Summary
यहाँ हम दोनों ताजा और जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों से neuronal टुकड़ियों Fos-व्यक्त करने में आणविक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) प्रोटोकॉल उपस्थित थे। जमे हुए ऊतक के उपयोग मूल्यवान पशु विषयों के उपयोग को अधिकतम करने के लिए कई सत्रों में कई मस्तिष्क क्षेत्रों की FACS अलगाव की अनुमति देता है।
Abstract
neuroplasticity और सीखा व्यवहार में आणविक परिवर्तन के अध्ययन के पूरे मस्तिष्क क्षेत्रों के अध्ययन से न्यूरोनल टुकड़ियों कि संघों सीखा मध्यस्थता बुलाया कम वितरित सक्रिय न्यूरॉन्स के विशिष्ट सेट का अध्ययन करने के लिए स्विच कर रहा है। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ने हाल ही में वयस्क चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों के लिए अनुकूलित और अनुमति न्यूरोनल मार्कर NeuN और Fos प्रोटीन, दृढ़ता से सक्रिय न्यूरॉन्स की एक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर सक्रिय न्यूरॉन्स के अलगाव की गई है। अब तक, Fos व्यक्त न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार की कोशिकाओं ताजा ऊतक, जो लंबे समय प्रसंस्करण दिन और मस्तिष्क के नमूनों की अनुमति बहुत सीमित संख्या लंबा और जटिल व्यवहार प्रक्रियाओं के बाद मूल्यांकन किया जाना entailed से अलग थे। यहाँ हमने पाया है कि Fos व्यक्त पृष्ठीय स्ट्रिएटम से न्यूरॉन्स और Fos mRNA की पैदावार हौसले से विच्छेदित ऊतक और ऊतक 3 के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए के बीच इसी तरह के थे - 21 दिनों के लिए। इसके अलावा, हम phenotype की पुष्टि कीन्यूरोनल का आकलन करने के जीन अभिव्यक्ति (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) और microgial (Iba1) मार्कर, जो इंगित करता है कि जमे हुए ऊतक भी की FACS अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा NeuN पॉजिटिव और नेगेटिव NeuN हल कोशिकाओं की glial सेल प्रकार के। कुल मिलाकर, यह इकट्ठा काटना और कई FACS सत्र के लिए मस्तिष्क के ऊतकों फ्रीज करने के लिए संभव है। इस बहुमूल्य पशु विषयों है कि अक्सर लंबी और जटिल व्यवहार प्रक्रिया से गुजरा है से प्राप्त आंकड़ों की राशि अधिकतम हो।
Introduction
सीखने के दौरान, जानवरों के अति विशिष्ट उत्तेजनाओं के जटिल सेट के बीच संगठन बनाते हैं। यह उच्च संकल्प जानकारी न्यूरोनल टुकड़ियों को बुलाया कम वितरित न्यूरॉन्स की विशिष्ट पैटर्न के भीतर परिवर्तन द्वारा इनकोडिंग होने लगा है। Neuronal टुकड़ियों कि हाल ही में दृढ़ता से व्यवहार या क्यू प्रदर्शन के दौरान सक्रिय थे ऐसे Fos, चाप, और Zif268 और न्यूरॉन्स में उनके प्रोटीन उत्पादों के रूप में तुरंत जल्दी जीन (IEGs) की प्रेरण द्वारा की पहचान की है। Fos व्यक्त न्यूरॉन्स विशेष रूप से संदर्भ और क्यू-विशिष्ट सीखा व्यवहार 1-4 में कारण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, इन सक्रिय Fos व्यक्त न्यूरॉन्स के भीतर अद्वितीय आणविक neuroadaptations तंत्रिका तंत्र है कि इस तरह की लत और सदमे के बाद तनाव विकार (पीटीएसडी) 5 के रूप में सामान्य और असामान्य सीखने सीखने विकारों के दौरान गठित संघों, सीखा सांकेतिक शब्दों के लिए शीर्ष उम्मीदवार हैं।
FluoreScence सक्रिय सेल छंटनी (FACS) ने हाल ही में Fos व्यक्त न्यूरॉन्स के भीतर अद्वितीय आणविक neuroadaptations के विश्लेषण की अनुमति दी है। प्रवाह cytometry और सेल छंटनी उनके प्रकाश बिखरने और immunofluorescent विशेषताओं के अनुसार विशेषताएँ और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1960 के दशक में विकसित किए गए 6.7, और लंबे समय इम्यूनोलॉजी और कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि प्रवाह cytometry और FACS अलग एकल कक्षों है कि वयस्क मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है की आवश्यकता है। FACS पहले अलग और विश्लेषण हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए ट्रांसजेनिक चूहों कि एंटीबॉडी लेबलिंग 8,9 आवश्यकता नहीं किया था से स्ट्रिआटल न्यूरॉन्स -expressing इस्तेमाल किया गया था। हम एक एंटीबॉडी आधारित FACS विधि 10 अलग और Fos व्यक्त जंगली प्रकार के पशुओं 11-15 में दवा और / या संकेतों द्वारा सक्रिय न्यूरॉन्स में आणविक परिवर्तन का आकलन करने के लिए विकसित की है। इस विधि में, न्यूरॉन्स, सामान्य न्यूरोनल मार्कर NeuN के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जबकि दृढ़ता से सक्रिय न्यूरॉन्सFos के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं। हालांकि हमारी प्रारंभिक विधि आवश्यक ताजा ऊतक के लिए नमूना प्रति अप करने के लिए 10 चूहों की पूलिंग, प्रोटोकॉल के बाद संशोधनों एक भी चूहा 13-15 से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के विश्लेषण के FACS अलगाव की अनुमति दी । कुल मिलाकर, अद्वितीय आणविक परिवर्तन Fos व्यक्त की लत अनुसंधान 12,14,15 में संदर्भ-क्यू और सक्रिय व्यवहार की एक किस्म के दौरान सक्रिय न्यूरॉन्स में पाए गए।
ताजा ऊतक पर FACS प्रदर्शन के साथ एक प्रमुख सैन्य समस्या यह है कि यह एक पूरा दिन लग जाते हैं ऊतक और प्रक्रिया FACS द्वारा अलग कर देना है। इसके अलावा, के बारे में केवल चार नमूने प्रति दिन संसाधित किया जा सकता है। यह आम तौर पर मतलब है कि केवल एक मस्तिष्क क्षेत्र प्रत्येक मस्तिष्क से मूल्यांकन किया जा सकता है और शेष मस्तिष्क क्षेत्रों खारिज किया जाना है। इस तरह के आत्म प्रशासन और विलुप्त होने ट्राई के रूप में कम throughput व्यवहार प्रक्रियाओं के लिए एक बड़ी समस्या हैनिंग कि सर्जरी और गहन प्रशिक्षण के कई सप्ताह की आवश्यकता है। इसके अलावा, परीक्षण के दिन पर लंबी और जटिल व्यवहार प्रक्रिया यह मुश्किल ही दिन पर FACS प्रदर्शन करने के लिए बनाता है। यह एक महत्वपूर्ण लाभ जानवरों तुरंत व्यवहार परीक्षण के बाद से दिमाग को फ्रीज करने में सक्षम हो सकता है, और उसके बाद 'जांचकर्ताओं को चुनने के अलग अलग समय पर एक या एक से अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स अलग।
यहाँ हम यह है कि हमारे FACS प्रोटोकॉल दोनों ताजा और जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स (और अन्य प्रकार की कोशिकाओं) को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करता है। एक उदाहरण के रूप में, हम Fos व्यक्त तीव्र methamphetamine इंजेक्शन के बाद और बिना इंजेक्शन (नियंत्रण हालत) भोले चूहों से चूहे स्ट्रिएटम से न्यूरॉन्स को अलग किया। हालांकि, इस FACS प्रोटोकॉल किसी भी व्यवहार या औषधीय उपचार के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे नमूने के बाद qPCR विश्लेषण से संकेत दिया है कि इन प्रकार की कोशिकाओं से जीन अभिव्यक्ति सिमी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता हैदोनों ताजा और जमे हुए ऊतकों से LAR दक्षता।
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Protocol
सभी प्रयोगों प्रयोगशाला पशुओं 16 वर्ष की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ अनुसार में प्रदर्शन किया गया।
नोट: नीचे उपयोग कम बाध्यकारी अपकेंद्रित्र ट्यूब सभी कदम है कि जब तक अन्यथा निर्दिष्ट बर्फ पर रखा गया था।
1. ऊतक संग्रह से पहले तैयारी
- 4 ओ सी के लिए सेंट्रीफ्यूज सेट
- आग पॉलिश लगभग 1.3 के घटते व्यास, 0.8, और प्रत्येक नमूना के लिए 0.4 मिमी के साथ तीन गिलास पाश्चर pipettes का एक सेट।
- 1 मिलीलीटर युक्त ठंड बफर लेबल 1.7 मिलीलीटर-ट्यूब को तैयार है और बर्फ पर ट्यूबों रखें।
- एक बर्फ मस्तिष्क मैट्रिक्स, spatulas और जिस पर विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए गिलास प्लेट (या उल्टे गिलास पेट्री डिश) टुकड़ा करने की क्रिया युक्त ट्रे तैयार करें। पूर्व ठंड दो या अधिक रेज़र ब्लेड गिलास प्लेट और उपयोग ऊतकों कागज पर सभी उपकरणों कि टी स्पर्श करने के लिए सूखीमुद्दा।
- एनजाइम ऊतक संग्रह से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर समाधान गला लें।
2. ऊतक संग्रह और विच्छेदन
- ऊतक संग्रह से पहले व्यवहार या औषधीय उपचार 90 मिनट आरंभ करें।
नोट: यहाँ दिखाया गया है परिणामों के लिए, एक उपन्यास पर्यावरण (परीक्षण हालत) और भोले चूहों में चूहों पर 5 मिलीग्राम / किग्रा methamphetamine की तीव्र intraperitoneal इंजेक्शन उनके घर पिंजरों (नियंत्रण हालत) में रखा प्रदर्शन किया गया। - संतृप्त isoflurane के साथ एक गिलास desiccator जार में रखकर चूहे anesthetize और चूहा 30 सिर काटना - 60 सेकंड बाद में एक गिलोटिन का उपयोग कर।
कैंची का प्रयोग सिर से त्वचा और मांसपेशियों को हटाने और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए। खोपड़ी में कटौती और रंध्र मैग्नम खोलने के लिए और खोपड़ी के पीछे के भाग को दूर करने के rongeurs का प्रयोग करें। खोपड़ी के शीर्ष किनारों के साथ कटौती करने के लिए मस्तिष्क को बेनकाब करने के rongeurs का प्रयोग करें। मस्तिष्क को नुकसान नहीं सावधान रहें। धीरे एक के तहत स्कूप करने के लिए एक छोटा सा रंग का प्रयोग करेंघ मस्तिष्क तरक्की। मस्तिष्क उठाएँ और नसों में कटौती जब तक मस्तिष्क मुक्त 17 है। - रेज़र ब्लेड का उपयोग ऊतक काटना।
नोट: निम्न विधियों का भी उपयोग ऊतक के नमूने प्राप्त: (2.3.1) हौसले से विच्छेदित ऊतक; (2.3.2) विच्छेदन के बाद जमे हुए ऊतक; या (2.3.3) जमे हुए ऊतक जमे हुए पूरे मस्तिष्क से विच्छेदित। विच्छेदन के दौरान मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया मैट्रिक्स, रेजर ब्लेड और कांच की प्लेट सूखा रखें और गाढ़ा पानी प्रक्रियाओं के रूप में क़ीमा कोशिकाओं के hypotonic lysing के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। चश्मा शीशा सटीक विच्छेदन सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग करें।- हौसले से विच्छेदित ऊतक के लिए, एक मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया मैट्रिक्स (1 मिमी अंतराल पर रेज़र ब्लेड के लिए स्लॉट के साथ एक चूहे के मस्तिष्क के आकार का धातु मोल्ड) कि बर्फ पर ठंडा कर दिया गया है में हौसले से निकाला मस्तिष्क जगह है। राज्याभिषेक स्लाइस कि ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) होते कटौती करने के लिए स्लॉट में दो या दो से अधिक पूर्व ठंडा रेज़र ब्लेड डालें। ठंडा गिलास प्लेट पर कटौती टुकड़ा रखें।
नोट: मस्तिष्क Regio काटनाएक ठंडा गिलास प्लेट पर ब्याज की एन एस। - विच्छेदन के बाद जमे हुए ऊतक के लिए, हौसले से निकाला मस्तिष्क, 2.3.1 में ऊपर वर्णित है कि इसी तरह के स्लाइस से ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) काटना। विच्छेदित ऊतक एक microtube में रखें और तेजी से 20 सेकंड के लिए -40 डिग्री सेल्सियस isopentane में microtube जलमग्न द्वारा ऊतक फ्रीज। विच्छेदित आगे की प्रक्रिया जब तक एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में हर समय जमे हुए ऊतक रखें।
- जमे हुए ऊतक के लिए, तुरंत अप करने के लिए 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर -40 डिग्री सेल्सियस isopentane और एक मोहरबंद बैग में दुकान में हौसले से निकाला मस्तिष्क फ्रीज।
- विच्छेदन के दिन, जमे हुए मस्तिष्क एक cryostat पर लगभग सेट में डिग्री सेल्सियस (कोई -18 की अपेक्षा अधिक गर्म डिग्री सेल्सियस) लगभग 2 घंटे के लिए तापमान को संतुलित करने के लिए जगह है -20।
नोट: दिमाग, इस तापमान पर आसानी से काटा जा सकता है, जबकि ज्यादा कूलर तापमान मस्तिष्क भी भंगुर सुरक्षित रूप से कटौती करने के लिए बनाते हैं। - 2 मिमी के राज्याभिषेक स्लाइस - 1 कटौती करने के लिए रेज़र ब्लेड का प्रयोग करेंएक cryostat में जमे हुए दिमाग। ठंड की शर्तों के तहत इन स्लाइस से ऊतक घूंसे प्राप्त करने के लिए एक 12 पा लिया करने के लिए 16 गेज सुई का प्रयोग करें। विच्छेदित आगे की प्रक्रिया जब तक सभी समय पर जमे हुए ऊतक रखें।
- विच्छेदन के दिन, जमे हुए मस्तिष्क एक cryostat पर लगभग सेट में डिग्री सेल्सियस (कोई -18 की अपेक्षा अधिक गर्म डिग्री सेल्सियस) लगभग 2 घंटे के लिए तापमान को संतुलित करने के लिए जगह है -20।
- हौसले से विच्छेदित ऊतक के लिए, एक मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया मैट्रिक्स (1 मिमी अंतराल पर रेज़र ब्लेड के लिए स्लॉट के साथ एक चूहे के मस्तिष्क के आकार का धातु मोल्ड) कि बर्फ पर ठंडा कर दिया गया है में हौसले से निकाला मस्तिष्क जगह है। राज्याभिषेक स्लाइस कि ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) होते कटौती करने के लिए स्लॉट में दो या दो से अधिक पूर्व ठंडा रेज़र ब्लेड डालें। ठंडा गिलास प्लेट पर कटौती टुकड़ा रखें।
- बफर के 2 बूँदें क़ीमा से पहले विच्छेदित ऊतक को कवर करने के लिए - 1 जोड़ें। ऊतक दो रेज़र ब्लेड का उपयोग कर विचूर्णन प्रक्रिया के बाकी के दौरान न्यूरॉन्स की हानि को रोकने के लिए से सफेद पदार्थ के सबसे निकालें। जमे हुए ऊतक के साथ शुरू करते हैं, तो ऊतक बफर समाधान लागू करने से पहले अधिक नहीं 1 मिनट के लिए गिलास ठंडा प्लेट पर पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं।
- एक ठंडा गिलास प्लेट पर एक रेजर ब्लेड के साथ ऊतक कीमा प्रत्येक orthogonal दिशा में 100 बार। जब नख़रेबाज़ धार कांच की प्लेट के लिए खड़ी पकड़ो।
ध्यान दें: पूरी तरह से नख़रेबाज़ सभी प्रोटोकॉल चरणों के लिए महत्वपूर्ण है। - 5 बार ke करने के लिए - microcentrifuge ठंड बफर ए के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब पलटना 3 ट्यूबों में कीमा बनाया हुआ ऊतक हस्तांतरण करने के लिए रेज़र ब्लेड का प्रयोग करेंसमाधान में सभी कीमा बनाया हुआ ऊतक Ep।
3. सेल हदबंदी
नोट: अंत के बाद सभी चरणों के लिए मिश्रण के ऊपर कोमल अंत का उपयोग। एक भंवर मिक्सर का उपयोग करें और हवा के बुलबुले कि सेल नुकसान का कारण से बचने मत करो।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 110 XG पर नमूना ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। धीरे-धीरे ठंड हौसले thawed एंजाइम समाधान (एंजाइमों का एक मिश्रण युक्त) microtube के भीतरी दीवार के नीचे के 1 मिलीलीटर जोड़ें। इसके तत्काल बाद पूरे गोली चूसना और धीरे से एक मामूली बड़ी टिप व्यास पिपेट साथ विंदुक ऊपर और नीचे केवल 4 बार कीमा बनाया हुआ ऊतक गोली को तितर-बितर करने के लिए।
- तुरंत microtubes उलटें नीचे से चिपके से गोली रोकने के लिए और 4 ओ सी पर 30 मिनट के लिए अंत से अधिक अंत मिश्रण के साथ नमूने सेते
- एंजाइमी ऊतक पाचन के बाद, अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 960 XG पर ट्यूबों। तैरनेवाला निकालें और ठंड बफर ए immediatel के 0.6 मिलीलीटर जोड़नेबफर जोड़ने के बाद वाई, एक ही विंदुक टिप गोली को तितर-बितर करने के लिए पूरे गोली चूसने से नीचे 5 बार का उपयोग करें और धीरे से ऊपर पिपेट और।
- यंत्रवत् पचा ऊतक triturate और निम्न चरणों का उपयोग 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा। प्रत्येक नमूना के लिए, लगभग 1.3, 0.8 और 0.4 मिमी लेटेक्स बल्बों से जुड़ी व्यास उतरते के साथ 3 आग पॉलिश कांच पाश्चर pipettes का एक अलग सेट का उपयोग करें।
- धीरे प्रत्येक नमूना 1.3 मिमी ग्लास विंदुक के साथ 10 बार triturate। नमूना बर्फ पर 2 मिनट के लिए व्यवस्थित (मलबे और undissociated कोशिकाओं नीचे करने के लिए आदी हो जाएगा) करते हैं। सतह पर तैरनेवाला (~ 0.6 एमएल) और हस्तांतरण एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब लीजिए (ट्यूब # 1)।
- 0.6 जोड़े मिलीलीटर शेष गोली के लिए एक समाधान बफर। नमूना Triturate 0.8 मिमी ग्लास विंदुक के साथ 10 बार। नमूना बर्फ पर 2 मिनट के लिए तय है। वही 15 मिलीलीटर के लिए सतह पर तैरनेवाला (~ 0.6 एमएल) और हस्तांतरण लीजिए शंक्वाकार ट्यूब # 1।
- 0.6 जोड़े मिलीलीटर शेष पेले के लिए एक समाधान बफरटी। नमूना Triturate 0.4 मिमी ग्लास विंदुक के साथ 10 बार। नमूना बर्फ पर 2 मिनट के लिए तय है। सतह पर तैरनेवाला लीजिए (~ 0.6 मिलीलीटर, गैर-अलग कोशिकाओं के साथ गोली छूने के बिना) और एक ही 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब # 1 के लिए स्थानांतरण।
नोट: निम्न विचूर्णन चरणों के लिए # 1 ट्यूब 0.4 मिमी व्यास पिपेट रखें। - दोहराएँ कदम 3.4.3 तीन से अधिक बार सबसे छोटा गिलास पिपेट (~ 0.4 मिमी व्यास) का उपयोग करते हैं, और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा एक अलग 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में (ट्यूब # 2)।
- 10 से अधिक बार 0.4 मिमी गिलास पिपेट का उपयोग के लिए ट्यूबों # # 1 और 2 में एकत्र सेल निलंबन Triturate और बर्फ पर रहते हैं।
4. सेल फिक्सेशन और Permeabilization
- 100% ठंड इथेनॉल के 800 μl जोड़कर नमूना प्रति 4 microtubes (# 1 ट्यूब से कोशिकाओं के लिए दो microtubes और दो ट्यूब # 2 से कोशिकाओं के लिए) तैयार प्रत्येक ट्यूब में (उपयोग करने से पहले -20 ओ सी में संग्रहीत) और बर्फ पर उन्हें रखने के । नोट: अंतिम इथेनॉलएकाग्रता 50% हो जाएगा।
- पिपेट ~ ठंड इथेनॉल युक्त 4 नलियों में से प्रत्येक में सेल निलंबन (# 1 ट्यूब और ट्यूब # 2 से) के 800 μl और ट्यूबों पलटना नमूने मिश्रण करने के लिए।
- 15 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों सेते नलियों हर 5 मिनट inverting है।
- बाद निर्धारण / permeabilization, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 1700 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सेल नुकसान को रोकने के लिए समाधान के 50 μl छोड़ दें।
नोट: इस चरण में छर्रों सफेद होते हैं और permeabilization पहले की तुलना में ट्यूब की दीवार के लिए कम चिपके रहते हैं। इसलिए, microtube की दीवार को छू द्वारा ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने जहां कोई गोली नहीं है और धीरे धीरे एक micropipette का उपयोग सतह पर तैरनेवाला आकर्षित।
5. सेल निस्पंदन
- ठंड पीबीएस के साथ कदम से 4.4 छर्रों पुनः निलंबित इस प्रकार है:
- # 1 ट्यूब से आ रही दो microtubes से एक के लिए ठंड पीबीएस के 550 μl जोड़ें, और एक मामूली बड़े व्यास गड़बड़ी का उपयोगPette टिप धीरे सेल निलंबन ऊपर और नीचे 5 बार पिपेट करने के लिए। एक microtube ट्यूब # 2 से आने के लिए एक ही दोहराएँ।
- # 1 ट्यूब से कोशिकाओं, एक ही पिपेट का उपयोग के लिए, दूसरी गोली पहली सेल निलंबन हस्तांतरण। धीरे संयुक्त सेल निलंबन ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा दूसरी गोली Resuspend।
- ट्यूब # 2 से कोशिकाओं के लिए, resuspend और छर्रों (यानी, तीसरे और चौथे microtubes) 5.1.2 में वर्णित के रूप में गठबंधन।
- फ़िल्टर चरणों 5.1.2 और 5.1.3 के लिए अलग से सेल strainers की दो अलग अलग जोड़े (100 माइक्रोन और 40 माइक्रोन ताकना आकार) के रूप में उपयोग करने से दो सेल निलंबन:
- झरनी के अंदर करने के लिए पीबीएस जोड़कर पूर्व गीला प्रत्येक कोशिका झरनी। झरनी के बाहर से अतिरिक्त पीबीएस हटाने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें।
- समान रूप से 100 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ पहली सेल झरनी पर कदम 5.1.2 से सेल निलंबन पिपेट। प्रवाह के माध्यम से बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में ले लीजिए। गड़बड़ी का प्रयोग करेंके माध्यम से सेल झरनी के बाहर की ओर तल पर संलग्न Pette flow- इकट्ठा करने के लिए।
- 40 माइक्रोन सेल झरनी के लिए 100 माइक्रोन सेल झरनी से प्रवाह के माध्यम से हस्तांतरण करने के लिए एक ही पिपेट का प्रयोग करें। इस प्रवाह के माध्यम से बर्फ पर एक और 50 मिलीलीटर ट्यूब में ले लीजिए। जब 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से प्रवाह के हस्तांतरण, 100 माइक्रोन सेल झरनी से संक्रमण से बचने के लिए नए पिपेट सुझावों के लिए बदल जाते हैं।
- फिल्टर का एक नया सेट का उपयोग कदम 5.1.3 से सेल निलंबन के लिए इन चरणों को दोहराएँ।
- नमूना के अनुसार लगभग 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक नमूने से दो प्रवाह के माध्यम से जुडा है।
6. एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन
नोट: मुख्य नमूना चल रहा से पहले सेटिंग्स कोशिकामापी उचित प्रवाह की स्थापना के लिए कई नियंत्रण के नमूने तैयार करने के लिए मस्तिष्क सेल निलंबन के छोटे aliquots का प्रयोग करें। प्रत्येक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए, नियंत्रण के नमूने है कि कोई एंटीबॉडी, केवल एसई शामिल तैयारcondary एंटीबॉडी (या अन्य फ्लोरोसेंट लेबल), और फिर दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी (या अन्य फ्लोरोसेंट लेबल)। फाटकों कि बनाम प्रवाह कोशिकामापी में गैर विशिष्ट लेबलिंग विशिष्ट अलग सेट करने के लिए इन पर नियंत्रण का प्रयोग करें। जब संभव हो, fluorochromes कि मुआवजे की आवश्यकता नहीं है का उपयोग करें। प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने से पहले पीबीएस जोड़कर 700 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए gating नियंत्रण नमूनों की अंतिम मात्रा बढ़ाएँ।
- एक 1.7 मिलीलीटर microtube के लिए फ़िल्टर कोशिकाओं की 100 μl नमूना हस्तांतरण से प्रकाश बिखरने और DAPI नियंत्रण नमूना तैयार करें। नाभिक धुंधला के लिए 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI के साथ ठंड पीबीएस के 600 μl जोड़ें। अंत ओवर के अंत मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए सेते हैं, और प्रवाह के माध्यम से पारित करने से पहले धो (के रूप में कदम 6.4.5 के लिए 6.4.2 में संकेत दिया)।
नोट: यह नमूना केवल सेल / नाभिक गेट FACS मशीन में शेष कोशिकाओं छँटाई करने के लिए पूर्व निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। - 100 & # स्थानांतरित द्वारा एकल immunolabeled नियंत्रण के नमूने तैयार181, एक 1.7 मिलीलीटर microtube के लिए फ़िल्टर कोशिकाओं के एल। एक एंटीबॉडी (जैसे, NeuN एंटीबॉडी) के साथ ठंड पीबीएस के 600 μl जोड़ें। एक और एंटीबॉडी (जैसे, Fos एंटीबॉडी) के साथ एक microtube को ठंड पीबीएस के 600 μl जोड़ें। इसी माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें, तो यह एक सीधा-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी नहीं है।
नोट: इन नमूनों उचित photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज निर्धारित करने के लिए, और यदि आवश्यक हो तो दो फ्लोरोसेंट संकेतों के ओवरलैप आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। एंटीबॉडी सांद्रता सभी चैनलों में सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्राप्त करने के लिए titrated किया जाना चाहिए। ओवरलैपिंग फ्लोरोसेंट संकेत भी प्रवाह कोशिकामापी के भीतर विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों की आंतरिक अंशांकन द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है। - एक 1.7 मिलीलीटर microtube के लिए फ़िल्टर कोशिकाओं के 100 μl के हस्तांतरण से डबल फ्लोरोसेंट लेबल नकारात्मक नियंत्रण नमूना तैयार करें। अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी या आईजीजी प्रत्यक्ष संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ठंड पीबीएस के 600 μl जोड़ें।
नोट: Thiनियंत्रण नमूना प्रत्येक fluorophore के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए छँटाई से पहले हर बार इस्तेमाल किया जा सकता है। - मुख्य नमूना तैयार हल किया जाना।
- एक 1.7 मिलीलीटर microtube में फ़िल्टर कोशिकाओं के 700 μl स्थानांतरण। प्राथमिक Fos एंटीबॉडी की एलेक्सा स्त्राव 647 (एंटी-Fos-AF647) और 1.4 μl (1: 500) को सीधे संयुग्मित phycoerythrin (विरोधी NeuN पीई) को सीधे संयुग्मित प्राथमिक NeuN एंटीबॉडी की: 7 μl (100 1) जोड़ें। अंत ओवर के अंत मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों सेते हैं।
- ऊष्मायन के अंत में, प्रत्येक microtube को ठंड पीबीएस के 800 μl जोड़ने के मुख्य नमूना और नियंत्रण के नमूने भी शामिल है, और उलटा द्वारा मिश्रण।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1300 XG पर अपकेंद्रित्र microtubes। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सेल नुकसान को रोकने के लिए 50 μl सतह पर तैरनेवाला जा रही है।
- एक मामूली बड़े टिप व्यास के साथ एक पिपेट का उपयोग कर गोली और resuspend कोशिकाओं को ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1300 XG पर अपकेंद्रित्र। डीसतह पर तैरनेवाला iscard।
- पुनः निलंबित 500 μl में गोली ठंड पीबीएस (अंतिम मात्रा गोली के आकार के आधार समायोजित)।
- स्थानांतरण और एक सेल झरनी टोपी (40 माइक्रोन) के साथ एक दौर नीचे FACS नमूना ट्यूब में निलंबन फिल्टर। बर्फ पर immunolabeled कोशिकाओं रखें और तुरंत FACS प्रदर्शन करते हैं। नोट: छानने के लिए, झरनी टोपी पर खड़ी विंदुक टिप को छूने और इसके माध्यम से सेल निलंबन धक्का।
- नियंत्रण नमूने का उपयोग फाटकों प्रवाह निर्धारित करें।
- कुल घटनाओं और सेलुलर मलबे से neuronal सेल की आबादी की पहचान करने के लिए प्रकाश बिखरने और DAPI नियंत्रण नमूना का प्रयोग करें।
नोट: - कुल घटनाओं (बाकी मलबा और टूटी सेलुलर प्रक्रियाओं कर रहे हैं) के 2% इस तैयारी में सेल निकायों केवल 1 रहे हैं। DAPI फ्लोरोसेंट संकेत (यह दर्शाता नाभिक) और आगे तितर बितर (सेल का आकार) के आधार पर यह सेल निकायों और गेट को पीछे की ओर आगे और साइड के आधार पर पता लगाने के लिए संभव है प्रकाश बिखरने के गुणकोशिकाओं (के रूप में चित्रा 1 ए, बी में दिखाया गया है)। - एकल immunolabeled नियंत्रण नमूने का उपयोग पीएमटी वोल्टेज सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए, और एक और फिल्टर / चैनल (जैसे, एलेक्सा स्त्राव 488 / FITC या Phycoerythrine) में एक विशिष्ट fluorochrome से उत्सर्जन के spillover विश्लेषण करने के लिए। अगर फ्लोरोसेंट संकेतों ओवरलैप करते हैं, मैन्युअल मुआवजा स्तरों का समायोजन करके ओवरलैप सही।
- सकारात्मक आबादी के लिए सीमा की स्थापना करने के लिए डबल फ्लोरोसेंट लेबल नकारात्मक नियंत्रण का प्रयोग करें।
नोट: इस नमूने संकेत से आने वाले ऑटो प्रतिदीप्ति और मुख्य इस सीमा से ऊपर स्थित नमूने की कोशिकाओं के कारण सकारात्मक रूप में माना जा सकता है माना जाता है। आमतौर पर, छंटाई के लिए सीमा मानकों को अधिक सख्त और लगभग नकारात्मक नियंत्रण ऊपर लेबल की कोशिकाओं के शीर्ष 2/3 वास्तव में हल कर रहे हैं।
- कुल घटनाओं और सेलुलर मलबे से neuronal सेल की आबादी की पहचान करने के लिए प्रकाश बिखरने और DAPI नियंत्रण नमूना का प्रयोग करें।
- FACS द्वारा मुख्य नमूना से क्रमबद्ध न्यूरॉन्स 1.7 मिलीलीटर microtubes में। शाही सेना के 50 μl में कोशिकाओं को ले लीजिएनिष्कर्षण बफर। छँटाई, भंवर और अपकेंद्रित्र ट्यूब और ट्यूब की दीवारों से सभी हल कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा निलंबन मिश्रण के बाद।
- 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर हल सेल निलंबन सेते हैं सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं आरएनए निष्कर्षण से पहले lysed रहे हैं, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 2800 XG पर अपकेंद्रित्र।
- के रूप में पहले 13-15 वर्णित -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक RNase मुक्त ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला या तुरंत शाही सेना अलगाव, सीडीएनए संश्लेषण, लक्ष्य जीन पूर्व प्रवर्धन और qPCR के लिए नमूना प्रक्रिया।
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Representative Results
तीव्र methamphetamine इंजेक्शन के बाद ही चूहों से ताजा और जमे हुए पृष्ठीय स्ट्रिएटम के ऊतकों से Fos-सकारात्मक और नकारात्मक Fos-न्यूरॉन्स छंटनी।
प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित methamphetamine (5 मिलीग्राम / किग्रा) के एक intraperitoneal इंजेक्शन के बाद एक भी चूहा पृष्ठीय स्ट्रिएटम 90 मिनट से Fos-सकारात्मक और नकारात्मक Fos-न्यूरॉन्स सुलझाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उनके घर पिंजरों में भोले चूहों नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। पृष्ठीय स्ट्रिएटम ऊतक संसाधित किया गया था या तो तुरंत अपने संग्रह (ताजा ऊतक) या जमे हुए हैं और 1, 7 या 21 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किए जाने के बाद संसाधित करने के बाद। इन ठंड समय अंक से परिणाम एक-दूसरे से काफी अलग नहीं थे, इसलिए डेटा जमा थे।
साधन पर छंटाई की स्थिति की स्थापना करने के लिए, नियंत्रण नमूने या तो घर पिंजरे नियंत्रण या methampheta से (ऊपर वर्णित)मेरा इंजेक्शन समूहों इस्तेमाल किया गया। प्रत्येक कण या इन नमूनों में घटना कोशिकामापी में प्रवाह सेल के माध्यम से गुजरता है, वे उस घटना के प्रकाश बिखरने और प्रतिदीप्ति विशेषताओं के साथ जुड़ा हुआ है और एक स्प्रेडशीट में दर्ज की गई है एक पहचान संख्या दी जाती है। इस पत्र में घटनाओं तो scattergrams या इन विशेषताओं (चित्रा 1) के लिए घनत्व भूखंडों में आयोजित किया जा सकता। इसी तरह की विशेषताओं के साथ घटनाक्रम तब बांटा जा सकता है या इस तरह के उन युक्त कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, या Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स के रूप में विशेषताओं फाटकों को निर्धारित करने के विभिन्न जोड़े द्वारा 'गेटेड'। एक बार फाटक के ऊपर वर्णित नियंत्रण नमूने का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं, मुख्य नमूना प्रवाह कोशिकामापी में इंजेक्शन और इन फाटकों के अनुसार हल किया जाता है। सेल की आबादी सभी घटनाओं (कोशिकाओं और मलबे) उनके आगे प्रकाश तितर बितर पर आधारित gated था (एफएससी; कण के आकार का एक संकेत) और साइड प्रकाश तितर बितर (एसएससी, कण के जी का एक संकेतranularity)। जैसा कि एफएससी एसएससी बनाम डॉट साजिश में दिखाया गया है (चित्रा 1 ए और 1 बी), सभी घटनाओं के घनत्व की साजिश समान आकार और विघटन के साथ एक छोटे समरूप जनसंख्या, इसके अलावा में एक बड़ी विषम जनसंख्या का पता चलता है (चित्रा 1 ए और 1 बी)। एक छोटा सा सजातीय आबादी है कि सेल निकायों शामिल पहचान और "सेल", पिछले अध्ययनों 11,13-15 और DAPI साथ लेबलिंग से FSC और एसएससी विशेषताओं के आधार पर के रूप में gated था। कोशिकाओं के एक थोड़ा उच्च प्रतिशत जमे हुए ऊतक (2.6%) ताजा ऊतक (1.9%) से अधिक से प्राप्त किया गया। बड़ी विषम जनसंख्या ज्यादातर शायद dendrites और axonal प्रक्रियाओं से मलबे है।
अगले, "सेल" गेट से एकल कक्षों उनके आकार, जो एक्स-अक्ष पर प्रत्येक घटना के लिए एफएससी संकेत की चौड़ाई ने संकेत दिया गया था पर आधारित पहचान की गई। घटनाओं है कि एकल कक्षों से बड़ा थे सेल समुच्चय विचार किया गया और से बाहर रखा "एकल कोशिका गेट। बाद के विश्लेषण के चरणों के सभी इस के भीतर आयोजित की गई" एकल कोशिका "गेट (चित्रा 1 सी और 1 डी)। इस एकल सेल की आबादी का बहुमत (> 92%) DAPI धुंधला के लिए सकारात्मक था (डेटा नहीं दिखाया गया है)।
सबसे पहले, न्यूरॉन्स उनके पीई प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत दिया है कि NeuN-immunoreactivity (चित्रा 1E और 1F) के आधार पर पहचान की गई। न्यूरॉन्स ताजा ऊतक और जमे हुए ऊतक के लिए 38% के लिए 'सिंगल सेल "गेट से सभी घटनाओं के लगभग 24% शामिल थे। लगभग सभी इस 'न्यूरॉन "गेट में घटनाओं (ताजा ऊतक में 98% और जमे हुए ऊतकों में 99%) की सेल नाभिक (चित्रा 1G और 1H) में डीएनए के DAPI धुंधला के लिए सकारात्मक थे। शेष एकल कोशिका गेट में DAPI लेबल घटनाओं NeuN नकारात्मक रूप में चित्रा 3 में qPCR द्वारा की पुष्टि कर रहे हैं और glia, oligodendrocytes और microglia शामिल हैं।
ove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> तो न्यूरॉन्स Fos-सकारात्मक या नकारात्मक Fos-न्यूरॉन्स उनके एलेक्सा स्त्राव 647 प्रतिदीप्ति संकेत (Fos-immunoreactivity) के आधार पर के रूप में वर्गीकृत किया गया सेल प्रकार मार्कर के विपरीत, Fos। धीरे-धीरे कारण तंत्रिका गतिविधि और समय निश्चित रूप से भिन्न स्तरों को न्यूरॉन्स बढ़ जाती है में अभिव्यक्ति के स्तर है। इसलिए, वहाँ नहीं बनाम Fos-नकारात्मक न्यूरॉन्स Fos पॉजिटिव के बीच एक स्पष्ट दहलीज होगा। पहले चरण में (प्रयुक्त बंद लाइन के लिए ही करने का विश्लेषण करती है Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स) के प्रतिशत की गणना, हम भोले घर पिंजरे नियंत्रण चूहों में NeuN नकारात्मक जनसंख्या से) अधिकतम एलेक्सा-647 प्रतिदीप्ति (FOS के लिए आधार पर Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स के लिए सीमा को परिभाषित किया। Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स संकेत कर रहे हैं चित्रा 2 में विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों से नीले वर्गों में दोनों ताजा और जमे हुए ऊतकों में, methamphetamine इंजेक्शन चूहों से प्रतिशत Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स। (1.9 - 2.2%, चित्रा -2 और 2 डी) में दो बार सह के रूप में था(- 0.8%, चित्रा 2A और 2 बी 0.7) घर पिंजरे में चूहों को mpared।अनुरुप लक्ष्य जीन पूर्व प्रवर्धन और आरटी पीसीआर का उपयोग कर FACS हल कोशिकाओं से सेल प्रकार विशिष्ट जीन।
दूसरे चरण में, बाद में mRNA के लिए मुख्य नमूना से केवल Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स की छँटाई सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण करती है और Fos नकारात्मक कोशिकाओं के शामिल किए जाने को कम करने, एलेक्सा-647 प्रतिदीप्ति सीमा उठाया गया था तो यह है कि Fos का केवल ऊपरी दो तिहाई नीले वर्गों में पॉजिटिव घटनाओं और हल एकत्र किए गए थे। यह सीमा है कम से कम 10 गुना अधिक है प्रतिदीप्ति (सेल प्रति अधिक Fos अभिव्यक्ति) से ऊपर का इस्तेमाल किया नमूनों में Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स के प्रतिशत की गणना करने के लिए सीमा से अधिक है। कोशिकाओं के चार आबादी NeuN नकारात्मक + Fos-नकारात्मक (~ 5000 की घटनाओं), NeuN नकारात्मक + Fos पॉजिटिव सहित एक ही ऊतक का नमूना, से हल किया गया (25 लेकर - 83 घटनाओं), NeuN पॉजिटिव + Fos-negative (~ 5000 की घटनाओं) और NeuN पॉजिटिव + Fos पॉजिटिव (- होम समूह के लिए 133 घटनाओं, 185 - Methamphetamine समूह के लिए 450 घटनाओं 44 से लेकर)। सबसे पहले, और NeuN नकारात्मक आबादी (दोनों Fos-सकारात्मक और नकारात्मक Fos-सहित) (दोनों Fos-सकारात्मक और नकारात्मक Fos-सहित) NeuN पॉजिटिव में सेल प्रकार विशिष्ट जीनों की अभिव्यक्ति की पुष्टि की थी (चित्रा 3)। GAPDH था हमारे पिछले अध्ययन 13 से परिणामों के आधार पर, संदर्भ / गृह व्यवस्था जीन के रूप में इस्तेमाल किया। नमूना और सीडीएनए पीसीआर प्रतिक्रियाओं में शाही सेना के विभिन्न स्तरों के लिए नियंत्रित करने के लिए, डुप्लेक्स qPCR प्रतिक्रियाओं दोनों लक्ष्य जीन और GAPDH सीडीएनए के लिए प्राइमरों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। GAPDH गृह व्यवस्था जीन के लिए सीटी मूल्यों सटीक मापन के लिए 15 और 31 के बीच रखा गया था। दोनों ताजा और जमे हुए ऊतक के लिए, NeuN mRNA स्तर NeuN नकारात्मक आबादी (पी <0.05 की तुलना में काफी अधिक (लगभग 8 गुना) NeuN पॉजिटिव आबादी में थे, चित्रा 3A GFAP (glial सेल मार्कर, चित्रा 3 बी) और Oligo2 (oligodendrocyte सेल मार्कर, चित्रा -3 सी) mRNA स्तर NeuN पॉजिटिव आबादी (पी में से NeuN नकारात्मक जनसंख्या में अधिक से अधिक थे <0.05 )। उच्च Iba1 का ऐसा ही एक प्रवृत्ति (microglial सेल मार्कर, चित्रा 3 डी) mRNA स्तर NeuN नकारात्मक आबादी में मनाया गया, लेकिन इस सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था। कुछ नमूने विशेष mRNAs की बेहद कम स्तर है कि सही रूप में एक विशेष सेल प्रकार में मापा नहीं जा सकता है निहित (जैसे, NeuN लेबल न्यूरॉन्स में GFAP mRNA)। अधिकतम सीटी मूल्यों मूल्यों है कि बहुत कम सही पता लगाया जा रहे थे समाप्त करने के लिए 35 के रूप में परिभाषित किया गया। उच्चतर सीटी मूल्यों हमारे qPCR assays में आत्मविश्वास की सीमा के पार हो गई।
Fos mRNA अभिव्यक्ति थीचूहों कि methamphetamine की एक इंजेक्शन (चित्रा 4) से प्राप्त NeuN पॉजिटिव न्यूरोनल जनसंख्या में जांच की। दोनों ताजा और जमे हुए ऊतक के लिए, Fos mRNA स्तर Fos-नकारात्मक न्यूरॉन्स की तुलना में Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स में अधिक से अधिक थे (पी <0.05)। इसके अलावा, जबकि वहाँ एक 3 गुना ताजा ऊतक से Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स में Fos mRNA की वृद्धि हुई है, एक 11 गुना जमे हुए ऊतकों से Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स में Fos mRNA की वृद्धि का पता चला गया था। साथ में ले ली, इन mRNA परिणाम Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स की पहचान, दोनों ताजा और जमे हुए ऊतकों से Fos-नकारात्मक न्यूरॉन्स और गैर-न्यूरोनल जनसंख्या की पुष्टि करें। इसके अलावा, सेल प्रकार विशिष्ट जीन और हित के अन्य जीन भी दोनों ताजा और जमे हुए की शर्तों के तहत हल कोशिकाओं से विश्लेषण किया जा सकता है।
चित्रा 1. जिले के gatingताजा और जमे हुए चूहे पृष्ठीय स्ट्रिएटम से sociated और लेबल की कोशिकाओं। 'कोशिकाओं' गेट आगे और पक्ष बिखराव गुण (ई) द्वारा निर्धारित और परमाणु DAPI धुंधला (जीएच) के साथ सकारात्मक लेबलिंग द्वारा पुष्टि की गई। 'कोशिकाओं' जनसंख्या के भीतर 'न्यूरॉन्स' गेट NeuN (; एफई पीई) के लिए प्रतिदीप्ति द्वारा निर्धारित किया गया था। (ए - बी) सेल गेट: सभी घटनाओं के रैखिक साजिश, उनके आगे तितर बितर (एक्स अक्ष, सेल आकार) और पक्ष तितर बितर (शाफ़्ट, विघटन) पर आधारित है। (सी - डी) एकल कक्षों गेट: आगे तितर बितर ऊंचाई (शाफ़्ट) और चौड़ाई (एक्स अक्ष) एबी में दिखाया सेल फाटक के भीतर के रैखिक साजिश है। (ई - एफ) न्यूरॉन गेट: पीई लेबल NeuN (शाफ़्ट) सीडी में दिखाए गए एकल कक्षों फाटक के भीतर के लिए immunofluorescence के लघुगणक साजिश घटनाओं और कम क्लस्टर में गैर neuronal कोशिकाओं के ऊपरी क्लस्टर में न्यूरॉन्स का पता चलता है। (जी एच) नाभिक धुंधला: DAPI लेबल नाभिक (शाफ़्ट) neuronal सेल फाटक के भीतर के लिए प्रतिदीप्ति का लघुगणक साजिश है। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. ताजा और जमे हुए चूहे पृष्ठीय स्ट्रिएटम से Fos-सकारात्मक और नकारात्मक Fos-न्यूरॉन्स NeuN और Fos के लिए डबल लेबलिंग के आधार पर की गेटिंग। चूहों से ताजा और जमे हुए पृष्ठीय स्ट्रिएटम (एक के बाद उनके घर पिंजरे या 90 मिनट से सीधे लिया methamphetamine की intraperitoneal इंजेक्शन) अलग और NeuN और Fos के खिलाफ सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल और एक FACS मशीन का उपयोग कर हल किया गया। छंटनी phycoerythrin (पीई) पर आधारित था -labeled NeuN immunofluorescence (एक्स अक्ष) और एलेक्सा 647 लेबल Fos immunofluorescence (शाफ़्ट)। Fos पॉजिटिव (नीले डॉट्स) और Fos-नकारात्मक (लाल डॉट्स) न्यूरॉन्स, ऊपरी और निचले सही quadrants में स्थित थे क्रमशः। डॉट भूखंडों NeuN पॉजिटिव कोशिकाओं (न्यूरॉन्स) और NeuN नकारात्मक कोशिकाओं (ग्रे डॉट्स) दिखाने; नीले वर्गों ऊपर दहलीज Fos अभिव्यक्ति के साथ न्यूरॉन्स संकेत मिलता है। (ए - बी) होम समूह: अपने घर पिंजरों से सीधे लिया भोले चूहों। (सी - डी) Methamphetamine समूह: चूहों कि methamphetamine के एकल इंजेक्शन प्राप्त किया। Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स के लिए थ्रेसहोल्ड सिर्फ अधिक से अधिक एलेक्सा-647 प्रतिदीप्ति (Fos-आईआर) घर पिंजरे नियंत्रण समूह में NeuN नकारात्मक कोशिकाओं के लिए मनाया ऊपर होने के लिए चुना गया था। सभी न्यूरॉन्स की 0.8% घर समूह में Fos-सकारात्मक रहे हैं, 1.9 - - 0.7 जबकि सभी न्यूरॉन्स की 2.2% methamphetamine समूह में Fos-सकारात्मक रहे हैं।
चित्र तीन। में मजबूत> सेल प्रकार विशिष्ट जीन एक्सप्रेशन FACS हल ताजा और जमे हुए चूहे पृष्ठीय स्ट्रिएटम से कोशिकाओं। NeuN पॉजिटिव न्यूरॉन्स (FOS पॉजिटिव और Fos-नकारात्मक) और NeuN नकारात्मक कोशिकाओं (FOS पॉजिटिव और Fos-नकारात्मक) हल किया गया वर्णित प्रोटोकॉल और सेल प्रकार विशिष्ट जीन की mRNA अभिव्यक्ति के स्तर का उपयोग करते हुए सेल छँटाई पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया। (ए) NeuN neuronal कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है। (बी) GFAP glial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है। (सी) Oligo2 एक मार्कर है oligodendrocyte कोशिकाओं के लिए। (डी) Iba1 microglial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है। NeuN mRNA के लिए, डेटा ± SEM के ताजा ऊतक से अभिव्यक्ति के स्तर के सापेक्ष गुना मूल्यों NeuN नकारात्मक कोशिकाओं में (- 14 एन = 9) का मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। , Oligo2 (एन = 9 - 11) - GFAP (12 एन = 6) के लिए और Iba1 (एन = 5 - 8) mRNA, डेटा के रूप में मतलब गुना मूल्यों का ± SEM रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर को Neu में प्रस्तुत कर रहे हैंताजा ऊतक से एन पॉजिटिव कोशिकाओं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है और Fos की mRNA स्तर की पुष्टि की थी के रूप में चित्रा 4. Methamphetamine इंजेक्शन। Fos-सकारात्मक और नकारात्मक Fos-न्यूरॉन्स के बाद ताजा या फ्रोजन चूहे पृष्ठीय स्ट्रिएटम से FACS हल न्यूरॉन्स में Fos mRNA स्तर हल किया गया। डेटा ताजा ऊतक से अभिव्यक्ति के स्तर के सापेक्ष गुना मूल्यों Fos-नकारात्मक न्यूरॉन्स में (- 4 N = 3) के SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं।
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Discussion
FACS तो ताजा या फ्रोजन वयस्क के मस्तिष्क के ऊतकों से न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार की कोशिकाओं से हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, जमे हुए ऊतक का उपयोग करने की क्षमता जानवरों है कि इस तरह की लत अनुसंधान के क्षेत्र में आत्म-प्रशासन और पतन के अध्ययन के रूप में जटिल और लंबी व्यवहार प्रक्रियाओं, आया है से नमूने का इष्टतम उपयोग की अनुमति देता है। 2 घंटा या उससे अधिक समय है, और सभी जानवरों की आवश्यकता होती है - ये व्यवहार प्रक्रिया आमतौर पर 1 लेता है (10 - 20 कुल) उसी दिन 13,18 पर परीक्षण किया। यह 4 हौसले से विच्छेदित मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों, जो मस्तिष्क विच्छेदन, सेल हदबंदी, permeabilization और immunolabeling शामिल संसाधित करने के लिए ~ 4 घंटा लेता है। 30 मिनट - प्रसंस्करण के बाद, FACS द्वारा प्रत्येक नमूना छँटाई 20 के बीच लेता है। lysis बफर में हल कोशिकाओं को गर्म करने के अंतिम चरण में एक और 30 मिनट की आवश्यकता है। कुल में, ~ 7 घंटा अंतिम शाही सेना युक्त सेल सेल समाधान कदम के लिए मस्तिष्क विच्छेदन से आवश्यक हैं। हालांकि, यह अभी पूरी brai फ्रीज करने के लिए संभव हैएनएस या हौसले तुरंत परीक्षण के बाद मस्तिष्क क्षेत्रों विच्छेदित, और उन्हें बाद की प्रक्रिया। यह बहुत सरल परीक्षण और कई मस्तिष्क क्षेत्रों में एक अलग दिन पर हल किया जा करने के लिए परमिट। FACS से पहले ऊतक ठंड भी परिणामों में सुधार कर सकते हैं। अधिक NeuN पॉजिटिव न्यूरॉन्स जमे हुए ऊतकों के नमूनों से प्राप्त कर रहे हैं। इस ठंड और बाद विगलन दौरान कोशिका झिल्ली के विघटन, जो इस तरह के NeuN और Fos के रूप में intracellular प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग में वृद्धि होगी के कारण बढ़ NeuN लेबलिंग के हिस्से में समझाया जा सकता है। इसी तरह के प्रभावों fibroblast, उपकला कोशिकाओं और हेला कोशिकाओं 19 के साथ मनाया गया है।
कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की उपज निम्न चरणों का उपयोग को बड़ा किया जा सकता है। ऊतक के विच्छेदन के दौरान, (, पृष्ठीय स्ट्रिएटम और नाभिक accumbens के लिए महासंयोजिका और पूर्वकाल संयोजिका क्रमशः) सफेद पदार्थ के बहुमत को हटा दें। यह प्लास्टिक सुझावों और बाद काएं में कांच pipettes का पालन करने से रोकता है ऊतकभज। उपयोग बफर कवर विच्छेदित ऊतक रखने के लिए (सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका में विनिर्देश देखें)। इस रेजर ब्लेड (2.5 कदम) के साथ ऊतक के क़ीमा के दौरान कोशिकाओं की गुणवत्ता में सुधार। छोटी से छोटी गिलास पिपेट (कदम 3.9) और सेल strainers (5 कदम) की एक दूसरे सेट के साथ बाद में छानने के साथ 3 विचूर्णन कदम के अतिरिक्त सेट कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की उपज डबल्स। सेल strainers पुनर्प्रयोग फिल्टर और कम सेल उपज रोकना होगा। जब छर्रों और विचूर्णन दौरान resuspending कोशिकाओं के साथ कोमल। इन चरणों के दौरान एक मामूली बड़े विंदुक टिप का उपयोग तनाव कतरनी के कारण कोशिका क्षति कम हो जाएगा। जब इथेनॉल (कदम 4.4) के साथ permeabilization के बाद सतह पर तैरनेवाला हटाने ध्यान से गोली देखते हैं। गोली कम कॉम्पैक्ट है और microcentrifuge ट्यूब की दीवार के साथ वितरित किया जा सकता है। किसी न किसी गणना का सुझाव है कि विच्छेदित striatal ऊतक के नमूने में शुरू संख्या का लगभग 10% है Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स की उपज। वर्तमान प्रोटोकॉल अन्य प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, ऊतक methamphetamine इंजेक्शन के बाद 90 मिनट एकत्र किया गया था क्योंकि Fos अभिव्यक्ति इस समय है, जो Fos व्यक्त न्यूरॉन्स की कुशल छँटाई के लिए महत्वपूर्ण है पर अधिक से अधिक स्तर तक पहुँचता है। हालांकि, ऊतक FACS के लिए किसी भी समय बिंदु पर एकत्र किया जा सकता है, प्रयोग के विशिष्ट उद्देश्य पर निर्भर करता है। प्रारंभिक ऊतक का नमूना भंडारण के लिए, हम सफलतापूर्वक हौसले से विच्छेदित ऊतक, विच्छेदन के बाद जमे हुए ऊतक, या फ्रोजन ऊतक जीन अभिव्यक्ति की qPCR विश्लेषण के बाद FACS का उपयोग Fos व्यक्त न्यूरॉन्स को अलग-थलग करने के लिए जमे हुए पूरे मस्तिष्क से विच्छेदित इस्तेमाल किया है। निर्धारण और permeabilization, अवधि और तापमान इस प्रोटोकॉल (15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) में दोनों cytoplasmic और परमाणु झिल्ली permeabilize करने के लिए, साथ ही ऊतक ठीक करने के लिए अनुकूलित किया गया था। अवधि और / या तापमान में बदलाव के लिए अंतिम परिणाम बदल सकते हैं। ऐसे paraformald के रूप में अन्य निर्धारण समाधानehyde और ऐसे सैपोनिन के रूप में गैर ईओण डिटर्जेंट, जो भ्रूण और प्रसवोत्तर न्यूरॉन्स 20 के लिए काम किया है, यह भी वयस्क के मस्तिष्क से न्यूरॉन्स के लिए काम कर सकते हैं। इसके अलावा, माइलिन हटाने मोती के रूप में मस्तिष्क के ऊतकों 21 से FACS के लिए हाल ही में दिखाया मौजूदा प्रोटोकॉल के एक संशोधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल दो महत्वपूर्ण सीमाओं पर विचार करने के लिए है। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल सेल phenotype मार्करों कि synapses में मुख्य रूप से व्यक्त कर रहे हैं (जैसे, डोपामाइन या ग्लूटामेट रिसेप्टर्स) क्योंकि इन सेलुलर प्रक्रियाओं विचूर्णन और पृथक्करण चरणों के दौरान सेल निकायों से हटा रहे हैं पता लगाने के लिए अनुकूल नहीं है। एक दूसरा संभव सीमा है कि शाही सेना लंबाई FACS हल कोशिकाओं से प्राप्त सभी आरएनए विश्लेषण के तरीकों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। आरएनए अखंडता संख्या (Rin) FACS से प्राप्त शाही सेना के लिए हल कोशिकाओं 2.5 3.5, जो कम औसत आरएनए हद तक मेल खाती के बीच हैं। इधर, छोटे आरएनए आकार से मुआवजा दिया गया था80 की अपेक्षाकृत कम qPCR amplicons का उपयोग कर - 100 बीपी, जैसा कि पहले 13-15 का वर्णन किया। हम यह भी माइक्रोएरे विश्लेषण 11 के लिए सफलतापूर्वक इन कम लंबाई RNAs का इस्तेमाल किया है। फिर भी, लघु आरएनए लंबाई प्राप्त सभी आरएनए विश्लेषण के तरीकों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। यह जोर दिया जाना चाहिए कि पीसीआर प्राइमरों है कि विशेष रूप से लक्षित एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों cytosol में पूरी तरह से spliced mRNA में ही पाया इस्तेमाल किया गया। ये प्राइमरों नाभिक से Intron युक्त शाही सेना को पता नहीं लगा है। इसके अलावा, हम पहले से सेलुलर झिल्ली 10 में cytosol और डी 1 डोपामाइन रिसेप्टर्स में tyrosine hydroxylase पता लगाने के लिए एंटीबॉडी और ताजा मस्तिष्क के ऊतकों के साथ इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। इन साइटोसोलिक और कोशिका झिल्ली मार्कर की जांच संकेत दिया कि हदबंदी प्रक्रिया काफी हद तक बरकरार कोशिकाओं का उत्पादन, और बस नाभिक नहीं।
कुल मिलाकर, जमे हुए नमूनों से न्यूरॉन्स की FACS अलगाव अन्य अनुप्रयोगों को खोलता है। छँटाई या जीन Expre में कोई मतभेद नहींssion मनाया गया (डेटा) नहीं दिखाया जब नमूने -80 में 3 दिन या 3 सप्ताह संग्रहीत किया गया डिग्री सेल्सियस। (- 40 नमूने 20) और जीन अभिव्यक्ति के लिए अलग-थलग आरएनए तीन हफ्ते एक विशिष्ट प्रयोग से सभी नमूनों सुलझाने के लिए एक उचित समय है। प्रयोग करने योग्य आरएनए भी -80 डिग्री सेल्सियस (डेटा यहाँ नहीं दिखाया गया है) में 6 महीने के लिए भंडारित मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त किया गया है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल पोस्टमार्टम जमे हुए मानव मस्तिष्क के नमूनों की FACS अलगाव है कि कई महीनों या वर्षों के लिए जमा थे के लिए उपयोगी हो सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
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