Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54358
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Behavioral Neuroscience Research Branch, Intramural Research Program, NIDA, NIH, DHHS, 2Division of Rheumatology, School of Medicine, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים מיון תא הופעל קרינה (FACS) פרוטוקול ללמוד שינויים מולקולריים Fos להביע רכבים עצביים משתי רקמת מוח טריה וקפואה. שימוש רקמה קפוא מאפשר בידוד FACS של אזורי מוח רבים על פני פגישות מרובות כדי למקסם את השימוש בנושאי בעלי חיים בעלי ערך.

Abstract

המחקר של פלסטיות עצבית ושינויים מולקולריים התנהגויות למדו עובר מהמחקר של אזורים במוח כולו ללימוד קבוצות הספציפיות של נוירונים מופעלים בדלילות שנקראים רכבים עצביים אשר מתווכות למדו עמותות. תא קרינת מיון מופעל (FACS) כבר מותאם לאחרונה עבור רקמת מוח עכברוש מבוגר ואפשר בידוד של נוירונים מופעלים באמצעות נוגדנים נגד הסמן העצבי NeuN ו Fos חלבון, סמן של נוירונים הופעל בחום. עד עכשיו, פוס-להביע עצב סוגי תאים אחרים נותקו מן הרקמה טריה, שהיה כרוכות ימי עיבוד ארוכים ואפשרו מספרים מצומצמים מאוד של דגימות המוח יוערכו לאחר נהלי התנהגות ממושכים ומורכבים. כאן מצאנו כי התשואות של Fos-להביע עצב ו Fos mRNA מ בסטריאטום הגבי היו דומות בין רקמות טרי גזור ורקמות קפוא ב -80 ºC עבור 3 - 21 ימים. בנוסף, אישרנו את הפנוטיפשל NeuN-חיובי תאים ממוינים NeuN שליליים על ידי סמני ביטוי גנים בהערכת סעיף עצבי (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ו microgial (Iba1), אשר מציין כי רקמה קפוא יכולה לשמש גם לבידוד FACS של סוגי תאי גליה. בסך הכל, אפשר לאסוף, לנתח ולהקפיא רקמת מוח הפעלות FACS המרובה. זה ממקסם את כמות נתונים המתקבלים בנושאי בעלי חיים יקרים, כי לעתים קרובות עברו נהלי התנהגות ארוכים ומורכבים.

Introduction

במהלך למידה, חיות להתאגד בין מכלולי גירויים מאוד ספציפיים. מידע ברזולוציה גבוהה זה הוא חשב להיות מקודד על ידי שינויים בתוך דפוסים מסוימים של נוירונים בדלילות שנקראים רכבים עצביים. רכבים עצביים זוהו לאחרונה על ידי האינדוקציה של גנים מוקדם מייד (IEGs) כגון Fos, Arc, ואת Zif268 ומוצרי החלבון שלהם בנוירונים אשר הופעלו בתוקף במהלך התנהגות או חשיפת קיו. Fos-להביע עצב בפרט הוכח לשחק תפקידים סיבתי בהקשר ו קיו ספציפי למדו התנהגויות 1-4. לפיכך, neuroadaptations המולקולרי הייחודי בתוך המופעל אלה נוירונים Fos להביע הם מועמדים מובילים עבור המנגנונים העצביים מקודדים למדו עמותות נוצרו במהלך למידה רגילה ולמידה נורמלית הפרעות, כגון התמכרות והפרעת דחק פוסט-טראומטית (PTSD) 5.

FluoreCell Scence המיון המופעל (FACS) אפשר ניתוח לאחרונה neuroadaptations המולקולרי הייחודי בתוך הנוירונים להביע Fos. Cytometry זרימה מיון תאים שפותחו בשנות ה -1960 6,7 לאפיין ולבודד תאים לפי מאפייני פיזור האור ואת immunofluorescent שלהם, ואת כבר זמן רב בשימוש באימונולוגיה וחקר הסרטן. עם זאת cytometry זרימת FACS דורש תאים בודדים ניתקים שקשה להשיג מרקמות מוח מבוגרות. FACS שימש לראשונה לבודד ולנתח חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -expressing נוירונים striatal מעכברים מהונדס כי לא דורשים תיוג נוגדן 8,9. פתחנו שיטת FACS מבוסס נוגדנים 10 לבודד ולהעריך שינויים מולקולריים Fos-להביע עצב מופעל על ידי סמים ו / או רמזים בחי סוג בר 11-15. בשיטה זו, נוירונים מסומנים עם נוגדן כנגד הסמן עצבי הכללי NeuN, בעוד מופעל בחום נוירוניםמסומנים עם נוגדן כנגד Fos. אמנם השיטה הראשונית שלנו נדרשת איגום של עד 10 חולדות לדגימה עבור רקמה טריה, שינויים מאוחרים יותר של הפרוטוקול מותר בידוד FACS של נוירונים Fos-הבעת תגובת שרשרת פולימראז כמותיים (qPCR) ניתוח של אזורים במוח הבדידים של חולדה אחת 13-15 . בסך הכל, שינויים מולקולריים ייחודיים נמצאו Fos-להביע עצב המופעל במהלך מגוון של התנהגויות להיקשר ו קיו המופעל במחקר התמכרות 12,14,15.

בעיה לוגיסטית גדולה עם ביצוע FACS על רקמה טריה היא שזה לוקח יום שלם כדי לנתק את הרקמה ותהליך ידי FACS. בנוסף, רק כארבע דגימות יכולות להיות מעובד ליום. בדרך כלל זה אומר כי רק באזור מוח אחד ניתן להעריך מכל מוח ואת אזורי המוח הנותרים צריכים להיות מושלכים. זוהי אחת בעיות עיקריות עבור נהלי התנהגות תפוקה נמוכה כגון מנהל עצמי ואת trai ההכחדהנינג הדורש ניתוח ושבועות רבים של אימונים אינטנסיביים. יתר על כן, ארוכים ומורכבים נהלי התנהגות ביום בדיקה מקשה לבצע FACS באותו היום. זה יהיה יתרון משמעותי על מנת להיות מסוגל להקפיא את המוח מן הבהמה מיד לאחר בדיקות התנהגותיות, ולאחר מכן לבודד נוירונים Fos להביע מאזורים במוח אחד או יותר בזמנים שונים לפי בחירת החוקרים.

כאן אנו מראים כי פרוטוקול FACS שלנו יכול לשמש כדי לבודד נוירונים Fos להביע (סוגי תאים אחרים) משתי רקמת מוח טריה וקפואה. כדוגמא, אנחנו מבודדים Fos-להביע עצב מן בסטריאטום עכברוש לאחר זריקות מתאמפטמין אקוטיות של חולדות נאיביות ללא זריקות (מצב מלא). עם זאת, פרוטוקול FACS זה יכול לשמש לאחר כל טיפול התנהגותי או תרופתי. ניתוח qPCR העוקבת של דגימות שלנו עולה כי ביטוי גנים סוגי תאים אלה ניתן להעריך עם סימייעילות Lar משתי רקמות טריות וקפואות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של ה- National Institutes of Health מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה 16.

הערה: כל השלבים הבאים צינורות צנטריפוגה שימוש מחייב נמוכים כי הוחזקו על קרח אלא אם צוין אחר.

1. הכנה לפני אוסף רקמות

  1. הגדר את צנטריפוגות עד 4 מעלות צלסיוס
  2. אש פולנית סט של שלוש פיפטות פסטר זכוכית עם בקטרים ​​הולכים ויורדים של 1.3 כ, 0.8, ו -0.4 מ"מ עבור כל דגימה.
  3. הכן שכותרתו 1.7 מ"ל-צינורות המכיל 1 מ"ל קר הצפת ולשמור את הצינורות על הקרח.
  4. הכין מגש קרח המכיל את מוח חיתוך מטריקס, שפכטלים וצלחות זכוכית (או בכלי זכוכית פטרי הפוכים) שעליו לבצע את הנתיחה. צמרמורת קדם סכיני גילוח שתיים או יותר על נייר לוחות זכוכית ושימוש ברקמות לייבוש כל המכשירים כי לגעת tנושא.
  5. להפשיר את הפתרון אנזים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות לפני איסוף רקמות.

רקמות 2. איסוף Dissection

  1. ליזום את 90 דקות טיפול התנהגותי או תרופתי לפני איסוף רקמות.
    הערה: לקבלת התוצאות המוצגות כאן, זריקות intraperitoneal חריפות של 5 מ"ג / קילו מתאמפטמין על חולדות בסביבת רומן (תנאי בדיקה) וחולדות נאיביות בכלובים בביתם (מצב מלא) בוצעו.
  2. להרדים את העכברוש על ידי הצבתו בתוך צנצנת ייבוש זכוכית עם isoflurane רווי לערוף את 30 עכברוש - שניות 60 מאוחר יותר באמצעות גיליוטינה.
    השתמש במספריים כדי להסיר את העור והשרירים מהראש ולחשוף את הגולגולת. השתמש rongeurs לחתוך את הגולגולת ולפתוח מגנום foramen ולהסיר את החלק האחורי של הגולגולת. השתמש rongeurs לחתוך לאורך השוליים העליונים של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. היזהר שלא להזיק למוח. השתמש מרית קטנה כדי לגרוף בעדינות תחתd לרומם את המוח. הרם את המוח לחתוך את העצבים עד למוח ללא תשלום 17.
  3. לנתח רקמות באמצעות סכיני גילוח.
    הערה: קבל דגימות רקמה באמצעות אחת מהשיטות הבאות: (2.3.1) רקמת גזור טרי; (2.3.2) רקמה קפוא לאחר דיסקציה; או (2.3.3) רקמה קפוא גזור מן המוח כולו קפוא. שמור המטריצה ​​חיתוך המוח, סכיני גילוח ויבש זכוכית צלחת ברחבי לנתיחה וקוצצים תהליכים כמים מרוכז יכול להוביל lysing hypotonic של תאים. השתמש בזכוכית מגדלת על מנת להבטיח לנתיחה מדויקת.
    1. עבור רקמות גזורות טרי, למקם את המוח הטרי חילוץ לתוך מטריצת חיתוך המוח (תבנית מתכת עכברוש בצורת מוח עם חריצים עבור סכיני הגילוח ב 1 במרווחי מ"מ) כי כבר מקוררת על קרח. הכנס שני או יותר סכיני גילוח מראש צונן לתוך החריצים לחתוך פרוסות עטרה המכילות את האזור במוח (ים) של עניין. מניח את הפרוסה לגזור על צלחת זכוכית הצוננת.
      הערה: לנתח את Regio המוחNS של ריבית על צלחת זכוכית צוננת.
    2. עבור רקמה קפוא לאחר דיסקציה, לנתח את האזור במוח (ים) של עניין מן פרוסות מוח חילוץ טרי, דומה לזה שתואר לעיל 2.3.1. הנח את הרקמה גזורה לתוך microtube במהירות להקפיא את הרקמות על ידי השריית microtube ב איזופנטאן -40 ºC במשך 20 שניות. שמור גזור הרקמה הקפואה בכל עת במקפיא -80 ºC עד לעיבוד נוסף.
    3. עבור הרקמה הקפואה, מיד להקפיא את המוח חילוץ טרי ב -40 ºC איזופנטאן ולאחסן בשקית אטומה ב -80 ºC עד 6 חודשים.
      1. ביום לנתיחה, למקם את המוח הקפוא בתוך cryostat נקבע על כ -20 ºC (לא חם יותר מאשר -18 ºC) למשך כ 2 שעות כדי לאזן את הטמפרטורה.
        הערה: Brains ניתן לחתוך בקלות בטמפרטורה זו, בעוד הרבה בטמפרטורות קרירות להפוך את המוח שביר מדי להיחתך בבטחה.
      2. השתמש סכיני גילוח לחתוך 1 - 2 מ"מ פרוסות עטרה שלבמוחם הקפוא cryostat. שימוש במחט 12 עד 16-מד קהה להשיג אגרופי רקמה פרוסות אלה בתנאי הקפאה. שמור גזור הרקמה הקפואה בכל עת עד לעיבוד נוסף.
  4. להוסיף 1 - 2 טיפות של הצפה כדי לכסות את הרקמה הגזורה לפני מיותר. הסר ביותר של החומר הלבן מהרקמה באמצעות שני סכיני גילוח כדי למנוע אובדן של נוירונים במהלך שאר תהליך הטחינה הדק. אם מתחיל עם רקמה קפוא, ואז לאפשר לרקמות להפשיר על צלחת הזכוכית הקרה למשך לא יותר מ 1 דקות לפני מריחת הצפת פתרון.
  5. לרכך את הרקמה 100 פעמים בכל כיוון מאונך עם סכין גילוח על צלחת זכוכית צוננת. החזק את סכין הגילוח אנכי לצלחת הזכוכית כאשר מיותר.
    הערה: מתייפייפים יסודי הוא קריטי עבור כל צעדי הפרוטוקול.
  6. השתמש סכיני גילוח להעביר את רקמות טחון לתוך צינורות microcentrifuge המכיל 1 מ"ל של חיץ א קר להפוך את הצינור 3 - 5 פעמים כדי KEEP כל הרקמות הטחונות בתמיסה.

3. תא דיסוציאציה

הערה: בסוף עדין השתמש מעל סוף הערבוב עבור כל השלבים הבאים. אין להשתמש במערבל מערבולת ולהימנע בועות אוויר הגורמות נזק לתאים.

  1. צנטריפוגה דוגמיות ב 110 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC. supernatant מחק. לאט לאט להוסיף 1 מ"ל של תמיסת אנזים קר טרי מופשר (המכיל תערובת של אנזימים מפרקי חלבונים) במורד הדופן הפנימית של microtube. מייד להתחנף הגלולה כולו פיפטה בעדינות מעלה ומטה רק 4 פעמים עם טפטף בקוטר טיפ גדול בינוני לפזר את גלולת רקמות הטחונה.
  2. הפוך את microtubes מייד כדי למנוע הגלולה יידבק לתחתית דגירת הדגימות עם ערבוב קצה מעל לקצה עבור 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
  3. לאחר עיכול רקמות האנזימטית, צנטריפוגה צינורות ב 960 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC. הסר את supernatant ולהוסיף 0.6 מ"ל של קר הצפת א Immediately לאחר הוספת החיץ, להשתמש באותו קצה פיפטה לפזר את הכדור על ידי מתחנף הגלולה כולו פיפטה בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים.
  4. מבחינה מכאנית triturate הרקמה מתעכלת ונאסף 15 מיליליטר צינורות באמצעות השלבים הבאים. עבור כל דגימה, השתמש קבוצה נפרדת של 3 פיפטות פסטר זכוכית אש מלוטש עם יורד בקטרים ​​של כ 1.3, 0.8 ו -0.4 מ"מ מחוברת נורות לטקס.
    1. בעדינות triturate כל דגימה 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 1.3 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח (פסולת ותאי undissociated יהיה ליישב לתחתית). אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל) ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל (צינור # 1).
    2. להוסיף 0.6 מ"ל הצפת פתרון גלולה הנותרים. Triturate מדגם 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 0.8 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח. אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל) ולהעביר אותו 15 מ"ל # צינור חרוטי 1.
    3. להוסיף 0.6 מ"ל הצפת פתרון Pelle הנותריםt. Triturate מדגם 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 0.4 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח. אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל; בלי לגעת גלולה עם תאים שאינם ניתק) ולהעביר לאותו 15 מ"ל # צינור חרוטי 1.
      הערה: שמור על פיפטה בקוטר 0.4 מ"מ בצינור # 1 עבור צעדי הטחינה הדקים הבאות.
    4. 3.4.3 חזור על שלב שלוש פעמים יותר בעזרת פיפטה זכוכית הקטנה (~ 0.4 מ"מ קוטר), לאסוף את supernatant לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר נפרד (צינור # 2).
    5. Triturate השעיות התא נאספים צינורות # 1 ו # 2 עבור 10 פעמים יותר בעזרת פיפטה זכוכית 0.4 מ"מ ולשמור על הקרח.

Cell 4. קיבוע Permeabilization

  1. כן 4 microtubes לדגימה (שני microtubes עבור תאים מצינור # 1 ושני תאים מצינור # 2) על ידי הוספת 800 μl של אתנול קר 100% (מאוחסן ב -20 מעלות צלסיוס לפני השימוש) לתוך צינור אחד ולשמור אותם על קרח . הערה: אתנול הסופיריכוז יהיה 50%.
  2. פיפטה ~ 800 μl של מתלי התא (מצינור # 1 צינור # 2) לתוך כל אחת מ -4 הצינורות המכילים אתנול קר להפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות.
  3. דגירת צינורות על קרח במשך 15 דקות תוך היפוך הצינורות כל 5 דקות.
  4. לאחר קיבוע / permeabilization, צנטריפוגות צינורות ב 1700 XG במשך 4 דקות ב 4 ºC וזורקים supernatant. השאירו 50 μl של פתרון כדי למנוע אובדן התא.
    הערה: הכדורים בשלב הזה לבנים, מקל פחות לקיר של הצינורות מבעבר permeabilization. לכן, להסיר את supernatant בקפידה על ידי נוגע בקיר של microtube שבו אין גלולה ולצייר את supernatant לאט באמצעות micropipette.

סינון נייד 5.

  1. Re- להשעות את כדורי משלב 4.4 עם PBS קר כדלקמן:
    1. להוסיף 550 μl של PBS קר אל אחד משני microtubes מגיע צינור # 1, ולהשתמש pi בקוטר גדול בינוניטיפ pette כדי פיפטה עד ההשעיה תא בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים. חזור על אותו הדבר עבור microtube אחד מגיע צינור # 2.
    2. עבור תאים מצינור # 1, באמצעות פיפטה אותו, להעביר את השעית התא הראשונה של הגלולה השנייה. Resuspend גלולה השני על ידי pipetting למעלה ההשעיה תא משולב בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים.
    3. עבור תאים מצינור # 2, resuspend ולשלב את הכדורים (כלומר, microtubes השלישי והרביעי) כמתואר 5.1.2.
  2. סנן את שני מתלי התא מפני צעדים 5.1.2 ו 5.1.3 בנפרד באמצעות שני זוגות שונים של מסננות תא (100 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר גודל נקבובי) כדלקמן:
    1. טרום רטוב כל מסננת תא על ידי הוספת PBS על החלק הפנימי של המסננת. השתמש פיפטה להסיר את PBS העודף מהחלק החיצוני של המסננת.
    2. פיפטה השעית תא משלב 5.1.2 באופן אחיד על מסננת התא הראשונה עם גודל נקבובי 100 מיקרומטר. אסוף את הזרימה דרך צינור 50 מ"ל על הקרח. השתמש pipette כדי לאסוף את הזרימה דרך מצורף בתחתית הצד החיצונית של מסננת התא.
    3. השתמש פיפטה אותו להעביר את הזרימה דרך מן מסננת תא 100 מיקרומטר מסננת תא 40 מיקרומטר. אסוף זרימה דרך זו עוד צינור 50 מ"ל על הקרח. בעת העביר את הזרימה דרך מ- 40 מיקרומטר מסננת תא, לשנות טיפים פיפטה חדשים כדי למנוע זיהום בין 100 מיקרומטר תא מסנן.
    4. חזור על שלבים אלה עבור השעית התא משלב 5.1.3 באמצעות סט חדש של מסננים.
  3. מערבבים את הזרימה דרך שתי מכל מדגם עבור נפח סופי של כ 1 מ"ל לדגימה.

6. דגירה עם נוגדנים

הערה: משתמש aliquots הקטן של מתלי תא המוח להכין דגימות שליטה מרובות עבור הגדרת הזרימה מתאימה cytometer הגדרות לפני הפעלת המדגם העיקרי. עבור כל תיוג נוגדן, להכין דגימות בקרה כוללות לא נוגדנים, רק seנוגדן condary (או תווית ניאון אחרת), ולאחר מכן הוא נוגדנים ראשוניים ומשניים (או תווית ניאון אחרת). השתמש בבקרות אלה כדי להגדיר את השערים מפרידים ספציפי לעומת התיוג הלא ספציפי של cytometer הזרימה. במידת האפשר, להשתמש fluorochromes שאינם דורשים פיצוי. הגבר את עוצמת הקול הסופית של דגימות בקרת gating לנפח סופי של 700 μl ידי הוספת PBS לפני הוספת הנוגדנים הראשוניים.

  1. הכן-פיזור אור מדגם מלא DAPI ידי העברת מדגם 100 μl של התאים המסוננים על microtube 1.7 מיליליטר. להוסיף 600 μl של PBS קר עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI מכתים גרעינים. דגירה במשך 10 דקות עם ערבוב הקצה על הקצה, ולשטוף (כמצוין צעדים 6.4.2 ל 6.4.5) לפני שהיא עוברת דרך cytometer זרימה.
    הערה: דגימה זו משמשת רק כדי להגדיר את שער התא / גרעינים לפני מיון התאים הנותרים במכונת FACS.
  2. הכן דגימות בקרת immunolabeled יחידות על ידי העברת 100 & #181; l של תאים מסוננים על 1.7 מ"ל microtube. להוסיף 600 μl של PBS קר עם נוגדן אחד (למשל, נוגדן NeuN). להוסיף 600 μl של PBS קר אל microtube עם נוגדן אחר (למשל, נוגדן Fos). מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים אם זה לא נוגדן ראשוני ישיר מצומדות.
    הערה: דגימות אלה משמשים כדי לקבוע את צינור מכפיל המתאים (PMT) מתח, ועל מנת להעריך את החפיפה של שני אותות ניאון במידת הצורך. ריכוזי נוגדנים צריכים להיות טיטרציה כדי להשיג את יחסי אות לרעש הטובים ביותר בכל הערוצים. אותות ניאון חופפים ניתן לפצות גם על ידי כיול פנימי של ערוצי ניאון שונים בתוך הזרימה cytometer.
  3. הכן מדגם שליטה שלילי ניאון שכותרתו כפול על ידי העברת 100 μl של תאים מסוננים על microtube 1.7 מ"ל. להוסיף 600 μl של PBS הקר עם נוגדנים משני לבד או נוגדנים ראשוניים ישירים מצומדות IgG.
    הערה: תימדגם מלא של ניתן להשתמש בכל פעם לפני המיון כדי לקבוע את קרינת הרקע עבור כל fluorophore.
  4. כן מדגם עיקרי להיות מסודר.
    1. העבר 700 μl של תאים מסוננים לתוך 1.7 מ"ל microtube. להוסיף 7 μl (1: 100) של נוגדן Fos העיקרי מצומדות ישירות אלקסה פלואוריד 647 (אנטי-Fos-AF647) ו -1.4 μl (1: 500) של נוגדן NeuN העיקרי מצומדות ישירות Phycoerythrin (אנטי-NeuN-PE). דגירה צינורות במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב הקצה על הקצה.
    2. בסוף הדגירה, מוסיפים 800 μl של קר PBS על כל microtube, כולל המדגם העיקרי דגימות בקרה, ומערבבים על ידי היפוך.
    3. microtubes צנטריפוגה ב 1,300 XG 3 דקות ב 4 ºC. בטל supernatant, עוזב 50 supernatant μl כדי למנוע אובדן התא.
    4. הוסף 1 מיליליטר של PBS הקר לתאים הגלולים ו resuspend בעזרת פיפטה בקוטר טיפ די רב.
    5. צנטריפוגה ב 1300 XG 3 דקות ב 4 ºC. Discard supernatant.
    6. Re- להשעות גלולה ב 500 μl PBS קר (להתאים את עוצמת הקול הסופי תלוי בגודל של גלולה).
    7. העברה ולסנן את ההשעיה לתוך צינור מדגם מסביב לתחתית FACS עם כובע מסננת תא (40 מיקרומטר). שמור את התאים immunolabeled על הקרח ומיד לבצע FACS. הערה: סינון, לגעת קצה פיפטה אנכית על הכובע המסנן ולדחוף את השעית תא דרך זה.
  5. זרימת גדר cytometer שערים באמצעות דגימות בקרה.
    1. השתמש פיזור אור המדגם מלא DAPI לזהות את אוכלוסיית תאים העצבית מאירועי הכולל ופסולת הסלולר.
      הערה: גופי תא בהכנה זו הם רק 1 - 2% של סך כל אירועים (השאר הוא פסולת תהליכים תאיים שבורים). בהתבסס על אות ניאון DAPI (גרעינים מציינים) ואת פיזור קדימה (גודל של התא) אפשר לאתר גופי תא שער לאחור מבוססים על קדימה וצד אור פיזור נכסים שלהתאים (כפי שמוצג באיור 1 א ', ב).
    2. השתמש בדגימות שליטה immunolabeled אחת כדי לקבוע את הגדרות מתח PMT, ולנתח גלישת פליטה מן fluorochrome אחד מסוים לתוך מסנן אחר / ערוץ (למשל, Alexa פלואוריד 488 / FITC או Phycoerythrine). אם אותות ניאון חופפים, לתקן את החפיפה באמצעות התאמת רמות פיצוי ידנית.
    3. השתמש בשלט השלילי הניאון שכותרתו הכפול להגדיר את הסף עבור האוכלוסייה החיובית.
      הערה: האות מגיע מדגם זה נחשב בשל קרינה אוטומטית ותאי המדגם העיקרי הנמצא מעל סף זה יכול להיחשב חיובי. בדרך כלל, פרמטרי הסף למיון הם מחמירים יותר וכ העליון 2/3 התאים שכותרתו מעל הביקורת השלילית הם למעשה מסודרות.
  6. מיין הנוירונים מן המדגם העיקרי ידי FACS לתוך 1.7 microtubes מ"ל. אוספים את התאים לתוך 50 μl של רנ"אחיץ החילוץ. לאחר מיון, מערבולת ו צנטריפוגות הצינור ומערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לשחזר את כל התאים הממוינים מן הקירות של הצינור.
  7. לדגור על השעיית התא מיון ב -42 ºC למשך 30 דקות על מנת להבטיח כי כל התאים lysed לפני מיצוי RNA, ולאחר מכן צנטריפוגות ב 2,800 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC.
  8. מעבירים את supernatant צינור RNase ללא עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ºC או מיד לעבד את המדגם עבור בידוד RNA, סינתזה cDNA, הגברה-מראש הגן היעד qPCR, כפי שתואר לעיל 13-15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מיון נוירונים Fos-חיובי Fos-שלילי מרקמות בסטריאטום הגבה טריות וקפואות מן החולדות יחידות לאחר זריקות מתאמפטמין חריפות.

הפרוטוקול המתואר לעיל היה רגיל לסוג Fos-חיובי Fos-שלילי נוירונים מתוך 90 דקות בסטריאטום הגבי יחיד חולדה לאחר זריקה intraperitoneal של מתאמפטמין (5 מ"ג / ק"ג). חולדות נאיביות בכלובים בביתם שמשו שולטים. הגב רקמות בסטריאטום היה מעובד או מיד לאחר גבייתו (רקמה טרי) או לאחר שהר קפוא ומאוחסנים -80 ºC עבור 1, 7 או 21 ימים. התוצאות מנקודות זמן הקפאה אלה לא היו שונים משמעותית זה מזה, כך שהנתונים היו נקווה.

כדי להגדיר את תנאי מיון על המכשיר, דגימות בקרה (כמתואר לעיל) משתי השליטה בכלוב בבית או methamphetaקבוצות-המוזרק שלי היו בשימוש. כאשר כל חלקיק או אירוע בדגימות אלה עובר דרך תא זרימת cytometer, הם מקבלים מספר זיהוי משויך מאפייני פיזור קרינת האור של האירוע נרשם בגיליון אלקטרוני. אירועי גיליון זה אז יכול להיות מאורגן scattergrams או מגרשי צפיפות עבור המאפיינים הללו (איור 1). אירועים בעלי מאפיינים דומים ואז ניתן לקבץ או 'מגודר' על ידי זוגות שונים של מאפיינים כדי לקבוע את השערים כגון אלה תאים המכילים, נוירונים, או נוירונים Fos-חיוביים. ברגע השערים נקבעים באמצעות דגימות בקרה שתוארו לעיל, המדגם העיקרי מוזרק לתוך זרם cytometer מיון לפי השערים הללו. אוכלוסיית התא מגודרת מכל האירועים (תאים ופסולת) מבוססים על פיזור האור קדימה שלהם (FSC; אינדיקציה לגודל של החלקיקים) ולפזר אור בצד (SSC; אינדיקציה של g החלקיקיםranularity). כפי שניתן לראות FSC מול SSC נקודת העלילה (האיור 1 א ו -1 B), עלילת הצפיפות של כל האירועים מגלה אוכלוסייה הומוגנית קטנה עם גודל גרעיני דומים להם, בנוסף לאוכלוסייה הטרוגנית גדולה (איור 1A ו -1 B). אוכלוסייה הומוגנית קטנה המכילה גופי תא זוהתה מגודרת כמו "תאים", מבוססים על FSC ומאפייני SSC ממחקרים קודמים 11,13-15 וסימון עם DAPI. אחוז מעט גבוה יותר של תאים התקבל רקמה קפוא (2.6%) מאשר מרקמות טריות (1.9%). האוכלוסייה הטרוגנית הגדולה היא בעיקר פסולת, ככל הנראה מן דנדריטים תהליכי axonal.

לאחר מכן, תאים בודדים מהשער "תאים" זוהו בהתבסס על גודלם, אשר צוין על ידי רוחב של האות FSC עבור כל אירוע על ציר ה- x. אירועים שהיו גדולים מאשר תאים בודדים נחשבו אגרגטים תא ומודרות מן "שער התא הבודד. כל השלבים לניתוח שלאחר מכן נערכו בתוך זה" שער תא בודד "(איור 1 ג ו 1D). רוב אוכלוסיית תא בודדת זה (> 92%) היה חיובי עבור מכתים DAPI (נתונים לא מוצג).

ראשית, הנוירונים זוהו מבוסס על עוצמת הקרינה PE שלהם שהצביעו-immunoreactivity NeuN (איור 1E ו 1F). נוירונים מהווים כ 24% מכלל האירועים משער "התא בודד" עבור רקמה טריה ו -38% עבור רקמה קפוא. כמעט כל אירועי שער "Neuron" זה (98% ב רקמה טריה ו -99% ב רקמה קפוא) היו חיוביים עבור מכתים DAPI של DNA בגרעין התא (איור 1G ו 1H). אירועי DAPI שכותרתו שנותרו שער התא היחיד הם NeuN שליליים וכוללים גליה, oligodendrocytes ו microglia, כפי שאושרו על ידי qPCR באיור 3.

ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> אז נוירונים סווגו Fos-חיובי או שלילי Fos נוירונים מבוסס על האות אלקסה פלואוריד 647 הקרינה שלהם (Fos-immunoreactivity) בניגוד סמנים תא מסוג, פוס. רמות הביטוי בנוירונים עולה בהדרגה עקב רמות שונות של פעילות עצבית ומהלך זמן. לפיכך, לא תהיינה סף ברור בין Fos-חיובי לעומת נוירונים Fos-שליליים. בשלב הראשון (משמשות רק עבור off-line מנתח לחשב אחוזים של נוירונים Fos-חיובי), הגדרנו את הסף נוירונים Fos-חיוביים המבוססים על קרינת Alexa-647 מקסימום (עבור Fos) מן אוכלוסיית NeuN-שלילי החולדות השליטות בכלוב בבית הנאיבית. נוירונים חיוב Fos מסומן בכיכרות הכחולות תנאי ניסויים שונים באיור 2 בשני רקמות טריות וקפואות, אחוז נוירונים Fos-חיובי חולדות מוזרקות מתאמפטמין. (1.9 - 2.2%, איור 2C ו 2 ד) היה כפליים שיתוףmpared חולדות בכלוב בבית (0.7 - 0.8%, איור 2 א ו -2).

אישור גנים ספציפיים תא מסוג מתאי-מסודר FACS באמצעות גן מטרת הגברה מראש ו RT-PCR.

בשלב השני, על מנת להבטיח מיון של נוירונים Fos-החיוביים היחידים מן המדגם העיקרי mRNA לאחר מנתח והפחתת הכללת תאי Fos-שליליים, סף קרינת Alexa-647 הועלה כך ששני שלישים העליונים בלבד של Fos אירועי -positive בכיכרות הכחולות מוינו שנאספו. יש סף זה לפחות פי 10 קרינה גבוהה יותר (ביטוי Fos גבוה לכל תא) מהסף בשימוש מעל לחשב אחוז נוירונים Fos-החיוביים בדגימות. ארבע אוכלוסיות של תאים מוינו ממדגם רקמות יחיד, כולל NeuN שלילי + Fos-שלילי (~ 5,000 אירועים), NeuN שלילי + Fos-חיובי (נע 25 - 83 אירועים), NeuN חיובי + Fos-נגative (~ 5,000 אירועים) ו NeuN חיובי + Fos-חיובי (נע 44 - 133 אירועים עבור הקבוצה הביתה, 185 - 450 אירועים עבור הקבוצה מתאמפטמין). ראשית, את הביטוי של גנים ספציפיים תא מסוג ב NeuN חיובי (כולל שני Fos-חיובי Fos-שלילי) ו NeuN שלילי האוכלוסייה (כולל שני Fos-חיובי Fos-שלילי) אושרה (איור 3). GAPDH היה משמש גן ההתייחסות / משק, על בסיס תוצאות המחקר הקודם שלנו 13. כדי לשלוט על רמות שונות של RNA במדגם ו cDNA בתגובות PCR, דופלקס תגובות qPCR בוצעו באמצעות פריימרים עבור שניהם הגן היעד GAPDH cDNA. ערכי ה- CT של גן משק GAPDH הוחזקו בין 15 ו -31 עבור מדידות מדויקות. עבור שני רקמות טריות וקפואות, רמות ה- mRNA NeuN היו גדולות יותר משמעותי (כ 8-פי) באוכלוסיית NeuN החיובית מאשר באוכלוסיית NeuN השלילית (p <0.05; איור 3 א GFAP (מסמן תא גלייה; איור 3) ו Oligo2 (סמן תא oligodendrocyte; איור 3 ג) רמות mRNA היו גדולות יותר אצל אוכלוסיית NeuN השלילית מאשר באוכלוסיית NeuN חיובית (p <0.05 ). מגמה דומה של Iba1 גבוה (סמן תא microglial; איור 3D) רמות mRNA נצפתה באוכלוסיית NeuN השלילית, אבל זה לא היה מובהק סטטיסטי. כמה דגימות הכילו רמות נמוכות מאוד של mRNAs מסוים כי לא ניתן היה למדוד במדויק לסוג תא מסוים (למשל, GFAP mRNA בנוירונים שכותרתו NeuN). ערכי ה- CT מרביים הוגדרו 35 לחסל ערכים היו נמוכים מכדי להיות מזוהים בצורה מדויקת. ערכים גבוהים Ct את הגבול המותר אמון מבחני qPCR שלנו.

Fos mRNA ביטוי היהבחן באוכלוסייה העצבית NeuN חיובי מן החולדות שקיבלו זריקה אחת של מתאמפטמין (איור 4). עבור שני רקמות טריות וקפואות, רמות ה- mRNA Fos היו יותר הנוירונים Fos-החיוביים מאשר נוירונים Fos-השליליים (p <0.05). יתר על כן, בעוד חלה עלייה של פי 3 של Fos mRNA בנוירונים Fos-חיוביים מהרקמות הטריות, עלייה פי 11 של Fos mRNA בנוירונים Fos-החיוביים מן הרקמה קפואה זוהתה. יחדיו, תוצאות mRNA אלה מאשרות את זהותו של נוירונים Fos-החיוביים, נוירונים Fos-שליליים אוכלוסייה הלא-עצבית משתי רקמות טריות וקפואות. יתר על כן, גנים ספציפיים לסוג תא וגנים אחרים בעלי עניין יכולים גם להיות מנותחים מתאי מסודרים תחת שני תנאים טריים וקפואים.

איור 1
איור 1. Gating של דיסתאי sociated ומסומן מ טרי קפוא העכברוש הגבה בסטריאטום. השער 'התאים' נקבע על ידי מאפייני פיזור קדימה בצד (AD) ואושר על ידי תיוג חיובי עם מכתים DAPI גרעיני (GH). השער "נוירונים" בתוך האוכלוסייה "תאים" נקבע על ידי הקרינה עבור NeuN (PE; EF). (א - ב) שער נייד: עלילה ליניארית של כל האירועים, המבוססת על פיזור קדימה שלהם (ציר ה- X, גודל התא) ולפזר בצד (ציר ה- Y, גרעיניות). (C - D) שער תאים בודדים: עלילה ליניארית של גובה פיזור קדימה (ציר ה- Y) ורוחב (ציר ה- X) בתוך השער התא המוצג AB. (E - F) שער Neuron: עלילת לוגריתמים של immunofluorescence עבור NeuN PE שכותרתו (ציר ה- Y) בתוך שער תאים הבודדים שמוצג CD מגלה נוירונים באשכול העליון של אירועי תאים שאינם עצביים באשכול הנמוך. (G H) גרעינים מכתימים: עלילת לוגריתמים של קרינה עבור גרעינים שכותרתו DAPI (ציר ה- Y) בתוך שער תאים העצבי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. Gating של Fos-חיובי Fos-שליליים נוירונים מ טרי הקפוא העכברוש הגבה בסטריאטום בהתבסס על זוגי תיוג עבור NeuN ו Fos. הסטריאטום הגב הטרי והקפוא מן החולדות (נלקח ישירות בכלוב בביתם או 90 דקות אחרי אחת הזרקת intraperitoneal של מתאמפטמין) היו מנותקים ומסומן עם נוגדנים מצומדות ישירות נגד NeuN ו Fos מיון באמצעות מכונה FACS. מיון התבססה על Phycoerythrin (PE) -labeled immunofluorescence NeuN (ציר ה- X) ו אלקסה 647 שכותרתו Fos immunofluorescence (ציר Y). Fos-חיובי (נקודות כחולות) ו Fos-שלילי (נקודות אדומות) נוירונים אותרו הרביעים הימניים העליונים ותחתונים, בהתאמה. המגרשים הנקודים להראות תאי NeuN חיוביים (נוירונים) ותאי NeuN שליליים (נקודות אפורות); הריבועים הכחולים מצביעים נוירונים עם ביטוי Fos-סף לעיל. (א - ב) קבוצת בית: חולדות נאיביות נלקחות ישירות בכלובים בביתם. (C - D) קבוצת מתאמפטמין: חולדות שקבלו זריקות יחידות של מתאמפטמין. הספים נוירונים Fos-חיוב נבחרו להיות בדיוק מעל מקסימאלי Alexa-647 קרינה (Fos-IR) שנצפתה עבור תאי NeuN שליליים בקבוצת הביקורת בכלוב בבית. בעוד 0.7 - 0.8% של כל הנוירונים הם Fos-חיוביים בקבוצה הביתה, 1.9 - 2.2% של כל הנוירונים הם Fos-חיוביים בקבוצת מתאמפטמין.

איור 3
איור 3. ביטוי גנים ספציפיים תאים מסוג ב FACS-מסודרים תאים טריים קפואים עכברוש הגבי בסטריאטום. נוירונים NeuN חיובי (Fos-חיובי-שלילי Fos) ותאי שלילי NeuN (Fos-חיובי-שלילי Fos) מוינו באמצעות פרוטוקול המתואר ורמות ביטוי mRNA של גנים ספציפיים תאים מסוג שימשו כדי לאשר מיון התא. (א) NeuN הוא סמן תאים עצביים. (ב) GFAP הוא סמן ותאי גלייה. (C) Oligo2 הוא סמן עבור תאי oligodendrocyte. (ד) Iba1 הוא סמן תאי microglial. עבור NeuN mRNA, נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של ערכים לקפל ביחס לרמות ביטוי בתאים NeuN שליליים מהרקמות הטריות (n = 9 - 14). עבור GFAP (n = 6 - 12), Oligo2 (n = 9 - 11) ו Iba1 (n = 5 - 8) mRNA, הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM של ערכים לקפל ביחס לרמות ביטוי NeuN חיובים תאים מהרקמות הטריות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. רמות Fos mRNA בנוירונים-מסודרים FACS מ טרי או קפוא העכברוש הגבה בסטריאטום לאחר מתאמפטמין הזרקה. Fos-חיובי נוירונים שליליים Fos מוינו כמתואר בפרוטוקול לעיל רמות ה- mRNA של Fos אושרו. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של ערכים לקפל ביחס לרמות ביטוי בנוירונים Fos-שלילי מהרקמות הטריות (n = 3 - 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתן להשתמש FACS למיין נוירונים סוגי תאים אחרים מרקמות המוח המבוגר טרי או קפוא. כפי שהוזכר במבוא, את היכולת להשתמש רקמה קפוא מאפשרת ניצול אופטימלי של דגימות מבעלי החיים שעברו הליכי התנהגותי מורכבים וממושך, כגון לימודי מנהל עצמי ו להרע במחקר התמכרות. נהלי התנהגות אלה בדרך כלל לוקחים 1 - 2 שעות או יותר, ודורשים כל בעלי החיים (10 - 20 בסך הכל) להיבדק באותו היום 13,18. זה לוקח ~ 4 שעות לעבד דגימות רקמת מוח 4 טריים גזורות, הכוללת לנתיחת מוח, תא דיסוציאציה, permeabilization ו immunolabeling. לאחר עיבוד, מיון כל דגימה על ידי FACS לוקח בין 20 - 30 דקות. השלב האחרון של חימום התאים הממוינים במאגר תמוגה דורש עוד 30 דקות. בסך הכל, ~ 7 שעות נדרשות לנתיחת המוח לשלב פתרון תא-ימס הסופי המכיל RNA. עם זאת, כיום ניתן להקפיא כל braiNS או טרי גזור אזורים במוח מיד לאחר ביצוע בדיקה, ולעבד אותם מאוחר יותר. זה מאוד מפשט בדיקות ומתיר אזורי מוח מרובים להיות מסודר ביום אחר. הקפאת הרקמה לפני FACS עשויה גם לשפר את תוצאות. עוד נוירונים NeuN חיוביים מתקבלים דגימות רקמה קפוא. זו עשויה להיות מוסברת בחלקה על ידי NeuN תיוג מוגבר בשל שיבוש קרום תא במהלך הקפאה להפשרה עוקבת אשר יגדיל גישת נוגדני חלבונים תאיים כגון NeuN ו פוס. תופעות דומות נצפו עם פיברובלסטים, תאי אפיתל ותאי הלה 19.

התשואה של תאי נוירונים יכולה להיות מוגדלת באמצעות השלבים הבאים. במהלך דיסקציה של הרקמה, להסיר רוב החומר לבן (כפיס מוח ואת השלכתי קדמי עבור הנסמך בסטריאטום והגרעין הגבה, בהתאמה). הדבר מונע רקמה דבק טיפי פלסטיק טפטפות זכוכית STE עוקבתps. השתמש הצפה (ראה מפרטת בטבלה של חומרים ריאגנטים) כדי לשמור על הרקמה הגזורה המכוסית. זה משפר את איכות התאים במהלך מיותר של הרקמה עם סכין הגילוח (שלב 2.5). הסט הנוסף של 3 שלבי טחינה דקים עם פיפטה זכוכית הקטנה (שלב 3.9) וסינון לאחר מכן עם סט שני של מסננות תא (שלב 5) מכפיל את התשואה של תאים ונוירונים. שימוש חוזר מסננות התא יהיה לסתום את מסנני תשואת תא תחתונה. תהיה עדין עם תאים כאשר resuspending את כדורי ובמהלך טחינה דקה. שימוש קצה פיפטה גדול בינוני במהלך השלבים הבאים יפחית ניזק לתאים עקב מאמץ הגזירה. בזהירות לצפות גלולה בעת הסרת supernatant לאחר permeabilization עם אתנול (שלב 4.4). הגלולה היא פחות קומפקטית והוא יכול להיות מופץ לאורך הקיר של צינור microcentrifuge. חישובים גסים מראים כי התשואה של נוירונים Fos-החיוביים הוא כ 10% של המספר הראשון במדגם רקמות striatal הגזור. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שונה כדי להתאים מטרות ניסיוניות אחרות. בפרוטוקול הנוכחי, רקמות נאספו 90 דקות לאחר זריקות מתאמפטמין כי ביטוי Fos מגיע לרמות מקסימליים בשלב זה, שהוא חיוני עבור מיון יעיל של נוירונים להביע Fos. עם זאת, רקמה ניתן לאסוף בכל נקודת זמן עבור FACS, תלוי המטרה הספציפית של הניסוי. עבור אחסון דגימת רקמה ראשוני, יש לנו בהצלחה השתמשו טרי רקמות גזורות, רקמה קפוא לאחר דיסקציה, או רקמה קפוא הגזורה מן המוח כולו קפוא לבודד נוירונים Fos להביע באמצעות FACS ואחריו ניתוח qPCR של ביטוי גנים. עבור קיבעון permeabilization, המשך וטמפרטורה בפרוטוקול זה (4 ºC במשך 15 דקות) היה מותאם permeabilize הוא ממברנות ציטופלסמית גרעיניות, כמו גם כדי לתקן את הרקמה. וריאציות משך ו / או הטמפרטורה יכולה לשנות את התוצאות הסופיות. פתרונות קיבעון אחרים כגון paraformaldehyde ודטרגנטים שאינם יוניים כגון saponin, אשר עבדו עבור נוירונים עובריים שלאחר הלידה 20, יכולים גם לעבוד עבור נוירונים במוח הבוגר. יתר על כן, חרוזי הסרת המיאלין יכולים לשמש שינוי של הפרוטוקול הנוכחי כפי שמוצגים לאחרונה עבור FACS ממוח רקמות 21.

הפרוטוקול הנוכחי יש שתי מגבלות חשובות שיש לקחת בחשבון. ראשית, פרוטוקול זה אינו מתאים לאיתור סמנים פנוטיפ התא אשר מתבטאות בעיקר סינפסות (למשל, קולטני דופאמין או גלוטמט) כי תהליכים תאיים אלה יוסרו מן גופי התא במהלך השלבים טחינה דקה ו דיסוציאציה. מגבלה אפשרית שנייה היא כי אורכי RNA המתקבל תאים-מסודרים FACS עלולים שלא להספיק עבור כל שיטות ניתוח RNA. מספרים שלמים RNA (רין) עבור RNA המתקבל FACS מיון תאים הם בין 3.5 2.5-, אשר תואם את אורכי RNA ממוצע קצרים יותר. הנה, את גודל RNA קצר פוצתהבאמצעות amplicons qPCR קצר יחסית של 80 - 100 נקודות בסיס, כפי שתואר לעיל 13-15. גם השתמשנו RNAs באורך קצר אלה בהצלחה לניתוח microarray 11. אף על פי כן, באורכי RNA קצרים השיג לא יכולים להיות מתאימים לכל שיטות ניתוח RNA. יודגש כי פריימרים PCR כי ממוקדות במיוחד בצמתים אקסון-אקסון נמצא רק mRNA שחבור במלואו cytosol שימשו. פריימרים אלו אינם מזהים RNA המכיל אינטרון מהגרעין. יתר על כן, יש לנו בעבר השתמשו בפרוטוקול זה עם נוגדנים רקמת המוח טרי כדי לזהות hydroxylase טירוזין ב קולטני דופאמין cytosol ו- D1 בקרום הסלולר 10. איתור של סמני קרום cytosolic ותא אלה עולה כי הליך הניתוק מייצר תאים שלמים ברובו, ולא רק גרעינים.

בסך הכל, FACS בידוד של נוירונים ממדגמים קפוא פותח יישומים אחרים. אין הבדלים למיון או גן expression נצפה (מידע לא מוצג) כאשר דגימות אוחסנו 3 ימים או 3 שבועות ב -80 ºC. שלושה שבועות הוא פרק זמן סביר כדי למיין את כל הדגימות מניסוי ספציפי (20 - 40 דגימות) ולבודד RNA עבור ביטוי גנים. RNA שמיש גם התקבל מרקמות המוח מאוחסן במשך 6 חודשים ב -80 ºC (מידע לא מוצג כאן). לפיכך, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור בידוד FACS של דגימות מוח אנושי קפוא שלאחר המוות כי אוחסנו במשך כמה חודשים או אפילו שנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain matrix CellPoint Scientific 69-2160-1 to obtain coronal brain slices
Hibernate A low fluorescence Brain Bits HA-lf Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps
Accutase Millipore SCR005 Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean Eppendorf 22431081 to prevent cell lost during the protocol
Cell Strainer, 40 µm BD Falcon 352340 to filter cell suspension
Cell Strainer, 100 µm BD Falcon 352360 to filter cell suspension
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap BD Bioscience 352235 to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Pasteur Pipet, Glass NIH supply 6640-00-782-6008 to do tissue trituration
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody EMD Millipore FCMAB317PE antibody to detect neurons
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)  Cell Signaling Technology  8677 antibody to detect Fos-expressing cells
DAPI Sigma D8417 to label nuclei
PicoPure RNA Isolation Kit Applied Biosystems. KIT0204 The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells
Superscript III first strand cDNA synthesis system Invitrogen 18080-051 to synthesize cDNA from RNA
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems. 4391128 to do targeted-preamplification from cDNA
TaqMan Advance Fast Master  Applied Biosystems. 4444963 to do PCR using TaqMan probes
Fos TaqMan probe Applied Biosystems. Rn00487426_g1 TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probe Applied Biosystems. CACTCCAACAGCGTGAC nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Forward primer Applied Biosystems. GGCCCCTGGCAGAAAGTAG nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Reverse primer Applied Biosystems. TTCCCCCTGGTCCTTCTGA nucleotide sequence for neuronal gene marker
Gfap TaqMan probe Applied Biosystems. Rn00566603_m1 TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker
iba-1 TaqMan probe Applied Biosystems. Rn00574125_g1 TaqMan probe/primers for microglya gene marker
Gapdh TaqMan probe Applied Biosystems. CTCATGACCACAGTCCA nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Forward primer Applied Biosystems. GACAACTTTGGCATCGTGGAA nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Reverse primer Applied Biosystems. CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Oligo2 TaqMan probe Applied Biosystems. Rn01767116_m1  TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker
P1000 pipettor Rainin 17014382 It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells
7500 Fast Real-time PCR system Applied Biosystems. 446985 for quantitative PCR
FACSAria I Cell Sorter BD Biosciences for FACS sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
  2. Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
  3. Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
  4. Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
  5. Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  6. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
  7. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
  8. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
  9. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  10. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
  11. Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
  12. Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
  13. Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
  14. Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
  15. Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
  16. US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
  17. Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
  18. Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
  19. Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
  20. Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
  21. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).

Tags

Neuroscience גיליון 114 סוגי תאים נוירונים גליה נוגדן mRNA FACS
רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R.,… More

Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (114), e54358, doi:10.3791/54358 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter