Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وجين تحليل التعبير عن فوس، معربا عن الخلايا العصبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة دماغ الفئران

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54358
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Behavioral Neuroscience Research Branch, Intramural Research Program, NIDA, NIH, DHHS, 2Division of Rheumatology, School of Medicine, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

هنا نقدم بروتوكول الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS) لدراسة التعديلات الجزيئية في فوس، معربا عن الفرق العصبية من أنسجة المخ على حد سواء الطازجة والمجمدة. استخدام الأنسجة المجمدة يسمح نظام مراقبة الأصول الميدانية عزل العديد من مناطق الدماغ خلال جلسات متعددة لتحقيق الاستفادة القصوى من الموضوعات الحيوان قيمة.

Abstract

دراسة المرونة العصبية والتعديلات الجزيئية في السلوكيات علم هو التحول من دراسة مناطق الدماغ كاملة لدراسة مجموعات محددة من الخلايا العصبية تنشيط توزيعها قليلة يسمى الفرق العصبية التي تتوسط علم الجمعيات. وقد تم مؤخرا الأمثل مضان الفرز الخلية المنشط (FACS) لأنسجة الفئران الكبار الدماغ ويسمح عزل الخلايا العصبية تفعيلها باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا العصبية NeuN والبروتين فوس، وهو علامة من الخلايا العصبية تفعيلها بقوة. حتى الآن، تم عزل فوس، معربا عن الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى من أنسجة جديدة، والتي تنطوي الأيام تجهيز طويلة ويتم تقييمها بعد إجراءات طويلة ومعقدة السلوكية يسمح أعداد محدودة جدا من عينات المخ. هنا وجدنا أن غلة فوس، معربا عن الخلايا العصبية وفو مرنا من المخطط الظهرية كانت متشابهة بين تشريح الأنسجة الطازجة والأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة 3 - 21 أيام. وبالإضافة إلى ذلك، أكدنا على النمط الظاهريمن الخلايا إيجابية NeuN وNeuN سلبية مرتبة حسب تقييم التعبير الجيني من الخلايا العصبية (NeuN)، نجمي (GFAP)، oligodendrocytic (Oligo2) وmicrogial علامات (Iba1)، مما يدل على أن الأنسجة المجمدة يمكن أن تستخدم أيضا لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزلة أنواع الخلايا الدبقية. عموما، فمن الممكن لجمع وتشريح وتجميد أنسجة المخ لجلسات متعددة FACS. هذا يزيد من كمية البيانات التي تم الحصول عليها من المواد الحيوانية القيمة التي غالبا ما خضعت لإجراءات سلوكية طويلة ومعقدة.

Introduction

خلال التعلم والحيوانات تشكل الجمعيات بين مجموعات معقدة من المحفزات محددة للغاية. ويعتقد أن هذه المعلومات ذات الدقة العالية ليتم تشفيرها من التغييرات في أنماط محددة من الخلايا العصبية وزعت قليلة يسمى الفرق العصبية. وقد تم مؤخرا تحديد الفرق العصبية التي كتبها تحريض الجينات في وقت مبكر على الفور (IEGs) مثل فوس، قوس، وZif268 ومنتجات البروتين في الخلايا العصبية التي تم تفعيلها بقوة خلال سلوك أو التعرض جديلة. فوس، معربا عن الخلايا العصبية على وجه الخصوص وقد ثبت أن تلعب دورا السببية في سياق والسلوكيات تعلمت 1-4 جديلة محددة. وهكذا، neuroadaptations الجزيئية فريدة من نوعها ضمن هذه تنشيط الخلايا العصبية فوس، معربا هي أفضل المرشحين للالآليات العصبية التي تكود علمت جمعيات شكلت خلال اضطرابات التعلم والتعلم غير طبيعية عادية، مثل الإدمان واضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) 5.

Fluoreوقد سمحت مسرح الحادث الفرز الخلية المنشط (FACS) مؤخرا تحليل neuroadaptations الجزيئية فريدة من نوعها داخل الخلايا العصبية فوس، معربا عن. التدفق الخلوي والفرز الخلية وضعت في 1960s 6،7 لتوصيف وعزل الخلايا وفقا لخصائص ضوء تشتت ومناعي بها، وقد استخدمت لفترة طويلة في علم المناعة وأبحاث السرطان. ومع ذلك التدفق الخلوي ونظام مراقبة الأصول الميدانية يتطلب خلايا مفردة نأت التي يصعب الحصول عليها من أنسجة المخ الكبار. وقد استخدم نظام مراقبة الأصول الميدانية أول من عزل وتحليل الخضراء بروتين فلوري (GFP) -expressing الخلايا العصبية الجسم المخطط من الفئران المعدلة وراثيا التي لا تتطلب الأجسام المضادة العلامات 8،9. قمنا بتطوير القائم على الضد طريقة FACS 10 إلى عزل وتقييم التعديلات الجزيئية في فوس، معربا عن الخلايا العصبية تفعيلها من خلال المخدرات و / أو العظة في الحيوانات البرية نوع 11-15. في هذه الطريقة، وصفت الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا العصبية العامة NeuN، في حين تفعيلها بقوة الخلايا العصبيةوصفت مع الأجسام المضادة ضد فوس. على الرغم من أن طريقة الأولي لدينا يتطلب تجميع ما يصل إلى 10 فئران لكل عينة لأنسجة جديدة، سمحت التعديلات اللاحقة للبروتوكول FACS عزل فوس، معربا عن الخلايا العصبية والبلمرة الكمية سلسلة من ردود الفعل (QPCR) تحليل مناطق الدماغ منفصلة من الفئران واحد 13-15 . وعموما، تم العثور على تغيرات الجزيئية فريدة من نوعها في فوس، معربا عن الخلايا العصبية تفعيلها خلال مجموعة متنوعة من السلوكيات context- وتنشيط جديلة في أبحاث الإدمان على 12،14،15.

وهناك مشكلة لوجستية كبرى مع أداء نظام مراقبة الأصول الميدانية على أنسجة جديدة هي أن يستغرق يوم كامل لفصل الأنسجة والعملية من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية. وبالإضافة إلى ذلك، هناك فقط حوالي أربع عينات يمكن معالجتها يوميا. وهذا يعني عادة أن منطقة الدماغ واحد فقط يمكن تقييم من كل الدماغ ومناطق الدماغ المتبقية يتعين التخلص منها. هذه هي المشكلة الرئيسية لانخفاض الإنتاجية الإجراءات السلوكية مثل الإدارة الذاتية وتري الانقراضنينغ يتطلب الجراحة وأسابيع عديدة من التدريب المكثف. وعلاوة على ذلك، والإجراءات السلوكية طويلة ومعقدة في يوم الاختبار يجعل من الصعب على أداء نظام مراقبة الأصول الميدانية في نفس اليوم. وسيكون ميزة كبيرة لتكون قادرة على تجميد العقول من الحيوانات مباشرة بعد الاختبار السلوكي، ومن ثم عزل الخلايا العصبية فوس، معربا عن من مناطق الدماغ واحدة أو أكثر في أوقات مختلفة من اختيار المحققين.

هنا علينا أن نبرهن أن لدينا بروتوكول FACS يمكن استخدامها لعزل الخلايا العصبية فوس، معربا عن (وأنواع الخلايا الأخرى) من أنسجة المخ على حد سواء الطازجة والمجمدة. وكمثال على ذلك، ونحن عزل فوس، معربا عن الخلايا العصبية من المخطط الجرذان بعد حقن الميثامفيتامين الحادة ومن الفئران ساذجة بدون حقن (حالة المراقبة). ومع ذلك، هذا البروتوكول FACS يمكن استخدام أي بعد العلاج السلوكي أو الدوائي. وأشار تحليل QPCR لاحق من عينات لدينا أن التعبير الجيني من هذين النوعين من الخلايا يمكن تقييمها مع سيميكفاءة لار من الأنسجة على حد سواء الطازجة والمجمدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) من المعاهد الوطنية للصحة الدليل للرعاية واستخدام حيوانات المختبر (16).

ملاحظة: جميع الخطوات أدناه استخدام أنابيب الطرد المركزي انخفاض ملزم التي تم الاحتفاظ بها على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إعداد قبل مجموعة الأنسجة

  1. تعيين أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية.
  2. البولندية النار على مجموعة من ثلاثة الماصات الزجاج باستور مع تناقص بأقطار من حوالي 1.3، 0.8، و 0.4 ملم لكل عينة.
  3. إعداد المسمى 1.7 مل أنابيب تحتوي على 1 مل الباردة العازلة ألف وإبقاء الأنابيب على الجليد.
  4. إعداد علبة الجليد التي تحتوي على تشريح مصفوفة، ملاعق وألواح الزجاج (أو مقلوب الزجاج طبق بيتري) التي لأداء تشريح الدماغ. قبل البرد اثنين أو أكثر من شفرات الحلاقة على ورقة لوحات الزجاج والأنسجة استخدام لتجف جميع الصكوك التي تمس رالقضية.
  5. ذوبان الجليد الحل أنزيم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة قبل جمع الأنسجة.

2. نسيج جمع وتشريح

  1. بدء السلوكي أو الدوائي العلاج 90 دقيقة قبل جمع الأنسجة.
    ملاحظة: للحصول على النتائج المعروضة هنا، والحقن داخل الصفاق الحاد من 5 ملغم / كغم من الميثامفيتامين على الفئران في بيئة جديدة (حالة اختبار) والفئران ساذجة أبقى في أقفاص وطنهم (حالة المراقبة) أجريت.
  2. تخدير الفئران عن طريق وضعها في مجفف عاء زجاجي مع isoflurane المشبعة وقطع رأس الفئران 30 - بعد مرور 60 ثانية باستخدام المقصلة.
    استخدام المقص لإزالة الجلد والعضلات من الرأس وفضح الجمجمة. استخدام رينجرز لقطع الجمجمة وفتح ماغنوم الثقبة وإزالة الجزء الخلفي من الجمجمة. استخدام رينجرز إلى قطع على طول الحواف العلوية من الجمجمة لفضح الدماغ. يجب الحرص على عدم تلف الدماغ. استخدام ملعقة صغيرة لحلج القطن بلطف تحتد رفع الدماغ. رفع الدماغ وقطع الأعصاب حتى الدماغ هو حر 17.
  3. تشريح الأنسجة باستخدام شفرات الحلاقة.
    ملاحظة: الحصول على عينات الأنسجة باستخدام أي من الطرق التالية: (2.3.1) تشريح الأنسجة حديثا. (2.3.2) الأنسجة المجمدة بعد تشريح. أو (2.3.3) الأنسجة المجمدة تشريح من الدماغ كله المجمدة. الحفاظ على مصفوفة تشريح الدماغ، شفرات الحلاقة والزجاج لوحة الجافة في جميع أنحاء تشريح ويمكن لعمليات مثل الماء المكثف تنميق تؤدي إلى الناشر منخفض التوتر من الخلايا. استخدام النظارات المكبرة لضمان تشريح دقيق.
    1. لتشريح الأنسجة الطازج، ضع الدماغ المستخرج حديثا في مصفوفة تشريح الدماغ (الفئران على شكل الدماغ قالب معدني مع فتحات لشفرات الحلاقة في فترات 1 مم) الذي تم المبردة على الجليد. إدراج اثنين أو أكثر من شفرات الحلاقة قبل المبردة في فتحات لقطع شرائح الاكليلية التي تحتوي على منطقة في الدماغ (ق) من الفائدة. ضع قطع شريحة على لوحة زجاجية مبردة.
      ملاحظة: تشريح الدماغ رجوملاعق من الفائدة على طبق من زجاج المبردة.
    2. لالأنسجة المجمدة بعد التشريح، تشريح منطقة في الدماغ (ق) من الفائدة من شرائح من الدماغ المستخرج حديثا، مماثلة لتلك المذكورة أعلاه في 2.3.1. ضع تشريح الأنسجة إلى microtube وتجميد بسرعة الأنسجة عن طريق غمر microtube في -40 درجة مئوية نظير البنتان لمدة 20 ثانية. حافظ على تشريح الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات في -80 درجة مئوية الفريزر حتى مزيد من المعالجة.
    3. لالأنسجة المجمدة، وتجميد فورا الدماغ المستخرج حديثا في -40 درجة مئوية نظير البنتان وتخزينها في كيس مختوم في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      1. في يوم من تشريح، ضع الدماغ المجمدة في ناظم البرد وضعت في حوالي -20 درجة مئوية (أي أكثر دفئا من -18 درجة مئوية) لحوالي 2 ساعة لكي تتوازن درجة الحرارة.
        ملاحظة: العقل يمكن أن تقطع بسهولة عند هذه الدرجة، في حين أن انخفاض درجات الحرارة كثيرا تجعل الدماغ هشة جدا بحيث لا يمكن خفض بأمان.
      2. استخدام شفرات الحلاقة لخفض 1-2 ملم شرائح الاكليليةأدمغة المجمدة في ناظم البرد. استخدام اضعافها إبرة 12- لعيار 16 للحصول على اللكمات الأنسجة من هذه الشرائح في ظل ظروف التجمد. حافظ على تشريح الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات حتى مزيد من المعالجة.
  4. إضافة 1-2 قطرات من عازلة لتغطية تشريح الأنسجة قبل تنميق. إزالة معظم المادة البيضاء من الأنسجة باستخدام اثنين من شفرات الحلاقة لمنع فقدان الخلايا العصبية خلال الفترة المتبقية من عملية سحن. إذا بدءا من الأنسجة المجمدة، ثم السماح للأنسجة لذوبان الجليد على لوحة زجاج الباردة لمدة لا تتجاوز 1 دقيقة قبل تطبيق العازلة حل.
  5. فرم الأنسجة 100 مرة في كل اتجاه متعامد مع شفرة حلاقة على طبق من زجاج المبردة. عقد شفرة حلاقة رأسي لوحة الزجاج عندما تنميق.
    ملاحظة: تنميق شامل أمر بالغ الأهمية لجميع الخطوات البروتوكول.
  6. استخدام شفرات الحلاقة لنقل الأنسجة المفروم إلى أنابيب microcentrifuge تحتوي على 1 مل من الاحتياطي البارد A. عكس أنبوب 3-5 مرات لكهEP جميع الأنسجة المفروم في الحل.

التفكك 3. خلية

ملاحظة: استخدام نهاية لطيف على نهاية خلط للجميع من الخطوات التالية. لا تستخدم خلاط دوامة وتجنب فقاعات الهواء التي تسبب تلف الخلايا.

  1. أجهزة الطرد المركزي لأنابيب العينات في 110 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف تجاهل. ببطء إضافة 1 مل من محلول أنزيم إذابة الطازج الباردة (التي تحتوي على مزيج من البروتينات والانزيمات) أسفل الجدار الداخلي للmicrotube. تمتص فورا بيليه كامل وبلطف ماصة صعودا وهبوطا 4 مرات فقط مع كبير معتدلة ماصة قطر الحافة لتفريق بيليه الأنسجة المفروم.
  2. عكس microtubes على الفور لمنع بيليه من الالتصاق إلى أسفل واحتضان عينات مع نهاية الإفراط في نهاية خلط لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  3. بعد هضم أنسجة الأنزيمية، أنابيب الطرد المركزي في 960 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف وإضافة 0.6 مل من الاحتياطي البرد A. فوراذ بعد إضافة العازلة ألف واستخدام نفس ماصة لتفريق بيليه بواسطة مص بيليه كامل وبلطف ماصة صعودا وهبوطا 5 مرات.
  4. ميكانيكيا يسحن الأنسجة هضمها وجمع في 15 مل أنابيب باستخدام الخطوات التالية. لكل عينة، استخدام مجموعة منفصلة من 3 الماصات باستور الزجاج المصقول النار مع تنازلي بأقطار من حوالي 1.3، 0.8 و 0.4 مم تعلق على المصابيح اللاتكس.
    1. يسحن بلطف كل عينة 10 مرات مع ماصة زجاج 1.3 مم. السماح للعينة تستقر لمدة 2 دقيقة على الجليد (الحطام والخلايا undissociated سوف تستقر في القاع). جمع طاف (~ 0.6 مل) ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل (أنبوب رقم 1).
    2. إضافة 0.6 مل العازلة حل لبيليه المتبقية. يسحن العينة 10 مرات مع ماصة زجاج 0.8 مم. السماح للعينة تستقر لمدة 2 دقيقة على الجليد. جمع طاف (~ 0.6 مل)، ونقل إلى نفس 15 مل المخروطية أنبوب # 1.
    3. إضافة 0.6 مل العازلة حل لبيلي المتبقيةت. يسحن العينة 10 مرات مع ماصة زجاج 0.4 مم. السماح للعينة تستقر لمدة 2 دقيقة على الجليد. جمع طاف (~ 0.6 مل، وبدون لمس بيليه مع الخلايا غير فصل) ونقل إلى نفس 15 مل المخروطية أنبوب # 1.
      ملاحظة: حافظ على قطر ماصة 0.4 ملم في أنبوب رقم 1 للخطوات سحن التالية.
    4. كرر الخطوة 3.4.3 ثلاث مرات أكثر باستخدام أصغر ماصة الزجاج (~ 0.4 مم)، وجمع طاف في منفصلة 15 مل أنبوب مخروطي (أنبوب رقم 2).
    5. يسحن تعليق خلية تم جمعها في أنابيب رقم 1 ورقم 2 لمدة 10 مرات أكثر باستخدام ماصة الزجاج 0.4 ملم والحفاظ على الجليد.

4. خلية التثبيت وPermeabilization

  1. إعداد 4 microtubes لكل عينة (اثنان microtubes للخلايا من أنبوب رقم 1 واثنين من لخلايا من أنبوب رقم 2) وذلك بإضافة 800 ميكرولتر من الايثانول البارد 100٪ (المخزنة في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام) في كل أنبوب والاحتفاظ بها على الجليد . ملاحظة: الإيثانول النهائيوالتركيز يكون 50٪.
  2. ماصة ~ 800 ميكرولتر من تعليق خلية (من أنبوب رقم 1 وأنبوب رقم 2) في كل من 4 أنابيب تحتوي على الإيثانول الباردة وعكس أنابيب لخلط العينات.
  3. احتضان أنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة في حين عكس الأنابيب كل 5 دقائق.
  4. بعد تثبيت / permeabilization، أنابيب الطرد المركزي في 1700 x ج لمدة 4 دقائق على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. ترك 50 ميكرولتر من حل لمنع فقدان الخلية.
    ملاحظة: الكريات في هذه المرحلة هي بيضاء وعصا أقل لجدار الأنابيب من قبل permeabilization. لذلك، إزالة طاف بعناية عن طريق لمس جدار microtube حيث لا يوجد بيليه ووضع طاف ببطء باستخدام micropipette.

الترشيح 5. خلية

  1. اعادة تعليق الكريات من الخطوة 4.4 مع برنامج تلفزيوني الباردة على النحو التالي:
    1. إضافة 550 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى واحد من اثنين من microtubes القادمة من أنبوب رقم 1، واستخدام بي قطر كبير نسبياpette تلميح إلى ماصة بلطف صعودا وهبوطا تعليق خلية 5 مرات. كرر الشيء نفسه بالنسبة microtube واحدة قادمة من أنبوب رقم 2.
    2. للخلايا من أنبوب رقم 1، وذلك باستخدام نفس ماصة، ونقل تعليق الخلية الأولى لبيليه الثاني. resuspend الكرية الثاني قبل pipetting بلطف جنبا إلى جنب تعليق خلية صعودا وهبوطا 5 مرات.
    3. للخلايا من أنبوب رقم 2، و resuspend والجمع بين الكريات (أي microtubes الثالث والرابع) كما هو موضح في 5.1.2.
  2. تصفية اثنين من تعليق خلية من خطوات 5.1.2 و 5.1.3 على حدة باستخدام اثنين من أزواج مختلفة من مصافى الخلية (100 ميكرون و 40 ميكرون أحجام المسام) على النحو التالي:
    1. قبل الرطب كل مصفاة الخلية عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني إلى داخل مصفاة. استخدام ماصة لإزالة الزائدة برنامج تلفزيوني من خارج مصفاة.
    2. ماصة تعليق الخلية من الخطوة 5.1.2 بالتساوي على مصفاة الخلية الأولى مع 100 ميكرون حجم المسام. جمع من خلال تدفق في أنبوب 50 مل على الجليد. استخدام بيpette لجمع flow- من خلال تعلق على الجزء السفلي الجانب الخارجي للمصفاة الخلية.
    3. استخدام نفس ماصة لنقل التدفق من خلال الخلية مصفاة 100 ميكرون إلى الخلية مصفاة 40 ميكرون. جمع هذا التدفق من خلال أنبوب في آخر 50 مل على الجليد. عند نقل تدفق من خلال من 40 ميكرومتر مصفاة الخلية، تغيير نصائح ماصة جديدة لتجنب التلوث من 100 مصفاة ميكرومتر الخلية.
    4. كرر هذه الخطوات تعليق الخلية من الخطوة 5.1.3 باستخدام مجموعة جديدة من المرشحات.
  3. الجمع بين التدفق من خلال اثنين من كل عينة عن الحجم النهائي من حوالي 1 مل لكل عينة.

6. الحضانة مع الأجسام المضادة

ملاحظة: استخدام قسامات صغيرة من تعليق خلايا الدماغ لتحضير عينات الرقابة متعددة لتحديد التدفق المناسب الكريات الإعدادات قبل تشغيل العينة الرئيسية. لكل وضع العلامات الأجسام المضادة، وإعداد عينات السيطرة التي تتضمن أية أجسام مضادة، إلا أن حد ذاتهاالأجسام المضادة condary (أو غيرها من التسمية الفلورية)، وبعد ذلك كل الأجسام المضادة الأولية والثانوية (أو غيرها من التسمية الفلورسنت). استخدام عناصر التحكم هذه لتعيين البوابات التي تفصل محددة مقابل وضع العلامات غير محدد في عداد الكريات التدفق. عندما يكون ذلك ممكنا، استخدام fluorochromes التي لا تتطلب التعويض. زيادة الحجم النهائي من العينات السيطرة النابضة إلى الحجم النهائي من 700 ميكرولتر بإضافة برنامج تلفزيوني قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية.

  1. إعداد تشتت الضوء والعينة الضابطة دابي عن طريق نقل عينة ميكرولتر من الخلايا التي تمت تصفيتها 100 إلى 1.7 مل microtube. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع 1 ميكروغرام / مل دابي لتلطيخ أنويتها. احتضان لمدة 10 دقيقة مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط، وغسل (كما هو موضح في الخطوات 6.4.2 إلى 6.4.5) قبل أن تمر عبر قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: يتم استخدام هذا النموذج فقط لضبط خلية / نوى البوابة قبل فرز الخلايا المتبقية في الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  2. إعداد عينات السيطرة immunolabeled واحدة عن طريق تحويل 100 & #181؛ ل من الخلايا التي تمت تصفيتها إلى 1.7 مل microtube. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع الأجسام المضادة واحد (على سبيل المثال، NeuN الأجسام المضادة). إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى microtube مع الأجسام المضادة آخر (على سبيل المثال، فو الأجسام المضادة). إضافة الضد الثانوية المقابلة إذا لم يكن على الأجسام المضادة الأولية المباشر، مترافق.
    ملاحظة: يتم استخدام هذه العينات لتحديد أنبوب مضخم المناسب (PMT) الجهد، وتقييم تداخل الإشارات الفلورسنت اثنين إذا لزم الأمر. يجب معاير تركيز الأجسام المضادة لتحقيق أفضل نسب الإشارة إلى الضوضاء في كل القنوات. ويمكن أيضا إشارات الفلورسنت المتداخلة يتم تعويضهم من قبل المعايرة الداخلية للقنوات الفلورسنت مختلفة في قياس التدفق الخلوي.
  3. إعداد مزدوجة الفلورسنت المسمى عينة السيطرة السلبية عن طريق نقل 100 ميكرولتر من الخلايا التي تمت تصفيتها إلى 1.7 مل microtube. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع الأجسام المضادة الثانوية وحدها أو الأجسام المضادة الأولية مباشرة مترافق مفتش الحكومة.
    ملاحظة: ثيعينة الضبط والرقابة ويمكن استخدام كل مرة قبل الفرز لتحديد مضان الخلفية لكل fluorophore.
  4. إعداد عينة رئيسية ليتم فرزها.
    1. نقل 700 ميكرولتر من الخلايا التي تمت تصفيتها إلى 1.7 مل microtube. إضافة 7 ميكرولتر (1: 100) من الأجسام المضادة فو الأساسي مترافق مباشرة إلى اليكسا فلور 647 (مكافحة فو-AF647) و 1.4 ميكرولتر (1: 500) من الأجسام المضادة NeuN الأساسي مترافق مباشرة إلى فيكوإيريترين (مكافحة NeuN-PE). احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط.
    2. في نهاية الحضانة، إضافة 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى كل microtube، بما في ذلك العينة الرئيسية والعينات السيطرة، ومزيج من قبل انقلاب.
    3. microtubes أجهزة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، وترك 50 ميكرولتر طاف لمنع فقدان الخلية.
    4. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى خلايا بيليه و resuspend باستخدام ماصة يبلغ قطرها غيض كبير باعتدال.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية. دiscard طاف.
    6. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر الباردة PBS (ضبط الحجم النهائي يتوقف على حجم بيليه).
    7. نقل وتصفية تعليق في أنبوب عينة FACS مستديرة أسفل مع غطاء مصفاة الخلية (40 ميكرون). الحفاظ على خلايا immunolabeled على الجليد وتنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية على الفور. ملاحظة: للحصول على الترشيح، ولمس طرف ماصة عموديا على الغطاء مصفاة، ودفع تعليق الخلية من خلال ذلك.
  5. تدفق تعيين الكريات البوابات باستخدام عينات السيطرة.
    1. استخدام تشتت الضوء والعينة الضابطة دابي لتحديد السكان الخلية العصبية من مجموع الأحداث والحطام الخلوي.
      ملاحظة: الهيئات خلية في هذا المستحضر ليست سوى 1-2٪ من مجموع الأحداث (والباقي الحطام والعمليات الخلوية مكسورة). واستنادا إلى دابي إشارة الفلورسنت (تشير إلى نوى) ومبعثر إلى الأمام (حجم الخلية) فمن الممكن لتحديد أجسام الخلايا وبوابة تستند إلى الوراء على الأمام والجانب ضوء نثر خصائصالخلايا (كما هو موضح في الشكل رقم 1 أ، ب).
    2. استخدام عينات سيطرة immunolabeled واحدة لتحديد إعدادات PMT الجهد، وتحليل امتداد الانبعاثات من تألقي واحد محدد إلى مرشح / قناة أخرى (على سبيل المثال، اليكسا فلور 488 / FITC أو Phycoerythrine). إذا تداخل الإشارات الفلورسنت، وتصحيح التداخل عن طريق ضبط مستويات التعويض يدويا.
    3. استخدام سيطرة سلبية مزدوجة الفلورسنت وصفت لإعداد عتبة للسكان إيجابي.
      ملاحظة: الإشارة القادمة من هذه العينة ويعتقد أن ذلك يعود إلى صناعة السيارات في مضان وخلايا العينة الرئيسية تقع فوق هذه العتبة يمكن اعتبارها إيجابية. عادة، والمعلمات عتبة تصنيفها هي أكثر صرامة وتقريبا يتم فرز فعلا 2/3 العلوي من الخلايا المسمى فوق مراقبة سلبية.
  6. نوع الخلايا العصبية من العينة الرئيسية التي FACS إلى 1.7 مل microtubes. جمع الخلايا في 50 ميكرولتر من الحمض النووي الريبياستخراج العازلة. بعد الفرز، ودوامة وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب وتخلط تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات لاسترداد جميع الخلايا مرتبة من جدران الأنبوب.
  7. احتضان تعليق خلية تم فرزها في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للتأكد من أن كل الخلايا هي lysed قبل استخراج الحمض النووي الريبي، ثم الطرد المركزي في 2800 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  8. طاف لنقل أنبوب ريبونوكلياز خالية للتخزين طويل الأجل في -80 درجة مئوية أو مباشرة معالجة العينة لعزل الحمض النووي الريبي، والتوليف [كدنا، الجين المستهدف قبل التضخيم وQPCR، كما هو موضح سابقا 13-15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فرز الخلايا العصبية الإيجابية فوس فوس وسلبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة الظهرية المخطط من الفئران واحدة بعد حقن الميثامفيتامين الحادة.

تم استخدام بروتوكول المذكورة أعلاه لفرز الخلايا العصبية الإيجابية فوس فوس وسلبية من فأر واحد ظهري المخطط 90 دقيقة بعد حقنة داخل الصفاق من الميثامفيتامين (5 ملغ / كلغ). واستخدمت الفئران ساذجة في أقفاص وطنهم والضوابط. الظهرية تمت معالجة الأنسجة المخطط إما مباشرة بعد مجموعتها (أنسجة جديدة) أو معالجتها بعد تجميدها وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 1 أو 7 أو 21 يوما. وكانت النتائج من هذه النقاط وقت التجميد لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض، لذلك كان يتم تجميع البيانات.

لإعداد شروط الفرز على الصك، وعينات التحكم (المذكورة أعلاه) إما من مراقبة المنزل قفص أو methamphetaاستخدمت الجماعات حقن الألغام. عندما يمر كل جسيم أو الحدث في هذه العينات من خلال خلية تدفق في الكريات، تعطى رقم هوية مقترن خصائص نثر ومضان الخفيفة الحدث وتسجيلها في جدول بيانات. الأحداث في هذه الورقة ومن ثم يمكن تنظيمها في scattergrams أو المؤامرات كثافة لهذه الخصائص (الشكل 1). الأحداث ذات خصائص مماثلة يمكن بعد ذلك تجميع أو "بوابات" من قبل أزواج مختلفة من الخصائص لتحديد بوابات مثل تلك التي تحتوي على الخلايا، الخلايا العصبية، أو الخلايا العصبية فو إيجابية. مرة واحدة يتم تحديد البوابات باستخدام عينات السيطرة المذكورة أعلاه، يتم حقن العينة الرئيسية في قياس التدفق الخلوي وفرزها وفقا لهذه البوابات. تم بوابات السكان خلية من كل الأحداث (خلايا والحطام) على أساس من التشرذم الضوء إلى الأمام (FSC، مؤشرا على حجم الجسيمات) والجانب على ضوء مبعثر (SSC، مؤشرا ز الجسيمranularity). كما هو مبين في FSC مقابل SSC مؤامرة نقطة (الشكل 1A و 1B)، والمؤامرة كثافة كل الأحداث يكشف عن السكان متجانسة صغيرة مع حجم مماثل وتحبب، بالإضافة إلى مجموعة متغايرة كبير (الشكل 1A و 1B). وقد تم تحديد عدد السكان متجانس صغير يحتوي على أجسام الخلايا وبوابات باسم "الخلايا"، على أساس FSC وخصائص التعاون بين بلدان الجنوب من الدراسات السابقة 11،13-15 ووضع العلامات مع دابي. وقد تم الحصول على نسبة أعلى قليلا من الخلايا من الأنسجة المجمدة (2.6٪) من من أنسجة جديدة (1.9٪). السكان غير متجانسة كبيرة هي في معظمها الحطام، ويفترض من التشعبات وعمليات محور عصبي.

بعد ذلك، الخلايا واحد من بوابة "خلايا" تم تحديدها بناء على حجمها، والذي يدل على ذلك عرض إشارة FSC لكل حدث على محور س. واعتبرت الأحداث التي كانت أكبر من الخلايا وحيدة الخلية المجاميع واستبعادها من "بوابة خلية واحدة. وقد أجريت جميع الخطوات تحليل اللاحقة في هذا" بوابة خلية واحدة "(الشكل 1C و1D). الغالبية العظمى من هذه الفئة من السكان خلية واحدة (> 92٪) كان ايجابيا للتلوين دابي (البيانات لا معروضة).

أولا، تم تحديد الخلايا العصبية على أساس كثافة مضان PE من التي أشارت NeuN-مناعية (الشكل 1E و1F). الخلايا العصبية تضم ما يقرب من 24٪ من جميع الأحداث من بوابة "خلية واحدة" للأنسجة جديدة، و 38٪ للالأنسجة المجمدة. وكلها تقريبا من أحداث في هذه البوابة "العصبية" (98٪ في أنسجة جديدة و 99٪ في الأنسجة المجمدة) كانت إيجابية لتلطيخ دابي من الحمض النووي في نواة الخلية (الشكل 1G و1H). ما تبقى من أحداث وصفت دابي في البوابة خلية واحدة هي NeuN سلبية وتشمل الدبقية، قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة، وهو ما أكدته QPCR في الشكل (3).

ove_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> ثم تم تقسيم الخلايا العصبية كما فوس إيجابية أو الخلايا العصبية فو سلبية على أساس اليكسا فلور 647 مضان إشارة منها (فو-مناعية) على عكس الخلية من نوع علامات، فو. مستويات التعبير في زيادة الخلايا العصبية تدريجيا بسبب مستويات النشاط العصبي ودوام المختلفة. وبالتالي، لن يكون هناك عتبة واضحة المعالم بين فوس إيجابية مقابل الخلايا العصبية فو سلبية. في الخطوة الأولى (تستخدم فقط لخارج الخط يحلل ل حساب النسب المئوية للخلايا العصبية فو إيجابية)، حددنا الحد الأدنى لالخلايا العصبية فو إيجابية على أساس أقصى مضان اليكسا-647 (لفو) من السكان NeuN سلبية في ساذجة الفئران مراقبة المنزل القفص. يشار إلى الخلايا العصبية فو إيجابية في الساحات الزرقاء من ظروف تجريبية مختلفة في الشكل 2 في كل من الأنسجة الطازجة والمجمدة، والنسبة المئوية فو إيجابية الخلايا العصبية من الفئران المحقونة الميثامفيتامين. (1،9-2،2٪، الشكل 2C و 2D) وضعف التعاونmpared للفئران المنزل قفص (0،7-0،8٪، الشكل 2A و 2B).

مؤكدا الخلية من نوع جينات معينة من الخلايا مرتبة FACS باستخدام الجينات المستهدفة قبل التضخيم وRT-PCR.

في الخطوة الثانية، لضمان فرز الخلايا العصبية فو-الإيجابية الوحيدة من العينة الرئيسية للمرنا لاحق التحليلات والحد من إدراج خلايا فو سلبية، تم رفع عتبة مضان اليكسا-647 بحيث لا العلوية ثلثي فوس تم فرز الأحداث -positive في الساحات الزرقاء والتي تم جمعها. هذه العتبة لديها 10 أضعاف على الأقل أعلى مضان (أعلى فوس التعبير لكل خلية) من العتبة المستخدمة أعلاه لحساب النسبة المئوية للخلايا العصبية فو إيجابية في العينات. تم فرز أربعة السكان من الخلايا من عينات الأنسجة واحدة، بما في ذلك NeuN سلبية + فوس سلبية (~ 5000 الأحداث)، NeuN سلبية + فوس إيجابية (تراوحت 25-83 الأحداث)، NeuN إيجابية + فوس-NEGative (~ 5000 الأحداث) وNeuN إيجابية + فوس إيجابية (تراوحت 44-133 الأحداث لمجموعة المنزل، 185-450 الأحداث لمجموعة الميثامفيتامين). أولا، تم تأكيد تعبير عن خلية من نوع جينات معينة في NeuN إيجابية (بما في ذلك فوس إيجابية وفو-سلبي) السكان وNeuN سلبية (بما في ذلك فوس إيجابية وفو سلبية) (الشكل 3). وكان GAPDH تستخدم الجين إشارة / خدمة الغرف، استنادا إلى نتائج دراستنا السابقة (13). للسيطرة على مستويات مختلفة من الحمض النووي الريبي في العينة وكدنا] في تفاعلات PCR، أجريت ردود الفعل QPCR المزدوجة باستخدام بادئات لكل من الجينات المستهدفة وGAPDH كدنا]. وظلت القيم ط م للالتدبير المنزلي الجينات GAPDH بين 15 و 31 لقياسات دقيقة. لالأنسجة الطازجة والمجمدة على حد سواء، وكانت مستويات NeuN مرنا أكبر بكثير (حوالي 8 أضعاف) في عدد السكان NeuN إيجابي من بين السكان NeuN سلبية (ع <0.05، الشكل 3A GFAP (علامة الخلية الدبقية، الشكل 3B) وOligo2 (دبقية قليلة التغصن علامة الخلية، الشكل 3C) وكانت مستويات مرنا أكبر في السكان NeuN سلبية من بين السكان NeuN بفيروس (ع <0.05 ). وقد لوحظ مستويات مرنا في عدد السكان NeuN سلبية، ولكن هذا لم يكن ذات دلالة إحصائية، وهناك اتجاه مماثل من أعلى Iba1 (الشكل 3D علامة الخلية الدبقية). بعض العينات تحتوي على مستويات منخفضة للغاية من من mRNAs الخاصة التي لا يمكن قياسها بدقة في نوع خلية معينة (على سبيل المثال، GFAP مرنا في الخلايا العصبية المسماة NeuN). وقد تم تحديد القيم ط القصوى الى 35 للقضاء على القيم التي كانت منخفضة جدا بحيث لا يمكن الكشف بدقة. تجاوزت القيم ط أعلى حد الثقة في المقايسات QPCR لدينا.

وكان فو مرنا التعبيردرست في عدد الخلايا العصبية NeuN إيجابية من الفئران التي تلقت حقنة واحدة من الميثامفيتامين (الشكل 4). لالأنسجة الطازجة والمجمدة على حد سواء، وكانت مستويات فو مرنا أكبر في الخلايا العصبية فو إيجابية مما كانت عليه في الخلايا العصبية فو سلبية (P <0.05). وعلاوة على ذلك، في حين كانت هناك زيادة بنسبة 3 أضعاف من فوس مرنا في الخلايا العصبية فو إيجابية من أنسجة جديدة، أي بزيادة 11 أضعاف من فوس مرنا في الخلايا العصبية فو إيجابية من الأنسجة المجمدة تم الكشف عنها. مجتمعة، وتؤكد هذه النتائج مرنا هوية الخلايا العصبية فو-إيجابية، الخلايا العصبية فو سلبية والسكان غير العصبية من الأنسجة الطازجة والمجمدة على حد سواء. وعلاوة على ذلك، الخلية الجينات من نوع معين وغيرها من الجينات من الفائدة يمكن أيضا أن تحلل من الخلايا مرتبة تحت كل الظروف الطازجة والمجمدة.

شكل 1
الشكل 1. المحاصرة من ديسخلايا sociated وإعتبر من الطازجة والمجمدة الجرذ ظهري المخطط. وتم تحديد بوابة 'خلايا' من خصائص مبعثر الجانب (م) إلى الأمام ووأكد بوصف إيجابي مع تلطيخ دابي النووية (GH). تم تحديد بوابة "الخلايا العصبية" في أوساط السكان 'خلايا' من قبل مضان لNeuN (PE، EF). (A - B) بوابة الخلية: خطي مؤامرة من جميع الأحداث، على أساس مبعثر إلى الأمام (المحور السيني، وحجم الخلية) والجانب مبعثر (العمودي، تحبب). (C - D) خلايا واحدة البوابة: مؤامرة خطية من ارتفاع الأمام مبعثر (العمودي) وعرض (المحور السيني) داخل بوابة الخلية هو مبين في AB. (E - F) الخلية العصبية البوابة: مؤامرة لوغاريتمي من المناعي للNeuN PE المسمى (العمودي) داخل بوابة خلايا وحيدة، المبين في مؤتمر نزع السلاح تكشف الخلايا العصبية في الكتلة العلوية من الأحداث والخلايا غير العصبية في الكتلة أقل. (G H) نوى تلطيخ: مؤامرة لوغاريتمي من مضان لنوى المسمى دابي (العمودي) داخل بوابة الخلية العصبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. المحاصرة من الخلايا العصبية الإيجابية فوس فوس وسلبية من الطازجة والمجمدة الجرذ ظهري المخطط بناء على مزدوجة وصفها لNeuN وفوس. والطازجة والمجمدة ظهري المخطط من الفئران (مأخوذة مباشرة من القفص وطنهم أو 90 دقيقة بعد واحد تم فصلها حقن داخل الصفاق من الميثامفيتامين) والمسمى مع الأجسام المضادة مترافق مباشرة ضد NeuN وفوس وفرزها باستخدام آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية. فرز استند فيكوإيريترين (PE) -labeled NeuN المناعي (المحور السيني) واليكسا 647 المسمى immunofluo فوسrescence (العمودي). فو إيجابية (النقاط الزرقاء) وفو سلبية كانت موجودة (النقاط الحمراء) الخلايا العصبية في الأرباع اليمنى العليا والسفلى، على التوالي. المؤامرات نقطة تظهر خلايا NeuN إيجابية (الخلايا العصبية) والخلايا NeuN سلبية (نقاط رمادية)؛ وتشير الساحات الزرقاء الخلايا العصبية مع السالفة عتبة فو التعبير. (A - B) مجموعة الرئيسية: الفئران ساذجة مأخوذة مباشرة من أقفاص وطنهم. (C - D) مجموعة الميثامفيتامين: الفئران التي تلقت حقن واحدة من الميثامفيتامين. تم اختيار عتبات الخلايا العصبية فو إيجابية سيكون فقط فوق القصوى اليكسا 647 مضان (فو-IR) لاحظ لخلايا NeuN السلبية في السيطرة على المجموعة قفص المنزل. في حين 0،7-0،8٪ من جميع الخلايا العصبية هي فو-إيجابية في المجموعة المنزل، 1،9-2،2٪ من جميع الخلايا العصبية هي فو-إيجابية في المجموعة الميثامفيتامين.

الشكل (3)
الشكل (3). خلايا من الطازجة والمجمدة الجرذ ظهري المخطط قوي> خلية من نوع التعبير الجيني المحدد في FACS فرزها. الخلايا العصبية NeuN إيجابية (فوس إيجابية وفو سلبية) وNeuN سلبية (فوس إيجابية وفو سلبية) باستخدام بروتوكول صفها ومرنا مستويات التعبير عن الخلية من نوع جينات معينة استخدمت لتأكيد فرز الخلايا. (A) NeuN هو علامة للحصول على الخلايا العصبية. (ب) GFAP هو علامة للحصول على الخلايا الدبقية. (C) Oligo2 هو علامة لخلايا دبقية قليلة التغصن. (D) Iba1 هو علامة للحصول على الخلايا الدبقية. لNeuN مرنا، يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM من القيم أضعاف النسبية لمستويات التعبير في الخلايا NeuN سلبية من أنسجة جديدة (ن = 9-14). لGFAP (ن = 6-12)، Oligo2 (ن = 9-11) وIba1 (ن = 5-8) مرنا، يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM من القيم أضعاف مقارنة بمستويات التعبير في نويخلايا N-إيجابية من أنسجة جديدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
تم فرز الرقم 4. مستويات فو مرنا في الخلايا العصبية فرز FACS-من الطازجة أو المجمدة الجرذ ظهري المخطط بعد الخلايا العصبية الإيجابية فو الميثامفيتامين حقن. وفو سلبية كما هو موضح في البروتوكول أعلاه ووأكد مستويات مرنا من فوس. وتعرض البيانات كما يعني ± SEM من القيم أضعاف النسبية لمستويات التعبير في الخلايا العصبية فو سلبية من أنسجة جديدة (ن = 3-4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FACS يمكن استخدامها لفرز الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى من أي الطازجة أو المجمدة أنسجة المخ الكبار. كما ذكر في المقدمة، القدرة على استخدام الأنسجة المجمدة تتيح استغلال الأمثل لعينات من الحيوانات التي خضعت لإجراءات سلوكية معقدة ومطولة، مثل دراسات الإدارة الذاتية والانتكاس في أبحاث الإدمان. هذه الإجراءات السلوكية عادة ما يستغرق 1-2 ساعة أو أكثر، وتتطلب جميع الحيوانات (10-20 الكل) يتم اختبارها في نفس اليوم 13،18. يستغرق ~ 4 ساعات لمعالجة 4 عينات أنسجة المخ تشريح حديثا، والتي تشمل تشريح الدماغ، تفكك خلية، permeabilization وimmunolabeling. بعد المعالجة والفرز لكل عينة من FACS يستغرق ما بين 20 - 30 دقيقة. الخطوة النهائية للتسخين الخلايا مرتبة في تحلل العازلة تتطلب 30 دقيقة أخرى. في المجموع، ~ مطلوبة 7 ساعات من تشريح الدماغ إلى التي تحتوي على الحمض النووي الريبي خلية تحلل حل الخطوة النهائية. ومع ذلك، فمن الممكن الآن لتجميد الدماغ كلهنانو ثانية أو حديثا تشريح مناطق الدماغ مباشرة بعد الاختبار، ومعالجتها في وقت لاحق. هذا يبسط إلى حد كبير الاختبار ويسمح مناطق الدماغ متعددة ليتم فرزها في يوم آخر. تجميد أنسجة قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية ويمكن أيضا تحسين النتائج. ويتم الحصول على الخلايا العصبية أكثر NeuN إيجابية من عينات الأنسجة المجمدة. ويمكن تفسير ذلك جزئيا عن طريق زيادة NeuN وضع العلامات بسبب تعطل أغشية الخلايا أثناء التجميد والذوبان لاحق، والذي من شأنه أن يزيد وصول الأجسام المضادة للبروتينات الخلايا مثل NeuN وفوس. وقد لوحظت آثار مماثلة مع الخلايا الليفية والخلايا الظهارية وخلايا هيلا 19.

العائد من الخلايا والخلايا العصبية يمكن تكبير باستخدام الخطوات التالية. أثناء تشريح الأنسجة، وإزالة غالبية المادة البيضاء (الجسم الثفني والصوار الأمامي للالمخطط ظهري ونواة المتكئة على التوالي). هذا يمنع النسيج من الانضمام إلى نصائح من البلاستيك والزجاج الماصات في الظريف لاحقملاحظة. استخدام العازلة ألف (انظر المواصفات في جدول المواد والكواشف) للحفاظ على تشريح الأنسجة تغطيتها. هذا يحسن من نوعية الخلايا خلال تنميق الأنسجة مع شفرة حلاقة (الخطوة 2.5). مجموعة اضافية من 3 خطوات سحن مع أصغر ماصة الزجاج (الخطوة 3.9) وتصفية لاحقة مع مجموعة ثانية من مصافى الخلية (الخطوة 5) يضاعف الغلة من الخلايا والخلايا العصبية. وإعادة استخدام مصافى الخلية تسد الفلاتر وانخفاض العائد الخلية. كن لطيفا مع الخلايا عند إعادة التعليق على الكريات وخلال سحن. فإن استخدام طرف ماصة كبير معتدل خلال هذه الخطوات تقلل من تلف الخلايا نتيجة لإجهاد القص. بعناية مشاهدة بيليه عند إزالة طاف بعد permeabilization مع الإيثانول (الخطوة 4.4). بيليه هو أقل مدمج ويمكن توزيعها على طول جدار أنبوب microcentrifuge. وتشير الحسابات التقريبية إلى أن العائد من الخلايا العصبية فو إيجابية ما يقرب من 10٪ من عدد بدءا من عينة أنسجة الجسم المخطط تشريح. البروتوكول الحالي يمكن تعديلها لتناسب أهداف تجريبية أخرى. في البروتوكول الحالي، والأنسجة جمع 90 دقيقة بعد حقن الميثامفيتامين لفو التعبير إلى مستويات القصوى في هذا الوقت، وهو أمر حاسم للفرز كفاءة الخلايا العصبية فوس، معربا عن. ومع ذلك، والأنسجة التي يمكن جمعها في أي لحظة من الوقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية، وهذا يتوقف على الهدف المحدد للتجربة. لالأولي تخزين عينات الأنسجة، وقد استخدمنا بنجاح تشريح الأنسجة حديثا، الأنسجة المجمدة بعد تشريح، أو الأنسجة المجمدة تشريح من الدماغ كله المجمدة لعزل الخلايا العصبية فوس، معربا عن استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية تليها تحليل QPCR التعبير الجيني. لتثبيت وpermeabilization، ومدة ودرجة الحرارة في هذا البروتوكول (4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة) والأمثل لpermeabilize كل من الأغشية السيتوبلازمية والنووية، فضلا عن إصلاح الأنسجة. الاختلافات في مدة و / أو درجة الحرارة يمكن أن تتغير النتائج النهائية. حلول تثبيت أخرى مثل paraformaldehyde والمنظفات غير الأيونية مثل سابونين، التي عملت على الخلايا العصبية الجنينية وبعد الولادة 20، قد تعمل أيضا على الخلايا العصبية من الدماغ الكبار. وعلاوة على ذلك، والخرز إزالة النخاعين يمكن أن تستخدم تعديل البروتوكول الحالي كما هو مبين في الآونة الأخيرة لنظام مراقبة الأصول الميدانية من أنسجة المخ 21.

البروتوكول الحالي واثنين من القيود الهامة التي يجب مراعاتها. أولا، لا تناسب هذا البروتوكول للكشف عن علامات النمط الظاهري الخلية التي يتم التعبير عنها في المقام الأول في نقاط الاشتباك العصبي (مثل الدوبامين أو الغلوتامات مستقبلات) لإزالة هذه العمليات الخلوية من أجسام الخلايا خلال سحن والتفكك الخطوات. والقيد الثاني المحتمل هو أن أطوال RNA تم الحصول عليها من خلايا فرز FACS قد لا تكون كافية لجميع أساليب تحليل الحمض النووي الريبي. فرز أرقام سلامة الحمض النووي الريبي (رين) عن الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من نظام مراقبة الأصول الميدانية الخلايا بين 2.5- 3.5، والتي تتطابق مع أقصر متوسط ​​أطوال الحمض النووي الريبي. هنا، وتعويض حجم RNA أقصر من قبلباستخدام amplicons QPCR قصيرة نسبيا من 80-100 نقطة أساس، كما هو موضح سابقا 13-15. وقد استخدمنا أيضا هذه الرنا طول أقصر بنجاح لتحليل ميكروأري 11. ومع ذلك، أطوال RNA القصيرة التي تم الحصول عليها قد لا تكون كافية لجميع أساليب تحليل الحمض النووي الريبي. وينبغي التأكيد على أن الاشعال PCR الذي وجدت تستهدف على وجه التحديد تقاطعات اكسون-اكسون فقط في مرنا تقسم بشكل كامل في العصارة الخلوية استخدمت. هذه البادئات لا بالكشف عن الحمض النووي الريبي التي تحتوي على إنترون من النواة. وعلاوة على ذلك، فإننا قد استخدمت سابقا هذا البروتوكول مع الأجسام المضادة وأنسجة المخ جديدة للكشف عن هيدروكسيلاز التيروزين في مستقبلات الدوبامين العصارة الخلوية وD1 في الغشاء الخلوي 10. وأشار الكشف عن هذه العلامات غشاء عصاري خلوي والخلية التي الإجراء التفكك ينتج خلايا سليمة إلى حد كبير، وليس مجرد نواة.

وعموما، FACS عزل الخلايا العصبية من العينات المجمدة يفتح التطبيقات الأخرى. عدم وجود فروق في الفرز أو expre الجينوقد لوحظت ssion (لا تظهر البيانات) عندما تم تخزينها عينات 3 أيام أو 3 أسابيع في -80 درجة مئوية. ثلاثة أسابيع هي فترة زمنية معقولة لفرز جميع العينات من تجربة محددة (20 - 40 عينة) وعزل الحمض النووي الريبي للتعبير الجينات. كما تم الحصول على الحمض النووي الريبي صالحة للاستعمال من أنسجة المخ تخزينها لمدة 6 أشهر في -80 درجة مئوية (لا تظهر البيانات هنا). وبالتالي، يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيد لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزلة بعد الوفاة عينات الدماغ المجمدة التي تم تخزينها لعدة أشهر أو حتى سنوات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain matrix CellPoint Scientific 69-2160-1 to obtain coronal brain slices
Hibernate A low fluorescence Brain Bits HA-lf Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps
Accutase Millipore SCR005 Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean Eppendorf 22431081 to prevent cell lost during the protocol
Cell Strainer, 40 µm BD Falcon 352340 to filter cell suspension
Cell Strainer, 100 µm BD Falcon 352360 to filter cell suspension
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap BD Bioscience 352235 to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Pasteur Pipet, Glass NIH supply 6640-00-782-6008 to do tissue trituration
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody EMD Millipore FCMAB317PE antibody to detect neurons
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)  Cell Signaling Technology  8677 antibody to detect Fos-expressing cells
DAPI Sigma D8417 to label nuclei
PicoPure RNA Isolation Kit Applied Biosystems. KIT0204 The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells
Superscript III first strand cDNA synthesis system Invitrogen 18080-051 to synthesize cDNA from RNA
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems. 4391128 to do targeted-preamplification from cDNA
TaqMan Advance Fast Master  Applied Biosystems. 4444963 to do PCR using TaqMan probes
Fos TaqMan probe Applied Biosystems. Rn00487426_g1 TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probe Applied Biosystems. CACTCCAACAGCGTGAC nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Forward primer Applied Biosystems. GGCCCCTGGCAGAAAGTAG nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Reverse primer Applied Biosystems. TTCCCCCTGGTCCTTCTGA nucleotide sequence for neuronal gene marker
Gfap TaqMan probe Applied Biosystems. Rn00566603_m1 TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker
iba-1 TaqMan probe Applied Biosystems. Rn00574125_g1 TaqMan probe/primers for microglya gene marker
Gapdh TaqMan probe Applied Biosystems. CTCATGACCACAGTCCA nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Forward primer Applied Biosystems. GACAACTTTGGCATCGTGGAA nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Reverse primer Applied Biosystems. CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Oligo2 TaqMan probe Applied Biosystems. Rn01767116_m1  TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker
P1000 pipettor Rainin 17014382 It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells
7500 Fast Real-time PCR system Applied Biosystems. 446985 for quantitative PCR
FACSAria I Cell Sorter BD Biosciences for FACS sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
  2. Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
  3. Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
  4. Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
  5. Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  6. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
  7. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
  8. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
  9. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  10. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
  11. Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
  12. Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
  13. Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
  14. Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
  15. Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
  16. US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
  17. Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
  18. Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
  19. Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
  20. Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
  21. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).

Tags

علم الأعصاب، العدد 114، أنواع الخلايا، الخلايا العصبية، الدبقية، الأجسام المضادة، مرنا، FACS
مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وجين تحليل التعبير عن فوس، معربا عن الخلايا العصبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة دماغ الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R.,… More

Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (114), e54358, doi:10.3791/54358 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter