Summary
Aqui apresentamos um protocolo de fluorescência de células activadas (FACS) para estudar alterações moleculares em Fos-expressando conjuntos neuronais a partir de tecido cerebral fresco e congelado. O uso de tecido congelado permite o isolamento FACS de muitas áreas do cérebro mais várias sessões para maximizar o uso de indivíduos animais valiosos.
Abstract
O estudo da neuroplasticidade e alterações moleculares em comportamentos aprendidos está a mudar a partir do estudo de regiões do cérebro inteiro ao estudo de conjuntos específicos de neurônios ativados escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais que medeiam aprendidas associações. Fluorescência de células activadas (FACS) foi recentemente optimizada para o tecido do cérebro do rato adulto e permitiu o isolamento de neurónios activados utilizando anticorpos contra o marcador neuronal NeuN e proteínas Fos, um marcador de neurónios fortemente activado. Até agora, os neurónios que expressam-Fos e outros tipos de células foram isoladas a partir de tecido fresco, o que implicou dias longos de processamento e permitiu número muito limitado de amostras de cérebro de ser avaliadas após procedimentos comportamentais longas e complexas. Aqui descobrimos que os rendimentos de Fos-expressando neurônios e mRNA Fos de striatum dorsal foram semelhantes entre o tecido recém-dissecados e tecido congelado a -80 ºC durante 3 - 21 dias. Além disso, confirmou o fenótipodas células NeuN positivos e NeuN-negativas classificados por expressão avaliar gene de natureza neuronal (NeuN), astrócitos (GFAP), oligodendrocíticos (Oligo2) e microgial marcadores (Iba1), o que indica que o tecido congelado pode também ser utilizado para o isolamento de FACS de tipos de células gliais. Em geral, é possível recolher, dissecar e congelar o tecido cerebral para sessões múltiplas de FACS. Isto maximiza a quantidade de dados obtidos a partir de sujeitos animais valiosos que têm muitas vezes sido submetidos a procedimentos comportamentais longos e complexos.
Introduction
Durante o aprendizado, os animais formam associações entre conjuntos complexos de estímulos altamente específicos. Esta informação de alta resolução é pensado para ser codificado por alterações dentro dos padrões específicos de neurônios escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais. Conjuntos neuronais foram recentemente identificados pela indução de genes imediatamente precoces (IEGs), tais como Fos, arco, e Zif268 e seus produtos proteicos em neurónios que foram fortemente activadas durante o comportamento ou a exposição a estímulos. Fos-expressando neurônios, em particular, têm sido mostrados para desempenhar papéis causais no contexto e comportamentos aprendidos 1-4 específico-cue. Assim, neuroadaptações moleculares únicas dentro desses neurônios Fos-expressando ativados são os melhores candidatos para os mecanismos neurais que codificam aprendidas associações formadas durante distúrbios de aprendizagem e de aprendizagem anormal normais, tais como vício e transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) 5.
fluoréscence de células activadas (FACS) permitiu recentemente a análise de neuroadaptações moleculares únicas dentro dos neurônios Fos-expressam. A citometria de fluxo e classificação celular foram desenvolvidos na década de 1960 para 6,7 caracterizar e isolar as células de acordo com as suas características de dispersão de luz e de imunofluorescência, e têm sido muito utilizados em imunologia e na investigação do cancro. No entanto citometria de fluxo e FACS requer células individuais dissociadas que são difíceis de obter a partir de tecido do cérebro adulto. FACS foi usado pela primeira vez para isolar e analisar Green Fluorescent Protein (GFP) -expressing neurónios do estriado de ratos transgénicos que não exigem rotulagem anticorpo 8,9. Foi desenvolvido um método de FACS baseada em anticorpos 10 para isolar e avaliar alterações moleculares em Fos-expressando neurónios activados por droga e / ou sinais do tipo em animais selvagens 11-15. Neste método, os neurónios são marcadas com um anticorpo contra o marcador neuronal geral NeuN, enquanto que os neurónios fortemente activadosão marcadas com um anticorpo contra Fos. Embora o nosso método inicial necessário o agrupamento de até 10 ratos por amostra de tecido fresco, modificações posteriores do protocolo permitiu o isolamento FACS de Fos-expressando neurônios e Polymerase Chain Reaction quantitativa de análise (qPCR) de áreas cerebrais distintas de um único rato 13-15 . No geral, as alterações moleculares únicas foram encontrados em Fos-expressando neurônios ativados durante uma variedade de comportamentos ao contexto e ativada por sinalização em pesquisa vício 12,14,15.
Um grande problema logístico com a realização de FACS em tecido fresco é que leva um dia inteiro para dissociar o tecido e processo pelo FACS. Além disso, apenas cerca de quatro amostras pode ser processado por dia. Isto normalmente significa que apenas uma área do cérebro pode ser avaliado a partir de todos os cérebros e os restantes áreas do cérebro têm que ser descartados. Este é um grande problema para os procedimentos comportamentais baixo rendimento como a auto-administração e trai extinçãoning que requer cirurgia e muitas semanas de treinamento intensivo. Além disso, os procedimentos comportamentais longas e complicadas no dia do teste faz com que seja difícil de executar de FACS no mesmo dia. Seria uma vantagem significativa de ser capaz de congelar os cérebros dos animais imediatamente após o teste de comportamento, e, em seguida, isolar-Fos neurónios que expressam a partir de uma ou mais áreas do cérebro em momentos diferentes da escolha do investigador.
Aqui demonstramos que o protocolo de FACS pode ser usado para isolar neurónios Fos-expressam (e outros tipos de células) a partir de tecido cerebral, tanto frescos e congelados. Como um exemplo, nós isolamos neurônios do corpo estriado de ratos após as injeções de metanfetamina agudas e de ratos ingênuos, sem injeções (condição de controle) Fos-expressar. No entanto, este protocolo FACS pode ser usado após qualquer tratamento comportamental ou farmacológica. análise qPCR subsequente de nossas amostras indicaram que a expressão do gene a partir desses tipos de células pode ser avaliada com simieficiência lar a partir de tecido fresco e congelado.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) dos Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório 16.
Nota: Todos os passos abaixo uso tubos de ligação baixas centrífuga que foram mantidos em gelo, a menos que especificado em contrário.
1. Preparação antes da coleção Tissue
- Definir a centrífuga a 4 o C.
- Fogo polonês um conjunto de três pipetas Pasteur de vidro com decrescentes diâmetros de cerca de 1,3, 0,8, e 0,4 mm para cada amostra.
- Preparar 1,7 ml rotulados-tubos contendo 1 ml de tampão A frio e manter os tubos em gelo.
- Prepare uma bandeja de gelo contendo o cérebro cortando matriz, espátulas e placas de vidro (ou invertida Petri prato de vidro) no qual executar a dissecação. Pré-chill dois ou mais lâminas de barbear sobre a placas de vidro e tecidos uso de papel para secar todos os instrumentos que tocam a tquestão.
- Descongelar a solução de enzima à temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos antes da recolha de tecidos.
2. Tissue Recolha e Dissection
- Inicie a comportamental ou farmacológica de tratamento 90 min antes da coleta do tecido.
NOTA: Para os resultados apresentados aqui, injecções intraperitoneais agudas de 5 mg / kg de metanfetamina em ratos num ambiente novo (situação de teste) e ratos ingénuos mantidos nas suas gaiolas (condição de controle) foram realizados. - Anestesiar o rato, colocando-o em um frasco de vidro com secador isoflurano saturada e decapitar o rato 30 - 60 seg mais tarde usando uma guilhotina.
Utilize uma tesoura para remover o músculo e pele da cabeça e expor o crânio. Use fórceps para cortar o crânio e abrir o forame magno e remover a parte de trás do crânio. Use fórceps para corte ao longo das bordas de topo do crânio para expor o cérebro. Tenha cuidado para não danificar o cérebro. Use uma pequena espátula para colher suavemente sob umd elevar o cérebro. Elevar o cérebro e cortar os nervos até o cérebro é livre 17. - Dissecar o tecido usando lâminas de barbear.
NOTA: obter amostras de tecido usando um dos seguintes métodos: (2.3.1) do tecido recém-dissecados; (2.3.2) tecido congelado após a dissecção; ou (2.3.3) de tecido congelado dissecado a partir do cérebro inteiro congelado. Manter a matriz de corte cérebro, lâminas de barbear e placa de vidro seco em toda a dissecção e picagem processos como a água condensada pode levar à lise hipotônica de células. Use lupas para garantir dissecção precisa.- Para o tecido recém-dissecados, colocar o cérebro recentemente extraído em uma matriz de corte cerebral (um molde de metal em forma de cérebro de rato com ranhuras para as lâminas de barbear, em intervalos de 1 mm) que foi arrefecida em gelo. Inserir dois ou mais lâminas de barbear pré-refrigerados nas ranhuras para cortar fatias coronais que contêm a região do cérebro (s) de interesse. Coloque a fatia cortada na placa de vidro refrigerado.
Nota: Dissecar a regio cérebrons de juros sobre uma placa de vidro refrigerada. - Para tecidos congelados após a dissecação, dissecar a região do cérebro (s) de interesse a partir de fatias de cérebro extraído fresco, semelhante ao descrito acima em 2.3.1. Colocar o tecido dissecado em um microtubo e congelar rapidamente o tecido através da submersão do microtubo em -40 ° C durante 20 seg isopentano. Manter o tecido dissecado congelados em todos os tempos em uma ºC congelador -80 até novo processamento.
- Para o tecido congelado, congelar imediatamente o cérebro recém-extraído em -40 ºC isopentano e armazenar em um saco selado a -80 ºC por até 6 meses.
- No dia da dissecção, colocar o cérebro congeladas em criostato ajustada para aproximadamente -20 ° C (não mais que -18 ° C) durante aproximadamente 2 horas para equilibrar a temperatura.
NOTA: Cérebros pode ser cortado facilmente a esta temperatura, enquanto que as temperaturas mais frias muito tornar o cérebro demasiado frágil para ser cortada com segurança. - Use lâminas de barbear para cortar 1-2 mm cortes coronais deos cérebros congelados em um criostato. Use uma agulha de 12 a 16 de calibre embotada obter socos de tecido de essas fatias sob condições de congelamento. Manter o tecido congelado dissecado em todos os momentos até ulterior processamento.
- No dia da dissecção, colocar o cérebro congeladas em criostato ajustada para aproximadamente -20 ° C (não mais que -18 ° C) durante aproximadamente 2 horas para equilibrar a temperatura.
- Para o tecido recém-dissecados, colocar o cérebro recentemente extraído em uma matriz de corte cerebral (um molde de metal em forma de cérebro de rato com ranhuras para as lâminas de barbear, em intervalos de 1 mm) que foi arrefecida em gelo. Inserir dois ou mais lâminas de barbear pré-refrigerados nas ranhuras para cortar fatias coronais que contêm a região do cérebro (s) de interesse. Coloque a fatia cortada na placa de vidro refrigerado.
- Adicionar 1 - 2 gotas de tampão A para cobrir o tecido dissecado antes da trituração. Remover a maior parte da matéria branca do tecido com duas lâminas de barbear para evitar a perda de neurónios durante o resto do processo de trituração. Se começando com tecido congelado, em seguida, permitir que o tecido para descongelar sobre a placa de vidro frio para não mais do que 1 minuto antes de aplicar Tampão A solução.
- Picar o tecido 100 vezes em cada direcção ortogonal com uma lâmina de barbear sobre uma placa de vidro gelada. Segure a lâmina de barbear vertical à placa de vidro, quando picados.
NOTA: picagem minuciosa é fundamental para todas as etapas do protocolo. - Use lâminas de barbear para transferir o tecido moído em tubos de microcentrifuga contendo 1 ml de tampão frio A. Inverter o tubo 3 - 5 vezes para keep todo o tecido picada na solução.
A dissociação 3. celular
NOTA: O uso final mais suave final de mistura para todos os passos seguintes. Não use um misturador de vórtice e evitar bolhas de ar que causam danos às células.
- Centrifugar os tubos de amostra a 110 g durante 2 minutos a 4 ºC. sobrenadante de descarte. Adiciona-se lentamente 1 ml de solução de enzima recentemente descongelado frio (contendo uma mistura de enzimas proteoliticas) para baixo da parede interior do microtubo. sugar imediatamente backup de todo o sedimento e gentilmente pipeta cima e para baixo apenas 4 vezes com uma pipeta moderadamente grande diâmetro da ponta para dispersar o sedimento de tecido picada.
- Inverta microtubos imediatamente para evitar que a pastilha se colem ao fundo e incubar as amostras com mistura-sobre-extremidade final durante 30 minutos a 4 o C.
- Após a digestão enzimática do tecido, os tubos de centrifugação a 960 xg durante 2 min a 4 ºC. Remover o sobrenadante e adicionar 0,6 ml de tampão A. frio immediately após a adição do tampão A, use a mesma ponta de pipeta para dispersar o sedimento por sugando todo o sedimento e gentilmente pipeta cima e para baixo 5 vezes.
- Mecanicamente tritura-se o tecido digerido e recolher em tubos de 15 ml, utilizando os seguintes passos. Para cada amostra, utilizar um conjunto separado de 3 pipetas Pasteur de vidro polido-fogo com descendente diâmetros de cerca de 1,3, 0,8 e 0,4 mm ligados a lâmpadas de látex.
- Gentilmente triturar cada amostra 10 vezes com a pipeta de vidro 1,3 mm. Deixe a amostra se contentar com 2 min no gelo (os detritos e células sem dissociar vai assentar no fundo). Recolhe-se o sobrenadante (~ 0,6 ml) e transferir para um tubo de 15 ml (tubo # 1).
- Adicionar 0,6 ml de tampão A solução para o sedimento restante. Tritura-se a amostra 10 vezes, com a pipeta de vidro de 0,8 mm. Deixe a amostra se contentar com 2 min em gelo. Recolher o sobrenadante (~ 0,6 ml) e transferir para os mesmos 15 ml cônico tubo # 1.
- Adicionar 0,6 ml de tampão A solução para o Pelle restantet. Tritura-se a amostra 10 vezes, com a pipeta de vidro de 0,4 milímetros. Deixe a amostra se contentar com 2 min em gelo. Recolher o sobrenadante (~ 0,6 ml; sem tocar a pelota com células não-dissociada) e transferir para os mesmos 15 ml cônico tubo # 1.
NOTA: Mantenha a pipeta de diâmetro 0,4 mm de tubo # 1 para os seguintes passos trituration. - Repita o passo 3.4.3 mais três vezes usando a pipeta de vidro menor (~ 0,4 mm de diâmetro), e recolher o sobrenadante para um separadas tubo de 15 ml (Tubo # 2).
- Tritura-se as suspensões de células colhidas em tubos # 1 e # 2 para mais de 10 vezes, utilizando a pipeta de vidro de 0,4 milímetros e manter em gelo.
4. celular Fixação e permeabilização
- Prepare 4 microtubos por amostra (dois microtubos para células do Tubo # 1 e para duas células de tubo 2 #) adicionando 800 ul de etanol frio a 100% (armazenada a -20 ° C antes da utilização) a cada tubo e mantê-los em gelo . Nota: O final de etanolconcentração será de 50%.
- Pipeta ~ 800 ul das suspensões de células a partir de tubo (# 1 e # 2 tubo) a cada um dos 4 tubos contendo etanol frio e inverter os tubos para misturar as amostras.
- Incubar os tubos em gelo durante 15 min, enquanto se invertendo os tubos a cada 5 min.
- Após a fixação / permeabilização, centrifugar os tubos a 1.700 g durante 4 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Deixar 50 ul de solução para prevenir a perda de células.
NOTA: As pastilhas, nesta fase, são de cor branca e ficar menos à parede dos tubos que antes permeabilização. Por isso, remover o sobrenadante cuidadosamente por tocar a parede do microtubo, onde não existe um pelete e o sobrenadante elaborar-se lentamente utilizando uma micropipeta.
Filtration 5. celular
- Re-suspender as pelotas do passo 4.4 com PBS frio como se segue:
- Adicionar 550 ul de PBS frio a uma das duas microtubos provenientes do tubo # 1, e usar um moderadamente grande diâmetro pipette dica para pipeta suavemente a suspensão de células para cima e para baixo 5 vezes. Repetir o mesmo para um microtubo vindo do tubo # 2.
- Para as células de tubo # 1, utilizando a mesma pipeta, transferir a primeira suspensão de células para a segunda pastilha. Ressuspender o segundo pellet com cuidado pipetando para cima suspensão de células combinadas e para baixo 5 vezes.
- Para as células de tubo # 2, ressuspender e combinar as pelotas (ou seja, terceiro e quarto microtubos) tal como descrito em 5.1.2.
- Filtrar as duas suspensões de células a partir de passos 5.1.2 e 5.1.3 separadamente usando dois pares diferentes de filtros de células (de 100 um e 40 um tamanho de poro) como segue:
- Pré-molhado cada filtro de células por adição de PBS para o interior do filtro. Usar uma pipeta para remover o excesso de PBS a partir do exterior do filtro.
- Pipetar a suspensão de células a partir do passo 5.1.2 uniformemente sobre o primeiro filtro de células com tamanho de poro de 100 um. Recolhe-se o fluxo através de um tubo de 50 ml em gelo. Use o pipette para recolher o fluxo-ligado através na parte inferior do lado exterior do filtro de células.
- Utilizar o mesmo pipeta para transferir o fluxo através do filtro de células de 100 um para o filtro de células de 40 ^ m. Recolha este flow-through em outro tubo de 50 ml em gelo. Ao transferir o fluxo através do filtro 40 mm celular, mudar para novas pontas de pipeta para evitar a contaminação de 100 mm filtro celular.
- Repita essas etapas para a suspensão de células a partir do passo 5.1.3, usando um novo conjunto de filtros.
- Combinar os dois fluxo através de cada amostra para um volume final de cerca de 1 ml por amostra.
6. A incubação com anticorpos
NOTA: Use pequenas alíquotas das suspensões de células do cérebro para preparar várias amostras de controlo para definir o fluxo adequado citômetro configurações antes de executar a amostra principal. Para cada rotulagem de anticorpos, preparar amostras de controlo que incluem não anticorpos, somente a sicundária anticorpo (ou outro marcador fluorescente), e, em seguida, ambos os anticorpos primário e secundário (ou outro marcador fluorescente). Use esses controles para definir as portas que separam específica contra rotulagem não-específica no citômetro de fluxo. Quando possível, use fluorocromos que não exigem compensação. Aumenta o volume final das amostras de controlo de propagação para um volume final de 700 ul por adição de PBS antes da adição do anticorpo primário.
- Prepare de dispersão de luz e a amostra de controlo, transferindo DAPI uma amostra de 100 ul das células filtradas para um microtubo de 1.7 ml. Adicionar 600 ul de PBS frio com 1 ug / ml de DAPI para a coloração de núcleos. Incubar durante 10 min, com mistura-sobre-extremidade final, e lava-se (tal como indicado nos passos 6.4.2 a 6.4.5) antes de passar através do citómetro de fluxo.
Observação: Este exemplo é usado apenas para definir o núcleo / gate celular antes de classificar as células restantes na máquina de FACS. - Prepare amostras únicas de controle immunolabeled através da transferência de 100 & #181; l das células filtradas para um microtubo de 1.7 ml. Adicionar 600 ul de PBS frio com um anticorpo (por exemplo, anticorpo NeuN). Adicionar 600 ul de PBS frio para um microtubo com outro anticorpo (por exemplo, anticorpo Fos). Adicionar o anticorpo secundário correspondente, se não é um anticorpo primário conjugado directa.
NOTA: As amostras serão usadas para determinar a tensão de tubo fotomultiplicador apropriado (PMT), e para avaliar a sobreposição dos dois sinais de fluorescência, se necessário. As concentrações de anticorpos deve ser titulada para alcançar os melhores rácios de sinal-ruído em todos os canais. A sobreposição de sinais fluorescentes também pode ser compensado por calibração interna de diferentes canais fluorescentes dentro do citómetro de fluxo. - Prepare amostra de controlo negativo fluorescente duplamente marcada pela transferência de 100 ul das células filtrados para um microtubo de 1,7 ml. Adicionar 600 ul de PBS frio, com os anticorpos secundários sozinho ou anticorpos primários direta conjugados IgG.
NOTA: Thiamostra s controle pode ser usado todas as vezes antes de triagem para determinar a fluorescência de fundo para cada fluoróforo. - Prepare amostra principal a ser classificado.
- Transferir 700 uL das células filtrada para um microtubo de 1.7 ml. Adicionar 7 l (1: 100) de anticorpo primário Fos conjugados directamente com Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) e 1,4 ul (1: 500) de anticorpo primário NeuN conjugados directamente com ficoeritrina (anti-NeuN-PE). Incubar os tubos durante 30 minutos a 4 ºC com mistura-over-end end.
- No final da incubação, adicionar 800 ul de PBS frio a cada microtubo, incluindo a amostra principal e as amostras de controlo, e misturar por inversão.
- microtubos centrifugar a 1300 xg por 3 min a 4 ºC. Descartar o sobrenadante, deixando 50 ul de sobrenadante para evitar perda de células.
- Adicionar 1 ml de PBS frio para as células pellet e ressuspender utilizando uma pipeta com uma moderadamente grande diâmetro da ponta.
- Centrifugar a 1.300 xg durante 3 min a 4 ºC. Discard o sobrenadante.
- Re-suspender o sedimento em 500 ul de PBS frio (Ajustar o volume final dependendo do tamanho da pastilha).
- Transferência e filtrar a suspensão para um tubo de ensaio de fundo redondo de FACS com um tampão de filtro de células (40 ^ M). Manter as células imunomarcadas em gelo e executar imediatamente FACS. Nota: Para filtragem, toque a ponta da pipeta na vertical sobre a tampa do filtro e empurre a suspensão de células através dele.
- Definir citômetro de fluxo portões utilizando amostras de controlo.
- Use a luz-se espalhando e amostra de controlo DAPI para identificar a população de células neuronais do total de eventos e restos celulares.
NOTA: Os corpos celulares nesta preparação são apenas 1 - 2% do total de eventos (o resto são detritos e processos celulares quebradas). Com base no sinal fluorescente DAPI (indicando núcleos) e dispersão para a frente (tamanho da célula) é possível localizar corpos celulares e para trás portão com base na frente e o lado de propriedades de dispersão de luzas células (como mostrado na Figura 1 A, B). - Use as amostras únicas de controle immunolabeled para determinar as configurações de tensão PMT, e analisar transbordamento da emissão de um fluorocromo específico em outro filtro / canal (por exemplo, Alexa Fluor 488 / FITC ou ficoeritrina). Se os sinais fluorescentes sobrepor-se, corrigir a sobreposição ajustando os níveis de compensação manualmente.
- Use o controle negativo fluorescente duplamente marcada para configurar o limiar para a população positiva.
NOTA: O sinal proveniente desta amostra é pensado ser devido a auto-fluorescência e as células da amostra principal localizada acima deste limite pode ser considerada como positiva. Normalmente, os parâmetros de limite para classificação são mais rigorosas e aproximadamente o topo 2/3 das células marcadas acima do controlo negativo são realmente ordenados.
- Use a luz-se espalhando e amostra de controlo DAPI para identificar a população de células neuronais do total de eventos e restos celulares.
- Separar os neurônios a partir da amostra principal por FACS em 1,7 ml microtubos. Recolher as células em 50 ul de ARNtampão de extracção. Após a triagem, vortex e centrifugar o tubo e misturar a suspensão por pipetagem cima e para baixo 10 vezes para recuperar todas as células classificadas a partir das paredes do tubo.
- Incubar a suspensão de células ordenada a 42 ºC durante 30 minutos para assegurar que todas as células são lisadas antes da extracção de ARN e, em seguida, centrifugar a 2800 xg durante 2 min a 4 ºC.
- Transferir o sobrenadante para um tubo livre de ARNase para o armazenamento a longo prazo a -80 ° C ou imediatamente a processar a amostra para o isolamento de ARN, a síntese de cDNA, do gene alvo pré-amplificação e qPCR, como descrito anteriormente 13-15.
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Representative Results
Classificando neurônios Fos-positivos e Fos-negativos de tecido dorsal striatum frescos e congelados de ratos individuais após as injeções de metanfetamina agudas.
O protocolo acima descrito foi utilizado para classificar os neurónios positivos e Fos-Fos-negativas a partir de um único rato estriado dorsal 90 minutos depois de uma injecção intraperitoneal de metanfetamina (5 mg / kg). ratos ingênuos em suas gaiolas foram utilizados como controle. Dorsal tecido estriado foi processado ou imediatamente após a sua recolha (tecido fresco) ou processado após ser congelado e armazenado em -80 ºC durante 1, 7 ou 21 dias. Os resultados a partir destes pontos de tempo de congelação não foram significativamente diferentes um do outro, de modo que os dados foram reunidos.
Para estabelecer as condições de triagem no instrumento, amostras de controlo (descrito acima) a partir de qualquer controlo casa gaiola ou methamphetaForam utilizados grupos de injeção de minas. Quando cada partícula ou evento nestas amostras passa através da célula de fluxo no citómetro, eles recebem um número de identificação que é associado com dispersão de luz e de fluorescência características do evento e registadas numa folha de cálculo. Os eventos dessa folha pode então ser organizada em scattergrams ou parcelas densidade para estas características (Figura 1). Eventos com características similares pode ser, em seguida, agrupadas ou "fechado" por diferentes pares de características para determinar as portas tais como as células que contêm, neurónios, ou neurónios Fos-positivos. Uma vez que as portas são determinados utilizando as amostras de controlo descritas acima, a amostra principal é injectado no citómetro de fluxo e classificados de acordo com estas portas. A população de células foi fechado a partir de todos os eventos (células e resíduos) com base na sua dispersão de luz frontal (FSC; uma indicação do tamanho da partícula) e dispersão de luz lateral (SSC; uma indicação de g da partícularanularity). Como mostrado no FSC SSC contra ponto trama (Figura 1A e 1B), a trama densidade de todos os eventos revela uma pequena população homogénea com um tamanho e granularidade semelhante, além de uma grande população heterogénea (Figura 1A e 1B). Uma pequena população homogénea que contém corpos celulares foi identificado e fechado como "células", com base no FSC e as características SSC de estudos anteriores 11,13-15 e rotulagem com DAPI. Uma percentagem ligeiramente mais elevado de células foram obtidas a partir de tecido congelado (2,6%) do que a partir de tecido fresco (1,9%). A grande população heterogênea é principalmente detritos, presumivelmente de dendrites e processos axonal.
Em seguida, as células individuais a partir do portão "Células" foram identificadas com base no seu tamanho, o qual foi indicado pela largura do sinal FSC para cada evento sobre o eixo x. Eventos que eram maiores do que as células isoladas foram considerados agregados celulares e excluído do "gate única célula. Todos os passos de análise subsequentes foram conduzidas dentro desta" portão de uma única célula "(Figura 1C e 1D). A maioria desta população de células único (> 92%) foi positiva para coloração com DAPI (dados não mostrando).
Em primeiro lugar, os neurónios foram identificados com base na intensidade de fluorescência PE que indicado NeuN-imunorreactividade (Figura 1E e 1F). Neurônios composta de aproximadamente 24% de todos os eventos do portão "célula única" para o tecido fresco e 38% para o tecido congelado. Quase todos os eventos neste gate "Neuron" (98% no tecido fresco e 99% em tecido congelado) foram positivos para DAPI coloração de DNA nos núcleos celulares (Figura 1G e 1H). Os restantes eventos DAPI marcados no portão de uma única célula são NeuN-negativas e incluem glia, oligodendrócitos e microglia, como confirmado por qPCR na Figura 3.
ove_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Em seguida, os neurônios foram classificados como neurônios Fos-positivo ou Fos-negativo com base na sua 647 sinal de fluorescência Alexa Fluor (Fos-imunorreatividade) Ao contrário de marcadores do tipo celular, Fos. os níveis de expressão em neurônios aumenta gradualmente devido a diferentes níveis de atividade neural e curso de tempo. Assim, não haverá um limite clara entre Fos-positiva em relação neurônios Fos-negativos. na primeira etapa (usado apenas para off-line analisa a calcular as percentagens de neurónios Fos-positivo), que definido o limiar para os neurónios Fos-positivas com base na fluorescência máxima Alexa-647 (para FOS) a partir da população NeuN-negativa nos ratos de controlo casa gaiola naive. neurónios Fos-positivos são indicados os quadrados azuis de diferentes condições experimentais na Figura 2 em ambos os tecidos frescos e congelados, os percentuais Fos-positivo neurônios de ratos injetados com metanfetamina. (1,9-2,2%, Figura 2C e 2D) foi duas vezes compared a ratos casa gaiola (0,7-0,8%, Figura 2A e 2B).Confirmação de genes específicos do tipo de células a partir de células FACS classificados usando gene alvo pré-amplificação e RT-PCR.
No segundo passo, para assegurar a classificação de apenas os neurónios Fos-positivas a partir da amostra principal por ARNm subsequente analisa e reduzindo a inclusão de células Fos-negativas, o limiar de fluorescência Alexa-647 foi elevado de modo a que somente os dois terços superiores da Fos eventos -positivas os quadrados azuis foram ordenados e recolhidos. Este limiar tem, pelo menos, 10 vezes mais elevada de fluorescência (maior expressão de Fos por célula) do que o limite usado para calcular a percentagem acima dos neurónios Fos-positivas nas amostras. Quatro populações de células foram classificadas a partir de uma única amostra de tecido, incluindo NeuN-negativos + Fos-negativa (~ 5.000 eventos), NeuN-negativos + Fos-positivo (variou de 25 - 83 eventos), NeuN-positivo + Fos-negative (~ 5.000 eventos) e NeuN-positivo + Fos-positivo (variou 44 - 133 eventos para o grupo-base, 185 - 450 eventos para o grupo de metanfetamina). Em primeiro lugar, a expressão de genes específicos do tipo de célula em NeuN positivos (incluindo tanto Fos-positiva e Fos-negativo) população e NeuN-negativa (incluindo tanto Fos-positiva e Fos-negativo) foi confirmada (Figura 3). GAPDH estava usado como gene de referência / serviço de limpeza, com base nos resultados do nosso estudo anterior 13. Para controlar a diferentes níveis de RNA na amostra e o cDNA nas reacções de PCR, reacções de qPCR duplex foram realizadas utilizando iniciadores para o gene alvo e o ADNc de GAPDH. Os valores Ct para o gene de manutenção GAPDH foram mantidas entre 15 e 31 para medições precisas. Para ambos os tecidos frescos e congelados, os níveis de ARNm NeuN foram significativamente maior (cerca de 8 vezes) na população NeuN positivos do que na população NeuN-negativo (p <0,05; figura 3A GFAP (marcador de células da glia; Figura 3B) e Oligo2 (marcador de células de oligodendrócitos; Figura 3C) os níveis de ARNm foi maior na população NeuN-negativas do que na população NeuN-positivo (p <0,05 ). Observou-se os níveis de mRNA na população NeuN-negativa, mas isto não foi estatisticamente significativo, uma tendência similar de maior Iba1 (Figura 3D marcador de células da microglia). Algumas amostras continham níveis extremamente baixos de ARNm particulares que não podia ser medido com precisão num tipo particular de célula (por exemplo, mRNA GFAP em neurónios NeuN-rotulados). Os valores máximos de Ct foram definidos como 35 a eliminar valores que eram demasiado baixa para ser detectada com precisão. Os valores mais elevados de Ct excedeu o limite de confiança em nossos ensaios qPCR.
A expressão de ARNm foi Fosexaminadas na população neuronal NeuN positivos a partir de ratos que receberam uma única injecção de metanfetamina (Figura 4). Para ambos os tecidos frescos e congelados, os níveis de ARNm Fos foram maiores nos neurónios Fos-positivos do que nos neurónios Fos-negativos (p <0,05). Além disso, enquanto que houve um aumento de 3 vezes de ARNm em neurónios Fos Fos-positivos a partir do tecido fresco, um aumento de 11 vezes de ARNm em neurónios Fos Fos-positivos a partir do tecido congelado foi detectado. Tomados em conjunto, estes resultados confirmam a identidade de ARNm dos neurónios Fos-positivos, neurónios Fos-negativas e a população não-neuronal de ambos os tecidos frescos e congelados. Além disso, genes específicos do tipo de célula e outros genes de interesse também pode ser analisado a partir de células classificadas sob duas condições frescos e congelados.
Figura 1. Supressão de DisCélulas ciada e rotulado de fresco e congelado Rat Dorsal corpo estriado. O portão "células" foi determinada pelo frente e propriedades de dispersão lateral (AD) e confirmados por marcação positiva com coloração DAPI nuclear (GH). O portão 'neurônios' dentro da população "células" foi determinada por fluorescência para NeuN (PE; EF). (A - B) portão celular: gráfico linear de todos os eventos, com base na sua dispersão para a frente (X-eixo, o tamanho da célula) e dispersão lateral (eixo dos Y, granularidade). (C - D) células única porta: Lote Linear da altura para a frente de dispersão (eixo Y) e largura (eixo X) no âmbito do portão de células mostrado na AB. (E - F) Neuron portão: Lote logarítmica de imunofluorescência para NeuN PE-rotulados (eixo Y) dentro do portão de células individuais mostrado na CD revela neurônios no cluster superior de eventos e células não-neuronais no cluster menor. (L H) Núcleos coloração: Lote logarítmica de fluorescência para núcleos DAPI-marcados (eixo Y), dentro da porta da célula neuronal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Supressão de neurônios Fos-positivos e Fos-negativos de fresco e congelado Rat Dorsal Estriado Baseado em dupla rotulagem para NeuN e Fos. O striatum dorsal fresco e congelado de ratos (tirada diretamente de sua gaiola ou 90 min após uma única injecção intraperitoneal de metanfetamina) foram dissociadas e marcadas com os anticorpos conjugados directamente contra NeuN e Fos e classificados usando uma máquina de FACS. Triagem foi baseado em ficoeritrina (PE) marcado com NeuN imunofluorescência (eixo X) e Alexa 647-rotulados immunofluo Fosrescência (eixo Y). Fos-positivos (pontos azuis) e Fos-negativa (pontos vermelhos) neurônios estavam localizados nos quadrantes direito superior e inferior, respectivamente. Os gráficos de pontos mostram células NeuN-positivo (neurônios) e células NeuN-negativos (pontos cinzentos); os quadrados azuis indicam neurônios com acima limiar de expressão de Fos. (A - B) grupo Home: ratos ingênuos tiradas diretamente de suas gaiolas. (C - D) Grupo de Metanfetamina: ratos que receberam injecções únicas de metanfetamina. Os limiares para os neurônios Fos-positivos foram selecionados para ser um pouco acima máxima Alexa-647 de fluorescência (Fos-IR) observado para células NeuN-negativos no grupo de controle gaiola. Enquanto 0,7-0,8% de todos os neurônios são Fos-positivas no grupo de casa, 1,9-2,2% de todos os neurônios são Fos-positivas no grupo de metanfetamina.
Figura 3. Célula tipo expressão de genes específicos em células de fresco e congelado Rat Dorsal Estriado FACS-ordenadas. neurônios NeuN-positivo (Fos-positivos e Fos-negativas) e NeuN-negativos (Fos-positivos e Fos-negativos) foram classificadas utilizando o protocolo descrito e os níveis de expressão de mRNA de genes específicos do tipo de células foram usadas para confirmar a separação de células. (a) NeuN é um marcador para as células neuronais. (B) GFAP é um marcador para células gliais. (C) Oligo2 é um marcador para células de oligodendrócitos. (D) Iba1 é um marcador para as células microgliais. Para ARNm NeuN, os dados são apresentados como média ± SEM de valores de vezes em relação aos níveis de expressão em células NeuN-negativas a partir de tecido fresco (n = 9 - 14). Para GFAP (n = 6-12), Oligo2 (n = 9-11) e Iba1 (n = 5-8) de ARNm, os dados são apresentados como média ± SEM de valores de vezes em relação aos níveis de expressão em NeuCélulas N-positivos do tecido fresco. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os níveis de mRNA Fos nos neurônios FACS-ordenadas de frescos ou congelados Rat Dorsal Estriado após neurônios Metanfetamina Injection. Fos-positivos e Fos-negativos foram classificadas conforme descrito no protocolo acima e níveis de mRNA de Fos foi confirmada. Os dados são apresentados como média ± SEM de valores de vezes em relação aos níveis de expressão em neurónios Fos-negativos em relação ao tecido fresco (n = 3 - 4).
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Discussion
FACS pode ser usado para classificar os neurónios e outro tipo de células a partir de qualquer tecido cerebral adulto fresca ou congelada. Como mencionado na introdução, a capacidade de usar tecido congelado permite uma utilização óptima das amostras de animais que tenham sido submetidos a procedimentos comportamentais complexas e prolongadas, como a auto-administração e de recaída estudos em pesquisa vício. Estes procedimentos comportamentais geralmente leva 1-2 horas ou mais tempo, e necessitam de todos os animais (10 - total de 20) ser testadas no mesmo dia 13,18. É preciso ~ 4 horas para processar 4 amostras de tecido do cérebro recém-dissecados, que inclui dissecção cérebro, dissociação celular, permeabilização e imunomarcação. Após o processamento, classificação de cada amostra por FACS leva entre 20 - 30 min. O passo final do aquecimento das células separadas no tampão de lise requer mais 30 min. No total, ~ 7 horas são necessárias de dissecção cérebro para a etapa de solução de células-lise contendo RNA final. No entanto, é agora possível congelar toda brains ou recém-dissecados regiões do cérebro imediatamente após o teste, e processá-los mais tarde. Isso simplifica muito teste e permite várias áreas do cérebro a ser classificadas em um dia diferente. Congelando o tecido antes da FACS também pode melhorar os resultados. Mais neurónios NeuN positivos são obtidos a partir de amostras de tecido congelado. Isso pode ser explicado em parte pelo aumento da NeuN-rotulagem, devido à ruptura das membranas celulares durante o congelamento e descongelamento posterior, o que aumentaria o acesso anticorpos para proteínas intracelulares, tais como NeuN e Fos. Efeitos semelhantes têm sido observados com fibroblastos, células epiteliais e células HeLa 19.
O rendimento de células e os neurónios podem ser maximizado utilizando os seguintes passos. Durante a dissecção do tecido, remover maior parte da matéria branca (corpo caloso e a comissura anterior para o estriado dorsal e nucleus accumbens, respectivamente). Isso evita que o tecido de aderir às pontas de plástico e pipetas de vidro no ste subsequenteps. Use Tampão A (ver especificação na tabela de materiais e reagentes) para manter o tecido dissecado coberto. Isto melhora a qualidade de células durante a picagem do tecido com a lâmina de barbear (passo 2.5). O conjunto extra de 3 etapas de trituração com a pipeta menor de vidro (passo 3.9) e subsequente filtração com um segundo conjunto de filtros celulares (Passo 5) dobra o rendimento de células e neurônios. Reutilizar os filtros celulares vai entupir os filtros e rendimento celular inferior. Seja gentil com as células quando ressuspensão das pelotas e durante a trituração. O uso de um moderadamente grande ponta da pipeta durante estas medidas irão reduzir os danos celulares devido à tensão de cisalhamento. observar cuidadosamente o sedimento ao remover sobrenadante após permeabilização com etanol (passo 4.4). O sedimento é menos compacto e pode ser distribuída ao longo da parede do tubo de microcentrífuga. Cálculos aproximados sugerem que o rendimento de neurónios Fos-positivos é de aproximadamente 10% do número inicial na amostra de tecido do corpo estriado dissecado. O protocolo atual pode ser modificado para atender outros objetivos experimentais. No protocolo atual, o tecido foi recolhido 90 min após as injeções de metanfetamina, porque expressão de Fos atinge níveis máximos neste momento, que é crucial para triagem eficiente dos neurônios Fos-expressam. No entanto, o tecido pode ser recolhida em qualquer ponto de tempo para FACS, dependendo do objectivo específico da experiência. Para o armazenamento inicial amostra de tecido, que foram utilizadas com sucesso tecido dissecado de fresco, após a dissecação de tecidos congelados, ou tecido congelado dissecado a partir de cérebro inteiro congelado para isolar neurónios que expressam-Fos usando FACS seguido de análise da expressão do gene qPCR. Para a fixação e permeabilização, a duração e a temperatura neste protocolo (4 ° C durante 15 min) foi optimizado para permeabilizar ambas as membranas citoplasmática e nuclear, bem como para fixar o tecido. As variações na duração e / ou a temperatura pode alterar os resultados finais. Outras soluções, tais como fixação paraformaldehyde e detergentes não iónicos, tais como saponina, que têm trabalhado para neurônios embrionários e pós-natal 20, também pode funcionar para os neurônios do cérebro adulto. Além disso, os grânulos de remoção da mielina pode ser utilizado como uma modificação do protocolo de corrente como mostrado recentemente por FACS a partir de tecido cerebral 21.
O protocolo atual tem duas limitações importantes a considerar. Em primeiro lugar, este protocolo não é adequado para a detecção de marcadores de fenótipo das células que são expressas principalmente em sinapses (por exemplo, receptores, dopamina ou glutamato) porque estes processos celulares são removidos dos corpos celulares durante os passos de trituração e de dissociação. Uma segunda limitação é possível que os comprimentos de ARN obtidos a partir de células FACS-ordenadas podem não ser suficientes para todos os métodos de análise de ARN. números de integridade do RNA (NIR) para o ARN obtido a partir de células são separadas por FACS entre 2,5- 3,5, o que corresponde a mais curtos comprimentos médios de ARN. Aqui, o tamanho de ARN mais curta foi compensado porusando amplicons qPCR relativamente curtos de 80-100 pb, conforme descrito anteriormente 13-15. Temos também utilizado esses RNAs de comprimento mais curto com sucesso para a análise microarray 11. No entanto, comprimentos curtos de RNA obtidos podem não ser adequados para todos os métodos de análise de RNA. Deve ser enfatizado que os iniciadores de PCR que especificamente orientadas junções exão-exão encontradas apenas em ARNm totalmente splicing no citosol foram usadas. Estes iniciadores não detectar ARN contendo intrão do núcleo. Além disso, nós já usou este protocolo com anticorpos e tecido cerebral fresco para detectar tirosina hidroxilase nos receptores de dopamina citosol e D1 na membrana celular 10. A detecção destes marcadores de membrana e citosólicos de células indicou que o procedimento de dissociação produz células intactas, em grande parte, e não simplesmente núcleos.
No geral, o isolamento FACS de neurônios a partir de amostras congeladas abre outras aplicações. Não houve diferença na classificação ou expre genession foram observados (dados não mostrados) quando as amostras foram armazenadas 3 dias ou 3 semanas a -80 ºC. Três semanas é um tempo razoável para classificar todas as amostras de uma experiência específica (20 - 40 amostras) e isolar RNA para a expressão do gene. ARN utilizáveis também foi obtido a partir de tecido cerebral armazenado durante 6 meses à temperatura de -80 ° C (dados não apresentados aqui). Assim, este protocolo poderia ser útil para o isolamento de FACS de amostras de cérebro humano post-mortem congelados que foram armazenados durante vários meses ou mesmo anos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
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