aangetoond D in figuur 2 en figuur 3 .
- Bereid een bio-compatibele laag van 100 ml D-PBS, 3,5 g tri-blok copolymer, 35,7 μL / ml fibronectine en 29 μl / ml laminine.
- Steriliseer dekglazen in ultraviolet licht gedurende minstens 10 minuten. Incubeer deksels in de voorbereide bio-compatibele oplossing gedurende de nacht.
OPMERKING: De bio-compatibele laag zal alleen vormen waar de bio-afstotingslaag is geëtst in de vorige stap. - De volgende dag wassen deklips twee keer met P-DBS. Incubeer dekjes in PM overnacht. Omslagen zijn nu klaar om te plakken.
- Steriliseer dekglazen in ultraviolet licht gedurende minstens 10 minuten. Incubeer deksels in de voorbereide bio-compatibele oplossing gedurende de nacht.
- Voer dissectie uit volgens standaardprocedures die al voorheen 23 , 24 gepubliceerd zijn.
- In samenvatting, pak hippocampus of cortex uit rat embryo's, typisch op dag E19, of van muizen, typisch op dag E17 23 ,class = "xref"> 24.
- Dissociëren cellen eerst in papaïne oplossing gedurende 20-30 minuten, gevolgd door een mechanische trituratie met 24 glaspipetten met toppen vuur gepolijst.
Opmerking: Als de cellen afkomstig zijn van genetisch gemodificeerde muizen dan het weefsel van elk embryo moet een afzonderlijke 1,5 ml plastic buis gedurende het gehele proces behouden. - Tellen cellen met trypaanblauw voor het zaaien.
LET OP: Voor genetisch gemodificeerde dieren de telling moet worden afzonderlijk voor elke embryo. - Voor 2D culturen, zaad muisneuronen 750.000 en rattenneuronen bij 850.000 cellen per putje. Voor 1D, zaad bij 650.000 cellen per putje. Schud de plaat iets onmiddellijk na het zaaien om homogene dekking van het dekglaasje te verzekeren.
- Onderhoud van de neuronale culturen.
- Bereid veranderende medium (CM) uit (per ml). 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml Hl HS, 10 pl 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUDR) met uridine 100x </ Li>
- Bereid eindmedium (FM) op, samengesteld uit (per ml): 0,9 ml MEM + 3G en 0,1 ml HI HS.
- Vervang PM met 1-1,5 ml CM na 4 dagen in vitro (DIV). Bij 6 DIV, vervang 50% van de CM met verse CM. Bij DIV 8, verander het medium tot 1,5 ml FM, gevolgd door een 50% verandering van FM elke 2 dagen. Na ongeveer een week ontstaat spontane synchrone activiteit.
- Imaging van spontane of opgeroepen activiteit in neuronale culturen met fluorescerende kleurstoffen.
- Bereid een oplossing van 50 μg calciumgevoelige fluorescerende kleurstof op (zie tabel van materialen / reagentia ) in 50 μl DMSO (dimethylsulfoxide).
- Bereid extracellulaire opnameoplossing (EM) die (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 sucrose (pH 7,4) bevat.
- Incubate neuronale cultuur in 2 ml EM met 8 μL van de calciumgevoelige fluorescerende kleurstofoplossing gedurende 1 uur. Bescherm tegen licht en draai voorzichtig om homogeen te verzekerenous verspreiding van de kleurstof aan de cellen.
- Vervang met een fris EM voorafgaand aan de beeldvorming. De fluorescente beeldvorming wordt getoond in figuur 4.
- Beeld in een fluorescentiemicroscoop met optische filters voor calcium fluorescentie beeldvorming (excitatie piek bij 488 nm, emissiepiek bij 520 nm), met een camera en software waarmee kwantificeren van de intensiteit van elk gebied van belang (ROI) binnen het gezichtsveld van de microscoop.
2. Elektrische stimulatie of Cultures
OPMERKING: De basisinstellingen voor elektrische stimulatie is getoond in figuur 1. Een afdekstrook waarop de neuronale kweek werd gekweekt gedurende 14 dagen geplaatst in een petrischaal onder een fluorescentiemicroscoop. Elektrische activiteit van neuronen wordt afgebeeld met behulp van calcium kleurstoffen terwijl een spanning aangelegd via twee paren bad elektroden die buiten de kweek worden geplaatst. De elektroden worden aangestuurd door alsignal generator waarvan het uitgangssignaal versterkt wordt door een dubbelkanaals versterker. Spanningsregeling voor stimulatie de voorkeur boven de meer standaard stroomregeling 25, 26 omdat het elektrisch veld vectoren direct bepaald, waardoor eenvoudige vectoroptelling en combinatie. Dit vereist een zorgvuldige controle van de uniformiteit van het elektrisch veld, waarbij over het gehele monster kan worden uitgevoerd bij spanningsregeling. Bij gebruik stuurspanning zorg moet worden genomen om aardlussen voorkomen en de homogeniteit van het elektrisch veld moet worden gecontroleerd (zie 2.2).
- Voor elektrische stimulatie met een homogeen elektrisch veld gebruiken een paar evenwijdige elektrodedraden.
- Gebruik elektroden van platina met een dikte in de orde van 0,005 "(127 urn). In combinatie met de 13 mm dekglaasjes, opdat de afstand tussen de twee elektroden is ongeveer 11 mm en plaats de elektrodeS 1 mm boven de kweek.
OPMERKING: Gebruik de polytetrafluorethyleen (PTFE) om de elektrodehouder ( Figuren 5A en 6A ) te maken. Boor smalle gaten door de PTFE om de elektroden te plaatsen. Het apparaat moet hoger zijn dan de extracellulaire oplossing, zodat het bovenste uiteinde, waar de elektroden worden blootgesteld, nooit in contact komen met de oplossing. Voor isolatie, gebruik epoxy lijm op elk deel van de elektrode leidingen die kunnen worden blootgesteld. - Gebruik een vierkante pulsvorm met een 50% duty cycle, zonder DC component om elektrolyse te vermijden. Varieer de pulsduur tussen 10 μs en 4 ms om effectieve stimulatie te veroorzaken zonder de cultuur te verbranden. Zorg ervoor dat de amplitude in de orde is van ± 22 V (zie figuur 5 ). De vierkante pols kan worden waargenomen op een parallelle parallel aan de elektroden verbonden oscilloscoop.
OPMERKING: Voor een gemakkelijke programmering van een gewenst golfvorm, gebruik een commerciële waveform editing software (zie Materialenlijst
- Gebruik elektroden van platina met een dikte in de orde van 0,005 "(127 urn). In combinatie met de 13 mm dekglaasjes, opdat de afstand tussen de twee elektroden is ongeveer 11 mm en plaats de elektrodeS 1 mm boven de kweek.
- Om te testen op veldhomogeniteit gebruik van een sonde-elektrode. Gebruik een raster van ten minste 1 mm x 1 mm om de sonde in het gebied tussen de elektroden te verplaatsen en meten van elektrische potentiaal.
- Meet elektrische potentiaal. Gebruik
het elektrische veld te berekenen. Een van de elektroden een referentie-elektrode. Meet het elektrische veld met variërende pulsduur van 100 ps tot 4 ms (zie Figuur 5B een voorbeeld van 100 ps pulsduur) om te controleren of het veld homogeen binnen het traject van stimulerende duur.
OPMERKING: Zie Figuur 5D een voorbeeld van een gemeten elektrische veld homogeniteit bij de pulsduur bedroeg 1 ms.
- Meet elektrische potentiaal. Gebruik
- Gebruik 2 loodrechte paren elektroden bad ingewikkeldere vormen elektrisch veld te produceren, enkunnen het veld in verschillende richtingen te oriënteren (zie fig. 6B). Inrichting met 2 paren elektroden worden gebruikt, en het signaal op elk paar elektroden wordt waargenomen op twee afzonderlijke oscilloscopen.
- Positioneer de elektroden 1 mm boven de cultuur en op een afstand van 10-11 mm van elkaar. Zorg ervoor dat beide elektrodeparen zweven (geen massaverbinding), en geen vast niet door het meten van de weerstand tussen een stel elektroden en verifiëren afwezigheid van kortsluiting tussen een van de elektroden. Controleren of alle gebruikte apparatuur, die verbonden is met de elektroden (zoals oscilloscopen, de versterkers, de signaalgeneratoren, etc.) zweeft ten opzichte van aarde door te controleren of alle apparatuur zweeft en dat geen van de referentie-elektroden raakt elke geaarde apparatuur.
- Om veldoriëntatie veranderen, veranderen de amplitude van de spanning toegevoerd aan de beide elektrodeparen met respect elkaar (zie figuur 7A). Bijvoorbeeld voor gebruik 0 ° ± 22 V op de elektrodepaar die loodrecht op het patroon en 0 V voor de andere elektrode. 45 ° Gebruik ± 15,6 V aan beide paren elektroden zonder faseverschuiving, een amplitude vectorsom van 15,6 2 15,6 2 2 = 22.
- Om op een roterend veld gebruiken één golfvorm van een sinusspanning puls en één enkele golfvorm van een cosinus spanningspuls aan beide paren elektroden een vaste amplitude roterende elektrische veld te produceren (zie figuur 6B).
Opmerking: Zoals in figuur 6B, kan worden gezien bij gebruik van een cyclus van een sinusgolf met ± 22 V in een elektrode en een cyclus van een cosinusgolf met ± 22 V in de andere elektrode, de vectorsom een roterende elektrische veld met de cyclusduur gelijk aan de sinus en cosinus golven, en met een amplitude van ± 22 V.
- Voor het meten en berekenen KronAxie en rheobase van axonen in de neuronale cultuur vs dendrieten in dezelfde cultuur uitvoeren de volgende stappen.
- Gebruik een calciumgevoelige fluorescerende kleurstof voor calciumafbeelding zoals beschreven in de Tabel van Materialen / Reagentia en in 1.5) met een 1D-kweekpatroon op dunne (170 μm) lange (10 mm) lijnen. Calcium gevoelige kleurstof wordt toegepast op de cultuur en gedurende 45 minuten geïncubeerd. De kleurstof wordt gewassen door te vervangen door een nieuwe opnameoplossing.
- Ontkoppel het netwerk om populatiestatistieken van het directe antwoord op elektrische stimulatie te bereiken, zonder synaptische transmissie. Doe hiervoor een combinatie van 40 μM bicuculline, die de remmende werking van gamma-aminobutyrinezuur-A (GABA A ) receptoren blokkeert, 10 μM 6-cyaan-7-nitroquinoxaline-2,3-dion (CNQX) , Om de a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoolpropionische (AMPA) en kainaatreceptoren te blokkeren en 20 μM (2R) -amino-5-fosfonovaleric acid (APV), die blokkeert de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptoren. De blokkers zal de opname-oplossing worden toegevoegd.
- Breng een rechthoekimpuls zoals beschreven in 2.1 en 2.3 met variërende tijdsduren tussen 100 us en 4 ms. Het signaal kan worden waargenomen op de oscilloscoop.
- Gebruik een fluorescentiemicroscoop met een beeldopname-programma (zie 1.5) aan de intensiteit van de calcium transiënten controleren op verschillende ROI, die elk een paar honderd neuronen. Het verwerven van beelden met behulp van een gevoelige EMCCD camera (zie Materials lijst), die in staat is een beeld verwerving van ten minste 20 frames per seconde. De verandering in lichtintensiteit evenredig met de hoeveelheid neuronen die werden gestimuleerd. Schat de fractie gestimuleerde neuronen met de relatieve verandering in intensiteit.
- Voor iedere pulsduur (100 us tot 4 ms), verandert de amplitude van de aan de elektroden vanaf een spanning waarbij geen verandering in intensiteit wordt waargenomen (enkele volt) spanning aan The spanning wanneer de veranderingen in intensiteit als gevolg van de aangelegde spanning is verzadigd (tot ± 22 V).
OPMERKING: De intensiteit wijziging wordt verspreid als een cumulatief 5 Gauss ten opzichte van de aangelegde spanning voor stimulatie voor elke tijdsduur van de spanningspuls. - Breng een cumulatieve Gauss-verdeling van de intensiteit versus de aangelegde spanning voor elke duur en extraheer de Gauss gemiddelde van deze fit.
LET OP: Dit gemiddelde is de vertegenwoordiger van de spanning waarop de neuronen gereageerd. - Aan het einde van dit proces ontvangt voor elke duur stimulatie een gemiddelde spanning waaraan de neuronen gereageerd. Gebruik deze paren duur en sterke punten van de Strength-Duration curves plotten (zie figuur 7).
het elektrische veld te berekenen. Een van de elektroden een referentie-elektrode. Meet het elektrische veld met variërende pulsduur van 100 ps tot 4 ms (zie Figuur 5B een voorbeeld van 100 ps pulsduur) om te controleren of het veld homogeen binnen het traject van stimulerende duur. 3. Magnetische Stimulatie van Cultures
Opmerking: de basisinstellingen voor magnetische stimulatie is getoond in figuur 2. Op de top rechts wordt getoondeen omgekeerde fluorescentiemicroscoop die wordt gebruikt om het calcium gevoelige kleurstoffen in de neuronen. Magneetspoel (blauwe cirkels) zich ongeveer 5 mm concentrisch boven een neuronale kweek ring, (blauw overzicht). Een opneemspoel (rode cirkel) op de omtrek van de petrischaal bewaakt de spanning geïnduceerd door de magnetische puls. Linksboven weergegeven de gemeten dynamica van de magnetische stimulator (MS) spoel met een condensatorspanning belasting van 5000 kV, zoals opgenomen vanaf de opneemspoel. Het geïnduceerde elektrische veld (berekend voor een ring radius van 14 mm) wordt getoond in groen als de magneetveld wordt weergegeven in blauw. Op de bodem worden weergegeven beelden van de neuronale cultuur. Linksonder is een lichtveld beeld van een patroon voorziene 24 mm dekglaasje. De witte gebieden zijn de neuronen. De gefotografeerde patroon bestaat uit concentrische ringen kweken met verschillende stralen. Rechtsonder is een zoom op een kort segment van de ringen, met individuele neuronen. Een schaal wid de ringenste ongeveer 200 urn.
- Groeien de neuronen in een cirkelvormige ring patroon (geëtst zoals in 1.2.5) voor 1D kweek stimulatie. Gebruik een calcium gevoelige fluorescerende kleurstof voor calcium beeldvorming (zie hoofdstuk 1.5) met een 1D cultuur patroon op dunne (170 pm), lange (10 mm) lijnen.
- Gebruik een cirkelvormige magneetspoel en plaats een Petrischaal en onder concentrische ongeveer 5 mm met de spoel. Een aangepaste spoel van ongeveer 30 mm (binnendiameter 46 mm buitendiameter) spoel met een inductantie L = 90 mH aangedreven door een zelfgemaakte of commerciële MS geladen met een maximale spanning van 5 kV.
- Ontladen een hoge spanning en stroom door een geleidende spoel moet met een snel lopende hoogspanningsschakelaar magnetisch stimuleert neuronale culturen. De magnetische stimulator (MS) kan worden opgebouwd zoals beschreven in 21 gebruiken grote condensatoren, in de orde van 100 mF, een hoogspanning van 1 te verkrijgen - 5 kV. Als alternatief een in de handelbeschikbaar MS (zie Table of Materials / reagentia).
OPMERKING: Gebruik een 0,254 mm dik en 6,35 mm breed polyestergecoat rechthoekige koperdraad met een zelfgemaakte spoel 21 te vervaardigen. Zet draden op maat gemaakte lijsten, geïsoleerd met glasvezels en gegoten in epoxy (zie tabel of Materials / reagentia). Alternatief commercieel verkrijgbaar spoelen (zie Tabel Materialen / Reagentia).
- Gebruik Draaiveld 2D culturen stimuleren.
- Gebruik nu de Draaiveld 2D culturen stimuleren. Vuur de TMS met geen enkele cultuur in de schaal, met verschillende intensiteiten, de lineaire correlatie van de spoel lezen met de intensiteiten tonen.
- Vervolgens, tijdens het opnemen calcium transiënten met een neuronale kweek, starten vuren TMS bij toenemende intensiteit tijdens het opnemen van zowel calcium transiënten en de spoel. In eerste instantie netwerk uitbarstingen waargenomen als grote calcium transiënten, should niet synchroniseren met pick-up spoel TMS spikes. Doorgaan met de intensiteit te verhogen, op een bepaald punt, het calcium transiënten beginnen te worden gesynchroniseerd met de TMS spikes. Alternatief, of daarnaast, na het bereiken van een gesynchroniseerde reactie beginnen te dalen de intensiteiten totdat synchronisatie wordt opgeheven, de TMS drempel te bepalen.
Opmerking: de voorwaarden moeten worden gehandhaafd strikt vast voor elk van de instellingen, met behulp van de exacte volume elke keer, dezelfde schepen en identificatie spoel posities en oriëntaties.- Monteer de opneemspoel op basis van de opname schotel, zodat het in een vlak evenwijdig aan de neuronale kweek en in een vaste positie ten opzichte van de kweek.
Opmerking: Dit zorgt ervoor dat de afhankelijkheid van de positionering van de opneemspoel ten opzichte van de magneet trouw aan de positie van de kweek en dat verschillen in de positionering verwaarloosbare op de opneemspoel metingen zullen zijn.- Met twee onafhankelijke wikkelingen dieloodrecht op elkaar (figuur 8B) een roterend magnetisch en geïnduceerde elektrische veld te genereren. Sluit elke spoel zijn eigen MS. Waarborgen dat de stimulatoren ontladen gelijke stromen aan een fasevertraging van 90 graden (figuur 10A), wat resulteert in een roterend magnetisch veld die 270 graden van de werkelijke ruimte scant maximaal gebied van ~ 270 V / m (Figuur 10B).
- Positioneer de neuronale kweek in een bolvormige glazen bak met de externe opnameoplossing (EM).
- Monitoren stimulatie (verandering in fluorescentie-intensiteit van de neuronen) met de camera zoals beschreven in stap 2.4.4.
- Bij het kruis spoelen (figuur 8B), plaatst de opneemspoel evenwijdig en op een bepaalde afstand onder het neuronale kweek. onderhouden van deze configuratie gedurende de experimenten voorzichtig.
- Monteer de opneemspoel op basis van de opname schotel, zodat het in een vlak evenwijdig aan de neuronale kweek en in een vaste positie ten opzichte van de kweek.
- Bereken analytisch het elektrische veld voor 1D configuratiesTIE Emax = k1 Br, waarbij Emax de maximale amplitude van de geïnduceerde elektrische veld en wordt langs de raaklijn van de ringen met radius r. B is de amplitude van de magnetische puls en k 1 is een dimensionaal evenredigheidsconstante die kunnen worden gemeten met de opneemspoel (Figuur 8A).
- Gebruik een numerieke simulatie pakket (zie Material lijst) numeriek simuleren van het elektrische veld 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gepresenteerde protocol maakt een eenvoudige patroonvorming van neuronale kweken. Wanneer het wordt gecombineerd met een aantal methoden die we ontwikkeld stimulatie, het stelt de metingen van enige intrinsieke neuron eigenschappen zoals Chronaxie en Rheobase 5 maken de eigenschappen van gezonde en zieke neuronen 27 vergelijken optimale manieren om kweken te stimuleren afhankelijk van voorbeeld hun structuur en vele andere nieuwe benaderingen. Enkele voorbeelden zijn weergegeven in de volgende figuren.
Figuur 3 toont de 1D gevormde configuraties die zijn geëtst in de bio-afstoting laag. Dunne lijnen van 170 micrometer breed zijn typisch ingeschreven die, bijvoorbeeld, concentrische ringen met verschillende radii (Figuur 3A) of parallelle lijnen, typisch -11 mm lang (Figuur 3B).
nt" fo: keep-together.within-page = '1'> Het bovenpaneel van figuur 4 toont een typisch beeld van fluorescentie-activiteit in de kweek, genomen met een ladingsgekoppelde inrichting (CCD) en met een afbeelding van fluorescent gelabelde neuronen in een 2D kweek. in dit voorbeeld drie ROI getoond, vetgedrukt, groen en rood. geïntegreerde fluorescentie-intensiteit sporen worden getoond in het onderste paneel van Figuur 4, gemeten in de drie verschillende ROI (sporen in de overeenkomstige kleur van de ROI's). Als inzet toont, in de 200 ms resolutie van het beeld acquisitie tijd waarop deze specifieke gegevens werden genomen, alle neuronen in de drie verschillende ROI barsten tegelijkertijd.De basisinrichting voor stimulering door een unidirectionele, constant elektrisch veld getoond in figuur 5A. De elektrodedraden worden ondergedompeld in het registratiemedium, ongeveer 1 mm boven het neuronale kweek.De basispulsvorm die wordt gebruikt voor elektrische stimulatie is getoond in figuur 5B . Wanneer deze spanningspuls wordt toegepast, zorgt het voor een constant elektrisch veld dat de oriëntatie 180 ° na de helft van de cyclus omklaagt. De verandering in veldrichting na de halve cyclus wordt gebruikt om elektrolyse en beschadiging van de elektroden te voorkomen. Typische spanningen die op de elektroden worden aangebracht zijn ± 22 V, en de typische pulsduur voor stimulatie van 2D culturen ligt in de orde van 100 - 500 μs.
Om te controleren op eventuele anisotropie bij de groei van neurieten, hebben we geverifieerd dat stimulatie van 2D-culturen isotropisch is. Door de elektroden handmatig te roteren in alle 360 ° bij 15 ° resolutie ( Figuur 5C ) wordt gezien dat er geen voorkeur is voor oriëntatie voor de stimulatie. Elke kleur in figuur 5C vertegenwoordigt de stimulatie van een andere cultuur. De afstand van de oorsprong vertegenwoordigt de minimale duRation nodig voor stimulatie met een constante amplitude. Het is duidelijk dat 2D culturen tot een goede benadering geen voorkeur hebben voor elektrische stimulatie.
Aangezien het enkele paar elektroden beperkt is met één gedefinieerde richting voor het veld (hoewel het kan worden omgeslagen), ontwikkelden we een apparaat voor elektrische stimulatie met twee elektroden ( Figuur 6A ). Een schematische weergave van de cultuur (grijze cirkelvormige achtergrond, donkerdere plekken zijn de cellichamen) en van de elektroden (parallelle dikke lijnen) wordt getoond in figuur 6B . Wanneer de golfvormen, weergegeven als blauwe en groene inserts in figuur 6B , cosinus- en sinusgolven zijn en samen worden toegepast, wordt er een roterend E-vectorveld geproduceerd. Wanneer de spanningsimpulsen vierkant zijn, hebben verschillende ampllituden en hebben nulfase tussen hen dan creëren ze een constant veld met de gewenste oriëntatie bepaald door de rElatieve amplitude tussen de twee elektroden. Deze elektrische rotatie is een duidelijke verbetering ten opzichte van de handmatige, mechanische rotatie die werd gebruikt om de hoekverdeling van de stimuleringssterktes in Figuur 5C te verkrijgen. Natuurlijk, zoals Figuur 6C laat zien, is het ook mogelijk om deze configuratie te gebruiken om slechts één vaste richting op te wekken, mogelijk als een controle, door slechts één paar elektroden te activeren.
Deze configuraties werden gebruikt om 2D neuronale culturen op te wekken met ofwel een roterend veld of een vaste hoek veld, met dezelfde wortel gemiddelde vierkant (RMS) spanning en vervolgens de vereiste pulsduur te vergelijken om de cultuur op te wekken als de amplitude is opgelost. We vonden dat bij gebruik van een roterend elektrisch veld met een constante amplitude van ± 22 V, een gemiddelde duur van 150 ± 14 μs nodig was om stimulatie te bereiken, terwijl bij een elektrisch veld met een richting een gemiddelde duur van290 ± 30 μs was nodig. De verhouding tussen de benodigde duur voor het opwekken van de cultuur met een roterende versus een vaste hoekveld is dus 0,53 ± 0,02.
Aangezien in een 2D-cultuur de axonen in alle richtingen uitstrekken, kan het roterende veld veel van de axonen opwekken. In tegenstelling hiermee zijn er maar enkele axons georiënteerd in die specifieke hoek en is het axonale excitatie niet bereikt. Wanneer de duur is toegenomen, zijn er ook de mogelijkheid om spannende andere delen van de neuron, in het bijzonder de dendrieten. Dit wordt nader toegelicht aan de hand van de Chronaxie metingen. Het feit dat veel kortere duur nodig is voor het opwekken van dezelfde cultuur bij het gebruik van een roterend veld is van groot belang bij het gebruik van externe velden voor hersenstimulatie, aangezien er vaak technische beperkingen zijn op de pulsduur.
figuur 7. In figuur 7A een 1D verbroken netwerk gestimuleerd met het elektrische veld hetzij langs de lijn van de kweek (bij 0 ° axonale stimulatie) of loodrecht op de lijn van de kweek (bij 90 ° dendritische stimulatie) twee paren elektroden. Wanneer de spanning toeneemt, zullen neuronen gestimuleerd en dit wordt weerspiegeld door de griepOrescence intensiteit, die evenredig is aan het aantal neuronen gestimuleerd (zie Figuur 7B ). Toenemende spanningsversterkingen worden gebruikt om de gehele cultuur geleidelijk te stimuleren. Elke neuron heeft een minimale drempelspanning (voor een specifieke pulsduur) waaraan het zal reageren, en volgens de wet van grote getallen wordt verwacht dat de verdeling van deze drempels Gaussisch is. Daarom, als we kijken naar het aantal neuronen dat reageerde en plot heeft tegen de toegepaste spanning, dan is de verdeling een cumulatieve Gaussische verdeling, een foutfunctie (erf) 5 . Het aantal neuronen dat reageert op een specifieke amplitude van elektrisch veld heeft ongeveer een Gaussische verdeling, en daarom wordt de fluorescentie goed beschreven door zijn integraal - een foutfunctie van de amplitude van het stimulerende veld ( figuur 7C ).
Figuur 7C is gebruikt om eXtract één parameter, de verwachting (gemiddelde) van de verdeling. Dit gebeurt door het aanbrengen van een cumulatieve Gauss-verdeling en het verkrijgen van de beste fit. Deze verwachting is de aangelegde spanning waaraan 50% van de cellen reageren. Dit proces wordt herhaald voor verschillende pulsduur (van 100 us tot 4 ms). De gemiddelde spanning waaraan de kweek gereageerd wordt uitgezet tegen de pulsduur aan de kracht van looptijd curve te verkrijgen. Twee sets van metingen werden uitgevoerd. In het begin was het veld evenwijdig aan het patroon en in de tweede was loodrecht hierop. Eerder is aangetoond 15, 23 die axons uitgelijnd met patroon, terwijl dendrieten groeien in alle richtingen. Dit geeft twee verschillende sterkte-duurkrommen, die zeer nuttig voor het verkrijgen van een verschil tussen de axonale en dendritische excitatie. Volledige scheiding dendritische en axonale geschreven wordt bereikt door het bekende feit dat de axonAl tijdconstante voor excitatie is veel korter dan dendritische die 2 , 3 , 4 .
De sterkte-duurscurven passen dan bij de Chronaxie bederfvergelijking 
, Waar V rh de Rheobase-spanning is en C de Chronaxie is. Bij pulsduur van t <1ms zijn het de axonen die eerst opgewonden zijn, waardoor de neuron brandt, met een lagere waarde voor excitatiespanning in de sterkte-duurscurve. Axonale Chronaxie werd berekend op 110 μs. Opvallend contrast, voor excitatie bij lange duur (t> 1 ms) is het dendritische compartiment de bron van excitatie voor de neuron met een dendritische Chronaxie, berekend op 900 μs.
De principes die de stimulatie van 2D en 1D culturen stimuleren met een circular spoel beschreven in figuur 8. Om een beter begrip van de fysische toestand te verkrijgen, worden numerieke simulaties van de magnetische en geïnduceerde elektrische velden geproduceerd met behulp van de COMSOL pakket. 1D kweken cirkelvormige magneetspoel wordt gebruikt, concentrisch boven de petrischaal stimuleren. Neuronen worden gekweekt in cirkelvormige ringen op een rond dekglaasje dat is geplaatst in de petrischaal voor opname. In dit geval is het geïnduceerde elektrische veld analytisch worden berekend, gelijk aan Emax = k1 Br, waarbij Emax de maximale amplitude van de geïnduceerde elektrische veld en wordt langs de raaklijn van de ringen met radius r. B is de amplitude van de magnetische puls en k 1 is een dimensionaal evenredigheidsconstante die kan worden gemeten met een opneemspoel.
De COMSOL numerieke berekening van het magneetveld created door de spoel in de 1D kweek wordt getoond in het bovenpaneel van figuur 8A (rood stroomlijnen). In het onderste paneel van Figuur 8A berekening behandeld voor het geïnduceerde elektrische veld. Stimulering van een 2D-kweek met gekruiste wikkeling configuratie is getoond in figuur 8B. 2D culturen flank spoel werd gebruikt die produceert Draaiveld gepositioneerd met een 2D neuronale kweek erin, in een bolvormige glazen houder die gevuld is met registratiemedium (EM) te stimuleren. In dit geval is het geïnduceerde elektrische veld niet meer analytisch worden berekend. Het kruis spoel wordt getoond in het bovenpaneel van figuur 8B, de sferische container geplaatst in de twee spoelen en de glazen dekglaasje ondersteuning van de 2D kweek op de bodem van de houder. Voor schaal, de binnendiameter van de binnenste wikkeling is 65mm. Numerieke simulaties met COMSOL de wervelstromen 3D-model worden in het bodempaneel,uitbeelden van het elektrisch veld geïnduceerd in het binnenoppervlak van de bolvormige houder. Een veldmicroscoop afbeelding van een glazen dekglaasje met typische 1D neuronale kweken gebruikt voor stimulatie helder is getoond in figuur 8C. De witte lijnen neuronen op de van een patroon lijnen, die zowel tangentiaal gericht en radiaal experimentele vergelijking en controle over het effect van directionaliteit.
Geometrie van de 1D cultuur speelt een grote rol bij het bepalen of een cultuur zal bij brand in reactie op de magnetische stimulatie. Slechts 22% van de 1D ring kweken reageerde op magnetische stimulatie. De succesvolle excitatie percentage sterk afhankelijk lineaire lengte van de cultuur, en zoals figuur 9A toont meer dan 60% van de culturen die meer dan 80 mm reageren op magnetische stimulatie. Dit houdt in dat bijzondere voorwaarden die noodzakelijk zijn voor magnetische respons zijn. Deze geometrische afhankelijkheid kweken w onderzoekenere gekweekt in configuraties die dln ringen - onder dezelfde straal maar verschillende lengtes door ze in patroon op bogen in plaats van volledige cirkels (zie figuur 8C)
Een uitgebreid onderzoek van het magneetveld drempelwaarden als functie van de radius van 1D ring kweken is weergegeven in figuur 9B. Witte cirkels experimentele metingen van stimulatiedrempels, terwijl de kleurcodering geeft de berekende waarschijnlijkheid een prikkeldrempel meten. Een stimulatiedrempel wordt gedefinieerd als de zwakste gebied dat nog steeds voor een gegeven neuronale kweek opwekt.
Figuur 9B benadrukt de trend die grotere ringen lagere stimulatiedrempels, namelijk omgekeerd verband tussen de straal van de ringen en de stimulatiedrempel. Bijvoorbeeld het gemiddelde 14 mm ring reageert magnetic impulsen met een amplitude van 1,5 T, terwijl de gemiddelde 7 mm ring alleen reageert 3 T of meer. Dit wordt verwacht van de theoretische berekening van de geïnduceerde elektrische veld, dat wordt afgebeeld als de kleurgecodeerde voorspelde kans om te schieten. Inderdaad, het elektrische veld geïnduceerd door 3T op een straal van 7mm gelijk aan die geïnduceerd met 1,5 T met tweemaal de straal. Samengevat, het gemiddelde elektrisch veld drempel 301 ± 128 (standaardafwijking) V / m, onafhankelijk van de straal van de ring kweken.
In tegenstelling tot de enkele cirkelvormige spoel, die geen respons konden opwekken in 2D culturen 15 30 2D-kweken die werden gestimuleerd door draaiveld magnetische stimulatie reageerden barsten neuronale excitatie. De twee onafhankelijke spoelen die loodrecht op elkaar (figuur 8B) genereren roterende magnetische en elektrische velden opgewekt. Elke spoel is verbonden met zijn eigen MS beide Discharge gelijke stromen aan een fasevertraging van 90 graden. De amplitude van het elektrische veld geïnduceerd door elk van de twee spoelen in het kruis spoel configuratie uitgezet in figuur 10A, en dezelfde sporen in figuur 10B weergegeven door een polaire representatie van de richting en de amplitude van de gesuperponeerde elektrisch veld van beide spoelen . De resulterende geïnduceerde elektrische veld scant 270 graden van de werkelijke ruimte op een maximum gebied van ~ 270 V / m.
Figuur 1: Schema van de Setup gebruikt voor elektrische stimulatie van neuronale kweken. Het gewenste signaal wordt geproduceerd door een signaalgenerator met twee uitgangen die geen gemeenschappelijke aarde hebben. Deze signalen worden versterkt tot een uitgangsspanning van tot ± 30 V. De elektrische signalen worden dan via twee afzonderlijke elektrodenparen toegevoerd stimuleren van een neuronale kweek in tw gevenO orthogonale en onafhankelijke richtingen. Stimulatie van neuronen kan worden bekeken en gecontroleerd door calcium kleurstoffen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch van de installatie die wordt gebruikt voor magnetische stimulatie van neuronale culturen. A. Bovenop staat de magnetische spoel (blauwe cirkels), die 5 mm concentrisch boven de neuronale ringcultuur is geplaatst, in een Petri-schotel geplaatst (blauwe omtrek). Een pick-upspoel (rode cirkel) die zich op de omtrek van de Petri-schotel bevindt, meet de door de magnetische puls geïnduceerde spanning. Onderaan wordt de gemeten dynamiek van de magnetische stimulatorspoel getoond (met behulp van een MS-condensator spanningsbelasting van 5.000 kV), zoals geïntegreerd in de pick-upspoel. Geïnduceerde elektrische veld (berekenenED een ring radius van 14 mm) wordt getoond in groen als de magneetveld wordt weergegeven in blauw B. Een omgekeerde microscoop beelden fluorescerende kleurstoffen gevoelig voor calcium transiënten neuronen reageren op magnetische pulsen. C. Neuronen gekweekt op een patroon van concentrische ringen, die voor een effectieve stimulatie van de ring magnetische stimulator. D. Helderveld microscoopbeeld neuronen gekweekt op een lijn van het patroon. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van Patterns of 1D neuronale kweken gebruikt voor het richten van het elektrische veld met de richting van Axonal Growth. A. cirkelpatroon wordt gebruikt voor de cirkelvormige magnetische spoel, wanneer de geïnduceerde ele ctric gebied een cirkelvormige oriëntatie. B. Lijnpatronen worden gebruikt wanneer de geïnduceerde of directe elektrische veld een enkele oriëntatie.
Figuur 4: Voorbeeld Sporen van calcium transiënten Bedrukte Tijdens Synchroon Network Bursts. A. Een afbeelding van neuronen die eerder werden geverfd om het experiment met een calcium kleurstof. B. Sporen van de intensiteit tegen de tijd van de ROI's in een met de kleur van de sporen die de kleur van de rand van de ROI A. Een grote toename in intensiteit gesynchroniseerd binnen drie ROI representeert een netwerk burst. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
54357fig5.jpg"/>
Figuur 5: Basic Setup Voor de elektrische stimulering, met behulp van een paar van de Parallel Bath elektroden om te bepalen dat 2D culturen Heb geen voorkeursrichting van de elektrische stimulatie. A. Apparatuur voor kweek stimulatie. Het elektrische veld wordt gevormd door aanleggen van een spanning op de platinadraad elektroden. De afstand tussen de twee draden 13 mm. B. Een voorbeeld van een spanningssignaal dat wordt aangebracht op de elektroden A. De bipolaire vorm van de puls helpt elektrolyse van de opname-oplossing aan de elektroden te voorkomen. C. Wanneer stimuleren van een 2D-kweek in verschillende rotaties van de elektroden is isotropie van de neuronale respons. D. Een voorbeeld van het elektrisch veld gemeten volgens de in stap 2.2 beschreven probe. Het elektrische veld is uniform een fout van maximaal 10%. Dit cijfer is aangepast 5.uploaden / 54357 / 54357fig5large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Elektrische stimulatie met twee paar elektroden Maakt rotatie van het elektrische veld en voor stimulatie in elke gewenste hoek. A. Voor meer ingewikkelde vormen van het elektrische veld te produceren, worden twee afzonderlijke elektrodenparen nodig. B. Het aanbrengen van een spanning cosinus vormige puls met een elektrode en een sinusvormige puls op de tweede elektrode creëert een roterend elektrisch veld met constante amplitude. C. aanbrengen van een vierkant spanningspuls één paar elektroden wordt een unidirectioneel uniform elektrisch veld. Dit cijfer is aangepast 5. Gelieve click hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Network uitschakeling door het blokkeren van Synaptic ingangen (zoals beschreven in 2.4.2) Hiermee waarneming van de totale bevolking van enkele cellen die gestimuleerd worden door een gegeven Electric Field. A. Door verschillende amplituden van spanningspulsen aan de twee elektrodenparen, kan het elektrische veld worden gericht op elke hoek zonder de noodzaak om de kweek handmatig schakelen. B. Voorbeeld opnames van calcium transiënten met elektrische stimulatie bij verschillende aangelegde spanningen. Vier sporen worden weergegeven, enigszins verticaal verschoven stand mogelijk te maken. Voltage waarden worden geschreven onder de blauwe sporen. C. Bij toepassing van een constante tijdsduur van elektrisch veld, het aantal neuronen die worden geactiveerd in reactie op het elektrische veld een cumulatief distribution functie (CDF) dat een cumulatieve Gaussische verdeling (of een erf functie) als functie van de amplitude van de spanning (die evenredig is met de veldsterkte). D. Een voorbeeld van een Strength-Duration curve verkregen onder toepassing van dit protocol. Dit cijfer is aangepast 5. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: magnetische spoel Configuratie en Berekening van het veroorzaakte elektrische gebied. A. Op boven een cirkelvormige spoel (blauwe cirkels) zich 5 mm boven ééndimensionale neuronale kweken ring (blauw schijf). De ringen zijn parallel en concentrisch met de spoel, waarbij een magnetische puls die is georiënteerd langs de rode lijnen ontstaat. Door Faraday's wet, het geïnduceerde elektrische veld ligt in vlakken die parallel aan de spoel samen ringen concentrisch te zijn. In de grond is een horizontale doorsnede volgens het vlak van de ring kweken. De relatieve waarde van het elektrische veld kleurcodering met de richting aangegeven door pijlen. Grotere ringen omsluiten een groter gebied van flux en dus het elektrisch veld geïnduceerde is hoger. B. Afbeelding van het kruisspoel magnetische stimulator (boven) en een simulatie van het elektrische veld dat wordt geïnduceerd door het. C. patroon gebruikt om neuronen die kunnen worden gestimuleerd met ofwel een ronde elektrisch veld of een radiaal elektrisch veld groeien. Dit cijfer is gewijzigd van 21, 28. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
9" src = "/ files / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg" />
Figuur 9: Reactie Ring culturen naar Magnetic Field. A. Het slagingspercentage van de stimulatie groeit met de straal van de cultuur. De foutbalken geven de standaardfout (SE). B. De relatie tussen ringgrootte en magnetische veldsterkte wordt weergegeven. De kans om de cultuur te wekken is een kleurcode. Inderdaad succesvolste excitaties van culturen liggen de overlap tussen de experimenteel toegankelijk faseruimte (witte rechthoek) en de hoge waarschijnlijkheid gebied (rood). Dit cijfer is aangepast 21. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: roterend magnetisch veld Setup Field. </ strong> A. Teneinde een roterende elektrische veld induceert bij het stimuleren van het kruisspoelinstrument magnetische stimulator, een faseverschuiving van 90 graden nodig tussen de twee spoelen. Getoond wordt het elektrische veld geïnduceerd in een opneemspoel geplaatst op 2 aangrenzende vleugels van het klaverblad spoel. De spoelen werden gescheiden door 2 commerciële stimulatoren aangedreven. B. Een reconstructie, waarvan een voorbeeld in A bochten van het resulterende elektrische veld amplitude en richting gedurende een puls van het klaverblad spoel. Dit cijfer is gewijzigd van 21, 28. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1D patroon is een belangrijk instrument dat kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen. Zo hebben we 1D patroonvorming gebruikt voor het maken logische poorten van neuronale kweken 29 en recenter in Chronaxie en Rheobase rat hippocampale neuronen 5 gemeten en de vertraging van het signaal voortplantingssnelheid schietbanen activiteit Downsyndroom hippocampale neuronen vergeleken met de wildtype (WT) hippocampale neuronen 27. De voorgestelde protocol voor 1D patroon is robuust en het is gemakkelijk om elk gewenst patroon te vormen. Wij stellen voor om de 1D cultuur te observeren alvorens metingen op de hoogte zijn van alle mogelijke onderbrekingen van het netwerk, waardoor zijn functie kunnen beïnvloeden.
Chemische patroonvorming van neuronale configuraties heeft een opvallende geschiedenis 30, 31, 32. We vonden dat onze aanpak opbrengstS vergelijkbare resultaten met chemische patreren, maar ze zijn robuuster en makkelijker te bereiken. Onlangs is de optie voor microfluidische patterning van neuronen een interessant alternatief geworden voor de aanpak die we aanbieden, met een vergelijkbare eenvoud en gebruiksvriendelijkheid 33 , 34 . De microfluidische benadering wordt in ons laboratorium gebruikt in parallel met de hier beschreven etsmethode.
Zoals we 5 hebben getoond, hebben 2D culturen geen voorkeur georiënteerd en hun stimulatie is isotropisch en hangt niet af van de oriëntatie van het toegepaste veld. Kortere duurzaamheden zijn nodig voor stimulatie van 2D culturen wanneer het veld draait. In tegenstelling hiermee zijn 1D culturen zeer afhankelijk van de oriëntatie van het veld. Wanneer het veld is georiënteerd met het patroon (en dus met de richting van axonale groei), is de duur van een vaste amplitude veld nodig voor stimulatie veel korter dan wanneer het veld oriënterened loodrecht op het patroon. Evenzo, als de tijdsduur constant wordt gehouden dan het veld nodig om de kweek te wekken kleiner als het veld en het patroon evenwijdig zijn. Wanneer loodrecht stimuleren, de veldpuls moet veel langer zijn (in de orde van een milliseconde wanneer het netwerk wordt verbroken) en vooral de dendrieten gestimuleerd. Wanneer elektrische velden (direct of geïnduceerd door een magneetveld) worden gebruikt voor hersenstimulatie, is uiterst belangrijk. Indien het hersengebied gericht is bekend dat bundels van axons hebben, kunnen deze axonen worden geëxciteerd door het oriënteren het veld in hun richting en minder stroom of korter het veld voor stimulatie nodig. Als de beoogde hersengebied geen inrichting voorkeursoriëntatie, dan is een draaiveld is efficiënter voor stimulatie. Als dendrieten zijn het doelwit van de stimulatie, langere pulsen zijn effectiever.
Magnetische velden kunnen neuronale activiteit te stimuleren wanneer een magnetische puls iOntstaat een elektrisch veld dat neuronen opwekt. Omdat momenteel haalbare magnetische pulsen in microseconden duur zijn, worden dendriten, waarvan de responstijd van de orde van milliseconden is, niet gevoelig voor magnetische stimulatie. In tegenstelling hiermee zijn axonen, wiens reactietijd sneller is, het doel van stimulatie 2 , 3 . Het antwoord van axonen op elektrische excitatie is maximaal wanneer zij evenwijdig zijn aan het elektrische veld en afneemt als zij loodrecht op het 1 , 35 liggen ; Daarom streven we in magnetische excitatie tot het opzetten van systemen waarbij het geïnduceerde elektrische veld parallel aan de gerichte axonen oriënteert. Bij het stimuleren van een 1D-ring moet het veld daarom evenwijdig aan de axonen worden georiënteerd, en de grootte van de ring bepaalt de drempel voor stimulatie. Vergelijkbaar voor de directe stimulatie door badelektroden, om een 2D-cultuur te stimuleren, wordt een roterende geïnduceerde electric veld is veel efficiënter.
De combinatie van patroonvorming van neuronen en externe excitatie met elektrisch of magnetisch veld is een krachtige techniek vele mogelijke toekomstige toepassingen. Chronaxie en Rheobase, alsmede drempel voor activering en activering vermeerdering dynamiek en snelheden zijn alle parameters die vertellen van intrinsieke eigenschappen van een neuronale cultuur. Vooral therapeutische behandelingen en het effect van geneesmiddelen en farmacologische behandeling kan worden onmiddellijk getest op de neuronen. Dit zou een efficiënte overzicht van beide ziektemodel neuronen en protocollen voor TMS stimulatie mogelijk. Op een conceptueel, het vermogen om neuronale kweken stimuleren juist leidt tot nieuwe mogelijkheden mbt de informatieverwerkingsinrichting aspecten van neurale configuraties en kunnen wij micro gedrukte schakeling die elektronische stimulatie combineert met levende neuronale netwerken nieuwe berekening verschaffen overwegenal apparaten en nieuwe hersenen interfacing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef en Eitan Reuveny voor zeer goede discussies. De auteurs bedanken Ilan Breskin en Jordi Soriano voor het ontwikkelen van vroege versies van de technologie. De auteurs bedanken Tsvi Tlusty en Jean-Pierre Eckmann voor hulp met de theoretische concepten. Dit onderzoek werd ondersteund door de Stichting Minerva, het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Israël, en door de Israëlische Wetenschapsstichting 1320/09 en de Bi-National Science Foundation Grant 2008331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
- Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
- Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
- Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
- Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
- Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
- Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
- Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
- Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
- Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
- Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
- Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
- Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
- Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
- Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
- Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
- Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
- Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
- Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
- Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
- Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).
