Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

עירור החיצוני של הנוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים ב אחד" ותרבויות דו ממדים

Published: May 7, 2017 doi: 10.3791/54357
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Summary

תרבויות עצביים הם מודל טוב ללימוד טכניקות גירוי המוח החדש דרך השפעתם על נוירונים בודדים או אוכלוסייה של נוירונים. להלן שיטות שונות עבור גירוי של תרבויות עצביות בדוגמת על ידי שדה חשמלי המיוצר ישירות על ידי אלקטרודות אמבטיה או המושרה על ידי שדה מגנטי משתנה זמן.

Abstract

תא עצב יפטר פוטנציאל פעולה כאשר פוטנציאל הממברנה שלה עולה על סף מסוים. בפעילות אופיינית של המוח, זה קורה כתוצאה תשומות הכימיקלים סינפסות שלה. עם זאת, הנוירונים יכול גם להתרגש שדה חשמלי שהוטל. בפרט, יישומים קליניים האחרונים להפעיל נוירונים ידי יצירת שדה חשמלי חיצונית. לכן עניין לחקור כיצד הנוירון מגיב לשדה החיצוני ומה גורם פוטנציאל הפעולה. למרבה המזל, יישום מדויק ומבוקר של שדה חשמלי חיצוני אפשרי עבור תאים עצביים עובריים אשר נכרתו, ניתקו גדלו בתרבויות. זה מאפשר חקירה של שאלות אלה במערכת מאוד לשחזור.

במאמר זה כמה מהטכניקות המשמשות יישום מבוקר של שדה חשמלי חיצוני על תרבויות עצביות נסקרים. הרשתות יכולות להיות חד ממדית, בדוגמת כלומר ב לינאהצורות r או מותרים לגדול על המטוס השלם של המצע, ובכך שני ממדי. יתר על כן, עירור יכול להיווצר על ידי יישום ישיר של שדה חשמלי באמצעות אלקטרודות שקוע בתוך נוזל (אלקטרודות אמבטיה) או על ידי גרימת השדה החשמלי באמצעות יצירה מרחוק של פולסים מגנטיים.

Introduction

האינטראקציה בין נוירונים ושדות חשמליים חיצוניים יש שלכות יסוד וכן פרקטי. אמנם ידוע מאז ימי וולטה ששדה חשמלי לשימוש חיצוני יכול לרגש רקמה, המנגנונים האחראים לייצור של פוטנציאל פעולה נובע בנוירונים הם רק מתחילים לאחרונה להתפורר 1, 2, 3, 4. זה כולל מציאת תשובות לשאלות לגבי המנגנון שגורם לאובדן קיטוב של פוטנציאל הממברנה, תפקידיו של תכונות הממברנה של תעלות יונים, ואפילו באזור הנוירון מגיב השדה החשמלי 2, 5. טיפולים עצביים 6, 7, 8, 9,

מדידת האינטראקציה בתוך המוח in vivo מוסיפה מרכיב חשוב להבנה זו, אבל הוא הכביד על ידי אי-הדיוק ויכולת הבקרה נמוכה של מדידות בתוך הגולגולת. לעומת זאת, מדידות בתרבויות יכולות להתבצע בקלות בנפח גבוה עם דיוק גבוה, אות מצוינת בביצועי רעש רמה גבוהה של שחזור של שליטה. שימוש בתרביות מגוון רחב של מאפיינים עצביים של התנהגות ברשת קולקטיבית ניתן הובהר 11, 12, 13, 14, 15, 16. בדומה לכך, המערכת היטב נשלטה הזה צפוי להיות יעיל מאוד הבהרת המנגנון שבאמצעותו שיטות גירוי אחרות לעבוד, למשל איך פתיחת הערוץ במהלך גירוי אופטי בנוירונים פעיל optogenetically 17, 18, 19 היא אחראית ליצירת פוטנציאל פעולה.

כאן הדגש הוא על המתאר את התפתחות והבנה של כלים שיכולים לרגש הנוירון ביעילות באמצעות שדה חשמלי חיצוני. במאמר זה אנו מתארים את ההכנה דו ממדים ותרבויות בהיפוקמפוס בדוגמת חד ממדיות, גירוי באמצעות תצורות וכיוון שונים של שדה חשמלי מיושם ישירות על ידי אלקטרודות אמבטיה, ולבסוף גירוי של דו ממדים בדוגמת תרבויות חדות ממדיות על ידי המשתנים עם זמן שדה מגנטי, אשר ומשרה שדה חשמלי5, 20, 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משפט ואתיקה: נהלים הקשורים בטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדי השתמש (IACUC) של מכון ויצמן למדע, והחוק הישראלי המתאים. מכון ויצמן הוא מוכר על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה (AAALAC). הטיפול בבעלי החיים המוסדי ויצמן ועדת השימוש אשרה במחקר זה, שנערך עם נוירונים בהיפוקמפוס.

1. הכנת דו מימדי (2D) ו חד ממדי (1D) תרבויות בהיפוקמפוס

  1. הכנת coverslips עבור תרבויות 2D.
    1. כן בינוני ציפוי (PM) הכוללת: 0.9 תקשורת חיונית מינימום המ"ל (MEM) + 3G, 0.05 נסיוב עגל עוברי מיליליטר (FCS), 0.05 סרום סוס המ"ל חום מומת (HS HI) ו 1 μL של תוסף B27. הערה: MEM + 3G מכיל לכל 500 מ"ל של ממ x 1, 1 מ"ל של gentamycin, 5 מ"ל של 100x L-גלוטמין התייצב (ראה
    2. הכן חיץ borate מורכב: 1.9 גר 'בורקס (decahydrate נתרן tetraborate) ב 200 מ"ל מים מזוקקים כפול (DDW) (לערבב ב 60 מעלות צלזיוס) ו 1.24 גרם חומצת בור ב 200 מ"ל DDW. לכייל פתרון סופי ל- pH 8.5 באמצעות 1 M HCl. הערה: הפתרון הסופי הוא 400 מ"ל 0.1 M חיץ borate.
    3. לטבול את coverslips זכוכית ב 65% חומצה חנקתית עבור 2 h. לשטוף שלוש פעמים DDW ואחריו שלוש שטיפות עם ריאגנט אנליטית המוחלט (AR ABS) אתנול.
    4. לעבור כל coverslip בקצרה דרך הלהבה של מבער בונזן שתיים או שלוש פעמים במשך 1 - 2 של, ולאחר מכן לעזוב כדי לדגור לילה 24 צלחות היטב עם 1 מ"ל פתרון 0.01% פולי- L- ליזין מדולל 1: 5 במאגר borate ( 0.1 M, pH 8.4). לאחר מכן לשטוף coverslips ב DDW שלוש פעמים ולהשאיר עם 1 מ"ל PM היטב לכל תקן 37 ° C, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה.
  2. הכנת coverslips עבור תרבויות 1D.
    1. g הנקיcoverslips נַעֲרָה ידי טבילה בתמיסה פיראניה בסיס המורכב 75 מ"ל DDW, 25 פתרון אמוניה מ"ל 25% ו 25 מ"ל מי חמצן 30%. פתרון מקום עם coverslips זכוכית על צלחת חימום ב ~ 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן לייבש את coverslips זכוכית עם חנקן.
    2. coverslips מעיל הראשון עם סרט כרום דק (99.999%) של עובי 6 ואחריו שכבה 30 א 'של זהב (99.999%), או באמצעות אדים או גמגום בתצהיר.
      1. כדי להשיג שיעור מקרטעת של 0.05 - 1 A / s להשתמש במכונת מקרטעת עם 2 דואר קורות ומערכת ואקום של 260 l / s עם יעד בגדלי 2" ו 4" . השתמש במת סיבוב שיכול ללכת מ 0 - 100 סיבובים לדקה (סל"ד). השתמש זרם ישר (DC) גמגום הכוח של 0 - 750 וואט.
      2. השתמש ברוטציה של 30 סל"ד ו ארגון 99.999% כדי לקבל פלזמה ב 10 לחץ mTorr בתא.
      3. הפעילו את אספקת החשמל של רובים המקרטעת ב 40 W כוח גמגום DC עבור כרום, שמוביל ~ 0.12 Å / s שער הכיסוי, ו ב 10 W DC כוח sputter עבור זהב, המוביל ~ 0.28 Å / s.
    3. ממיסים 0.1 גרם 1-octadecanethiol ב 100 מ"ל ABS אתנול AR באמצעות אולטרסאונד למשך 30 דקות. מקום Cr- מצופה coverslips מצופה עבור 2 שעות בפתרון זה, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול ABS ו יבש עם חנקן.
    4. הכן פתרון של 100 מ"ל Dulbecco של פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) ו -3.5 גרם של תלת לחסום שיתוף פולימר (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים ) על ידי ערבוב עבור 1 - 2 שעות ב 600 - 700 סל"ד. מקום coverslips בפתרון עבור 1 ח. יבש coverslips עם חנקן.
    5. מכני לחרוט את הדפוס הרצוי על ידי גירוד שכבת ביו דחייה 22 . לעשות זאת באמצעות הקושר עט, שבו העט מוחלף על ידי מחט תחריט. גרדו את התבנית דרך שכבות המתכת כדי להגיע אל הזכוכית הבסיסית. שליטה על תהליך זה על ידי מחשב כדי להשיג דפוס משוכפל הרצוי. דפוסים שנוצרו על ידי תהליך זה הם להדגים ד באיור 2 ואיור 3.
    6. הכן שכבת תואם-ביו של 100 מ"ל D-PBS, 3.5 גרם שיתוף פולימר Tri-גוש, 35.7 μL / פיברונקטין מ"ל ו 29 μl / laminin מ"ל.
      1. לעקר coverslips לאור אולטרה-סגול דק '10 לפחות. דגירה coverslips למשך הלילה פתרון ביו-תואם מוכן.
        הערה: השכבה ביו-התואמת תהווה היחיד שבו השכבה ביו-הדחייה כבר חרוטה מעל בשלב הקודם.
      2. ביום לשטוף למחרת coverslips פעמיים עם P-אס. דגירת coverslips ב PM הלילה. Coverslips מוכן כעת ציפוי תא.
  3. בצע לנתיחה על פי נהלים קבועים אשר פורסמו בהרחבה בעבר 23, 24.
    1. בקיצור, ההיפוקמפוס תמצית או קליפה מעובר עכברוש, בדרך כלל יום E19, או מעכברים, בדרך כלל יום E17 23,class = "Xref"> 24.
    2. לנתק התאים הראשון בתמיסת פפאין למשך 20 - 30 דקות, ואחריו טחינה דקה מכני 24 עם טפטפות זכוכית שקצותיהם הם אש מלוטשת.
      הערה: אם התאים באים עכברים מהונדסים גנטיים אז הרקמה מעוברת אחד צריכה להישמר בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר פלסטיק נפרדת במהלך התהליך כולו.
    3. ספירת תאים עם כחול trypan לפני הזריעה.
      הערה: בעלי חיים מהונדסים גנטי הספירה צריכה להיעשות בנפרד עבור כל עובר.
    4. עבור תרבויות 2D, הנוירונים עכבר הזרע בבית נוירונים 750,000 ו עכברוש בבית 850,000 תאים לכל טוב. עבור 1D, סיד 650,000 תאים לכל טוב. Shake צלחת מעט מייד לאחר הזריעה כדי להבטיח כיסוי הומוגנית של coverslip.
  4. תחזוקה של התרבויות העצביות.
    1. הכן שינוי המדיום (CM) מורכב (לכל מ"ל):. 0.9 3G מ"ל ממ +, 0.1 HS מ"ל HI, 10 μL 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) עם 100x uridine </ Li>
    2. הכן בינוני סופי (FM) מורכב (לכל מ"ל): 0.9 מ"ל ממ + 3G ו 0.1 HS מ"ל HI.
    3. החלף PM עם 1-1.5 מ"ל CM לאחר 4 ימים במבחנה (DIV). בשעה 6 DIV, להחליף 50% של CM עם CM טרי. בשלב DIV 8, לשנות את המדיום כדי 1.5 מ"ל FM, ואחריו שינוי 50% של FM כל 2 ימים. לאחר כ פעילות סינכרונית שבוע ספונטנית עולה.
  5. הדמיה של פעילות ספונטנית או עורר תרבויות עצביות עם צבעי ניאון.
    1. הכן תמיסה של 50 מיקרוגרם צבע פלואורסצנטי רגיש סידן (ראו טבלה של חומרים / ריאגנטים) ב 50 μL DMSO (sulfoxide דימתיל).
    2. כן פתרון הקלטה תאי (EM) המכיל (מ"מ) 10 HEPES, 4 KCl, 2 2 CaCl, 1 2 MgCl, 139 NaCl, 10 D- גלוקוז, סוכרוז 45 (pH 7.4).
    3. דגירה תרבות העצבית 2 מ"ל EM עם 8 μL של פתרון צבע רגיש סידן ניאון עבור 1 h. להגן מפני אור בעדינות לסובב כדי להבטיח homogenהתפשטות מפוקפקת של הצבע לתאים.
    4. חלף פתרון עם טרי EM לפני ההדמיה. הדמית פלורסנט מודגמת באיור 4.
    5. תמונה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם פילטרים אופטיים עבור דימות פלואורסצנטי סידן (שיא עירור ב 488 ננומטר, שיא פליטה ב 520 ננומטר), באמצעות מצלמה ותוכנה מסוגלת לכמת את העוצמת בכל אזור של עניין (ROI) בתוך שדה ראייה של המיקרוסקופ.

גירוי חשמלי 2. של תרבויות

הערה: תוכנית ההתקנה הבסיסית עבור גירוי חשמלי מוצג באיור 1. תלוש כיסוי שעליו תרבות העצבית כבר גדל במשך כ 14 ימים מושם בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פעילות חשמלית של תאי העצב הוא צלם באמצעות צבעי סידן רגישים בזמן מתח מוחל באמצעות שני זוגות של אלקטרודות אמבטיה הממוקמים מחוץ לתרבות. האלקטרודות הם מונעים על ידי כפיגנרטור ignal שתפוקתו המועצמת על ידי מגבר ערוץ כפול. בקרת מתח עבור גירוי עדיפה על השליטה הנוכחית הסטנדרטית יותר 25, 26 מכיוון וקטורי השדה החשמליים נקבעים ישירות, ובכך לאפשר תוספת וקטור פשוטה שילוב. זה דורש בדיקה קפדנית של האחידות של השדה החשמלי, אשר יכול להתבצע על המדגם השלם במקרה של בקרת מתח. כאשר טיפול בקרת מתח באמצעות יש לנקוט כדי למנוע לולאות קרקע ההומוגניות של השדה החשמלי צריך להיות מאומת (ראה 2.2 להלן).

  1. עבור גירוי חשמלי עם שדה חשמלי הומוגני להשתמש זוג חוטי אלקטרודות מקבילים.
    1. השתמשו אלקטרודות עשויות פלטינה עם עובי בסדר גודל של 0.005 "" (127 מיקרומטר). כאשר בשימוש עם 13 את coverslips מ"מ, להבטיח כי המרחק בין שתי האלקטרודות הוא סביב 11 מ"מ, ולמקם האלקטרודהים 1 מ"מ מעל התרבות.
      הערה: כדי להפוך את מחזיק האלקטרודה (איורים 5 א ו 6A) להשתמש polytetrafluoroethylene (PTFE). לקדוח חורים צרים דרך PTFE להכניס את האלקטרודות. המכשיר צריך להיות גבוה יותר מאשר הפתרון התאי כך בקצה העליון, שבו אלקטרודות נחשפים, לא יבוא במגע עם הפתרון. עבור בידוד, להשתמש בדבק אפוקסי על כל חלק של מוביל אלקטרודה שעשויים להיחשף.
    2. השתמש בצורה דופקת מרובעת עם מחזור העבודה 50%, ללא רכיב DC להימנע אלקטרוליזה. וארי הדופק משך בין 10 מיקרו-שניות ו 4 ms לגרום גירוי יעיל בלי לשרוף את התרבות. ודא כי משרעת היא בסדר גודל של ± 22 V (ראה איור 5). הדופק המרובע ניתן לצפות על אוסצילוסקופ מחובר במקביל אלקטרודות.
      הערה: עבור תכנות קל של כל צורת גל רצוי, להשתמש בתוכנת עריכת צורת הגל מסחרית (ראה רשימת חומרים
  2. כדי לבדוק הומוגניות שדה להשתמש אלקטרודה בדיקה. להשתמש ברשת של לפחות 1 מ"מ x 1 מ"מ כדי לאפשר הבדיקה להתרגש באזור שבין האלקטרודות ולמדוד פוטנציאל חשמלי.
    1. למדוד פוטנציאל חשמלי. להשתמש משוואה 1 כדי לחשב את השדה החשמלי. השתמש באחת האלקטרודות כמו אלקטרודה התייחסות. מדדו את השדה החשמלי משתנה משכי הדופק בין 100 מיקרו-שניות כדי 4 ms (ראה איור 5 עבור דוגמה משך הדופק 100 מיקרו-שניות) כדי לוודא שהשדה הוא הומוגני בטווח של משכי מגרה.
      הערה: ראה איור 5D עבור דוגמא הומוגניות שדה חשמלי נמדדה כאשר משך הדופק היה 1 ms.
  3. השתמש 2 זוגות בניצב של אלקטרודות אמבטיה לייצר צורות שדה חשמליות מסובכות יותר, וכדילהיות מסוגל להתמצא בשטח בכיוונים שונים (ראו איור. 6B). המכשיר עם 2 זוגות אלקטרודות ישמש, ואת האות על כל זוג של אלקטרודות תקוים על שני אוסצילוסקופ נפרד.
    1. מקם את האלקטרודות 1 מ"מ מעל התרבות במרחק של 10 - 11 מ"מ זה מזה. ודא ששני זוגות אלקטרודה הם צפים (אין חיבור לאדמה), ואין להם שום מכנה משותף על ידי מדידת התנגדות בין כל סט של אלקטרודות ואימות בהעדר קצרים בין כל האלקטרודות. ודא כי כל הציוד המשמש, אשר מחובר אלקטרודות (כגון אוסילוסקופים, המגברים, מחוללי האותות, וכו ') הוא צף ביחס לקרקע על ידי בדיקה שכל הציוד צף כי אף אחד אלקטרודות ההתייחסות נוגע כל ציוד מקורקע.
    2. כדי לשנות את הנטייה שדה, לשנות את משרעת של מתח נמאס לשני זוגות אלקטרודה עם מילpect זה לזה (ראה איור 7 א). לדוגמא, עבור 0 ° שימוש ± 22 V על זוג אלקטרודה אשר בניצב הדפוס ו 0 V עבור האלקטרודה האחר. במשך 45 °, להשתמש ± 15.6 V משני זוגות של אלקטרודות בפיגור לא שלב, תמורת סכום וקטור משרעת של 15.6 2 15.6 2 = 22 2.
    3. כדי להחיל שדה מסתובב להשתמש גל אחד של דופק מתח סינוס גל אחד בודד של דופק מתח קוסינוס לשני הזוגות אלקטרודות לייצר משרעת קבועה מסתובבת שדה חשמלי (ראה איור 6).
      הערה: כפי שניתן לראות באיור 6B, בעת שימוש מחזור אחד של גל סינוס עם ± 22 V ב אלקטרודה אחת מחזור אחד של גל קוסינוס עם ± 22 V ב האלקטרודה האחר, סכום הווקטור הוא שדה חשמלי מסתובב עם משך המחזור זהה גל סינוס וקוסינוס, וכן עם משרעת של ± 22 V.
  4. כדי למדוד ולחשב ChronAxie ו Rheobase של אקסונים בתרבות העצבית לעומת דנדריטים באותה תרבות לבצע את הצעדים הבאים.
    1. השתמש בסידן סידן רגיש סידן עבור הדמיה סידן כמתואר בטבלה של חומרים / ריאגנטים ב 1.5) עם תרבות 1D בדוגמת על רזה (170 מיקרומטר), ארוך (10 מ"מ) שורות. צבע רגיש סידן יחול על התרבות, מודגרת במשך 45 דקות. צבע יהיה שטף על ידי החלפת פתרון הקלטה טריים.
    2. לנתק את הרשת כדי להשיג נתונים סטטיסטיים של האוכלוסייה של התגובה הישירה לגירוי חשמלי, ללא ההשפעה של שידור סינפטי. כדי לעשות זאת, להחיל שילוב של 40 מיקרומטר של bicuculline, אשר חוסמת את פעילות מעכב של גמא- Aminobutyric חומצה A (GABA) קולטנים, 10 מיקרומטר של 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) , כדי לחסום את α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) ו קולטנים kainate ו 20 מיקרומטר של (2R) -amino-5-phosphonovaleחומצה כלורית (APV), אשר חוסם את הקולטנים N-methyl-D-aspartate (NMDA). החוסמים יתווספו פתרון ההקלטה.
    3. החל דופק מרובע כמתואר 2.1 ו 2.3 עם משתנים משכי הזמן בין 100 מיקרו-שניות ו 4 ms. האות ניתן לצפות על אוסצילוסקופ.
    4. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם תוכנית רכישת התמונה (ראה 1.5) כדי לנטר את עוצמת הארעיים סידן בכמה רואיס, שכל אחת מהן מכילה כמה מאות נוירונים. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת EMCCD רגישה (ראה רשימת חומרים), מסוגלות שיעור רכישת תמונה של 20 מסגרות לפחות לשנייה. השינוי בעוצמת האור הוא יחסי לכמות של נוירונים שהיו מגורה. הערך את השבריר של נוירונים מגורה באמצעות השינוי ביחס בעצמה.
    5. עבור כל משך הדופק (100 מיקרו-שניות כדי 4 ms), לשנות את משרעת של מתח להחיל את האלקטרודות החל מהשעה מתח שבו אין שינוי בעוצמת נתפסת (כמה וולט), כדי thדואר מתח שבו השינויים בעוצמת עקב המתח מיושם כבר רוויים (עד ± 22 V).
      הערה: השינוי בעוצמת יחולק בתור 5 גאוס המצטברים בגין המתח להחיל עבור גירוי לכל משך זמן של דופק המתח.
    6. התאם הפצה גאוס מצטבר עבור עוצמת לעומת מתח מיושם לכל משך ולחלץ את הממוצע גאוס מן ההתקף הזה.
      הערה: ממוצע זהו מתח הנציג שאליו הנוירונים הגיבו.
    7. בסוף התהליך זה להשיג עבור כל משך גירוי מתח ממוצע שאליו הנוירונים הגיבו. השתמש זוגות אלה של משכים ועוצמות לשרטט עקומות הכח-Duration (ראה איור 7).

3. גירוי מגנטי של תרבויות

הערה: תוכנית ההתקנה הבסיסית עבור גירוי מגנטי מוצג באיור 2. בפינה השמאלית העליונה מוצגמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המשמש לתמונות צבע סידן רגיש הנוירונים. סליל מגנטי (עיגולים כחולים) ממוקם סביב 5 מ"מ באופן קונבנציונלי מעל תרבות טבעת עצביים, (מתאר כחול). סליל איסוף (עיגול אדום) על היקף צלחת פטרי מנטרת את המתח המושרה על ידי הדופק המגנטי. בצד שמאל למעלה מוצג הדינמיקה נמדדת של מגנטי מגנטי (MS) סליל עם עומס מתח קבלים של 5000 קילו וולט, משולב סליל טנדר. שדה חשמלי המושרה (מחושב עבור רדיוס טבעת של 14 מ"מ) מתואר בירוק בעוד השדה המגנטי מתואר בכחול. בתחתית מוצגים תמונות של התרבות העצבית. בתחתית השמאלית הוא שדה שדה בהיר של coverslip 24 מ"מ בדוגמת. האזורים הלבנים הם הנוירונים. הדפוס המצולם מורכב מתרבויות טבעת קונצנטריות עם רדיוסים שונים. בפינה הימנית התחתונה הוא זום על קטע קצר של הטבעות, מראה נוירונים בודדים. עבור קנה מידה, רוחב הטבעותה הוא כ 200 מיקרומטר.

  1. לגדל את הנוירונים בתבנית טבעת עגולה (חרוט כמתואר 1.2.5) עבור גירוי תרבות 1D. השתמש צבע פלואורסצנטי רגיש סידן הדמיה סידן (כמתואר בסעיף 1.5) עם תרבות 1D בדוגמת על רזה (170 מיקרומטר), רב קווי (10 מ"מ).
    1. השתמש סליל מגנטי עגול ולמקם בצלחת פטרי כ 5 מ"מ מתחת קונצנטריים עם הסליל. השתמש סליל המנהג של כ 30 מ"מ (קוטר פנימי, קוטר חיצוני 46 מ"מ) סליל עם השראות של L = 90 MH מונע על ידי MS תוצרת בית או מסחרי טעון עם מתח מקסימלי של 5 קילו.
    2. פריקת מתח גבוה וזרם דרך סליל מוליך באמצעות מתג גבוה הנוכחי-מתח גבוה כדי לעורר תרבויות עצביות מגנטי. ממריץ מגנטי (MS) יכול להיבנות כמתואר 21 באמצעות קבלים גדולים, בסדר גודל של 100 MF, כדי להשיג מתח גבוה של 1 - 5 קילו. לחלופין להשתמש באופן מסחריMS זמין (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים).
      הערה: השתמש 0.254 מ"מ עובי ו 6.35 מ"מ רחב צופה פוליאסטר מלבן חוט נחושת לפברק סליל תוצרת בית 21. מפעיל את החוטים על מסגרות בהתאמה אישית, מבודד עם סיבי זכוכית ומטיחן אפוקסי (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים). לחלופין להשתמש סלילי זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים / ריאגנטים).
  2. השתמש מסתובב בשדות מגנטיים כדי לעורר תרבויות 2D.
  3. עכשיו, השתמש בשדות מגנטיים מסתובבים כדי לעורר תרבויות 2D. לפטר את TMS ללא תרבות בצלחת, בעוצמות שונות, כדי להראות את הקשר הליניארי של קריאת הסליל עם העוצמות.
  4. הבא, בעת ההקלטה ארעית סידן עם תרבות עצבית, להתחיל ירי TMS להגדיל עוצמות בעוד הן ההקלטה ארעית סידן ואת הסליל. בתחילה, התפרצויות רשת שנצפו כמו הארעיים סידן גדולים, shoULD לא לסנכרן עם להרים קוצים TMS סליל. המשך להגביר את העצימות, בשלב מסוים, הארעי סידן מתחיל להיות מסונכרן עם קוצי TMS. לחלופין, או בנוסף, לאחר השיג תגובה מסונכרנת, להתחיל להקטין את העוצמות עד הסנכרון הוא בוטל, כדי לקבוע את סף TMS.
    הערה: יש לשמור על תנאי קבוע אך ורק עבור כל אחד מהערכים, באמצעות הנפח המדויק בכל פעם, באותו כלי ועמדות סליל מדויקים אורינטציות.
    1. הר סליל הטנדר על הבסיס של מנת ההקלטה, כך שהוא נמצא במקביל מטוס לתרבות העצבית ו בתנוחה קבועה ביחס לתרבות.
      הערה: הדבר מבטיח כי התלות של המיצוב של סליל האיסוף ביחס המגנט הוא נאמן לתפקיד התרבות ושכל בפערים בין המיצוב יהיו זניחים על קריאות סליל איסוף.
      1. השתמש בשני סליליים עצמאיים כי הםבניצב זה לזה (איור 8B) כדי ליצור שדה חשמלי מגנטי מושרה מסתובב. חברו כל סליל כדי MS משלו. ודא כי לגירוי לפרוק זרמים דומים בפיגור פאזה של 90 מעלות (איור 10A), וכתוצאה מכך שדה מגנטי מסתובב שסורק 270 מעלות של המרחב האמיתי במגרש מרבי של ~ 270 V / m (האיור 10B).
      2. מקם את התרבות העצבית בתוך מיכל זכוכית כדורי מלא פתרון ההקלטה החיצוני (EM).
      3. נטור גירוי (שינוי בעוצמת קרינה של נוירונים) עם המצלמה כפי שמתואר בשלב 2.4.4.
      4. במקרה של סלילי צלב (איור 8B), למקם את ההקבלה סליל איסוף ובמרחק ספציפי מתחת תרבות העצבית. בזהירות לשמור את התצורה הזו לאורך כל הניסויים.
  5. חישוב אנליטי השדה החשמלי עבור configura 1Dtion ידי E max = k 1 Br, כאשר E מקס הוא משרעת מקסימלית של השדה החשמלי המושרה ואת מכוונת לאורך המשיק של טבעות עם רדיוס r. B היא האמפליטודה של פולס מגנטי ו k 1 הוא קבוע המידתיות ממדי שניתן למדוד באמצעות סליל איסוף (איור 8 א).
  6. השתמש חבילת סימולציה נומרית (ראה רשימת חומר) כדי לדמות את השדה החשמלי 21 מספרית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המובא מאפשר דפוסים קלים של תרבויות עצביות. כאשר הוא משולב עם כמה שיטות שפיתחנו עבור גירוי, הוא מאפשר לבצע מדידות של כמה תכונות הנוירון מהותי כגון Chronaxie ו Rheobase 5, להשוות המאפיינים של נוירונים בריאים וחולים 27, כדי למצוא דרכים אופטימליות כדי לעורר תרבויות כפונקציה של המבנה שלהם ואת גישות חדשות רבות יותר. כמה דוגמאות מוצגות הנתונים הבאים.

איור 3 מראה את 1D בדוגמת תצורות חרותות השכבה ביו-הדחייה. קווים דקים של כ 170 מיקרומטר רוחב בדרך כלל חקוקים שיכולים, למשל, להיות טבעות קונצנטריות עם רדיוס משתנה (איור 3A) או קווים מקבילים, בדרך כלל ~ 11 מ"מ ארוך (איור 3B).

Nt ": לשמור יחד.בעוד הדף =" 1 "> הלוח העליון של איור 4 מראה תמונה טיפוסית של פעילות ניאון בתרבות, נלקח עם מכשיר מצמידים תשלום (CCD) ומראה תמונה של שכותרתו fluorescently נוירונים בתרבות 2D.בדוגמה זו שלושה ROIs שונים מוצגים, מסומנים בשחור, ירוק ואדום.שילוב משולב עקבות הקרינה מוצגים בלוח התחתון של איור 4 , נמדד אלה שלושה החזרים ROI שונים (עקבות הם בצבע המתאים של ההחזר על ההשקעה) .כפי מראה הבלעה, בתוך 200 ms ברזולוציה של זמן הרכישה מסגרת שבו נתונים ספציפיים אלה נלקח, כל הנוירונים בשלושת ROIs שונים התפוצצו בו זמנית.

המנגנון הבסיסי המשמש לגירוי על ידי חד כיווני, שדה חשמלי קבוע מוצג באיור 5 א . חוטי האלקטרודה שקועים במדיום ההקלטה, על 1 מ"מ מעל התרבות העצבית.הצורה הדופקת הבסיסית המשמשת גירוי חשמלי מוצגת באיור 5 ב. כאשר דופק מתח זה מוחל זה יוצר שדה חשמלי קבוע כי סלטות האורינטציה שלה על ידי 180 מעלות אחרי חץ המחזור. השינוי בכיוון השדה לאחר חצי מחזור משמש כדי למנוע אלקטרוליזה נזק אלקטרודות. מתחים אופיינית להחיל את האלקטרודות הם ± 22 V, ואת משך הדופק אופייני גירוי של תרבויות 2D היא בסדר גודל של 100 - 500 מיקרו-שניות.

כדי לשלוט על כל אנאיזוטרופיה בצמיחת neurites, אנו מאשרים כי גירוי של תרבויות 2D הוא איזוטרופי. על ידי סיבוב אלקטרודות ידני בכל 360 ° ב 15 ° רזולוציה (איור 5 ג) זה נראה כי אין העדפה של האוריינטציה של גירוי. כל צבע באיור 5C מייצג את הגירוי של תרבות אחרת. המרחק מן המקור מייצג את du המינימאלימנה דרושה גירוי עם משרעת קבועה. ברור כי, כדי קירוב טוב, תרבויות 2D אין אורינטציה מועדפת עבור גירוי חשמלי.

מאז זוג אחד של אלקטרודות מוגבל שיש כיוון מוגדר אחד עבור השדה (אם כי ניתן התהפך), פיתחנו מנגנון עבור גירוי חשמלי עם שני זוגות של אלקטרודות (איור 6 א). סכמטי של התרבות (רקע עגול אפור, כתמים כהים הם גופי התא) ושל אלקטרודות (קווים עבים מקבילים) מוצג באיור 6B. כאשר הגל, הראה כתוספות כחולות וירוקות באיור 6B, הם קוסינוס ו גלי סינוס מוחל יחד אז שדה וקטורים E מסתובב מופק. כאשר פולסי המתח הם רבועים, יש אמפליטודות שונות ויש אפס שלב בפיגור ביניהם ואז הם יוצרים שדה מתמיד עם הכיוון הרצוי שנקבע על ידי rמשרעת elative בין שני זוגות של אלקטרודות. סיבוב חשמלי זהו שיפור ברור מעל סיבוב ידני, מכני ששימש להשיג חלוקת הזוויתי של עוצמות הגירוי באיור 5C. כמובן, כמו איור 6C מציג, אפשר גם להשתמש בתצורה זו להלהיב רק בכיוון אחד קבוע, ואולי כביקורת, על ידי הפעלת רק זוג אחד של אלקטרודות.

תצורות אלה שמשו להלהיב תרבויות עצביות 2D עם או בשדה מסתובב או שדה קבוע זווית, עם אותו השורש ממוצע הריבועים (RMS) מתח ולאחר מכן להשוות את משך הדופק צריך להלהיב את התרבות כאשר משרעת קבועה. מצאנו כי כאשר באמצעות שדה חשמלי מסתובב עם משרעת קבועה של ± 22 V, במח"מ של 150 ± 14 מיקרו-שניות היה צורך להשיג גירוי, ואילו עם שדה בודד כיוון חשמלי במח"מ של 290 ± 30 מיקרו-שניות היה צורך. היחס בין משכי דרושים מרגש התרבות עם סיבוב מול שדה קבוע זווית ולכן 0.53 ± 0.02.

מאז בתרבות 2D האקסונים להאריך לכל הכיוונים, בתחום המסתובב הוא מסוגל להלהיב רבים של אקסונים. לעומת זאת, עם שדה האורינטציה היחיד יש רק כמה אקסונים אורינטציה כי הזווית ספציפית עירור אקסונלית אינו מושג. כאשר משך ביקור מוגבר, קיים אפשרות של חלקים אחרים מרגשים של הנוירון כמו גם, ובעיקר דנדריטים. זה מוסבר בהמשך בתיאור מדידות Chronaxie. העובדה הרבה משכים קצרים נדרשים עבור עירור של אותה התרבות בעת שימוש בשדה מסתובב היא בעל חשיבות גבוהה בזמן שימוש בשדות חיצוניים עבור גירוי מוחי, שכן יש לעתים קרובות מגבלות טכניות על משכי הדופק.

-page = "1"> נקודה חשובה היא כי בתוך רשת מחוברת (ללא חוסמי הסינפטי מיושמים) עירור הוא ביוזמת אחוז קטן של נוירונים, אשר לאחר מכן להלהיב את שאר הרשת באמצעות קשרים סינפטיים. משמעות הדבר היא כי מספר קטן של נוירונים להשתלט על המדידה. כדי להשיג מדידות לשחזור וכמותיים היה צורך לנטר את נתוני אוכלוסייה המלאים ברשת, אשר נותקה באמצעות חוסמי הסינפטי. השרטוטים עבור התצורה להשתמש כדי לפקח על תגובת האוכלוסייה במהלך ריגושים אקסונלית לעומת אלה דנדריטים מוצגים באיור 7. באיור 7A רשת מנותקת 1D מגורה עם השדה החשמלי או לאורך הקו של התרבות (ב 0 ° לגירוי אקסונים) או בניצב לקו של התרבות (ב 90 ° לגירוי דנדריטים) על ידי שני זוגות של אלקטרודות. כאשר המתח מוגבר, נוירונים יותר יהיה מגורה, וזה בא לידי ביטוי על ידי השפעתעוצמת orescence, אשר עומדת ביחס למספר הנוירונים המגורים (ראה איור 7 ב). אמפליטודות מתח הגדלה משמשות כדי לעורר את התרבות כולה בהדרגה. כל נוירון מתח סף מינימלי (למשך דופק ספציפיים) שהוא יגיב, ולפי חוק המספרים הגדולים, חלוקת ספי אלה צפויה להיות גאוס. לכן, אם אנו בוחנים את מספר הנוירונים כי הגיבו ואת העלילה זה נגד המתח המיושם, החלוקה תהיה הפצה גאוס המצטבר, אשר מהווה פונקצית שגיאה (ERF) 5. מספר הנוירונים כי להגיב משרעת ספציפית של שדה חשמלי יש כ הפצת גאוס, ולכן הקרינה מתוארת היטב על ידי אינטגרלית שלה - פונקצית שגיאה של משרעת השדה מגרה (האיור 7C).

איור 7C משמש לדוארxtract אחד פרמטר, הציפייה (ממוצע) של ההפצה. הדבר נעשה על ידי התאמת הפצה גאוס המצטבר וקבלה בכושר הטוב ביותר. ציפייה זו היא המתח להחיל אשר 50% מהתאים יגיבו. תהליך זה חוזר על משכי הדופק מספר (החל 100 מיקרו-שניות כדי 4 ms). המתח הממוצע שאליו התרבות הגיבה זמם לעומת משך הדופק כדי להשיג את עקומת כוח-משך. שני סטים של מדידות בוצעו. בחלק הראשון בתחום היה מקביל לדפוס, ובמקרה השני זה היה בניצב אליו. הוכח בעבר 15, 23 כי האקסונים להתיישר עם דפוס, תוך דנדריטים לגדול לכל הכיוונים. זה נותן שתי עקומות כוח-משך שונים, אשר הם מאוד שימושי לקבלת הבדל ברור בין אקסונים ו עירור דנדריטים. הפרדה מלאה לתרומות דנדריטים אקסונלית מושגת על ידי העובדה הידועה כי האקסוןאל הזמן קבוע עבור עירור הוא הרבה יותר קצר מאשר אלה דנדריטים 2 , 3 , 4 .

עקומות חוזק משך מכן מתאימים את משוואת ריקבון Chronaxie משוואה 2 , כאשר V rh הוא מתח Rheobase ו- C הוא Chronaxie. במרווחי הדופק של t <1ms זה האקסונים הנרגשים הראשונים ולגרום לנוירון לירות, בעל ערך נמוך יותר עבור מתח עירור בעקומת כוח-משך. Axonal Chronaxie חושב להיות 110 μs. בניגוד בולט, עבור עירור על משכי זמן ארוכים (t> 1 MS) תא דנדריטים הוא המקור של עירור עבור נוירון עם Chronaxie דנדריטים מחושב ב 900 μs.

העקרונות הבסיסיים גירוי של תרבויות 2D ו 1D עם סיבסליל cular מתואר באיור 8. כדי להשיג הבנה טובה יותר של המצב הפיזי, סימולציות נומריות של השדות המגנטיים מושרים החשמליים מיוצרות באמצעות חבילת COMSOL. כדי לעורר תרבויות 1D סליל מגנטי עגול משמש, מיקומו concentrically מעל צלחת פטרי. נוירונים גדלים טבעות מעגליות על coverslip עגול ממוקמות בתוך צלחת פטרי להקלטה. במקרה זה השדה החשמלי המושרה ניתן לחשב אנליטית שווה מקסימום E = k 1 Br, כאשר E מקס הוא משרעת מקסימלית של השדה החשמלי המושרה ואת מכוונת לאורך המשיק של טבעות עם רדיוס r. B היא האמפליטודה של פולס המגנטי ו k 1 הוא קבוע מידתי ממדית שניתן למדוד באמצעות סליל איסוף.

החישוב המספרי COMSOL של ג השדה המגנטיreated ידי הסליל בתרבות 1D מוצג בחלק העליון של האיור 8A (מייעלת אדומה). בלוח התחתון של איור 8A החישוב מוצג עבור השדה החשמלי המושרה. גירוי של תרבות 2D עם תצורת סליל חצתה מוצג באיור 8B. כדי לעורר תרבויות 2D סליל צלב שמש שמייצר מסתובב בשדות מגנטיים, מיקומו עם תרבות 2D עצבית בתוכו, ממוקמת במכל זכוכית כדורי כי הוא מלא הקלטה בינונית (EM). במקרה זה השדה החשמלי המושרה כבר לא יכול להיות מחושב בצורה אנליטית. הסליל החוצה מתואר בלוח העליון של 8B האיור, עם מכל הכדורים הממוקם בתוך השנייה הסלילי ואת coverslip זכוכית תמיכת תרבות 2D ממוקמת בתחתית המכל. עבור סולם, הקוטר הפנימי של הסליל הפנימי הוא 65mm. סימולציות נומריות באמצעות COMSOL עם מודל 3D זרמי המערבולת מוצגות בלוח התחתון,המגלם את השדה החשמלי מושרה על פני השטח הפנימיים של המכל הכדורי. תמונת מיקרוסקופ השדה בהירה של coverslip זכוכית עם תרבויות עצביות 1D טיפוסיים המשמשות גירוי מוצגת באיור 8C. הקווים הלבנים מראים נוירונים על הקווים בדוגמת, אשר מכוונים הוא בעקיפין ו רדיאלית להשוואת הניסיון ובקרנו על ההשפעה של כיווניות.

גיאומטריה של תרבות 1D משחקת תפקיד גדול בקביעה אם תרבות תיפטר בתגובה לגירוי מגנטי. רק 22% של תרבויות טבעת 1D הגיבו גירוי מגנטי. שיעור העירור המוצלח תלוי בחום על האורך ליניארי של התרבות, וכפי שניתן לראות בתרשים 9A, יותר מ 60% של תרבויות שהורכנו מ 80mm להגיב לגירוי מגנטי. משמעות הדבר הוא כי תנאים מיוחדים דרושים בתגובה מגנטית. כדי לחקור תרבויות תלות גיאומטריות זה wאלקטרה נדל"ן גדל בתצורות שאינן חלקי טבעות - נתקל באותה רדיוס אבל באורכים שונים לפי דפוסים אותם על קשתות ולא על סיבובים שלמים (ראה איור 8C)

חקירה מקיפה של ספי השדה המגנטי כפונקציה של רדיוס של תרבויות טבעת 1D מוצג באיור 9B. עיגולים לבנים מייצגים מדידות ניסיוניות של ספי גירוי, בעוד צבע קידוד מציין את ההסתברות מחושבת למדוד סף עירור. סף גירוי מוגדר כשדה החלש שעדיין מעורר תגובה עבור תרבות עצבית נתונה.

איור 9B מדגיש את המגמה כי טבעות גדולות יותר יש סף גירוי נמוך, עם מתאם הפוך ברור בין רדיוס טבעות סף הגירוי. לדוגמא, 14 מ"מ טבעת הממוצע מגיבה magnפולסים etic עם משרעת של 1.5 T בעוד טבעת 7 מ"מ בממוצע מגיב רק 3 T או יותר. זה צפוי מן החישוב התיאורטי של השדה החשמלי המושרה, אשר מתואר לפי הצבעים חזה הסתברות לפטר. ואכן, השדה החשמלי המושרה על ידי 3T ברדיוס של 7 מ"מ שווה לזו הנגרמת על ידי 1.5 T בסכום כפול רדיוס. לסיכום, סף השדה החשמלי הממוצע הוא 301 ± 128 מ '/ V (סטיית תקן), עצמאי של רדיוס תרבויות הטבעת.

בניגוד הסליל העגול הבודד, אשר לא יכולתי לעורר תגובה בתרבויות 2D, 15 של 30 2D תרבויות שגורו על ידי החלפת גירוי שדה מגנטי הגיבו עם מתפרצת עירור עצבי. שני הסלילים העצמאיים ממוקמים ניצבים זה לזה (איור 8b) ליצור מסתובבים בשדות חשמליים מגנטיים מושרים. כל סליל מחובר MS משלה, אשר שניהם dischArge זרמים דומים בשלב השהיה של 90 מעלות. משרעת השדה החשמלי המושרה על ידי כל אחד משני סלילי הצלב סליל הצלב הוא זממו בתרשים 10A , ואת עקבות אותו מיוצגים בתרשים 10B על ידי ייצוג הקוטב של כיוון ומשרעת של השדה החשמלי על שני סלילים . כתוצאה מכך נגרם שדה חשמלי של 270 מעלות של המרחב האמיתי בשדה מרבי של ~ 270 V / m.

איור 1
איור 1: סכמטי של ההתקנה משמש עבור גירוי חשמלי של תרבויות העצבית. האות הרצוי מופק על ידי מחולל אות עם שתי יציאות שאין להן קרקע משותפת. אותות אלה הם מוגבר לתת מתח המוצא של עד ± 30 V. אותות חשמליים מוזנים אז דרך שני זוגות נפרדים של אלקטרודות, מגרה תרבות העצבית ב twO כיוונים אורתוגונליים ובלתי תלויים. גירוי של נוירונים ניתן לראות פיקוח על ידי סידן צבעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: סכמטי של ההתקנה משמש עבור גירוי מגנטי של תרבויות העצבית. א בראש מוצג סליל מגנטי (עיגולים כחולים), אשר ממוקם 5 מ"מ באופן קונבנציונלי מעל תרבות הטבעת העצבית, להציב צלחת פטרי (מתאר כחול). סליל איסוף (מעגל אדום) ממוקם על היקף צלחת פטרי מודד את המתח המושרה על ידי הדופק המגנטי. בתחתית הדינמיקה הנמדדת של סליל מגנטי מגנטי מוצג (באמצעות עומס מתח קבלים MS של 5000 קילו וולט), משולב סליל איסוף. שדה חשמלי חשוף (חישובed עבור רדיוס טבעת של 14 מ"מ) מתואר בירוק ואילו השדה המגנטי מתואר תמונות מיקרוסקופ כחולות B. הפוך פלורסנט צבעים רגישים ארעי סידן של נוירונים מגיבים פולסים מגנטי. ג נוירונים גדלו על דפוס של טבעות קונצנטריות, המשמשים עבור גירוי יעיל על ידי ממריץ מגנט הטבעת. ד ברייט תמונת מיקרוסקופ שדה של נוירונים גדלה על קו אחד של הדפוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: דוגמאות של דפוסי תרבויות 1D עצביות משמשות המכוון את השדה החשמלי עם הכיוון של אקסונים צמיחה. בתבנית עגולה א משמש סליל מגנטי עגול, כאשר ele המושרה שדה ctric בעל אוריינטציה מעגלית. דפוסי קו B. משמשים כאשר השדה החשמלי המושרה או ישיר בעל אורינטציה יחידה.

איור 4
איור 4: עקבות דוגמה של הארעיים סידן צילמו במהלך סינכרוני Network התפרצויות. א תמונה של נוירונים כי נצבעו קודם הניסוי עם צבע סידן. ב עקבות של עוצמת לעומת הזמן של ROIs ב- A עם הצבע של העקבות המייצגות את צבע הגבול של ROI ב א עלייה גדולה בעצמה המסונכרנת בתוך השלושה ROIs מייצג פרץ ברשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

54357fig5.jpg "/>
איור 5: התקנה בסיסית עבור גירוי חשמלי, באמצעות זוג אחד של מקביל אמבט אלקטרודות לקבוע כי תרבויות 2D יש לא העדפה מועדפת של גירוי חשמלי. א מכשיר המשמש לגירוי תרבות. השדה החשמלי מופק על ידי החלת מתח על פלדות חוט פלטינה. המרחק בין שני החוטים הוא 13 מ"מ. ב דוגמה של אות מתח להיות מיושם על האלקטרודות ב A. הצורה הדו קוטבית של הדופק מסייעת למנוע אלקטרוליזה של פתרון ההקלטה על האלקטרודות. ג בעת גירוי בתרבות 2D סיבובים שונים של האלקטרודות, יש איזוטרופיה של התגובה העצבית. ד . דוגמה למדידת השדה החשמלי באמצעות בדיקה המתוארת בשלב 2.2. השדה החשמלי אחיד לשגיאה של עד 10%. נתון זה השתנה מ -5 .להעלות / 54,357 / 54357fig5large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: גירוי חשמלי עם שני זוגות של אלקטרודות מאפשר סיבוב של חשמל השדה לגירוי בכל זווית רצויה. א כדי לייצר צורות מורכבות יותר של השדה החשמלי, שני זוגות אלקטרודה עצמאיים נדרשים. B. החלת דופק בצורת מתח קוסינוס כדי אלקטרודה אחת דופק סינוס אל האלקטרודה השנייה ויוצר שדה חשמלי מסתובב עם משרעת קבועה. ג החלת דופק מתח בכיכר אל זוג אחד של אלקטרודות ויוצר שדה חשמלי אחיד חד כיווני. דמות זו שונתה מ 5. אנא CLאיכס כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: Network ניתוק ידי חסימת תשומות Synaptic (כמתואר 2.4.2) מאפשר תצפית של סה"כ אוכלוסיית תאים בודדים כאלה שיעלו על ידי שדה חשמלי בהינתן. א על ידי יישום אמפליטודות שונות של פולסי המתח לשני הזוגות של אלקטרודות, השדה החשמלי יכול להיות מכוון מכל זווית ללא הצורך להפוך את התרבות באופן ידני. הקלטות דוגמא ב 'של הארעיים סידן עם גירוי חשמלי במתח יישומית שונה. ארבע עקבות נראות לעין, מעט השתנה אנכית כדי לאפשר צפייה. ערכי מתח נכתבים מתחת העקבים הכחולים. ג בעת החלת משך קבוע של שדה חשמלי, מספר הנוירונים כי ייפטר בתגובת השדה החשמלי יש dist מצטברתפונקצית ribution (CDF) כי היא הפצת גאוס מצטברת (או פונקציה ERF) כפונקציה של משרעת של המתח (אשר הוא יחסים עוצמת השדה). ד דוגמה של עקומת כוח-משך שהושגו תוך שימוש בפרוטוקול זה. דמות זו שונתה מ 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8: תצורת סליל מגנטי חישוב השדה החשמלי המושרה. א למעלה יש סליל עגול (עיגולים כחולים) ממוקם 5 מ"מ מעל תרבויות טבעת עצביות חד-ממדי (דיסק כחול). הטבעות מקבילות ו קונצנטריים עם הסליל, אשר יוצר דופק מגנטי בכיוון לאורך הקווים האדומים. על ידי החוק של פאראדיי, השדה החשמלי המושרה שוכן על מטוסים כי הם מקבילים הסליל יחד טבעות קונצנטריות עם זה. בשורה התחתונה הוא חתך אופקי לאורך המטוס של תרבויות הטבעת. השווי היחסי של השדה החשמלי הוא בצבעים, עם כיוון מתואר על ידי חצים. טבעות גדולות מקיפות שטח גדול יותר של שטף ולכן השדה החשמלי מושרה יש גבוהה. תמונה ב 'של ממריץ מגנטי צולבות סליל (למעלה) סימולציה של השדה החשמלי המושרה על ידה. תבנית ג נהגו לגדל נוירונים אשר יכול להיות מגורה עם או שדה חשמלי עגול או שדה חשמלי רדיאלי. דמות זו שונתה מ 21, 28. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

9" src = "/ files / ftp_upload / 54,357 / 54357fig9.jpg" />
איור 9: תגובת תרבויות טבעת שדה מגנטי. א שיעור גירוי ההצלחה גדל עם רדיוס התרבות. ברי השגיאה מייצגים את שגיאת ההתקן (SE). ב היחס בין גודל הטבעת ועוצמת השדה המגנטי מתואר. ההסתברות להלהיב את התרבות היא בצבעים. ואכן את ריגושים המצליחים ביותר של תרבויות לשכב החפיפה בין מרחב הפאזה הנגיש באופן ניסיוני (מלבן לבן) ובאזור ההסתברות הגבוהה (אדום). דמות זו שונתה מ 21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10
איור 10: סיבוב שדה Setup שדה מגנטי. </ strong> א כדי לגרום שדה חשמלי מסתובב כאשר מגרה עם ממריץ מגנטי צולבות סליל, פאזה של 90 מעלות נדרשת בין שני הסלילים. המוצג הינו השדה החשמלי המושרה בתוך סליל איסוף ממוקם על 2 כנפיים השכנות של סליל עלה תלתן. הסלילים גורשו בנפרד על ידי 2 לגירוי מסחרי. B. שחזור, באמצעות עקומות מוצג א ', של משרעת וכיוון השדה החשמלי שנוצר במהלך הדופק של סליל עלה תלתן. דמות זו שונתה מ 21, 28. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דפוסי 1D הוא כלי חשוב שיכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים. לדוגמא, השתמשנו דפוסי 1D ליצירת שערים לוגיים מתרבויות עצביות 29 ולאחרונה למדוד את Chronaxie ו Rheobase של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה 5, ו להאטת מהירות התפשטות אותות של פעילות הירי ב נוירונים בהיפוקמפוס תסמונת דאון בהשוואה סוג בר (WT) נוירונים בהיפוקמפוס 27. הפרוטוקול הציע עבור דפוסי 1D הוא חזק וזה קל ליצור כל תבנית רצויה. אנו ממליצים לבחון את תרבות 1D לפני מדידות כדי להיות מודעות לכל ניתקים של הרשת, אשר עשוי להשפיע על התפקוד שלה.

יש דפוסים כימיים של העצבית תצורות 30 היסטוריה מכובדת, 31, 32. מצאנו כי תשואת הגישה שלנוזה תוצאות דומות דפוסים כימיים, אך עם זאת מדובר יותר חזקים ויותר קל להשיג. לאחרונה האופציה עבור דפוסים microfluidic של נוירונים הפכה אלטרנטיבה מעניינת הגישה שאנו מציעים, עם פשטות דומה וקלות השימוש 33, 34. גישת microfluidic נמצאת בשימוש במעבדה שלנו במקביל לשיטת התחריט המתוארת כאן.

כפי שהראינו 5, תרבויות 2D אין אורינטציה מועדפת והגירוי שלהם הוא איזוטרופי ואינו תלוי האורינטציה של השדה מיושם. משכים שורטר נדרשים עבור גירוי של תרבויות 2D כאשר השדה מסתובב. לעומת זאת, תרבויות 1D תלויות מאוד את הכיוון של השדה. כאשר השדה מכוון עם הדפוס (ולכן עם כיוון צמיחת אקסונים), משך בשדה קבוע משרעת הדרושים גירוי קצר בהרבה כאשר השדה הוא אוריינטed בניצב הדפוס. באופן דומה, אם משך נשמר קבוע אז השדה הדרוש כדי להלהיב את התרבות הוא קטן אם שדה הדפוס מקבילים. כאשר מגרו בניצב, דופק השדה צריך להיות הרבה יותר (לפי הסדר של אלפית שני כאשר הרשת מנותקת), ולאחר מכן בעיקר הדנדריטים הם מגורה. כאשר שדות חשמליים (ישירים או מושרה על ידי שדה מגנטי) משמשים גירוי המוח, זו היא מרחיקת לכת. אם האזור במוח הממוקד הוא ידוע כבעל צרורות של אקסונים, אקסונים אלה יכולים להתרגש ממקמים את השדה בכיוון שלהם ואז צריכים פחות כוח או משך זמן קצר יותר של השדה עבור גירוי. אם האזור במוח הממוקד אינו מעדיף אורינטציה, אז בשדה מסתובב הוא יעיל יותר עבור גירוי. אם דנדריטים הם היעד של הגירוי, פולסים יותר יעילים יותר.

שדות מגנטיים יכולים לעורר את פעילות עצבית כאשר דופק מגנטי iNduces שדה חשמלי המרגש נוירונים. מכיוון שהפעימות המגנטיות הקיימות כיום הן במיקרו-שניות, הדנדריטים, שזמן התגובה שלהם הוא בסדר של אלפיות השנייה, אינם צפויים להיות רגישים לגירוי מגנטי. לעומת זאת, האקסונים, אשר זמן התגובה שלהם הוא מהיר יותר, הם היעד של גירוי 2 , 3 . התגובה של אקסונים כדי עירור חשמלי הוא מקסימלי כאשר הם מקבילים השדה החשמלי ואת פוחתת כאשר הם בניצב אליו 1 , 35 ; לכן, בגירוי מגנטי, אנו שואפים להקים מערכות שבהן השדה החשמלי המושרה מקביל לאקסונים הממוקדים. לכן, כאשר מגרה טבעת 1D, השדה צריך להיות מקביל בכיוון האקסונים, ואת גודל הטבעת קובע את הסף לגירוי. בדומה לגירוי ישיר על ידי אלקטרודות אמבטיה, כדי לעורר תרבות 2D, סיבוב המושרה eשדה lectric הוא הרבה יותר יעיל.

השילוב של דפוסים של נוירונים ושל עירור חיצוני עם שדה חשמלי או מגנטי הוא טכנולוגיה חזקה עם יישומים עתידיים אפשריים רבים. Chronaxie ו Rheobase, כמו גם סף דינמיקת הפעלת התפשטות הפעלת מהירויות הללו כל הפרמטרים אומרים של הנכסים המהותיים של תרבות עצבית. בפרט, לטיפולי השפעת סמים או טיפול תרופתי יכולים להיבדק מייד ישירות על תאי העצב. יכולת זו תאפשר סקר יעיל של שני נוירונים מודל המחלה של פרוטוקולים עבור גירוי TMS. ביום בכיוון רעיוני יותר, היכולת לעורר תרבויות עצביות גורמת דווקא אפשרויות רומן לגבי היבטי עיבוד מידע של תצורות עצביות, ולאפשר לנו לראות בעיני רוחותינו מעגלים מודפסים מייקרו המשלבת גירוי אלקטרוני עם חי רשתות נוירונים לספק חישוב חדשמכשירים אל והתקני ממשק מוח רומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים עופר פיינרמן, פרד וולף, מנחם סגל, אנדראס Neef ואיתן ראובני לדיונים מועילים מאוד. המחברים מודים אילן ברסקין ו ג'ורדי סוריאנו לפיתוח גרסאות מוקדמות של הטכנולוגיה. המחברים מודים צבי Tlusty וז'אן-פייר אקמן לעזרה עם מושגים תיאורטיים. מחקר זה מומן על ידי קרן מינרווה, משרד המדע והטכנולוגיה, ישראל, ועל ידי ישראל למדע מענק 1320-1309 וקרן Bi-לאומי למדע מענק 2,008,331.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M Fluka  21098 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Tags

Neuroscience גיליון 123 רשתות נוירונים גירוי חשמלי גירוי מגנטי Chronaxie Rheobase הדמית סידן תרבויות בדוגמת
עירור החיצוני של הנוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים ב אחד&quot; ותרבויות דו ממדים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., … More

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter