Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bir ve İki Boyutlu Kültürlerde Elektrik ve Manyetik Alanlar Kullanan Nöronların Harici Uyarımı

Published: May 7, 2017 doi: 10.3791/54357
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Summary

Nöronal kültürler tek nöronlar üzerindeki etkisi veya nöronların nüfusu yoluyla ortaya çıkan beyin stimülasyonu teknikleri incelemek için iyi bir modeldir. Banyo elektrotlar doğrudan üretilen ya da zaman içinde değişen bir manyetik alan tarafından indüklenen bir elektrik alanı ile desenli nöronal kültürler uyarılması için farklı yöntemler burada sunulmuştur.

Abstract

zar potansiyeli, belirli bir eşik değerini aştığında bir nöron, bir eylem potansiyelini ateşleyeceği şeklindeki. beyin tipik aktivitesi, bu da sinaps kimyasal girdi bir sonucu olarak ortaya çıkar. Ancak, nöronlar da dayatılan elektrik alanı ile uyarılabilir. Özellikle, son klinik uygulamalar dışarıdan bir elektrik alanı oluşturarak nöronları aktif hale getirin. Bu nöron dış alana yanıt verir ve hangi işlemin potansiyelini nasıl neden araştırmak için ilgi odağı olmaktadır. Neyse ki, bir dış elektrik alanı hassas ve kontrollü bir uygulama, kesilmiş ayrılır ve kültür içinde yetiştirilir, embriyonik nöronal hücreler için mümkündür. Bu son derece tekrarlanabilir sisteminde bu soruların soruşturma sağlar.

Bu yazıda nöronal kültürler üzerinde dış elektrik alanın kontrollü uygulama için kullanılan bazı teknikler gözden geçirilmiştir. Ağlar ya tek boyutlu, yani linea de desenli olabilirr biçimleri ya da substrat bütün düzlemde büyümesine izin verilir ve bu şekilde iki boyutlu. Ayrıca, tahrik sıvısı (banyo elektrotlar) 'de ya da manyetik impuls uzaktan yaratılması kullanarak elektrik alanı uyararak daldırılmış elektrodlar aracılığıyla elektrik alanının doğrudan uygulanması ile oluşturulabilir.

Introduction

nöronlar ve dış elektrik alan arasındaki etkileşimin temel etkileri yanı sıra pratik olanları vardır. Bu, dışarıdan uygulanan bir elektrik alanı dokuyu harekete ki Volta zamanlardan beri bilinmekle birlikte, nöronlarda bir Sonuçta elde edilen eylem potansiyeli üretimi için sorumlu olan mekanizmalar sadece son 3, 4, 2, 1 çözülemeyen başlıyor. Bu elektrik alanı 2, 5 yanıt nöron membran potansiyelinin depolarizasyonu, membran özelliklerinin ve iyon kanallarının rolü ve hatta bölgeyi neden mekanizmasına ilişkin sorulara cevap bulmak içerir. Nörostimülasyon 6, 7, 8, 9 Tedavi,

In vivo beyin içinde etkileşimi Ölçüm Bu anlayışa önemli bir bileşen ekler, ancak hassas olmamasından ve kafatası içindeki ölçümler, düşük kontrol edilebilirlik nedeniyle engellenmektedir. Bunun aksine, kültürlerde ölçümleri kolayca yüksek hassasiyet, gürültü performansı mükemmel sinyal ve tekrarlanabilirliği ve kontrol, yüksek bir derecede yüksek hacimde gerçekleştirilebilir. Toplu ağ davranışı nöronal özelliklerinin büyük bir çeşitlilik 14, 13, 12, 11 açımlanabilir kültürleri kullanılarak, 15, 16. Benzer şekilde, bu iyi bir şekilde kontrol sistemi optogenetically aktif nöronların 17, 18 optik uyarılması sırasında kanalı açma, 19 aksiyon potansiyelinin oluşturmak için sorumlu kadar, örneğin diğer uyarım yöntemler işe hangi mekanizma, açıklık son derece etkili olduğu tahmin edilmektedir.

İşte odak verimli bir dış elektrik alanı sayesinde nöronlara heyecanlandırmak araçlar geliştirilmesi ve anlayış açıklayan üzerindedir. Bu yazıda tek boyutlu kültürleri farklı yapılandırmalar ve banyo elektrotlarla doğrudan uygulanan bir elektrik alanı yönünü, ve iki boyutlu son olarak uyarılması ile uyarı, iki boyutlu ve tek boyutlu model verilmiş hipokampal kültürlerin hazırlanmasını tarif desenli zamana göre değişen bir elektrik alanı oluşturur, manyetik alan,5, 20, 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Beyanı: Hayvan işlemeyi kapsayan Prosedürler Weizmann Bilim Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve uygun İsrail hukuk kurallarına uygun olarak yapıldı. Weizmann Enstitüsü Laboratuarı Uluslar arası Hayvan Bakım Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir. Weizmann Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi hipokampal nöronlar ile yürütülen bu çalışmayı onayladı.

(2D) iki boyutlu ve tek boyutlu (1D) Hipokampal Kültürler hazırlanması 1.

  1. 2B kültürleri için lamelleri hazırlanması.
    1. 0.9 ml minimum temel ortam (MEM) + 3G, 0.05 ml cenin buzağı serumu (FCS), 0.05 ml ısı ile inaktive edilmiş at serumu (HI HS) ve B27 takviyesi 1 uL: kaplama ortamı oluşan (PM) hazırlayın. Not: MEM + 3G MEM 1 x her 500 ml için içerir, gentamisin, 1 mL, stabilize L-glutamin 100x 5 mL (bakınız
    2. oluşan borat tamponu hazırlayın: 200 ml iki kez damıtılmış su (DDW) içerisinde 1.9 g boraks (sodyum tetraborat dekahidrat) (60 ° C'de karıştırın) ve 200 mL DDW içinde 1.24 g borik asit. 1 M HCI kullanılarak pH 8.5 nihai çözelti titre edilir. Not: Nihai çözelti, 400 mL 0.1 M borat tamponudur.
    3. 2 saat boyunca% 65 nitrik asit içinde cam lamelleri bırakın. Mutlak analitik reaktif (ABS AR), etanol ile üç kez durulanır, ardından DDW içinde üç kez yıkayın.
    4. (Borat tampon maddesi içinde 5: 2 s, ve ardından 1 seyreltilmiş 1 ml poli-L-lisin,% 0.01 çözelti ile gece boyunca 24 oyuklu plakalar inkübe bırakın - 1 Bunsen brülör alevi ile kısa bir süre, iki ya da üç kez her lamel geçmek 0.1 M, pH 8.4). Daha sonra DDW içinde üç kez lamelleri yıkayın ve gece boyunca standart bir 37 ° C de, oyuk başına 1 ml PM ile,% 5 CO2 kuluçka bırakın.
  2. 1D kültürler için lamelleri hazırlanması.
    1. Temiz gr75 mL DDW, 25 ml% 25'lik amonyak çözeltisi ve 25 ml% 30 hidrojen peroksit içeren bir baz pirana çözeltisi içine daldırma ile lass lamelleri. ~ 50 ° C'de bir ısıtma plakası üzerinde cam kapak 30 dakika boyunca ve daha sonra nitrojen ile birlikte bir cam lamelleri kuru ile yer çözeltisi.
    2. birinci yerleştirme buhar veya püskürtmeyle kullanılarak altın (% 99.999) bir 30 tabakası tarafından takip 6 Â kalınlığa sahip ince bir krom filmi (% 99.999) ile kaplayın lamelleri.
      1. 0.05 bir püskürtme hızı elde etmek için 1 - A / S 2 E-profil ve bir vakum hedefi ile 260 l / s sistemi 2" boyutları ve 4" ile bir püskürtme makinesi kullanın. (RPM) başına 100 mermi - 0 dan gidebilecekleri bir rotasyon sahne kullanın. 750 Watt - 0 gücünü sputter bir doğru akım (DC) kullanın.
      2. 30 rpm'lik bir dönme kullanarak ve oda içinde 10 mTorr basıncında plazma elde etmek için 99,999% argon.
      3. yol açan, krom DC püskürtme gücünü B 40 ° C'de püskürtme tabancaları güç kaynağı İşlet -0.12 A / s kaplama oranı, 10 ° C sıcaklıkta DC B ~ 0.28 Â / sn giden altın için güç püskürtmeyle çökeltilmesi.
    3. 30 dakika boyunca ultrason kullanılarak 100 mL ABS AR etanol içinde 0.1 g 1-oktadekanetiol çözülür. daha sonra etanol ABS AR ve azot ile yıkayın ve bu çözelti 2 saat boyunca Cr-Au kaplı lamelleri.
    4. 700 rpm - 600 2 saat - 100 mL Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (D-PBS) bir tri-blok ko-polimer 3.5 g bir çözeltisi hazırlandı 1 karıştırma ile (Malzeme / Reaktifler İçindekiler'i bakınız). 1 saat boyunca çözelti içinde lamelleri. azot ile kuru lamelleri.
    5. Mekanik olarak biyo-ret tabaka 22 kazınarak istenilen desen etch. Kalem, bir aşındırma iğne ile değiştirilir bir kalem çizici kullanılarak yapın. altta yatan cam ulaşmak için metal katmanlar ile desen kaşı. Çoğaltılmış istenilen desen elde etmek için bilgisayar tarafından bu işlemi kontrol eder. Bu işlem tarafından oluşturulan Grafikleri göstermek olan Şekil 2 ve Şekil 3'te d.
    6. 100 ml D-PBS, 3.5 g tri-blok ko-polimeri, 35.7 mL / mL fibronektin ve 29 ul / ml laminin bir biyo-uyumlu bir tabaka hazırlanır.
      1. En az 10 dakika boyunca ultraviyole ışık lamelleri sterilize edin. hazırlanan biyo-uyumlu bir çözelti içinde bir gece boyunca lamelleri inkübe edin.
        NOT: biyo-uyumlu katman biyo-ret tabakası önceki adımda kapalı kazınmış olan sadece nereye oluşturacaktır.
      2. Ertesi gün yıkama On P-DBS ile iki kez lamelleri. gecede PM lamelleri inkübe edin. Lameller artık hücre kaplama için hazır.
  3. Daha önce 23, 24 kapsamlı yayınlanmıştır standart prosedürlere göre diseksiyon.
    1. Tipik olarak, gün E19 sıçan embriyolarından kısa özüt hipokamp veya korteks, olarak, ya da tipik olarak günde farelere, E17 23'ten,class = "xref"> 24.
    2. Kimin ipuçları yangın cilalı cam pipetler ile mekanik öğütüldükten 24, ardından 30 dk, - ilk 20 için papain çözüm hücreleri ayırmak.
      Not: Hücreler daha sonra genetik olarak modifiye edilmiş farelerden geliyorsa her embriyo doku olarak tüm işlem esnasında ayrı bir 1.5 ml plastik bir tüp içinde muhafaza edilmelidir.
    3. ekim önce tripan mavisi ile hücre sayımı.
      NOT: genetiği değiştirilmiş hayvanlar için sayım her embriyo için ayrı ayrı yapılmalıdır.
    4. oyuk başına 850,000 hücre 750,000 ve sıçan nöronlarının de 2B kültürleri, tohum fare nöronlar için. 1D için, oyuk başına 650,000 hücre tohum. lamel homojen kapsama sağlamak için tohumlama sonra biraz hemen plakayı sallayın.
  4. nöronal kültürlerin Bakım.
    1. orta (mL başına) oluşan (CM) değişen hazırlayın. 0.9 ml MEM + 3G, 0.1 mL HI HS, 10 uL uridin 100x ile 5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR) </ Li>
    2. 0.9 ml MEM + 3G ve 0.1 ml HI HS: Son (mL başına) oluşan ortamı (FM) hazırlayın.
    3. In vitro olarak 4 gün (DIV), sonra 1-1.5 ml CM ile PM değiştirin. 6 DIV anda, taze CM CM% 50 değiştirin. DIV 8 'de, her 2 günde bir FM% 50 değişim, ardından 1.5 mL FM ortamı, değiştirin. Yaklaşık bir hafta sonra spontan senkron aktivite ortaya çıkar.
  5. floresan boyalar ile birlikte nöron kültürlerinde spontan veya uyarılmış aktivitesinin görüntülenmesi.
    1. 50 ug kalsiyuma duyarlı fluoresan boya, bir çözelti hazırlayın 50 uL DMSO (dimetil sülfoksit) içinde (Malzeme / Reaktifler İçindekiler'i bakınız).
    2. Hücredışı kayıt solüsyonu (EM) (mM olarak), 10 HEPES, 4 KCI ihtiva eden hazırlama 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glikoz, 45 sukroz (pH 7.4).
    3. 1 saat boyunca kalsiyuma duyarlı fluoresan boya çözeltisi 8 uL 2 mL EM nöronal kültür inkübe. Işıktan koruyunuz ve yavaşça homojen sağlamak için döndürmekhücrelere boyanın lı yayıldı.
    4. görüntüleme öncesi taze EM ile çözüm değiştirin. Floresan Görüntüleme, Şekil 4'te gösterilmiştir.
    5. Kalsiyum fluoresans görüntü (488 nm 'de uyarım pik, 520 nm dalga boyunda emisyon tepe) için optik filtrelerle bir flüoresans mikroskop görüntü, bakış alanı içinde (ROI), herhangi bir bölgesinde yoğunluğunu ölçmek yeteneğine sahip bir kamerayı ve yazılım kullanılarak mikroskop.

Kültürlerin 2. Elektrik Uyarımı

NOT: Elektrik stimülasyonu için temel kurulum Şekil 1'de gösterilmiştir. nöronal kültür yaklaşık 14 gün geliştirilmiş olan bir kapak kayma bir floresan mikroskobu altında bir Petri tabağına yerleştirilir. bir voltaj kültürün dışında konumlandırılmış banyo iki elektrot çiftleri üzerinden uygulanır ise nöronların elektriksel aktivitesi kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak görüntülenir. elektrotları tarafından sürülür, çıkış bir çift kanal amplifikatör ile yükseltilir ignal jeneratör. Uyarılması için gerilim kontrolü, böylece basit bir vektör toplamını ve kombinasyonu sağlayarak, daha çok standart akım kontrolü 25, elektrik alan vektörleri, doğrudan tespit edilir, çünkü 26 tercih edilir. Bu gerilim kontrolü durum için tüm örnek üzerinde yapılabilir elektrik alanın bütünlüğü, dikkatli bir çek gerektirir. kullanarak voltaj kontrolü bakımı herhangi Şasi döngüleri oluşmasını önlemek için alınması gereken ve elektrik alanın homojenlik doğrulanması gerekir zaman (aşağıda 2.2 bakınız).

  1. homojen bir elektrik alanı ile elektrik stimülasyonu için paralel elektrot telleri bir çift kullanın.
    1. 0.005 '' (127 um) mertebesinde bir kalınlığı olan platinden yapılmış elektrotları kullanarak. 13 mm'lik lamelleri ile birlikte kullanıldığında, iki elektrot arasındaki mesafe yaklaşık 11 mm olduğundan emin olun ve elektrot yerleştirmekkültürünün üzerinde 1 mm.
      NOT: elektrot tutucu (Şekil 5A ve Şekil 6A) kullanmak politetrafloroetilen (PTFE) yapmak için. elektrotlar eklemek için PTFE ile dar delik delin. Elektrotlar maruz kalan en sonunda, çözelti ile temas asla böylece cihaz dışı çözelti daha yüksek olmalıdır. yalıtımı için, maruz kalabileceği elektrot potansiyel herhangi bir parçası üzerinde epoksi yapıştırıcı kullanılır.
    2. elektroliz önlemek için bir DC bileşenine sahip bir% 50 görev döngüsü ile bir kare dalga şekli kullanın. kültür yakmadan etkili uyarılmasını 10 us ve 4 ms arasında puls süresi değişir. Genlik ± 22 V (bakınız Şekil 5) arasında sırayla olduğundan emin olun. kare dalga elektrot paralel olarak bağlı bir osiloskop üzerine gözlenebilir.
      NOT: istenilen dalga kolay programlama, ticari bir dalga formu düzenleme yazılımı kullanmak için (Malzemeler listesini görmek
  2. Alan homojenliğini test etmek için bir prob elektrodu kullanın. Probun elektrotlar arasındaki alan içerisinde hareket etmesini sağlamak ve elektrik potansiyelini ölçmek için en az 1 mm x 1 mm'lik bir ızgarayı kullanın.
    1. Elektrik potansiyelini ölçün. kullanım Denklem 1 Elektrik alanını hesaplamak için. Elektrotlardan birini referans elektrot olarak kullanın. Alanın uyarıcı süreler içinde homojen olduğunu doğrulamak için, 100 μs ila 4 ms arasındaki değişen darbe süreleri ile elektrik alanını ölçün (bkz. Şekil 5B , 100 μs darbe süresi örneği için).
      NOT: Darbe süresi 1 ms olduğunda, ölçülen bir elektrik alan homojenliğinin bir örneği için bkz. Şekil 5D .
  3. Daha karmaşık elektrik alan şekilleri üretmek için 2 dikey banyo elektrodu çifti kullanın ve(Şek. 6B bakınız) farklı yönlerde alan yönlendirmek mümkün. Elektrotların 2 çift cihaz kullanılır, ve elektrotlar her bir çifti üzerine sinyali iki ayrı osiloskoplarda gözlenecektir.
    1. birbirinden 11 mm - elektrotları kültür üzerinde ve 10 bir mesafede 1 mm yerleştirin. Her iki elektrot çiftleri (bir zemin bağlantısı var) yüzen, ve elektrotlar her set arasında bir direnç ölçüm ve elektrotların her arasındaki kısa devre olmaması doğrulayarak bir ortak bir zemin yok olduğundan emin olun. Kontrol ederek (örneğin vb osiloskop, amplifikatörler, sinyal verici gibi) elektrotlara bağlanır kullanılan tüm ekipman, zemine göre kayan olduğundan emin olun tüm ekipman kayan ve referans elektrot hiçbirinin değecek herhangi topraklı ekipmanı.
    2. Alan yönünü değiştirmek için, res ile iki elektrot çifti beslenen gerilim genliğini değiştirmekbirbirine pect (bkz Şekil 7A). Örneğin, 0 ° kullanımı elektrot çifti V 22 ± paternine dik olan ve diğer elektrot için 0 V. 45 ° için, 15.6 2 + 15.6 ° 2 = 22 2 bir amplitüd vektör toplamı için, herhangi bir faz gecikmesi, elektrotların her iki çifti ile 15.6 V ± kullanımı.
    3. Bir dönme alanı elektrik alan döner sabit bir amplitüd üretilmesi için bir sinüs voltaj darbesinin tek dalga biçimi ve iki elektrot çifti için bir kosinüs voltaj darbesinin tek dalga formunu kullanmak uygulamak için (bakınız ŞEKİL 6B).
      NOT: ± 22 bir elektrotta V ve diğer elektrotta ± 22 V bir kosinüs dalga bir devir ile bir sinüs dalgası bir devir kullanıldığında Şekil 6B'de görülebileceği gibi, vektör toplamı olan bir dönen elektrik alanıdır sinüs ve kosinüs dalgalarının aynı ve ± 22 V lik bir genlik ile çevrim süresi
  4. Chron ölçmek ve hesaplamak içinAynı kültürde dendritler vs nöronal kültüründe aksonların axie ve Rheobase aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. 10 mm), hatlar (uzun ince (170 um üzerinde desenli bir 1D kültürü) ile) Malzemeler / Reaktifler Tablo tarif ve 1.5 de olduğu gibi, kalsiyum görüntülemesi için bir kalsiyuma duyarlı fluoresan boya kullanın. Kalsiyum duyarlı boya kültür uygulandı ve 45 dakika süre ile inkübe edilir. boya taze kayıt solüsyonu ile değiştirerek yıkanacaktır.
    2. sinaptik iletim etkisi olmadan, elektriksel uyarım doğrudan yanıt nüfus istatistiklerini elde etmek şebekeyi ayırın. Bunu yapmak için, bicuculline 40 uM, bloklar gama-aminobütirik asit-A inhibe edici etki (GABA A) reseptörleri, bir kombinasyonunu uygulamak 10 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion uM (CNQX) , α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik (AMPA) ve kainat reseptörleri ve (2R) 20 uM amino-5-phosphonovale engellemekasitin (APV), bloke eden, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörleri. blokerler kayıt solüsyonu eklenir.
    3. 100 us ve 4 ms arasında zaman süreleri değişen 2.1 ve 2.3 de tarif edildiği gibi bir kare pulsu uygular. Sinyal osiloskopta gözlenebilir.
    4. Birkaç ROI'ler kalsiyum geçici yoğunluğunu izlemek üzere (1.5), bir görüntü elde etme programı ile, bir floresans mikroskobu kullanarak, bir kaç yüz nöronların içeren. saniyede en az 20 kare bir görüntü elde etme oranı kapasitesine sahip bir hassas EMCCD kamera kullanarak görüntü (Malzeme listesi), elde edin. ışık yoğunluğundaki değişim uyarıldı nöronların miktarı ile orantılıdır. yoğunluk nispi değişimi ile uyarılan nöronlar fraksiyonu tahmin.
    5. Her bir darbe süresi (4 ms ila 100 us) için, yoğunluğunda herhangi bir değişiklik (birkaç Volt) görülen bir voltajda başlangıç ​​elektrotlara uygulanan gerilim genliğini değiştirmek, inci(22 V ± kadar) bağlı uygulanan voltaj ile şiddetindeki değişiklikler doymuş e- gerilimi.
      Not: yoğunluk değişimi voltaj darbesinin her zaman süresi için uyarılması için uygulanan voltaj ile ilgili olarak, bir toplu Gauss 5 gibi dağıtılacaktır.
    6. Her süresince uygulanan gerilimin vs yoğunluğu için kümülatif Gauss dağılımı Fit ve bu uyum gelen Gauss ortalama ayıklamak.
      NOT: Bu ortalama nöronlar yanıt verdiği için temsili gerilimdir.
    7. Bu işlemin sonunda bu nöronların yanıt verdi, her uyarım süresi için bir ortalama gerilim elde. Güç-Süresi eğrileri çizmek için süre ve güçlü çiftlerini kullanarak (bakınız Şekil 7).

Kültürlerin 3. Manyetik Uyarım

Not: Manyetik uyarılması için temel kurulum, Şekil 2'de gösterilmiştir. Sağ üstte gösterilirNöronlarda kalsiyum duyarlı boyaların imgesinde kullanılan inverted fluorescence mikroskopu. Manyetik bobin (mavi daireler) nöronal halka kültürünün (mavi çizgi) üzerinde 5 mm'lik konsantrik olarak konumlandırılmıştır. Petri kabının çevresindeki bir başlatma bobini (kırmızı daire), manyetik darbe tarafından indüklenen voltajı izler. Sol üstte, manyetik uyarıcının (MS) bobininin ölçülen dinamikleri, başlatma bobinden entegre edildiği gibi 5.000 kV'lık bir kapasitör voltaj yüküyle gösterilmektedir. İndüklenen elektrik alanı (14 mm'lik bir halka yarıçapı için hesaplanmıştır), yeşil olarak gösterilirken, manyetik alan mavi ile gösterilir. Alt kısmında nöronal kültürün resimleri gösterilmektedir. Sol altta, desenli 24 mm lamellerin parlak bir alan görüntüsü var. Beyaz alanlar nöronlardır. Fotoğraflı desen, farklı yarıçaplara sahip konsantrik halka kültürlerinden oluşur. Sağ alt kısımda, halkaların kısa bir bölümüne zum yaparak bireysel nöronlar gösteriliyor. Bir ölçek için yüzüklerin genişliğiinci yaklaşık 200 um'dir.

  1. 1D kültür uyarılması için dairesel bir halka şeklinde nöronlar büyütün (1.2.5 tarif edildiği gibi muamelesi). ince (170 um) üzerinde desenli bir 1D kültür, uzun (10 mm) hatları ile (bölüm 1.5'de anlatıldığı gibi) kalsiyum görüntülemesi için bir kalsiyuma duyarlı fluoresan boya kullanın.
    1. dairesel bir manyetik bobin kullanarak ve bir Petri tabağına bobinle altında ve eş yaklaşık olarak 5 mm yerleştirin. 5 kV maksimal voltaj ile yüklü bir ev yapımı veya ticari MS tarafından tahrik edilen L bir indüktans = 90 mH ile yaklaşık 30 mm (iç çap, 46 mm dış çapı), bobinin özel bir bobin kullanın.
    2. manyetik olarak nöronal kültürleri canlandırmak için yüksek akım-yüksek gerilim anahtarını kullanarak bir iletken bobin aracılığıyla yüksek gerilim ve akım deşarj edin. 5 kV - 1, yüksek bir gerilim elde etmek için, 100 mF gibi büyük bir kondansatör kullanılarak 21 de tarif edildiği gibi manyetik bir stimülatörü (MS) inşa edilebilir. Alternatif olarak, ticari olarak kullanmakMevcut MS (bakınız Malzeme / Reaktifler Tablo).
      Not: bir ev yapımı bobini 21 imal etmek için bir 0,254 mm kalınlığında ve 6.35 mm genişliğinde, polyester kaplı dikdörtgen bakır tel kullanınız. Epoksi, cam elyafları ve döküm ile izole özel yapılmış kare, teller açın (Malzeme / Reaktifler Tablo). Alternatif olarak (Malzemeler / Reaktifler Tablo) ticari olarak temin edilebilir batarya kullanılması.
  2. 2B kültürleri uyarmak için dönen manyetik alanlar kullanın.
  3. Şimdi, 2D kültürleri teşvik etmek döner manyetik alanları kullanın. şiddetleri ile bobin okuma doğrusal bir korelasyon göstermektedir etmek, farklı yoğunluklarda, çanak hiçbir kültürü ile TMS ateşleyin.
  4. Bir nöronal kültürü ile geçici kalsiyum kaydederken Sonra, geçici kalsiyum ve bobin hem kayıt sırasında yoğunlukları artırmayı TMS ateş etmeye. İlk olarak, ağ patlamaları Sho büyük kalsiyum geçici olarak gözlenenuld ile senkronize bobin TMS sivri almak değil. bir noktada, yoğunluğunu artırmaya devam eden kalsiyum geçici TMS ani senkronize hale başlar. Alternatif olarak, veya ek olarak, bir senkronize bir yanıt elde ettikten sonra, senkronizasyon TMS eşik seviyesinin belirlenmesi için kaldırılmıştır kadar yoğunlukları azalan başlar.
    NOT: Koşullar muhafaza kesinlikle tam hacmini her zaman aynı damarları ve kesin bobin pozisyonları ve yönelimleri kullanarak, kurulumları her biri için sabit olmalıdır.
    1. Bu nöronal kültüre paralel bir düzlemde ve kültüre göre sabit bir konumda olacak şekilde kayıt çanak tabanında alma bobini monte edin.
      NOT: Bu mıknatısa göre alma bobin konumlandırma bağımlılık kültürünün pozisyonuna sadık olmasını sağlar ve konumlandırma herhangi tutarsızlıklar pikap bobin okumaları üzerine önemsiz olacağı.
      1. iki bağımsız bobinleri kullanınbirbirine dik yerleştirilmiş (Şekil 8B), bir döner manyetik ve indüklenen elektrik alan oluşturmak için. kendi MS'e her bobin bağlayın. Uyarıcıları ~ 270 V / m arasında bir maksimum alanda (Şekil 10B) gerçek alan 270 derecelik tarayan bir döner manyetik alan içinde elde edilen, 90 ° (Şekil 10A) bir faz gecikmesi, benzer akımları tahliye emin olun.
      2. harici kayıt solüsyonu (EM) ile doldurulmuş bir küresel cam kap içinde nöronal kültür yerleştirin.
      3. Adım 2.4.4 tarif edildiği gibi kamera ile stimülasyonu (nöronların floresan değişimi) izleyin.
      4. Çapraz bobinler (Şekil 8B) olması durumunda, alma bobini paralel konumlandırmak ve nöronal kültür altında belirli bir mesafede. Dikkatle deneyler boyunca bu yapılandırmayı sürdürmek.
  5. analitik 1D ayarlaya için elektrik alanı hesaplayınEmax indüklenen elektrik alanının maksimum genliği ve yarıçapı r olan halkaların teğet olan Emaks = k, 1 Br ile tion. B manyetik dalga amplitüdü ve k, 1 alma bobini (Şekil 8A) kullanılarak ölçülebilir bir boyutsal orantı sabitidir.
  6. Sayısal olarak elektrik alanı 21 simüle etmek sayısal simülasyon paketi (Malzeme listesine bakın) kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sunulan protokol nöronal kültürlerin kolay uygulamalar için elektron verir. Biz uyarılması için geliştirilmiş çeşitli yöntemler ile kombine edildiğinde, sağlıklı ve hastalıklı nöronlar 27 özelliklerini karşılaştırmak için bir fonksiyonu olarak kültürleri canlandırmak için en uygun yollar bulmak, böyle Chronaxie ve Rheobase 5 gibi bazı içsel nöron özelliklerin ölçümlerini yapar sağlar yapıları ve daha yeni yaklaşımlar. Bazı örnekler sonraki rakamlar sunulmuştur.

Şekil 3, 1D biyo-ret tabakası kazınır yapılandırmaları desenli. Yaklaşık 170 um genişliğinde İnce çizgiler, genellikle, örneğin, tipik haliyle, farklı yarıçaplar (Şekil 3A) veya paralel çizgilerle eşmerkezli halkalar olabilir yazılıdır ~ 11 mm long (Şekil 3B).

nt" fo: tutmak-together.within sayfa = '1'> Şekil 4'ün üst panel etiketli tipik bir yükle-birleştirilmiş cihaz (CCD) ile alınmış kültürde floresan aktivitesinin görüntü ve floresan görüntü gösteren gösterir 2B kültür nöronları. üç farklı ROI'ler gösterilmiştir, bu örnekte, siyah, yeşil ve kırmızı. entegre floresan yoğunluğu izlerinde işaretlenmiş bu üç farklı ROI'ler ölçülen, Şekil 4'ün alt panelde gösterilmektedir (izleri uygun renklidir ROI). ilave görüldüğü gibi, bu, belirli bir veri alındı ​​hangi kare alma süresi 200 ms çözünürlüğü içinde üç farklı ROI'ler tüm nöronları aynı patlama.

Tek yönlü bir sabit elektrik alanı ile stimülasyon için kullanılan bir temel cihazın Şekil 5A'da gösterilmiştir. Elektrot telleri kayıt ortamında nöronal kültür üzerinde yaklaşık 1 mm daldırılır.Elektrikli uyarım için kullanılan temel pals şekli Şekil 5B'de gösterilmektedir. Bu gerilim darbesi uygulandığında bu döngünün yarısından sonra 180 ° yönelimini döndüren bir sabit elektrik alanı oluşturur. yarım çevriminden sonra alan yönünde değişiklik elektrotlara elektroliz ve zarar gelmesini önlemek için kullanılır. Elektrotlara uygulanan tipik voltajlar 22 V ± olan ve 2B kültürleri uyarılması için tipik darbe süresi 100 mertebesinde olduğu - 500 Ps.

Neurites büyümesinde herhangi anizotropi kontrol etmek için, biz 2B kültürlerin bu stimülasyon izotropik olduğu doğrulandı. El ile 15 ° çözünürlükte 360 ° 'de elektrotlar döndürerek (Şekil 5C) uyarılması için yönlendirme tercih yok olduğu görülmektedir. Şekil 5C'de Her renk farklı kültür uyarılmasını gösterir. Kalkış mesafe en az du temsiloranı, sabit bir genlikle uyarımı için ihtiyaç duyulan. Iyi bir ayarlamayla, 2B kültürleri elektrik stimülasyonu için tercih edilen bir yönelimleri yoktur, belirgindir.

Elektrot tek bir çift iletken (bu çevrilmiş rağmen) alanı için bir tanımlanmış doğrultusuna sahip sınırlıdır yana, iki elektrot çifti (Şekil 6A) ile elektrik stimülasyonu için bir cihaz geliştirmiştir. Kültür bir şematik (gri dairesel bir arka plan, koyu noktalar hücre gövdeleri) ve elektrotların (paralel kalın çizgiler) arasında Şekil 6B 'de gösterilmiştir. Şekil 6B'de, mavi ve yeşil uçlar olarak gösterilen dalga formları, kosinüs ve sinüs dalgası ve dönen bir E vektörü alan üretilir sonra birlikte uygulandığında. voltaj darbeleri kare olduğu zaman farklı amplitüdlere sahiptir ve r ile tespit istenilen oryantasyona sahip sabit bir alan oluşturmak sonra aralarında sıfır faz gecikmesine sahipiki elektrot çifti arasında arasında bağıl genlik. Bu elektrik dönme Şekil 5C'de uyarım güçlü açısal dağılımı elde etmek için kullanılan, elle, mekanik rotasyon üzerinde bariz bir gelişme. Şekil 6C, gösterildiği gibi, tabii ki, elektrotların yalnızca bir çift etkinleştirerek, muhtemelen, bir kontrol olarak, sadece tek bir sabit bir yönü uyarmak üzere bu konfigürasyonu kullanmak da mümkündür.

Bu konfigürasyonlar aynı ortalama kök ile de, dönen bir alan veya bir sabit açılı alan iki kare (RMS) gerilim 2D nöron hücreleri uyarmak için kullanıldı ve genlik sabitlendiği zaman kültür uyarmak için gerekli olan darbe süresinin karşılaştırma. Biz, ± 22 V, 150 ± 14 us bir ortalama süresi bir sabit genlikli bir döner elektrik alanı kullanıldığında stimülasyon elde etmek için gerekli olduğu bulunmuştur ise bir tek yönlü bir elektrik alanı, bir ortalama süresi bir ile290 ± 30 us gerekiyordu. Bir sabit bir açı alanında karşı dönen verici kültürü için gerekli sürelerin arasındaki oranı dolayısıyla 0.53 ± 0.02 olup.

2D kültüründe aksonlar her yöne uzatmak için, dönen saha akson birçok heyecanlandırmak edebilmektedir. Buna karşılık, tek oryantasyon alanıyla belirli açıda yönlendirilmiş ve aksonal uyarma elde edilmez, sadece birkaç aksonlar vardır. süresi arttığında, dendritler özellikle de nöronun heyecan verici diğer bölümlerinin olasılığı vardır. Bu da Chronaxie ölçümler konusunda aşağıda açıklanmaktadır. darbe süreleri sık sık teknik sınırlamalar vardır, çünkü beyin stimülasyonu için dış alanlarını kullanarak dönen bir alanını kullanırken çok daha kısa süreler aynı kültürün uyarılma için gerekli olan gerçeği yüksek öneme sahiptir.

Şekil 7'de gösterilmektedir. Şekil 7A'da , 1D bağlantısız ağ, ya kültür hattı boyunca (aksonal uyarılma için 0 ° 'de) ya da iki çift elektrot tarafından kültür çizgisine dik (dendritik uyarı için 90 °' de) olan elektrik alanı ile uyarıldı. Voltaj arttıkça, daha fazla nöron uyarılır ve bu grip yoluyla yansıtılıruyarılmış nöron sayısı ile orantılıdır orescence yoğunluğu, (bkz Şekil 7B). Artan gerilim genlikleri kademeli olarak tüm kültür uyarmak için kullanılır. Her nöron o cevap verecektir ki (belirli bir darbe süresi için) minimal eşik gerilimi vardır ve çok sayıda yasa ile, bu eşik dağılımı Gauss olması bekleniyor. Biz cevap nöron sayısının bakıp uygulanan gerilimin karşı komplo nedenle, dağıtım Hata fonksiyonu (erf) 5'tir kümülatif Gauss dağılımı olacaktır. Elektrik alanının özel bir genlik yanıt nöronların sayısı yaklaşık bir Gauss dağılımı vardır ve bu nedenle floresan de onun tamamlayıcı tarafından açıklanan - uyarıcı alan (Şekil 7C) genliğinin bir hata fonksiyonu.

Şekil 7C, e için kullanılanxtract bir parametre, beklenti dağılım (ortalama). Bu kümülatif Gauss dağılımı uydurma ve en uygun alarak yapılır. Bu beklenti hücrelerin% 50 cevap verecektir hangi uygulamalı gerilimdir. Bu işlem, (100 us 4 ms kadar) birçok darbe süreleri için tekrarlanır. Kültür yanıt verdiği için ortalama gerilim Kuvvet-zaman eğrisi elde etmek için atım süresine karşılık çizilmiştir. ölçümlerin iki dizi gerçekleştirildi. İlk olarak alan desenine paralel olduğu ve ikinci kendisine dik oldu. Dendritler her yöne büyürken Daha önce, 15, aksonlar desenli hizaya 23 gösterilmiştir. Bu akson ve dentrit uyarım arasında bariz bir fark elde etmek için çok yararlı olan iki farklı Güç-Süresi eğrileri verir. dendritik ve aksonal katkıları Tam ayırma akson o bilinen gerçeği ile elde edilirUyarım için sabit al zaman dendritik olanlar, 2, 3, 4 daha kısadır.

Güç-Süresi eğrileri Chronaxie bozunma aşağıdaki denkleme sonra bir uyum vardır Denklem 2 V rh Rheobase gerilimidir ve Cı Chronaxie olduğu. t <1 ms atım süreleri azından Kuvvet-zaman eğrisi, uyarım gerilimi daha düşük bir değere sahip olan, birinci uyarılmış ve nöron ateşlenmesine neden aksonlar olup. Aksonal Chronaxie 110 us olarak hesaplandı. Oysa, uzun süreler (t> 1 ms) 'de bir eksitasyon için dendritik bölme 900 us hesaplanan bir dendritik Chronaxie ile bir nöron için uyarım kaynağıdır.

Bir cir 2D ve 1D kültürlerinin uyarılmasını temel prensipleriküler bobin Şekil 8'de tarif edilir. Fiziksel durumun daha iyi anlaşılmasını sağlamak için, manyetik ve uyarılmış elektrik alanların sayısal simülasyonlar COMSOL paket programı kullanılarak üretilmektedir. eş Petri kabı üzerine yerleştirilen dairesel bir manyetik bobin kullanılır 1D kültürleri, teşvik etmek. Nöronlar kayıt için Petri kabı içinde yerleştirilen yuvarlak lamel dairesel halkalar yetiştirilmektedir. Bu durumda, indüklenen elektrik alanı analitik hesaplandı ve Emax indüklenen elektrik alanının maksimum genliği ve yarıçapı r olan halkaların teğet olan Emaks = k, 1 Br, eşit olabilir. B manyetik dalga amplitüdü ve k 1, bir alma bobini kullanılarak ölçülebilen bir boyutsal orantı sabitidir.

Manyetik alan c COMSOL sayısal olarak hesaplanması1D kültüründe bobin reated Şekil 8A (kırmızı Hale) üst panelinde gösterilir. Şekil 8A'da alt panelinde hesaplama neden olduğu elektrik alanı için sunulmuştur. Bir çapraz bobin konfigürasyonu olan bir 2 boyutlu kültür uyarılması Şekil 8B'de gösterilmektedir. Çapraz bobin kayıt ortamı (EM) ile doldurulmuş olan bir küresel cam kaba yerleştirilir içindeki bir 2 boyutlu nöronal kültürü ile yerleştirilmiş manyetik alanlar, döner üreten bu kullanıldı 2B kültürleri teşvik etmek. Bu durumda indüklenen elektrik alan artık analitik hesaplanabilir. Çapraz bobin iki bobin ve kabın dibine yerleştirilmiş 2B kültür taşıyıcı cam lamel içine yerleştirilmiş küresel kap ile, Şekil 8B'de üst panelde gösterilmiştir. ölçek için, iç bobininin iç çapının 65 mm olduğu. Eddy akımları 3D modeli ile Comsol kullanarak sayısal sonuçlar, alt panelde gösterilmektedirküresel kabın iç yüzeyinde neden olduğu elektrik alanı tasvir. Uyarılması için kullanılan tipik 1D nöron kültürleri ile bir cam kapak bir parlak alan mikroskop görüntüsü Şekil 8C'de gösterilmiştir. beyaz çizgiler yönlendirilebilirlik etkisi deneysel karşılaştırma ve kontrol için, radyal olarak her iki teğet olarak yönlendirilip edilir desenli cephelerde, nöronlar göstermektedir.

1D kültür geometrisi bir kültür manyetik bir uyarıya yanıt olarak yangın belirlenmesi önemli bir rol oynar. 1D halka kültürlerinin sadece% 22'si manyetik uyarılmaya yanıt verdi. Başarılı bir uyarım oranı güçlü kültürün doğrusal uzunluğuna bağlı ve Şekil 9A, gösterildiği gibi, manyetik uyarıma daha uzun 80mm yanıt kültürlerin fazla% 60. Bu özel koşullar manyetik yanıtı için gerekli olduğunu ima eder. w, bu geometrik bağımlılık kültürleri araştırmakere halkaların bir parçası olan konfigürasyonlarda yetiştirilen - yerine tam daireler üzerinde daha yayların bunları işaretlemeden aynı çapındaki ancak farklı uzunluklara sahip (Şekil 8C bakınız)

1D halka kültürlerin yarıçapının bir fonksiyonu olarak manyetik alan eşik kapsamlı bir araştırma, Şekil 9B'de gösterilmiştir. renk kodlaması bir uyarım eşiği ölçmek için hesaplanan olasılığına işaret ederken beyaz daireler, uyarım eşiklerine deneysel değerleri göstermektedir. Bir uyarım eşiği hala belirli bir nöron kültürü için bir tepki uyaran zayıf bir alan olarak tanımlanır.

Şekil 9B, halkaların yarıçapı ve uyarım eşiği arasında açık bir ters korelasyon daha büyük halkaları düşük bir uyarım eşiklerine sahip eğilim, vurgulamaktadır. Örneğin, ortalama 14 mm halka Magn yanıt1.5 T genliği ile etik darbeler ortalama 7 mm halka, yalnızca T ya da daha fazla 3'e cevap verir. Bu renk kodlu yangın ihtimalini tahmin olarak tasvir edilir indüklenen elektrik alanı, teorik hesaplama beklenmektedir. Gerçekten de, 7 mm yarıçapında 3T neden olduğu elektrik alanı iki yarıçapta 1.5 T ile uyarılan eşittir. Özet olarak, ortalama elektrik alanı eşik halka kültürleri yarıçapından bağımsız 301 ± 128 (standart sapma) V / m, olan.

alan manyetik stimülasyon döndürerek uyarıldı 30 2B kültürleri 15 nöronal uyarım patlama ile cevap, 2B kültürlerinde yanıtı ortaya değil tek tek dairesel bobin, aksine. Birbirlerine (Şekil 8B) dik bir biçimde yerleştirilmiştir, iki bağımsız bobinler manyetik ve indüklenen elektrik alanlar dönen üretir. Her bobin disch her ikisi de kendi MS, bağlandığında90 derece faz gecikmesinde benzer akımları oluşturun. Çapraz bobin konfigürasyonunda iki bobinin her biri tarafından indüklenen elektrik alanının genliği Şekil 10A'da çizilmiş ve aynı izler Şekil 10B'de her iki bobinin üst üste binen elektrik alanının yönünün ve amplitüdünün polar bir gösterimi ile gösterilmiştir . Elde edilen indüklenen elektrik alanı gerçek alanın 270 derecesini ~ 270 V / m maksimum alana tarar.

Şekil 1
Şekil 1: Nöronal Kültürlerin Elektriksel Uyarımında Kullanılan Kurulum Şeması. Arzulanan sinyal, ortak bir zemine sahip olmayan iki çıkışlı bir sinyal jeneratörü tarafından üretilir. Bu sinyaller, ± 30 V'a kadar bir çıkış gerilimi verecek şekilde yükseltilir. Elektrik sinyalleri daha sonra iki ayrı elektrot çifti boyunca beslenir ve tw'de bir nöronal kültürü uyarırO ortogonal ve bağımsız yönleri. nöronların uyarılması inceledi ve kalsiyum boyalar ile izlenebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2: Nöronal Kültürlerin Manyetik stimüle etmek amacıyla kullanılır Setup şematik. En azından A bir Petri kutusu (mavi çizgi) yerleştirilir nöronal halka kültürü üzerinde 5 mm eş bulunduğu manyetik bobin (mavi daireler), gösterilmektedir. Petri kabının çevresi üzerinde yer alan bir alıcı bobin (kırmızı daire) manyetik dalga ile indüklenen gerilimi ölçer. alma bobinden entegre olarak altta manyetik stimülatör bobinin ölçülen dinamik (5000 kV MS kapasitör gerilimi yükü kullanarak) gösterilmektedir. Bağlı elektrik alanı (calculatManyetik alan mavi B. Bir ters mikroskop görüntüleri manyetik darbeleri reaksiyona nöronların geçici kalsiyum duyarlı boyalar floresan gösterilmiş olmakla beraber 14 mm bir halka yarıçapı) için ed yeşil tasvir edilmektedir. C Nöronlar halka manyetik stimülatör ile etkili stimülasyon için kullanılan, eş merkezli halkaların bir model üzerinde büyümüş. Nöronların D. Aydınlık alan mikroskop görüntü modelinin bir hat üzerinde büyümüş. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3: aksonal Büyümenin yönü ile elektrik alanı yönlendirme için kullanılır 1D Nöronal Kültürlerin Desenleri örnekler. C. dairesel model dairesel manyetik bobin, indüklenen ele için kullanılan Ctric alanın dairesel bir yönü vardır. B. Hat desenleri, indüklenen veya doğrudan elektrik alanı tek bir yöne sahip olduğunda kullanılır.

Şekil 4
Şekil 4: Senkron Ağ Patlamaları Sırasında Görüntülenen Kalsiyum Geçici Maddelerin İzleri. A. Deneyden önce bir kalsiyum boya ile boyanan nöronların bir görüntüsü. B. A'da ROI sınırının rengini temsil eden izin rengiyle A'daki ROI'lerin yoğunluğu ve zamanı izleri. Üç ROI'de senkronize edilen yoğunlukta büyük bir artış bir ağ patlamasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

54357fig5.jpg"/>
Şekil 5: Elektrik Stimulation Temel Ayarlar, Paralel Banyo Elektrotlar biri Çifti kullanarak 2D Kültürleri Elektrik Stimülasyonunun hiçbir Tercih Yönünü var olduğunu belirlemek için. Kültür, stimülasyon için kullanılan C. aparat. Elektrik alanı platin tel elektrotlara voltaj uygulayarak üretilir. iki kablo arasındaki mesafe 13 mm'dir. Bir voltaj sinyali B. örnek sinyalinin iki kutuplu şekil elektrotlarda kayıt çözeltisi elektroliz önlemeye yardımcı olur A'da elektrotlar üzerinde uygulanacak. Elektrotların farklı dönüş 2B kültür uyarıcı, sıcaklığın nevrotik tepki izotropisi vardır. Adım D. 2.2 tarif edilen prob kullanılarak elektrik alan ölçüm örneği. Elektrik alanı% 10'a kadar bir hata homojendir. Bu şekil 5 ile modifiye edilmiştir./ 54357 / 54357fig5large.jpg" target = '_ blank' yüklemek> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6: Elektrik Stimülasyon Elektrotların iki çift Elektrik alan Dönüşleri ve herhangi bir istenen açı olarak uyarılmasına imkan verir. Elektrik alanının daha karmaşık şekillerin üretilmesini A., iki bağımsız elektrot çifti gereklidir. B. bir elektrot için kosinüs gerilimi şeklinde darbesi uygulamak ve ikinci elektrota bir sinüs pals sabit genlikli bir döner elektrik alanı oluşturur. Elektrot bir çift tek-yönlü bir tek biçimli olmayan elektrik alanı oluşturur C. kare voltaj darbesi uygulamak. Bu şekil 5 ile modifiye edilmiştir. cl LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya Ick.

Şekil 7,
Şekil 7: (2.4.2 tarif edildiği gibi) Synaptic Girişlerin Engelleme Ağ Ayırma Verilen Bir Elektrik alan ile uyarılır Tek Hücrelerin toplam nüfus gözlenmesi sağlar. Elektrotlar iki çift voltaj darbelerinin farklı genlikleri uygulayarak A. elektrik alan el kültürünü çevirmek gerek kalmadan her açıdan yönelik edilebilir. Farklı uygulanan voltajlarda elektrik stimülasyonu ile geçici kalsiyum B. Örnek kayıtları. Dört izleri hafifçe değerlendirilmesine olanak sağlamak için dikey olarak kaydırılır, gösterilmektedir. Gerilim değerleri mavi izleri altında yazılır. Elektrik alanının sabit bir süre uygularken C, elektriksel alana tepki olarak yangın nöronların sayısı kümülatif dist sahipribution fonksiyonu (alan gücüne orantılıdır) voltajının amplitüdü bir fonksiyonu olarak kümülatif Gauss dağılımı (veya bir erf fonksiyonu) 'nin (CDF). D. bu protokolü kullanılarak da elde edilen Direnç Süresi eğrisinin bir örneğidir. Bu şekil 5 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 8,
Şekil 8: Manyetik bobin Yapılandırma ve indüklenen elektrik alanın hesaplanması. En azından A tek boyutlu nöronal halka kültürleri 5 mm üzerinde tertip edilen bir halka bobini (mavi daireler) (mavi diski) 'dir. halkalar kırmızı çizgiler boyunca yönlendirilmiş olan bir manyetik vuru yaratan, bobin ile paralel ve ortak merkezlidir. Tarafından Faraday yasası, indüklenen elektrik alanı bobine paralel olan ve ona eşmerkezli halkalar bulunan düzlemlerde uzanır. Altta halka kültürlerinin düzlemi boyunca yatay bir kesit yer almaktadır. Elektrik alanının göreli değeri, oklarla gösterilen yön ile renk kodludur. Daha büyük halkalar daha büyük bir akı alanı içerir ve dolayısıyla indüklenen elektrik alanı daha yüksektir. B. Çapraz bobinli manyetik uyarıcının görüntüsü (üstte) ve onun tarafından indüklenen elektrik alanının simülasyonu. C. Dairesel bir elektrik alanı veya radyal elektrik alanı ile uyarılan nöronları büyütmek için kullanılan model. Bu rakam 21 , 28'den değiştirildi . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

9" src = "/ files / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg" />
Şekil 9: Manyetik Alana Halka Kültürlerin Tepki. A. stimülasyon başarı oranı kültürünün yarıçapı ile büyür. Hata çubukları standart hata (SE) temsil eder. Halka boyutu ve manyetik alan gücü arasındaki B. ilişki gösterilmiştir. kültürünü heyecanlandırmak için olasılık renk kodludur. Gerçekten de kültürlerin en başarılı uyarılmaları deneysel erişilebilir faz alanı (beyaz dikdörtgen) ve yüksek olasılık bölgesi (kırmızı) ile üst üste gelecek şekilde uzanmaktadır. Bu rakam 21 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 10,
Şekil 10: Manyetik Alan Kur Field Döner. </ strong> A, çapraz bobin, manyetik uyarıcı ile uyarılması dönen bir elektrik alanı indüklemek için, 90 derecelik bir faz kayması iki bobin arasına gereklidir. Gösterilen yonca yaprağı bobininin 2 komşu kanatlar üzerine yerleştirilmiş bir alma bobininde indüklenen elektrik alanıdır. bobinleri 2 ticari uyarıcıları ayrı ayrı tahrik edildi. B. yeniden yonca bobinin bir atım esnasında elde edilen elektrik alan genliği ve yönü A'da gösterilen eğriler kullanarak. Bu rakam, 28 21'den değiştirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1D desen çeşitli uygulamalar için kullanılabilir önemli bir araçtır. Örneğin, nöronal kültürler 29 mantık kapıları oluşturmak ve daha yakın zamanda sıçan hipokampal nöronlarının 5 Chronaxie ve Rheobase ölçmek ve kıyasla Down sendromlu hipokampal nöronlar ateşleme aktivitesinin sinyal yayılma hızının yavaşlatılması için 1D model oluşturmanın kullandık vahşi tip (WT) hipokampal nöronlar 27. 1D desen için önerilen protokol sağlamdır ve arzu edilen herhangi bir desen oluşturan çok kolaydır. Biz ölçümleri onun fonksiyonunu etkileyebilir ağının olası kesintiler, farkında olmak önce 1D kültürünü gözlemlemek için öneriyoruz.

Nöronal konfigürasyonlarda, kimyasal olarak modelli seçkin tarihi 30, 31, 32 yer alır. Biz bulduğu yaklaşımımız verimKimyasal desenlendirme ile benzer sonuçlar verir, ancak daha sağlam ve daha kolay elde edilirler. Son zamanlarda, nöronların mikroakışkan desenlendirme seçeneği, sunduğumuz yaklaşımın ilginç bir alternatifi haline gelmiştir ve benzer basitlik ve kullanım kolaylığıyla 33 , 34 mevcuttur. Mikroakışkan yaklaşım, burada açıklanan yontma yöntemine paralel olarak laboratuarımızda kullanılmaktadır.

5'i gösterdiğimiz gibi 2D kültürlerin tercih yönelimleri yoktur ve uyarımı izotropiktir ve uygulanan alanın yönüne bağlı değildir. Alan dönerken 2D kültürlerin uyarılması için daha kısa süreler gereklidir. Buna karşılık, 1D kültürleri alanın yönlendirilmesine çok bağlıdır. Tarla modeli yönlendirildiğinde (ve dolayısıyla aksonal büyüme yönünde) uyarı için gereken sabit genlikli alanın süresi, alan yöneliminden çok daha kısadırDesenin dik ed. süresi sabit tutulursa, tarla ve desen paralel Benzer şekilde, daha sonra kültür heyecanlandırmak için gerekli alan küçüktür. dikey olarak uyarıcı zaman alan pulsu (şebeke kesildiğinde, bir milisaniye olarak) çok daha uzun olması gerekmektedir ve sonra da temel olarak dendritler uyarılır. elektrik alanları (doğrudan ya da bir manyetik alan tarafından indüklenen olarak) beyin uyarımı için kullanıldığı zaman, bu çok büyük önem taşımaktadır. Bilindiği hedeflenen beyin alanı akson demetleri sahip olmak, bu aksonlar onlara doğru alanını yönlendirme heyecan ve sonra daha az güç veya uyarılması için alanın daha kısa bir süre ihtiyaç olabilir. hedeflenen beyin bölgesi yönünü tercih sahip değilse, o zaman bir döner alan uyarımı için daha etkilidir. dendritler stimülasyon hedef ise, daha uzun bakliyat daha etkilidir.

Manyetik alanlar nöronal aktiviteyi uyarabilir zaman manyetik bir darbe inöronları uyarır bir elektrik alanı nduces. Şu anda elde edilebilen manyetik darbeleri yanıt süresi milisaniye mertebesindedir süresi, dendrit içinde mikro olduğundan, manyetik uyarılara duyarlı olması beklenmemektedir. Olan cevap süresi hızlı aksine, aksonların, uyarma 2, 3 hedef vardır. Elektrikli uyarıma aksonların tepkisi, elektrik alanına paralel olduğunda maksimumdur ve bunun 1, 35 dik olan zaman azalır; Dolayısıyla, manyetik uyarım içinde, biz neden olduğu elektrik alanı hedeflenen aksonlar paralel yönlendirir nerede sistemlerini kurmak için çalışıyoruz. 1D halka uyarıcı Bu nedenle, alan aksonlar paralel yönlendirilmiş olmalıdır ve halka büyüklüğü uyarılması için eşiğini belirler. banyo elektrotlar tarafından direkt uyarılma için benzer bir 2B kültür, dönen uyarılan e uyarmak içinlectric alan çok daha verimlidir.

nöronların ve elektrik veya manyetik alanla dış uyarım desenleme kombinasyonu birçok olası gelecek uygulamaları ile güçlü bir teknolojidir. Chronaxie ve Rheobase yanı sıra aktivasyon ve aktivasyon yayılma dinamikleri eşik ve hızları nöronal kültürün içsel özelliklerin anlatıyor parametrelerdir. Özel olarak, terapötik tedaviler ve ilaç veya farmakolojik bir tedavinin etkisi hemen nöronlar üzerinde direkt olarak test edilebilir. Bu, her iki hastalık modeli nöronların ve TMS uyarımı için protokollerin etkin bir anket olanak sağlayacak. Daha kavramsal yönü üzerinde nöronal kültürleri uyarma yeterliliği tam nöral yapılandırmaları bilgi işleme yönüne ilişkin yeni olasılıklara yol açar ve bizi yeni hesaplama sağlamak üzere nöronal ağlar yaşayan elektronik uyarılması birleştiren mikro baskılı devre tasavvur izinark cihazları ve yeni beyin arayüz cihazları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar çok yararlı tartışmalar için Ofer Feinerman Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef ve Eitan Reuveny teşekkür ederim. Yazarlar teknolojinin erken sürümlerini geliştirmek için Ilan Breskin ve Jordi Soriano teşekkür ederim. Yazarlar teorik kavramlarla yardım Tsvi Tlusty ve Jean-Pierre Eckmann teşekkür ederim. Bu araştırma Minerva Vakfı, Bilim ve Teknoloji, İsrail, Bakanlığı tarafından ve İsrail Bilim Vakfı hibe 1320-1309 ve Bi-Ulusal Bilim Vakfı hibe 2008331 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M Fluka  21098 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Tags

Nörobilim Sayı 123 nöronal ağlar elektrikli uyarım manyetik stimülasyon Chronaxie Rheobase kalsiyum görüntüleme desenli kültürler
Bir ve İki Boyutlu Kültürlerde Elektrik ve Manyetik Alanlar Kullanan Nöronların Harici Uyarımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., … More

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter