Summary
ここでは、生鮮・冷凍の両方の脳組織から神経アンサンブルをフォスが発現に分子変化を研究するための蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）プロトコルを提示します。凍結組織の使用は、貴重な動物被験体の使用を最大化するために、複数のセッションに比べて多くの脳領域のFACS単離を可能にします。
Abstract
神経可塑性と学習された行動の分子変化の研究は関連を学んだ媒介する神経のアンサンブルと呼ばれるまばらに分布し、活性化ニューロンの特定のセットの研究に全脳領域の研究からスイッチングされます。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、最近、成体ラット脳組織のために最適化し、ニューロンマーカーのNeuN及びFos蛋白質、強く活性化されたニューロンのマーカーに対する抗体を用いて活性化ニューロンの単離を可能にされています。今までは、Fosの発現ニューロンおよび他の細胞タイプは、長い処理日と長く複雑な行動手順後に評価される脳サンプルの許可非常に限られた数を伴う新鮮な組織から単離しました。 21日- 。ここでは、背側線条体からのFos発現ニューロンとのFos mRNAの収率は3 -80ºCで凍結したばかりの解剖組織と組織との間に類似していたことがわかりました加えて、我々は表現型を確認しました凍結組織はまたのFACS単離に使用することができることを示している神経細胞の評価遺伝子発現（ のNeuN）、アストロサイト（GFAP）、オリゴデンドロサイト（Oligo2）とmicrogial（IBA1）マーカーによるのNeuN陽性とのNeuN陰性選別細胞のグリア細胞型。全体的に、収集解剖複数FACSセッションの脳組織を凍結することが可能です。これは、多くの場合、長くて複雑な行動手順を受けた貴重な動物被験体から得られたデータの量を最大化します。
Introduction
学習の間、動物は非常に特定の刺激の複雑なセット間の関連付けを形成します。この高解像度情報は、神経アンサンブル呼ばまばらに分布したニューロンの特定のパターン内の変化によってエンコードされると考えられています。ニューロンアンサンブルは最近強く行動やキュー露光時に活性化したようなフォス 、 アーク 、およびニューロンにおけるのZif268およびそのタンパク質産物として直ちに初期遺伝子（IEGs）の誘導により同定されています。特に、フォス発現ニューロンは、コンテキストに因果役割を果たしていることが示されており、キュー固有の行動1-4を学びました。したがって、これらの活性化フォス発現ニューロン内でユニークな分子神経適応は、エンコードは、このような中毒や心的外傷後ストレス障害（PTSD）5などの通常の学習および異常な学習障害、中に形成された関連を学んだ神経機構のトップ候補です。
Fluorescence活性化細胞選別（FACS）は、最近のFos発現ニューロン内で一意の分子神経適応の分析を可能にしました。フローサイトメトリーおよび細胞分取、その光散乱および免疫蛍光特性に応じて細胞を特徴付けるし、単離するために6,7、1960年代に開発された、と長い免疫学および癌研究に使用されています。しかし、フローサイトメトリーおよびFACSは、成人の脳組織から得ることが困難で解離した単一細胞を必要とします。 FACSは、第一の抗体標識8,9を必要としなかったトランスジェニックマウスからの線条体ニューロンを発現性緑色蛍光タンパク質（GFP）を単離し、分析しました。私たちは、薬物および/ または野生型動物における手がかり11-15によって活性化フォス発現ニューロンに分子変化を分離し、評価するために、抗体ベースのFACS法10を開発しました。強くニューロンを活性化しながら、この方法では、ニューロンは、一般的なニューロンのマーカーのNeuNに対する抗体で標識されていますFosタンパク質に対する抗体で標識されています。新鮮な組織のためのサンプルあたり最大10匹のラットの私たちの最初の方式に必要なプーリングが、プロトコルのその後の修正はフォス発現ニューロンのFACS分離し、単一のラット13-15から離散脳領域の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析を可能にしました。全体的に、ユニークな分子変化は、中毒の研究12,14,15でcontext-とキュー活性化のさまざまな動作中に活性化フォス発現ニューロンで発見されました。
新鮮な組織にFACSを実行すると、主要な物流の問題は、FACSによる組織とプロセスを分離するために1丸一日かかることです。また、わずか約4つのサンプルは、日ごとに処理することができます。これは通常、唯一の脳領域は、各脳から評価することができ、残りの脳の領域が廃棄されなければならないことを意味します。これは、自己投与及び絶滅TRAIのような低スループットの行動手順のための主要な問題です手術や集中的な訓練の数週間を必要と寧。また、試験日に長く複雑な行動手順は難しい同じ日にFACSを行うことができます。直ちに行動試験後、動物から脳を凍結し、その後の研究者」が選択した異なる時点で一つ以上の脳領域からのFos発現ニューロンを単離できることが大きな利点であろう。
ここで我々はFACSプロトコルは新鮮凍結両方脳組織からのFos発現ニューロン（および他の細胞型）を単離することができることを示しています。例として、我々は急性メタンフェタミン注射後の注射なしナイーブラット（対照条件）から、ラットの線条体からのFos発現ニューロンを単離しました。しかしながら、このFACSプロトコルは任意の行動または薬理学的処置の後に使用することができます。我々のサンプルのその後のqPCR分析は、これらの細胞型からの遺伝子発現は、シミを用いて評価することができることが示され生鮮・冷凍の両方の組織からLAR効率。
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Protocol
すべての実験は、実験動物16の管理および使用のための健康ガイドの国立研究所の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って行われました。
注意：特に指定のない限り、氷上に保持した使用低結合遠心管以下のすべてのステップ。
組織収集の前に1.準備
- C. O 4に遠心分離機を設定します。
- ファイアーポリッシュ約1.3の直径の減少と共に3ガラスパスツールピペットのセット、0.8、および各サンプルの0.4ミリメートル。
- 冷たい緩衝液A 1ミリリットルを含む標識1.7ミリリットル-チューブを準備し、チューブを氷上に保ちます。
- 解剖を実行する上での行列、ヘラやガラス板をスライス脳（または反転ガラスシャーレ）を含む製氷皿を準備します。ガラス板上の事前チル2以上のかみそりの刃とtをタッチするすべての機器を乾燥させるために組織の紙を使用問題。
- 組織採取前に30分間、室温（RT）での酵素溶液を解凍します。
2.組織収集および解剖
- 90分組織採取の前の行動や薬物治療を開始します。
注：ここに示した結果を得るためには、新しい環境（試験条件）とナイーブラットのラットに5 mgの/ kgのメタンフェタミンの急性腹腔内注射は、ホームケージ（制御条件）に保管を行いました。 - 飽和イソフルランたガラスデシケータージャー内に置くことにより、ラットを麻酔し、30ラットを刎ねる - ギロチンを使用して60秒後に。
頭から皮膚や筋肉を除去し、頭蓋骨を露出するためにハサミを使用してください。頭蓋骨をカットし、大後頭孔を開き、頭蓋骨の背面部分を除去するために鉗子を使用してください。脳を露出するために頭蓋骨の上縁に沿って切断するために鉗子を使用してください。脳を損傷しないように注意してください。そっと下スクープする小さなへらを使用して、脳を昇格dは。脳を上げ、脳が17外れるまで神経を切断します。 - かみそりの刃を使用して、組織を解剖。
注：以下のいずれかの方法を使用して、組織サンプルを入手します（2.3.1）したばかりの解剖組織。解剖後（2.3.2）凍結組織。凍結した全脳から解剖または（2.3.3）凍結した組織。解剖を通して脳スライス行列、かみそりの刃やガラス板の乾燥を維持し、凝縮水などの処理を刻むことは、細胞の低張溶解につながることができます。正確な解剖を確保するために拡大鏡を使用してください。- たての解剖組織のために、氷上で冷却された脳スライスマトリックス（1ミリメートル間隔でカミソリの刃のためのスロットを備えたラット脳状の金属金型）に抽出したての脳を置きます。関心の脳領域（複数可）を含有する冠状スライスをカットするスロットに2枚以上の予冷したカミソリの刃を挿入します。冷やしたガラス板上にカットスライスを配置します。
注：脳のレジオを解剖冷やしたガラス板上の目的のナノ秒。 - 切開後の凍結組織については、2.3.1で上述したものと同様の新たに抽出された脳切片からの関心のある脳領域（複数可）を解剖。マイクロチューブに解剖組織を置き、急速に20秒間-40ºCのイソペンタン中でマイクロチューブを沈めることによって組織を凍結します。さらに処理するまで-80ºCの冷凍庫内のすべての回で凍結解剖組織を保管してください。
- 凍結組織の場合は、すぐに最大6ヶ月間-80ºCで密封された袋に入れて-40ºCのイソペンタンとストア内の抽出したての脳を凍結します。
- 解剖の日に、程度に設定クライオスタットで凍結した脳を置く-20ºC（以下-18ºCなしウォーマー）約2時間、温度を平衡化します。
注：多くのクーラーの温度を安全にカットするために、脳はあまりにも脆くながら脳を、この温度で容易に切断することができます。 - の2ミリメートル冠状切片 - 1をカットするかみそりの刃を使用しますクライオスタットで凍結した脳。凍結条件の下でこれらのスライスからの組織のパンチを得るために鈍化し、12〜16ゲージの針を使用してください。さらなる処理まで、すべての回で凍結解剖組織を保管してください。
- 解剖の日に、程度に設定クライオスタットで凍結した脳を置く-20ºC（以下-18ºCなしウォーマー）約2時間、温度を平衡化します。
- たての解剖組織のために、氷上で冷却された脳スライスマトリックス（1ミリメートル間隔でカミソリの刃のためのスロットを備えたラット脳状の金属金型）に抽出したての脳を置きます。関心の脳領域（複数可）を含有する冠状スライスをカットするスロットに2枚以上の予冷したカミソリの刃を挿入します。冷やしたガラス板上にカットスライスを配置します。
- ミンチ前に解剖組織をカバーするために緩衝液Aの2滴 - 1を追加します。トリチュレーションプロセスの残りの間、ニューロンの損失を防止するために、2つのカミソリの刃を用いて組織から白質の大部分を削除してください。凍結組織で始まる場合、その組織はバッファに溶液を塗布する前に、わずか1分間冷たいガラス板上に解凍することができます。
- 冷やしたガラス板上にかみそりの刃で組織をそれぞれ直交する方向に100回をみじん切りに。ミンチ時にガラス板に垂直なカミソリの刃を保持します。
注：徹底ミンチは、すべてのプロトコルステップのために重要です。 - KEに5回 - チューブ3を反転冷たいバッファーAの1ミリリットルを含むマイクロ遠心チューブにみじん切りの組織を転送するためにカミソリの刃を使用しますepが全て溶液中で組織をミンチ。
3.細胞解離
注：以下の手順のすべての混合端部の上に穏やかなエンドを使用します。ボルテックスミキサーを使用して、細胞の損傷を引き起こす気泡を回避しません。
- 遠心機4ºCで2分間、110×gで試料管は上清を捨てます。ゆっくりとマイクロチューブの内壁ダウン冷たい解凍したての酵素液（タンパク質分解酵素の混合物を含む）の1ミリリットルを追加します。すぐに全体のペレットを吸うと静かに細分化した組織ペレットを分散させるために適度に大きな先端径ピペットでダウンのみ4回までピペットと。
- 底に付着するペレットを防ぎ、転倒は4 O℃で30分間混合した試料をインキュベートし、直ちにマイクロチューブを反転
- 酵素組織消化した後、4ºCで2分間960×gで遠心管を。上清を除去し、冷たい緩衝液A Immediatelの0.6ミリリットルを追加します。yの緩衝液Aを加えた後、ダウン5回全体ペレットを吸引してペレットを分散させるために、同じピペットチップを使用し、軽くアップピペットと。
- 機械的に消化された組織を粉砕すると、次の手順を使用して、15ミリリットルチューブに集めます。各サンプルについて、ラテックス電球に取り付けられた約1.3、0.8および0.4ミリメートルの直径を降順で3ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットの別個のセットを使用します。
- 静かに1.3ミリメートルのガラスピペットを用いて各サンプルを10回粉砕します。サンプルは（破片と解離していない細胞が底に沈むだろう）、氷上で2分間沈降してみましょう。上清を収集し（〜0.6ミリリットル）と15ミリリットルコニカルチューブ（チューブ＃1）に転送します。
- 0.6ミリリットルが残ったペレットを解決をBuffer追加。 0.8mmガラスピペットを用いて試料を10回粉砕します。サンプルは氷上で2分間沈降してみましょう。上清を収集し（〜0.6ミリリットル）と同じ15ミリリットルコニカルチューブ＃1を転送します。
- 0.6ミリリットルを加え、残りPELLEに対する解決策をBufferトン。 0.4ミリメートルのガラスピペットを用いて試料を10回粉砕します。サンプルは氷上で2分間沈降してみましょう。 （;非解離細胞を用いたペレットを触れず〜0.6ミリリットル）と同じ15ミリリットルコニカルチューブ＃1に転送し、上清を収集します。
注：以下の磨砕工程のためにチューブ＃1に0.4ミリメートルの直径のピペットを保管してください。 - 繰り返しステップ3.4.3（チューブ＃2）を最小のガラスピペット（〜0.4ミリメートルの直径）を使用して、独立した15ミリリットルコニカルチューブに上清を回収3回以上。
- 0.4ミリメートルのガラスピペットを用いて10回以上のチューブ＃1、＃2で収集した細胞懸濁液をトリチュレートし、氷上に保ちます。
4.細胞固定と透過処理
- 100％冷エタノール800μlのを追加することによって、（チューブ＃2からの細胞のためのチューブ＃1からセル用の2つのマイクロチューブおよび2）サンプルあたり4マイクロチューブを準備し、各チューブに（使用前に-20 O Cで保存）し、氷上にそれらを保ちます。注：最終エタノール濃度が50％になります。
- ピペット〜（チューブ＃1とチューブ＃2）細胞懸濁液の800μlの冷エタノールを含む4本の各チューブに、サンプルを混合するためにチューブを反転。
- チューブ5分ごとに反転させながら15分間氷上でチューブをインキュベートします。
- 固定/透過処理した後、4ºCで4分間、1700×gでチューブを遠心分離し、上清を捨てます。セル損失を防止するために、溶液50μlを残します。
注：この段階でのペレットは白であり、透過処理前に比べてチューブの壁にあまりを貼り付けます。したがって、ペレットが存在しない場合にマイクロチューブの壁に触れて慎重に上清を除去し、ゆっくりとマイクロピペットを用いて上清を描きます。
5.細胞ろ過
- 次のように冷たいPBSでステップ4.4からのペレットを再サスペンドします。
- チューブ＃1から来る2マイクロチューブの1に冷PBSの550μlのを追加し、適度に大きな直径のパイを使用優しく上下に5回の細胞懸濁液をピペットするpetteチップ。チューブ＃2からの1マイクロチューブのために同じことを繰り返します。
- 同じピペットを使用して、管＃1からの細胞については、第二のペレットに最初の細胞懸濁液を移します。軽く合わせた細胞懸濁液を上下に5回ピペッティングすることにより、第2ペレットを再懸濁。
- チューブ＃2からの細胞については、再懸濁し、5.1.2で説明したようにペレット（ すなわち、第三及び第四のマイクロチューブ）を組み合わせます。
- 次のように別々のセルストレーナーの二つの異なる組（100ミクロンと40ミクロンの孔サイズ）を使用して、ステップ5.1.2および5.1.3からの二つの細胞懸濁液をフィルター：
- ストレーナの内側にPBSを添加することにより、各セルストレーナーをプリウェット。ストレーナの外から過剰のPBSを除去するために、ピペットを使用してください。
- 均等に100μmの孔径を持つ最初のセルストレーナーにステップ5.1.2からの細胞懸濁液をピペットで。氷上の50mlチューブでフロースルーを収集します。パイを使用セルストレーナーの外側底部に取り付けられたフロースルーを収集するpette。
- 40μmのセルストレーナーに100μmのセルストレーナーからフロースルーを転送するために、同じピペットを使用してください。氷上でさらに50ミリリットルのチューブで、このフロースルーを収集します。 40μmのセルストレーナーからフロースルーを転送する場合、100μmのセルストレーナーからの汚染を避けるために新しいピペットチップに変更します。
- フィルターの新しいセットを使用して、ステップ5.1.3から細胞懸濁液のためにこれらのステップを繰り返します。
- サンプル当たり約1ミリリットルの最終容量のために、各サンプルから2フロースルーを兼ね備えています。
抗体による6.インキュベーション
注：前のメインのサンプルを実行する設定サイトメーター適切なフローを設定するための複数のコントロールサンプルを調製するために脳細胞懸濁液の小アリコートを使用してください。各抗体の標識のために、何の抗体を含まない対照試料、Seのみを準備condary抗体（または他の蛍光標識）、その後、一次および二次の両方の抗体（または他の蛍光標識）。フローサイトメーターでの非特異的標識の対特定の分離ゲートを設定するためにこれらのコントロールを使用してください。可能な場合、補償を必要としない蛍光色素を使用します。前の一次抗体を加えることにPBSを添加することにより、700μlの最終体積にゲート制御サンプルの最終容量を増やします。
- 1.7ミリリットルマイクロチューブにフィルタリング100μlの細胞サンプルを転送することにより、光散乱およびDAPIコントロールサンプルを準備します。核染色のために1μg/ mlのDAPIで冷PBS600μlのを追加します。転倒混合しながら10分間インキュベートし、そして（ステップ6.4.5に6.4.2に示されるように）、フローサイトメーターを通過する前に洗います。
注：このサンプルのみFACS機に残った細胞を選別する前に、細胞/核のゲートを設定するために使用されます。 - 100＆＃を転送することにより、単一の免疫標識対照試料を準備します181; 1.7ミリリットルマイクロチューブにフィルタリング細胞のリットル。 1抗体（ 例えば、のNeuN抗体）で冷PBS600μlのを追加します。別の抗体（ 例えば、フォス抗体）とのマイクロチューブに冷PBS600μlのを追加します。それは直接共役一次抗体でない場合は、対応する二次抗体を追加します。
注：これらのサンプルは、適切な光電子増倍管（PMT）の電圧を決定するために、必要に応じて二つの蛍光シグナルの重なりを評価するために使用されます。抗体濃度は、全てのチャンネルで最高の信号対雑音比を達成するために滴定されるべきです。重複蛍光シグナルはまた、フローサイトメーター内の異なる蛍光チャネルの内部較正によって補償することができます。 - 1.7ミリリットルマイクロチューブにフィルタリング細胞100μlを転送することにより、二重蛍光標識陰性対照試料を準備します。単独の二次抗体またはIgG直接共役一次抗体で冷PBS600μlのを追加します。
注：ティ複数の対照試料は、各フルオロフォアのためのバックグラウンド蛍光を決定するために、選別前に、すべての時間を使用することができます。 - ソートする主なサンプルを準備します。
- 1.7ミリリットルマイクロチューブ中に濾過した細胞の700μlのを転送します。フィコエリトリン（抗NeuNの-PE）に直接結合させ、一次のNeuN抗体の：アレクサフルオロ647（抗フォス-AF647）及び1.4μlの（500 1）に直接結合一次のFos抗体の：（100 1）7μlを添加します。転倒混合しながら4ºCで30分間チューブをインキュベートします。
- インキュベーションの終わりに、メインサンプルおよび対照サンプルを含め、各マイクロチューブに冷PBS800μlのを追加し、反転により混合します。
- 4ºCで3分間1300×gで遠心マイクロチューブ。セル損失を防止するために、50μlの上清を残し、上澄み液を捨てます。
- 適度に大きな先端径でピペットを用いてペレットを再懸濁細胞に冷PBSの1ミリリットルを追加します。
- 4ºCで3分間1300×gで遠心分離します。 D上清をiscard。
- 再懸濁500μlの冷PBS（ペレットの大きさに依存最終体積を調整）でペレットを。
- 転写および細胞ストレーナーキャップ（40ミクロン）で丸底FACSサンプルチューブに懸濁液を濾過します。氷上で免疫標識細胞を維持し、直ちにFACSを行います。注：フィルタ処理を行う場合は、ストレーナーキャップ上に垂直にピペットチップを触れ、それを介して細胞懸濁液を押してください。
- セットは、対照試料を使用してゲートフローサイトメーター。
- 総イベントや細胞破片から神経細胞集団を識別するために、光散乱およびDAPIコントロールサンプルを使用してください。
注： - 合計イベント（残りは破片や壊れた細胞プロセスである）の2％、この製剤中の細胞体は1つだけです。 DAPI蛍光（核を示す）信号および前方散乱（細胞の大きさ）に基づいて、後方の前方および側方光散乱特性に基づく細胞体およびゲートを配置することが可能です細胞（ 図1のA、Bに示すように）。 - PMT電圧設定を決定するために、単一の免疫標識対照試料を使用し、別のフィルタ/チャネル（ 例えば、アレクサフルオロ488 / FITCまたはフィコエリトリン）にある特定の蛍光色素からの発光のスピルオーバーを分析します。蛍光シグナルが重複する場合は、手動で補正レベルを調整することにより、重複を修正します。
- 陽性集団のしきい値を設定するには、二重蛍光標識ネガティブコントロールを使用します。
注：このサンプルからの信号は、自己蛍光によるものと考えられ、この閾値より上に位置するメインサンプルの細胞を陽性とみなすことができます。一般的に、ソートするためのしきい値パラメータは、より厳しいとほぼ陰性対照上記標識された細胞の上部2/3が実際にソートされています。
- 総イベントや細胞破片から神経細胞集団を識別するために、光散乱およびDAPIコントロールサンプルを使用してください。
- 1.7ミリリットルのマイクロチューブにFACSによって主サンプルからニューロンを並べ替えます。 RNAを50μlに細胞を収集抽出緩衝液。ソートした後、ボルテックスと遠心管と管の壁からすべての選別された細胞を回収するために上下にピペッティング10回サスペンションを混ぜます。
- すべての細胞はRNA抽出前に溶解していることを確認し、[4ºCで2分間2800×gで遠心分離する30分間、42ºCでソートされた細胞懸濁液をインキュベートします。
- 以前に13-15説明したように、RNA単離、cDNA合成、標的遺伝子プレ増幅および定量PCR用のサンプルを処理し、直ちに-80ºCで長期保存のためのRNaseフリーのチューブに上清を移したり。
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Representative Results
急性メタンフェタミン注射した後、単一のラットからの生鮮・冷凍背側線条体組織からのFos陽性とフォス陰性ニューロンを並べ替え。
上記のプロトコルは、メタンフェタミン（5mg / kg）の腹腔内注射後に1匹のラットの背側線条体90分からのFos陽性とフォス陰性ニューロンをソートするために使用されました。それらのホームケージにおけるナイーブラットを対照として使用しました。背側線条体組織は、直ちにそのコレクション（新鮮な組織）の後に処理または1,7または21日間凍結し、-80ºCに格納された後に処理しました。これらの凍結時点からの結果は、互いに有意差がなかったので、データをプールしました。
機器のソート条件を設定するには、いずれかのホームケージ制御またはmethamphetaから（上記の）コントロールサンプル鉱山注射群を使用しました。これらのサンプル中の各粒子またはイベントがサイトメーターでフローセルを通過すると、それらは事象の光散乱および蛍光特性に関連し、スプレッドシートに記録された識別番号が与えられています。このシートのイベントは、その後、スキャッタグラムまたはこれらの特性のための密度プロット（ 図1）で編成することができます。同様の特性を持つイベントが、そのような細胞、神経細胞、またはフォス陽性ニューロンを含むものなどのゲートを決定するために、特性の異なる対によって「ゲーティング」グループ化したりすることができます。ゲートは、上述の対照試料を使用して決定されると、メイン試料をフローサイトメータに注入し、これらのゲートに応じてソートされます。および側方散乱光（SSC;粒子のグラムの指標、細胞集団は、その前方光散乱（粒子の大きさの指標FSC）に基づいて、すべてのイベント（細胞や破片）からゲートされましたranularity）。 SSCドットプロット（ 図1Aおよび1B）対FSCに示すように、すべてのイベントの密度プロットは、大きな異種集団（ 図1Aおよび1B）に加えて、類似のサイズおよび粒度を有する小さな均一な集団を明らかにする。細胞体が含まれている小さな均一な集団が同定され、以前の研究11,13-15及びDAPIで標識からFSCとSSC特性に基づいて、「セル」、としてゲートされました。細胞のわずかに高い割合が新鮮な組織（1.9％）からよりも凍結組織（2.6％）から得ました。大きな不均一な集団は、おそらく、樹状突起と軸索のプロセスから、ほとんどが破片です。
次に、「セル」ゲートから単一細胞を、x軸上の各イベントのFSC信号の幅によって示されたそれらのサイズに基づいて同定されました。単一細胞よりも大きかったイベントは、細胞集合体と考えられていました以下とから除外「単細胞ゲート。その後の解析ステップのすべてが、この内で行われた「シングルセル」ゲート（ 図1Cおよび1D）。この単一の細胞集団の大部分（> 92％）は、DAPI染色に陽性であった（データではありません示されています）。
まず、ニューロンは、NeuNの免疫反応性（ 図1Eおよび1F）を示し、それらのPEの蛍光強度に基づいて同定しました。ニューロンは、新鮮な組織と凍結組織のための38パーセントのための「シングルセル」ゲートからすべてのイベントの約24％を構成していました。ほとんどすべてこの「ニューロン」ゲートのイベント（新鮮な組織における98％と凍結組織内の99％）の細胞核（ 図1Gおよび1H）におけるDNAのDAPI染色陽性でした。単一細胞ゲート内の残りのDAPIで標識されたイベントは、NeuNの陰性であり、 図3に定量PCRによって確認されるように、グリア細胞、オリゴデンドロサイトおよびミクログリアが含まれます。
1 ">そして、ニューロンがそのアレクサフルオロ647蛍光シグナル（FOS-免疫反応性）に基づいて、ニューロンのFos陽性またはフォス陰性と分類された細胞型マーカーとは異なり、フォス。：「キープtogether.within-ページ= FO」ove_content神経活動と時間経過の異なるレベルに徐々に神経細胞が増加中の発現レベルがあるので、フォス陰性ニューロン対フォス陽性の間で明確なしきい値が存在することはありません。最初のステップで（オフラインでに分析のみに使用しますフォス陽性ニューロンの割合を計算する）、我々はナイーブホームケージ対照ラットでのNeuN陰性集団からフォスの最大のAlexa-647蛍光に基づいて、フォス陽性ニューロン（）のしきい値を定義した。フォス陽性ニューロンが示されています図2の異なる実験条件からの青色の正方形で生鮮・冷凍の両方の組織では、メタンフェタミン注射したラットからのパーセンテージのFos陽性ニューロン。（1.9から2.2パーセント、 図2Cおよび2D）は二回共同ようでした（ - 0.8％、 図2Aおよび図2B 0.7）ホームケージラットにmpared。標的遺伝子前増幅およびRT-PCRを用いて、FACS選別細胞からの細胞型特異的遺伝子を確認しました。
第二段階では、その後のmRNAのための主要なサンプルからのみのFos陽性ニューロンのソートを保証するために分析し、フォス陰性細胞の混入を低減し、アレクサ647蛍光閾値が上昇したことにより、フォスの唯一の上位三分の二青い四角で陽性のイベントがソートされ、収集されました。この閾値は、サンプル中のFos陽性ニューロンの割合を計算するために上記で使用した閾値よりも少なくとも10倍高い蛍光（細胞あたりより高いFos発現する）を有しています。 、のNeuN陽性+フォス陰性 - セルの四つの集団は負のNeuN-+フォス陰性（〜5000イベント）、NeuNの陰性+のFos陽性（83イベント25の範囲であった）を含む、単一の組織試料から選別しましたティブ（〜5000イベント）とのNeuN陽性+のFos陽性（ - ホームグループのための133のイベント、185 - メタンフェタミンのグループのための450のイベント44の範囲でした）。まず、（両方のFos陽性とFosの陰性を含む）とのNeuN陰性人口（FOS陽性とフォス負の両方を含む）のNeuN陽性で細胞型特異的遺伝子の発現が確認された（ 図3）。GAPDH でした私たちの以前の研究13の結果に基づいて、参照/ハウスキーピング遺伝子として使用します。 PCR反応における試料およびcDNAにおけるRNAの異なるレベルを制御するために、二重のqPCR反応は、標的遺伝子およびGAPDH cDNAの両方のためのプライマーを用いて行きました。 GAPDHハウスキーピング遺伝子に対するCt値は、正確な測定のために15と31との間に維持しました。両方の新鮮凍結組織については、NeuNの mRNAレベルはのNeuN陰性人口た（p <0.05に比べてのNeuN陽性人口（約8倍）有意に大きかった。 図3（a） 、GFAP（グリア細胞マーカー; 図3B）の両方のためにとOligo2（オリゴデンドロサイト細胞マーカー; 図3C）のmRNAレベルはのNeuN陽性人口た（p <0.05に比べてのNeuN陰性集団において大きかったです）。高いIBA1の同様の傾向（ミクログリア細胞マーカー; 図3D）mRNAレベルをNeuNの陰性集団において観察されたが、これは統計的に有意ではなかったです。いくつかの試料を正確に特定の細胞型（ 例えば 、NeuNの標識ニューロンにおけるGFAPのmRNA）で測定することができなかった特定のmRNAの非常に低いレベルを含んでいました。最大Ct値を正確に検出できないほど低かった値を排除するために35としました。高いCt値は、当社のqPCRアッセイにおける信頼限界を超えました。
Fosの mRNAの発現でした（ 図4）メタンフェタミンの単回注射を受けたラットからのNeuN陽性ニューロン集団で検討しました。生鮮・冷凍の両方の組織については、 フォス mRNAレベルは、フォス陰性ニューロンた（p <0.05）に比べフォス陽性ニューロンに大きかったです。新鮮な組織からのFos陽性ニューロンでのFos mRNAの3倍の増加があった一方でまた、凍結組織からのFos陽性ニューロンでのFos mRNAの11倍の増加が検出されました。まとめると、これらのmRNAの結果は、生鮮・冷凍の両方の組織からのFos陽性ニューロン、フォス陰性ニューロンおよび非ニューロン集団の身元を確認します。また、細胞型特異的遺伝子および目的の他の遺伝子はまた、新鮮な凍結条件の両方でソートされた細胞から分析することができます。
ディスの 図1. ゲーティング生鮮・冷凍ラット背部線条体からsociatedと標識された細胞。「細胞」ゲートは前方および側方散乱特性（AD）によって決定され、核のDAPI染色（GH）と正の標識により確認しました。 「細胞」集団内の「ニューロン」ゲートはのNeuN（; EF PE）のために、蛍光によって決定しました。 （A - B）細胞ゲート：すべてのイベントの線形プロット、その前方散乱（X軸、セルサイズ）および側方散乱（Y軸、粒度）に基づきます。 （C - D）シングルセルゲート：ABに示すセルゲート内の前方散乱の高さ（Y軸）と幅（X軸）の線形プロット。 （E - F）ニューロンゲート：PE標識のNeuN（Y軸）のための免疫蛍光の対数プロット単一細胞ゲート内のCDに示すが低く、クラスタ内のイベントと非神経細胞の上部クラスタ内のニューロンを明らかにする。 （G H）核染色：神経細胞のゲート内のDAPI標識核（Y軸）についての蛍光の対数プロット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. のNeuNとFosのための二重標識に基づいて、生鮮・冷凍ラット背部線条体からのFos陽性とフォス陰性ニューロンのゲーティング。単一の後にホームケージまたは90分から直接採取したラットからの生鮮・冷凍背側線条体（メタンフェタミンの腹腔内注射）が解離し、のNeuN及びフォスに直接結合した抗体で標識し、FACS機を用いて選別しました。並べ替えをNeuNの免疫蛍光（X軸）を標識およびAlexa 647標識フォスimmunofluoフィコエリトリン（PE）に基づいていましたrescence（Y軸）。 FOS陽性（ブルードット）とFOS陰性（赤い点）ニューロンは、それぞれ、上部および下部右象限に位置していました。ドットプロットはのNeuN陽性細胞（ニューロン）とのNeuN陰性細胞（灰色の点）を示します。青い四角はしきい値以上Fos発現とニューロンを示しています。 （A - B）ホームグループ：ホームケージから直接取得ナイーブラット。 （C - D）メタンフェタミングループ：メタンフェタミンの単回注射を受けたラット。フォス陽性ニューロンの閾値は、最大のAlexa-647蛍光（FOS-IR）はホームケージ対照群でのNeuN陰性細胞について観察されただけの上になるように選択しました。すべてのニューロンの0.8％ホーム・グループ内のFos陽性であり、1.9 - - 0.7は、一方で、すべてのニューロンの2.2％は、メタンフェタミンのグループ内のFos陽性です。
図3。 で強い> 細胞型特異的な遺伝子発現生鮮・冷凍ラット背部線条体からの細胞をFACSでソート。のNeuN陽性ニューロンを（FOS陽性とフォス陰性）とのNeuN陰性細胞を選別し、記載されたプロトコルを使用して、細胞型特異的遺伝子のmRNA発現レベルは、細胞選別を確認した。（A） のNeuNは神経細胞のマーカーである。（B）GFAPは、グリア細胞のマーカーである。（C）Oligo2マーカーでありますオリゴデンドロサイトの細胞。（D）のためIBA1は、ミクログリア細胞のマーカーです。 NeuNの mRNAについて、データは平均±SEM新鮮な組織からのNeuN陰性細胞における発現レベルと比較し倍の値（ - 14のn = 9）の平均として提示されています。 GFAP（N = 6から12まで）については、Oligo2（N = 9から11）とIBA1た（n = 5から8）mRNAは、データが倍の値の平均±SEMノイにおける発現レベルに対する相対平均として提示されています新鮮な組織からのN陽性細胞。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
上記のプロトコルに記載されており、 フォスのmRNAレベルを確認したとして覚せい剤注入。フォス陽性とフォス陰性ニューロンの後に新鮮または凍結したラット背部線条体からFACSソートニューロンにおける 図4 のFos mRNAレベルを選別しました。データは、新鮮な組織からのフォス陰性ニューロンにおける発現レベルと比較し倍の値（ - 4のn = 3）の平均±SEMとして提示されています。
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Discussion
FACSは、新鮮または凍結のいずれか成体脳組織からニューロンおよび他の細胞タイプを分類するために使用することができます。冒頭で述べたように、凍結組織を使用する能力は、そのような中毒研究における自己投与および再発の研究など、複雑かつ長期化行動の手順を、受けた動物からのサンプルの最適な利用を可能にします。 2時間以上、およびすべての動物が必要です-これらの行動の手順は、通常、1をとる（10から20までの合計）が同じ日13,18上でテストされます。これは、脳の解剖、細胞解離、透過性及び免疫標識を含む4新たに解剖した脳組織試料を処理するために約4時間かかります。 30分 - 処理した後、FACSにより各サンプルを分類すると、20との間をとります。溶解緩衝液中で選別された細胞を加熱する最後のステップは、別の30分を必要とします。合計では、〜7時間は、最終的なRNA含有細胞溶解液の段階に脳の解剖から必要とされています。しかし、全体braiを凍結することが可能になりましたNSまたはたてをすぐに試験後の脳領域を解剖し、後でそれらを処理します。これは、大幅にテストを簡素化し、別の日にソートする複数の脳領域を可能にします。前FACSに組織を凍結することも、結果を改善することができます。より多くのNeuN陽性ニューロンは、凍結組織サンプルから得られます。これは、そのようなのNeuNやフォスなどの細胞内タンパク質に対する抗体のアクセスを増加させる凍結およびその後の解凍時に細胞膜の破壊、に増加のNeuN標識によって部分的に説明することができます。同様の効果は、線維芽細胞、上皮細胞およびHeLa細胞を19で観察されています。
細胞およびニューロンの収率は、以下のステップを使用して最大化することができます。組織の解剖時には、白質の大部分を除去（脳梁と背側線条体と側坐核のための前交連、それぞれ）。これは、後続のSTEでプラスチックのヒントとガラスピペットに付着するから組織を防止しますpsの。使用緩衝液Aは、覆われた解剖組織を維持するために（材料および試薬の表に仕様を参照してください）。これは、カミソリの刃（ステップ2.5）で組織を刻むの間に細胞の品質が向上します。セルストレーナー（ステップ5）の第二のセットと最小のガラスピペット（ステップ3.9）とその後のフィルタリングと3摩砕段階の余分なセットは、細胞と神経細胞の収量を倍増します。セルストレーナーを再利用するフィルタと低い細胞収率を詰まらせます。ペレットを再懸濁し、トリチュレーション中に時の細胞と穏やかなこと。これらの工程の間に適度に大きなピペットチップの使用は、せん断応力による細胞の損傷を軽減します。エタノール（ステップ4.4）で透過処理した後、上清を除去する際に慎重にペレットを見ます。ペレットはあまりコンパクトであり、マイクロチューブの壁に沿って分布させることができます。大まかな計算は、フォス陽性ニューロンの収率は解剖線条体組織サンプル中の出発数の約10％であることを示唆しています。 現在のプロトコルは、他の実験の目的に合わせて変更することができます。 Fos発現はFosの発現ニューロンの効率的な選別のために重要である、このときに最大レベルに達したため、現在のプロトコルでは、組織は、メタンフェタミン注射後90分に採取しました。しかし、組織は、実験の特定の目的に依存して、FACSのための任意の時点で収集することができます。初期の組織サンプルの保存については、我々は成功したばかりの解剖組織、解剖後に凍結組織、または遺伝子発現のqPCR分析に続いて、FACSを用いて、フォス発現ニューロンを単離するために、凍結した全脳から解剖凍結組織を使用しています。このプロトコル（15分間4ºC）で固定し、透過性、持続時間と温度の両方の細胞質と核膜を透過するために、ならびに組織を固定するために最適化されました。持続時間および/または温度の変化は、最終的な結果を変更することができます。このようなparaformaldのような他の固定ソリューションehydeと胚および出生後のニューロン20のために働いているようなサポニンなどの非イオン性界面活性剤は、また、成人の脳からのニューロンのために働くことがあります。脳組織21からFACSのために最近示されているようさらに、ミエリン除去ビーズは現在のプロトコルの変形例として用いることができます。
現在のプロトコルは、考慮すべき二つの重要な制限があります。まず、このプロトコルは、これらの細胞プロセスは、トリチュレーションおよび解離工程の間に細胞体から除去されるため、シナプスで主に発現している細胞表現型マーカー（ 例えば 、ドーパミンやグルタミン酸受容体）を検出するため適していません。第2の可能な制限は、FACSソートした細胞から得られたRNAの長さは、すべてのRNA分析の方法のために十分ではないかもしれないということです。 FACSから得られたRNAのためのRNA完全性番号（RIN）は、細胞がより短い平均RNAの長さに相当する2.5〜3.5の間にあるソート。ここで、短いRNAのサイズはによって補償されました以前に13-15説明したように、100 bpの- 80の比較的短い定量PCRアンプリコンを使用。また、マイクロアレイ解析11で正常にこれらの短い長さのRNAを使用しています。それにもかかわらず、得られた短いRNAの長さは、全てのRNAの解析方法の適切でないかもしれません。特異的に標的エクソン - エクソン接合はサイトゾル中で唯一の完全にスプライシングされたmRNAで見つかったPCRプライマーを用いたことを強調すべきです。これらのプライマーは、核からイントロン含有RNAを検出しません。さらに、我々は以前に細胞膜10に、サイトゾルおよびD1ドーパミン受容体におけるチロシンヒドロキシラーゼを検出するための抗体、新鮮な脳組織で、このプロトコルを使用しています。これらのサイトゾル、細胞膜マーカーの検出は、分離手順は、主にインタクトな細胞を生成し、単に核ではないことを示しました。
全体的に、凍結サンプルから神経細胞のFACS分離は、他のアプリケーションを開きます。ソートまたは遺伝子expreに違いありませんサンプルは-80で3日間または3週間保存したときssionは（データは示していない）が観察されました ºC。 （ - 40サンプル20）と遺伝子発現のためのRNAを単離三週間は、特定の実験からのすべてのサンプルを並べ替えるための合理的な時間です。使用可能なRNAはまた、-80ºC（データは図示せず）で6ヶ月間保存された脳組織から得られました。したがって、このプロトコルは、数ヶ月または数年のために保存した死後冷凍ヒト脳サンプルのFACS単離のために有用であり得ます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
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