Summary
Здесь мы приводим протокол Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) для изучения молекулярных изменений в Фос-экспрессирующих нейронные ансамбли из свежих и замороженных тканей мозга. Использование замороженной ткани позволяет FACS изоляцию многих областей мозга более нескольких сеансов, чтобы максимально использовать ценные предметы животного происхождения.
Abstract
Изучение нейропластики и молекулярных изменений в изученных поведения переходит из исследования целых регионов мозга к изучению конкретных наборов единично активированных нейронов, называемых нейронных ансамблей, которые опосредуют ученые ассоциации. Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) недавно была оптимизирована для ткани взрослого мозга крысы и позволил выделение активированных нейронов с использованием антител против нейронального маркера NeuN и белка Fos, маркер сильно активированных нейронов. До сих пор, Фос-экспрессирующие нейроны и другие типы клеток были выделены из свежей ткани, что повлекло за собой долгие дни обработки и позволили очень ограниченное количество образцов мозга, которые будут оценены после длительных и сложных поведенческих процедур. Здесь мы обнаружили , что выходы Fos-экспрессирующих нейронов и мРНК Fos из спинного стриатума были похожи между свеже рассеченной ткани и ткани замораживали при -80 ° С в течение 3 - 21 дней. Кроме того, мы подтвердили фенотипиз NeuN-положительных , так и к NeuN-отрицательных отсортированных клеток путем оценки экспрессии гена нейрональной (NeuN), астроцитов (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) и microgial (Iba1) маркеров, что свидетельствует о том , что замороженные ткани также могут быть использованы для FACS изоляции глиальные типов клеток. В целом, можно собирать, анализировать и замораживать ткани мозга для нескольких сеансов FACS. Это увеличивает объем данных, полученных от ценных предметов животного происхождения, которые часто подверглись длинные и сложные поведенческие процедуры.
Introduction
Во время обучения, животные образуют ассоциации между комплексными наборами весьма специфических стимулов. Эта информация с высокой разрешающей способностью, как полагают, кодируемый изменениями в конкретных моделей единично нейронов, называемых нейронными ансамблями. Нейронные ансамбли недавно были идентифицированы с помощью индукции немедленно ранних генов (IEGs) , таких как Fos, дуга, и Zif268 и их белковых продуктов в нейронах , которые были сильно активируются во время поведения или воздействия метки. Fos-экспрессирующих нейронов , в частности , было показано, играют роль в причинно - следственные связи и кием по конкретным извлеченные модели поведения 1-4. Таким образом, уникальные молекулярные neuroadaptations в этих активированных Fos-экспрессирующих нейронов являются главными кандидатами для нейронных механизмов , которые кодируют узнали ассоциации , сформированные в процессе обучения и нормальных ненормальным обучения расстройств, таких как наркомания и посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) 5.
FluoreScence Активированный сортировки клеток (FACS) недавно позволил анализ уникальных молекулярных neuroadaptations в пределах Fos-экспрессирующих нейронов. Проточная цитометрия и сортировка клеток были разработаны в 1960 - е годы 6,7 охарактеризовать и выделения клеток в соответствии с их светорассеивающих и иммунофлуоресцентных характеристиками, и уже давно используются в области иммунологии и исследования рака. Однако проточной цитометрии и FACS требует диссоциированных отдельных клеток, которые трудно получить из ткани мозга взрослого. FACS впервые был использован для выделения и анализа зеленого флуоресцентного белка (GFP) -expressing нейронов стриатума от трансгенных мышей , которые не требуют маркировки антител 8,9. Мы разработали антитела на основе метода FACS 10 для выделения и оценки молекулярных изменений в Фос-экспрессирующих нейронов , активированные лекарственного средства и / или репликами у диких животных типа 11-15. В этом методе, нейроны помечены антителом против общего нейронального маркера NeuN, в то время как сильно активируются нейронымаркированы с антителом против FOS. Хотя наш первоначальный метод требовал объединения до 10 крыс на образец для свежей ткани, последующие модификации протокола позволил FACS изоляцию Фос-выражающей нейронов и количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) анализа дискретных областей мозга от одной крысы 13-15 , В целом, уникальные молекулярные изменения были найдены в Фос-экспрессирующие нейроны активируются во время различных контекстно- и биток активированные поведения в наркомании исследований 12,14,15.
Одна из основных проблем с материально-технического выполнения FACS на свежей ткани является то, что она занимает целый день, чтобы отделить ткани и процесс путем FACS. Кроме того, лишь около четырех образцов могут быть обработаны в день. Как правило, это означает, что только одна область мозга может быть оценена из каждого мозга, а остальные участки мозга должны быть отброшены. Это является серьезной проблемой для низкой пропускной способности поведенческих процедур, таких как самостоятельного введения и исчезновения Traiнин, что требует хирургического вмешательства и много недель интенсивных тренировок. Кроме того, длинные и сложные поведенческие процедуры на день тестирования затрудняет выполнение FACS в тот же день. Было бы существенным преимуществом, чтобы иметь возможность заморозить мозг у животных сразу же после тестирования поведения, а затем изолировать Фос-экспрессирующие нейроны от одной или нескольких областях головного мозга в разное время по своему выбору следователей.
Здесь показано, что наш протокол FACS могут быть использованы для выделения Фос-экспрессирующие нейроны (и другие типы клеток) из свежих и замороженных тканей мозга. В качестве примера, мы выделили Fos-экспрессирующих нейронов крысы из стриатума после острого метамфетамина инъекций и от наивных крыс без инъекций (контрольной группы). Тем не менее, этот протокол FACS может быть использован после любого поведенческого или фармакологического лечения. Дальнейший анализ КПЦР наших образцов показали, что экспрессия гена из этих типов клеток могут быть оценены с СимиЭффективность лар из свежих и замороженных тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) из Национальных институтов здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных 16.
Примечание: Все шаги ниже Применение трубок низких связывающих центрифуг, которые держали на льду, если не указано иное.
1. Подготовка к ткани коллекции
- Установите центрифугу до 4 о С.
- Огонь польский набор из трех стекла пипетки Пастера с убывающими диаметром приблизительно 1,3, 0,8 и 0,4 мм для каждого образца.
- Готовят меченые 1,7 мл пробирки, содержащие-1 мл холодного буфера А и держать пробирки на лед.
- Подготовьте лоток льда, содержащий мозг нарезки матрицы, шпатели и стеклянные пластины (или перевернутую стеклянную чашку Петри), на котором для выполнения рассечение. Предварительно холодок два или более бритвенных лезвий на стеклянные пластины и ткани используют бумагу, чтобы высушить все инструменты, которые касаются твопрос.
- Растаяйте ферментного раствора при комнатной температуре (КТ) в течение 30 мин до сбора ткани.
2. Сбор и тканей Вскрытие
- Инициировать поведенческий или медикаментозного лечения 90 мин до сбора ткани.
Примечание: Для получения результатов, показанных здесь, острые внутрибрюшинное введение 5 мг / кг метамфетамина на крыс в новой среде (тест состояния), и наивные крыс, содержащихся в их клетках (контрольное условие) были выполнены. - Обезболить крысы, поместив его в стеклянную банку с эксикаторным насыщенным изофлуран и обезглавить крысу 30 - 60 сек позже с помощью гильотины.
Используйте ножницы, чтобы удалить кожу и мышцы от головы и подвергать черепа. Используйте кусачек, чтобы разрезать череп и открыть затылочного отверстия и снимите заднюю часть черепа. Используйте кусачек, чтобы разрезать вдоль верхнего края черепа подвергать мозг. Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг. Используйте маленькую лопаточку, чтобы мягко выкопать подd поднять мозг. Поднимите мозг и перерезать нервы , пока мозг не освободится 17. - Рассеките тканей с помощью лезвия бритвы.
Примечание: Получение образцов ткани, используя один из следующих способов: (2.3.1) свеже рассеченной ткани; (2.3.2) замороженной ткани после рассечения; или (2.3.3) замороженной ткани рассекают из замороженных всего мозга. Держите матрицу мозга нарезка, бритвенные лезвия и стеклянная пластина сухой по всей рассечение и мясорубки процессы как сгущенное воды может привести к гипотоническому лизису клеток. Используйте увеличительные стекла для обеспечения точного рассечение.- Для свеже рассеченной ткани, поместите Свежеотжатый мозг в матрицу мозга нарезка (в головном мозге крысы-образной металлической формы с пазами для бритвенных лезвий с интервалом в 1 мм), который был охлажденным на льду. Вставьте два или более предварительно охлажденные лезвия, в пазы, чтобы вырезать корональные срезы, которые содержат область мозга (ы) интересов. Поместите отрезанный кусочек на охлажденную стеклянную пластину.
Примечание: Рассеките Regio мозганс процентов по охлажденный стеклянной пластине. - Для замороженных тканей после рассечения, рассекают область мозга (ы) интереса из кусочков Свежеотжатый мозга, аналогично тому, как описано выше в разделе 2.3.1. Поместите расчлененный ткани в микропробирок и быстро замораживать ткани, погружая микропробирок в -40 ºC изопентана в течение 20 сек. Держите расчлененный ткани замороженные во все времена в -80 ºC морозильнике до дальнейшей обработки.
- Для замороженной ткани, немедленно заморозить Свежеотжатый мозг в -40 ºC изопентана и хранить в закрытой упаковке при температуре -80 ° С до 6 месяцев.
- В день диссекции, поместите замороженный мозг в криостат установлен на уровне около -20 ° С (не теплее, чем -18 ° C) в течение приблизительно 2 ч, чтобы уравновесить температуру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозги можно легко разрезать при этой температуре, в то время как более низкие температуры делают мозг слишком хрупким, чтобы быть разрезан безопасно. - Используйте лезвия бритвы вырезать 1 - 2 мм корональных ломтикизамороженные мозги в криостат. Используйте притупляются от 12 до 16 калибра иглы, чтобы получить пунши ткани из этих срезов в условиях замораживания. Хранить расчлененный ткани замораживали в любое время до тех пор дальнейшей обработки.
- В день диссекции, поместите замороженный мозг в криостат установлен на уровне около -20 ° С (не теплее, чем -18 ° C) в течение приблизительно 2 ч, чтобы уравновесить температуру.
- Для свеже рассеченной ткани, поместите Свежеотжатый мозг в матрицу мозга нарезка (в головном мозге крысы-образной металлической формы с пазами для бритвенных лезвий с интервалом в 1 мм), который был охлажденным на льду. Вставьте два или более предварительно охлажденные лезвия, в пазы, чтобы вырезать корональные срезы, которые содержат область мозга (ы) интересов. Поместите отрезанный кусочек на охлажденную стеклянную пластину.
- Добавьте 1 - 2 капли буфера А, чтобы покрыть расчлененный ткани, прежде чем мясорубки. Удалить большую часть белого вещества из ткани с использованием двух бритвенных лезвий, чтобы предотвратить потерю нейронов в течение остальной части процесса растиранием. Если, начиная с замороженной ткани, а затем позволить ткани оттаивать на стеклянной пластине холодной в течение не более 1 мин перед применением буфера для раствора.
- Фарш ткани 100 раз в каждом ортогональном направлении с бритвенным лезвием на охлажденный стеклянную пластину. Держа лезвие бритвы по вертикали на стеклянной пластине при измельчении.
Примечание: Тщательное мясорубки имеет решающее значение для всех этапов протокола. - Используйте лезвия бритвы для передачи измельченной ткани в микроцентрифужных пробирки, содержащие 1 мл холодного буфера А. Переверните пробирку 3 - 5 раз К.Э.ер все измельченной ткани в растворе.
3. Cell диссоциация
Примечание: Используйте нежный конец над концом смешивания для всех следующих шагов. Не используйте вихревой смеситель и избежать воздушных пузырей, которые вызывают повреждение клеток.
- Центрифуга пробирки с образцами при 110 х г в течение 2 мин при 4 ° С. Удалите супернатант. Медленно добавляют 1 мл холодной свежей талой ферментного раствора (содержащего смесь протеолитических ферментов) вниз по внутренней стенке микропробирок. Сразу высосать весь осадок и осторожно пипеткой вверх и вниз только 4 раза с умеренно большого диаметра наконечника пипетки, чтобы разогнать фарша лепешку ткани.
- Обратить микропробирки немедленно , чтобы предотвратить осадок от прилипания к нижней и инкубировать образцов с конца над уровнем конца перемешивания в течение 30 мин при температуре 4 о С.
- После расщепления ферментативный ткани, центрифуга пробирки при 960 х г в течение 2 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и добавить 0,6 мл холодного буфера А. Immediatelу после добавления буфера А, используют один и тот же наконечник пипетки, чтобы рассеять осадок путем подлизываться весь осадок и осторожно пипеткой вверх и вниз 5 раз.
- Механически растирают переваренной ткани и собирают в 15 мл пробирки, используя следующие шаги. Для каждого образца используйте отдельный набор из 3 пожарно-полированного стекла Пастера пипеток с нисходящим диаметром приблизительно 1,3, 0,8 и 0,4 мм, прикрепленных к латексных луковиц.
- Аккуратно растирать каждый образец в 10 раз со стеклянной пипеткой 1,3 мм. Пусть образец оседать в течение 2 мин на льду (мусора и недиссоциированных клетки будут оседать на дно). Соберите супернатант (~ 0,6 мл) и трансфер в 15 мл коническую трубку (трубка # 1).
- Добавить 0,6 мл буферного раствора Раствор к оставшемуся осадку. Растирают образца 10 раз со стеклянной пипеткой 0,8 мм. Пусть образец оседать в течение 2 мин на льду. Соберите супернатант (~ 0,6 мл) и трансфер в те же 15 мл коническую трубку # 1.
- Добавить 0,6 мл буферного раствора Раствор для оставшейся Pelleт. Растирают образца 10 раз со стеклянной пипеткой 0,4 мм. Пусть образец оседать в течение 2 мин на льду. Соберите супернатант (~ 0,6 мл, не касаясь гранул с не-диссоциированных клеток) и передать те же 15 коническую трубку # 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пипетку диаметром 0,4 мм в трубке № 1 для следующих шагов тритурационного. - Повторите шаг 3.4.3 еще три раза с использованием наименьшего стеклянной пипетки (~ 0,4 мм в диаметре) и собирают супернатант в отдельную 15 мл коническую трубку (трубка # 2).
- Растирают собранные клеточные суспензии в пробирки # 1 и # 2 в течение более 10 раз с использованием 0,4 мм стеклянной пипетки и держать на льду.
4. Cell Фиксирование и пермеабилизирующего
- Подготовьте 4 микропробирки на образец (две микропробирки для клеток из трубы № 1 и два для клеток из трубы № 2) путем добавления 800 мкл 100% -ного холодного этанола (хранили при -20 ° С перед использованием) в каждую пробирку и держать их на льду , Примечание: Конечный этанолконцентрация будет составлять 50%.
- Пипетка ~ 800 мкл суспензии клеток (из пробирки # 1 и # 2 трубки) в каждую из 4-х пробирки, содержащие холодным этанолом и инвертировать трубы, чтобы смешивать образцы.
- Инкубируйте пробирки на льду в течение 15 мин, переворачивая пробирки каждые 5 мин.
- После фиксации / пермеабилизации, центрифугировать пробирки при 1,700 мкг в течение 4 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. Оставьте 50 мкл раствора, чтобы предотвратить потерю клеток.
Примечание: Гранулы на данном этапе являются белыми и пряника меньше к стенке трубок, чем раньше пермеабилизации. Поэтому удалите супернатант осторожно прикасаясь к стенке микропробирок, где нет гранул и составлять супернатант медленно с помощью микропипетки.
5. Сотовый фильтрация
- Повторное приостановить гранул из стадии 4.4 с холодным PBS следующим образом:
- Добавить 550 мкл холодного PBS к одной из двух микропробирок поступающих из трубки # 1, и используют умеренно большого диаметра пиPette наконечник осторожно пипеткой клеточной суспензии вверх и вниз 5 раз. Повторите то же самое для одного микропробирки исходя из трубы № 2.
- Для получения клеток из пробирки # 1, с использованием той же пипетки перенос первой суспензии клеток на второй таблеткой. Ресуспендируют вторую таблетку, осторожно пипеткой объединенную клеточную суспензию вверх и вниз 5 раз.
- Для получения клеток из пробирки # 2, ресуспендируют и объединить гранул (то есть, третий и четвертый микропробирок) , как описано в 5.1.2.
- Фильтр двух клеточных суспензий со стадий 5.1.2 и 5.1.3 отдельно с использованием двух различных пар сотовых сетчатых (100 мкм и размером пор 40 мкм) следующим образом:
- Предварительное смачивание каждый сетчатый фильтр клеток путем добавления PBS к внутренней стороне сетчатого фильтра. С помощью пипетки, чтобы удалить избыток PBS с внешней стороны сетчатого фильтра.
- Пипетировать клеточной суспензии со стадии 5.1.2 равномерно на первый сетчатый фильтр ячейки с 100 мкм размером пор. Соберите проточный в 50 мл пробирку на льду. Используйте пиPette собрать проточных прикрепленный на внешней стороне нижней части ячейки фильтра.
- Используйте тот же пипетки для передачи Проточный из ячейки фильтра 100 мкм до 40 ячейки фильтра мкм. Собрать этот проточный в другой 50 мл пробирку на льду. При передаче потока через из мкм ячейки фильтра 40, перейти к новым наконечниками пипеток, чтобы избежать загрязнения от мкм ячейки фильтра 100.
- Повторите эти действия для клеточной суспензии со стадии 5.1.3, используя новый набор фильтров.
- Объединение двух проточных из каждого образца для конечного объема приблизительно 1 мл на образце.
6. Инкубация с антителами
Примечание: Используйте маленькие аликвоты клеток мозга суспензий подготовить несколько контрольных образцов для установки соответствующего потока цитометра настройки перед запуском основного образца. Для каждой маркировки антител, готовят контрольные образцы, которые не включают антитела, только РЭcondary антитела (или другие метки флуоресцентный), а затем обе первичные и вторичные антитела (или другие флуоресцентные метки). Используйте эти элементы управления, чтобы установить ворота, отделяющие специфические по сравнению с неспецифической маркировки в цитометр потока. Когда это возможно, использовать флуорохромии, которые не требуют компенсации. Увеличение конечного объема контрольных образцов стробирования до конечного объема 700 мкл добавлением PBS перед добавлением первичных антител.
- Подготовить светорассеивающих и контрольного образца DAPI путем переноса 100 мкл пробы отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирок. Добавить 600 мкл холодного PBS с 1 мкг / мл DAPI для ядер окрашивания. Инкубировать в течение 10 мин с конца над уровнем конца перемешивания, и промывка (как указано в пунктах 6.4.2 до 6.4.5) перед прохождением через проточный цитометр.
Примечание: В этом примере используется только для установки клеток / ядер ворот до сортировки оставшихся клеток в машине FACS. - Подготовка единичных образцов immunolabeled управления путем передачи 100 & #181; л отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирки. Добавьте 600 мкл PBS с холодной одного антитела (например, антитела к NeuN). Добавьте 600 мкл холодного PBS в микропробирки с другим антителом (например, Фос антитело). Добавьте соответствующее вторичное антитело, если оно не является прямым конъюгированные с первичным антителом.
Примечание: Эти образцы используются для определения напряжения соответствующих фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), а также для оценки перекрытия двух флуоресцентных сигналов, если это необходимо. Концентрация антител следует титровать для достижения наилучшего соотношения сигнал-шум во всех каналах. Перекрытие флуоресцентные сигналы также могут быть компенсированы с помощью внутренней калибровки различных флуоресцентных каналов в проточном цитометре. - Приготовьте двойную флуоресцентного меченных отрицательного контрольного образца путем переноса 100 мкл отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирки. Добавьте 600 мкл холодного PBS с одним только вторичными антителами или IgG с прямым конъюгированных с первичными антителами.
Примечание: ТхиКонтрольный образец s можно использовать каждый раз, когда до сортировки для определения фоновой флуоресценции для каждого флуорофора. - Подготовьте основной образец для сортировки.
- Передача 700 мкл отфильтрованных клеток в 1,7 мл микропробирок. Добавить 7 мкл (1: 100) первичного антитела, конъюгированного Fos непосредственно к Alexa Fluor 647 (анти-Фос-AF647) и 1,4 мкл (1: 500) первичного антитела, конъюгированного NeuN непосредственно к фикоэритрин (анти-NeuN-PE). Инкубируйте пробирки в течение 30 мин при 4 ° С с конца над уровнем конца перемешивания.
- В конце инкубации, добавьте 800 мкл холодного PBS в каждую микропробирок, в том числе основной выборки и контрольных образцов, и перемешать с помощью инверсии.
- Центрифуга Микропробирки при 1300 мкг в течение 3 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, оставляя 50 мкл надосадочной жидкости, чтобы предотвратить потерю клеток.
- Добавьте 1 мл холодного PBS к осадку и ресуспендирования клеток с помощью пипетки с умеренно большого диаметра наконечника.
- Центрифуга при 1300 х г в течение 3 мин при 4 ° С. Discard супернатант.
- Повторное приостановить осадок в 500 мкл холодного PBS (отрегулировать конечный объем в зависимости размер гранул).
- Передача и Суспензию фильтруют в круглодонную дно пробирки FACS с крышкой ячейки фильтра (40 мкм). Держите immunolabeled клетки на льду и сразу же выполнить FACS. Примечание: Для фильтрации, нажмите кончиком пипетки вертикально на сетчатого колпачка и нажмите клеточной суспензии через него.
- Установить проточный цитометр ворот с использованием контрольных образцов.
- С помощью рассеивающего свет и контрольного образца DAPI для идентификации нейронную популяцию клеток от общего количества событий и клеточного мусора.
Примечание: Клеточные тела в этом препарате только 1 - 2% от общего числа событий (остальные мусор и сломанные клеточные процессы). На основе DAPI флуоресцентного сигнала (с указанием ядер) и рассеяния вперед (размер ячейки) можно обнаружить клеточные тела и ворота в обратном направлении на основе вперед и из стороны свойства рассеяния светаклетки (как показано на рисунке 1 , A, B). - Используйте отдельные образцы immunolabeled управления для определения параметров PMT напряжения, а также проанализировать перетекания излучения от одного конкретного флуорохромом в другой фильтр / канал (например, Alexa Fluor 488 / FITC или фикоэритрин). Если флуоресцентные сигналы перекрывают друг друга, устранить дублирование путем регулировки уровней компенсации вручную.
- Используйте двойную флуоресцентного меченных отрицательный контроль, чтобы установить порог для положительного населения.
Примечание: сигнал, поступающий из этого образца, как полагают, из-за автофлуоресценции и клетки основного образца, расположенного выше этого порога можно рассматривать как положительный. Как правило, пороговые параметры для сортировки являются более жесткими, и примерно в верхней 2/3 меченых клеток выше отрицательного контроля фактически сортируются.
- С помощью рассеивающего свет и контрольного образца DAPI для идентификации нейронную популяцию клеток от общего количества событий и клеточного мусора.
- Сортировать нейроны от основного образца FACS в 1,7 мл микропробирок. Собирают клетки в 50 мкл РНКИзвлечение буфера. После сортировки, вихревое и отцентрифугировать пробирку и перемешать подвеску с помощью пипетки вверх и вниз 10 раз, чтобы восстановить все отсортированные клетки от стенок трубы.
- Выдержите отсортированный клеточной суспензии при 42 ° С в течение 30 мин, чтобы гарантировать, что все клетки лизируют до экстракции РНК, а затем центрифуге при 2800 х г в течение 2 мин при 4 ° С.
- Передача супернатант к РНКазы свободной трубки для длительного хранения при температуре -80 ° С или сразу же обработать образец для выделения РНК, синтез кДНК гена - мишени, предварительной амплификации и кПЦР, как описано выше 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сортировка Fos-позитивных и Фос-отрицательные нейроны от свежих и замороженных спинной стриатуме ткани от отдельных крыс после острых метамфетамина инъекций.
Протокол, описанный выше, был использован для сортировки Фос-положительные, так и отрицательные Фос-нейроны от одиночной крысы спинной стриатуме через 90 мин после внутрибрюшинного введения метамфетамина (5 мг / кг). Наивные крыс в их клетки использовали в качестве контролей. Спинной стриатуме ткань была обработана либо сразу после сбора (свежей ткани) или обработанной после замораживали и хранили в -80 ° С в течение 1, 7 или 21 дней. Результаты этих замерзающих моменты времени существенно не отличались друг от друга, так что данные были собраны.
Чтобы установить условия сортировки на инструменте, контрольные образцы (описанные выше), либо из элемента управления домашней клетки или methamphetaбыли использованы группы шахтные впрыском. Когда каждая частица или событие в этих образцах проходит через проточную ячейку в цитометр, они дают идентификационный номер, связанный с по рассеянию света и флуоресценции характеристик мероприятия и записываются в электронную таблицу. События в этом листе могут быть организованы в скаттерграмм или участков плотности для этих характеристик (рисунок 1). События с аналогичными характеристиками, то можно сгруппировать или "закрытого" с помощью различных пар характеристик, чтобы определить ворота, такие как способы, содержащие клетки, нейроны, или Фос-позитивных нейронов. После того, как ворота определяются с использованием контрольных образцов, описанных выше, основной образец впрыскивается в проточном цитометре и сортируются в соответствии с этими воротами. Популяция клеток была закрытого типа из всех событий (клеток и мусора) на основе их прямого рассеяния света (FSC, указание размера частицы) и боковую светорассеяния (SSC; указание г частицыranularity). Как показано в сравнении с ЛПС SSC точка участка (рис 1А и 1В), плотность участок всех событий показывает небольшой гомогенной популяции с аналогичного размера и зернистости, в дополнение к большой гетерогенной популяции (рис 1А и 1В). Был идентифицирован и закрытого типа , как "Элементы", на основе FSC и SSC характеристик из предыдущих исследований 11,13-15 и маркировки с DAPI Небольшая однородная популяция , которая содержит клеточные тела. Несколько более высокий процент клеток получали из замороженной ткани (2,6%), чем из свежей ткани (1,9%). Большой гетерогенную популяцию в основном мусор, предположительно из дендритов и аксонов процессов.
Затем отдельные клетки из "клеток" ворота были идентифицированы на основании их размера, что указывало на ширину сигнала FSC для каждого события на оси абсцисс. События, которые были больше, чем отдельные клетки рассматривались клеточные агрегаты и исключены из "одни ворота клеток. Во всех последующих этапов анализа были проведены в рамках этой" ворота одноклеточ- "(Рисунок 1C и 1D). Большая часть этой одной популяции клеток (> 92%) был положительным для DAPI окрашивания (данные не показано).
Во- первых, были выявлены нейроны на основе их PE интенсивности флуоресценции , которые указывали NeuN-иммунореактивности (рис 1E и 1F). Нейроны составляли примерно 24% всех событий от ворот "Single Cell" для свежей ткани и 38% для замороженной ткани. Почти все события в этих воротах "Нейрон" (98% в свежей ткани и 99% в замороженной ткани) были положительными для DAPI окрашивания ДНК в ядрах клеток (рис 1G и 1H). Остальные DAPI меченные события в воротах одноклеточ- являются NeuN-отрицательными и включают в себя глии, олигодендроцитов и микроглии, как это было подтверждено кПЦР на рисунке 3.
ove_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Тогда нейроны были классифицированы как Фос-положительным или отрицательным Fos-Нейроны на основе их Alexa Fluor 647 сигнала флуоресценции (Фос-иммунореактивности) В отличие от маркеров клеточного типа, Фос. уровни экспрессии в нейронах постепенно увеличивается из-за различных уровней нейронной активности и течения времени. Следовательно, не будет четкий порог разрезом между Фос-положительной по сравнению с Фос-отрицательных нейронов. на первом этапе (используется только для офф-лайн анализов рассчитать процент Fos-позитивных нейронов), мы определили порог для Fos-позитивных нейронов на основе максимального Alexa-647 флуоресценции (для ФОС) из NeuN-отрицательной популяции в наивном контрольных крыс домашней клетки. Fos-позитивных нейронов показаны в синих квадратов из различных экспериментальных условиях на рисунке 2 в обоих свежих и замороженных тканей, процент Fos-позитивных нейронов от метамфетамина крыс , инъецированных. (1,9 - 2,2%, рис 2С и 2D) был в два раза соmpared к домашней клетки крыс (0,7 - 0,8%, рис 2А и 2В).Подтверждающие камерного типа специфические гены из FACS отсортированных клеток с использованием гена-мишени предварительно амплификации и RT-PCR.
На втором этапе, чтобы обеспечить сортировку только Фос-позитивных нейронов от основного образца для последующего мРНК анализа и уменьшения включения Фос-негативных клеток, порог флуоресценции Alexa-647 был поставлен таким образом, что только верхние две трети Fos -положительные события в синих квадратов были отсортированы и собраны. Этот порог имеет по крайней мере, в 10 раз выше флуоресценции (выше Фос экспрессии на клетку), чем порог, используемый выше, чтобы вычислить процент Фос-позитивных нейронов в образцах. Четыре популяции клеток были рассортированы из одного образца ткани, в том числе NeuN отрицательных результатов + FOS-отрицательные (~ 5000 событий), NeuN отрицательных результатов + Fos-положительных (варьировались 25 - 83 события), NeuN положительных результатов + Фос-негтельной (~ 5000 событий) и NeuN положительных результатов + Fos-положительных (в диапазоне 44 - 133 событий для домашней группы, 185 - 450 событий для группы метамфетамина). Во- первых, экспрессия специфических генов клеточного типа в NeuN-положительных ( в том числе и Fos-положительных и Фос-отрицательной) и NeuN-негативного населения ( в том числе и Fos-положительных и Фос-отрицательных) была подтверждена (Рисунок 3). GAPDH был используется в качестве гена ссылка / ведение домашнего хозяйства, основанные на результатах нашего предыдущего исследования 13. Для управления для различных уровней РНК в образце и кДНК в реакции ПЦР, дуплексные реакции КПЦР проводили с использованием праймеров , как для гена - мишени и GAPDH кДНК. Значения Ct для гена домашнего хозяйства GAPDH находились от 15 до 31 для точных измерений. Для получения свежих и замороженных тканей, уровни мРНК NeuN были значительно выше (примерно в 8 раз) в NeuN-положительного населения , чем в NeuN-отрицательной популяции (р <0,05; рис 3A GFAP (глиальных клеток маркер; фигура 3В) и Oligo2 (олигодендроцитов маркер; 3С) уровни мРНК были больше в NeuN-отрицательной популяции , чем в NeuN-позитивной популяции (р <0,05 ). Аналогичная тенденция более высокого Iba1 (микроглии клеток маркера; Рисунок 3D) уровни мРНК наблюдалась в NeuN-отрицательной популяции, но это не было статистически значимым. Некоторые образцы содержали очень низкие уровни определенных мРНК , которые не могут быть точно измерены в конкретный тип клеток (например, GFAP мРНК в NeuN-меченных нейронов). Максимальные значения Ct были определены как 35, чтобы исключить значения, которые были слишком малы, чтобы быть точно обнаружено. Более высокие значения Ct превышает предел достоверности в наших КПЦР анализов.
Экспрессия Fos мРНКисследовали в NeuN-позитивных нейронов населения от крыс, получавших однократную инъекцию метамфетамина (Рисунок 4). Для получения свежих и замороженных тканей, уровни мРНК Fos были больше в Fos-позитивных нейронов , чем в Фос-отрицательных нейронов (р <0,05). К тому же , в то время как было 3-кратное увеличение мРНК Fos в Фос-позитивных нейронов из свежей ткани, 11-кратное увеличение мРНК Fos в Фос-позитивных нейронов из замороженной ткани была обнаружена. Взятые вместе, эти результаты мРНК подтверждают идентичность Fos-позитивных нейронов, Фос-отрицательных нейронов и не-нейрональных населения из свежих и замороженных тканей. Кроме того, гены конкретного типа клеток и других представляющих интерес генов также могут быть проанализированы с отсортированных клеток в обоих свежих и замороженных условиях.
Рисунок 1. Gating Дисаsociated и меченые клетки из свежих и замороженных Rat спинной стриатуме. Калитка 'клеток определяли с помощью вперед и свойства бокового рассеяния (AD) и подтверждается положительными мечения DAPI окрашивания ядерной (GH). Ворота «нейронами» в популяции "клеток определяли с помощью флуоресценции для NeuN (PE; EF). (A - B) Сотовый ворота: Линейный сюжет всех событий, на основе их рассеяния вперед (оси Х, размер ячейки) и бокового рассеяния (Y-оси, зернистости). (C - D) Отдельные клетки ворота: Линейный участок высоты переднего рассеяния (Y-ось) и ширины (оси Х) в пределах ворот ячейки , показанной на AB. (Е - Е) Нейрон ворота: логарифмическом иммунофлюоресценции для РЕ-меченого NeuN (Y-ось) в пределах ворот одиночных клеток , показанного на компакт - диске показывает нейроны в верхнем ряду событий и не-нейрональных клеток в нижнем кластере. (G H) Ядра окрашивание: логарифмическом флуоресценции для DAPI-меченых ядер (Y-ось) в пределах нейронного клеток ворот. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Стробирование Fos-положительных и отрицательных Fos-Нейроны из свежих и замороженных Rat спинной стриатуме основанный на двойном Маркировки для NeuN и Фос. Свежее и замороженное спинной стриатуме у крыс (взяты непосредственно из их домашней клетки или 90 мин после однократного внутрибрюшинное введение метамфетамина) диссоциируют и помечены непосредственно конъюгированных антител против NeuN и Fos и отсортирован, используя машину FACS. Сортировка была основана на фикоэритрин (РЕ), меченным NeuN иммунофлюоресценции (ось Х) и Alexa 647-меченых Фос immunofluoценция (Y-ось). Фос-положительные (синие точки) и Фос-отрицательные (красные точки) нейроны расположены в верхнем и нижнем правом углу квадранта, соответственно. На точечные графики показывают NeuN-положительных клеток (нейронов) и NeuN-негативных клеток (серые точки); синие квадраты указывают нейроны с выражением выше порога Фос. (A - B) Домашняя группа: наивные крыс , взятые непосредственно из их клетки. (C - D) Метамфетамин Группа: крыс, получавших инъекции одиночные метамфетамина. Пороговые значения для Fos-позитивных нейронов были выбраны, чтобы быть чуть выше максимальной Alexa-647 флуоресценции (Fos-IR) наблюдается для NeuN-отрицательных клеток в домашней контрольной группе клетки. В то время как 0,7 - 0,8% от всех нейронов являются Фос-положительными в домашней группе, 1,9 - 2,2% всех нейронов Fos-позитивных в группе метамфетамина.
Рисунок 3. сотового типа конкретных экспрессии генов в FACS отсортированных клеток из свежих и замороженных крыс Спинной стриатуме. NeuN-позитивные нейроны (Fos-положительных и Фос-отрицательные) и NeuN-негативных клеток (Fos-положительных и Фос-отрицательные) были отсортированы с использованием описанного протокола и уровни экспрессии мРНК специфических генов клеточного типа были использованы для подтверждения сортировки клеток. (а) к NeuN является маркером для нейрональных клеток. (в) GFAP является маркером для глиальных клеток. (с) Oligo2 является маркером для олигодендроцитах. (D) Iba1 является маркером для клеток микроглии. Для получения мРНК NeuN, данные представлены в виде среднего значения ± SEM складчатых значений относительно уровня экспрессии в NeuN-негативных клеток из свежей ткани (п = 9 - 14). Для GFAP (п = 6 - 12), Oligo2 (п = 9 - 11) и Iba1 (п = 5 - 8) мРНК, данные представлены как среднее значение ± SEM складчатый значений по сравнению с уровнями экспрессии в NeuN-позитивные клетки из свежей ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Fos мРНК Уровни в FACS отсортированных Нейроны из свежих или замороженных Rat спинной стриатуме после метамфетамина Injection. Fos-положительных и отрицательных Fos-нейронов были отсортированы , как описано в приведенном выше протоколе и уровни мРНК Fos была подтверждена. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM складчатых значений относительно уровня экспрессии в Фос-отрицательных нейронов из свежей ткани (п = 3 - 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS могут быть использованы для сортировки нейроны и другие типы клеток из свежей или замороженной ткани мозга взрослого человека. Как уже упоминалось во введении, возможность использования замороженной ткани позволяет оптимальное использование образцов от животных, которые подверглись сложные и затяжные поведенческие процедуры, такие как самоуправления и рецидивами исследований в области исследований наркомании. Эти поведенческие процедуры , как правило , занимает 1 - 2 ч или дольше, и требовать от всех животных (10 - 20 всего) будут опробованы на тот же день 13,18. Она занимает ~ 4 часа обрабатывать 4 свеже расчлененный образцы тканей мозга, который включает рассечение мозга, клеток диссоциации, пермеабилизации и иммунноокрашивания. После обработки, сортировки каждого образца FACS занимает от 20 - 30 мин. Окончательный этап нагрева отсортированных клеток в буфере для лизиса требуется еще 30 мин. В общей сложности ~ 7 ч требуется от рассечения мозга на конечной стадии клеточного раствора лизиса РНК-содержащие. Тем не менее, в настоящее время можно заморозить всю BRAIнс или свеже рассеченные участки мозга сразу после тестирования, и обработать их позже. Это значительно упрощает тестирование и позволяет несколько областей мозга, которые будут сортироваться в другой день. Замораживание ткани перед FACS может также улучшить результаты. Более NeuN-позитивных нейронов получают из образцов замороженной ткани. Это может быть объяснено отчасти увеличением NeuN маркировки из-за нарушения клеточных мембран во время замораживания и последующего оттаивания, что приведет к увеличению доступа антител к внутриклеточных белков, таких как NeuN и Фос. Аналогичные эффекты наблюдались с фибробластами, эпителиальных клеток и клеток HeLa 19.
Выход клеток и нейронов может быть развернуто с помощью следующих шагов. Во время рассечения ткани, удалить большую часть белого вещества (мозолистого тела и передней спайки для спинной стриатуме и прилежащем ядре, соответственно). Это предотвращает ткань от присоединения к пластиковыми наконечниками и стеклянных пипеток в последующем STEпс. Использование буфера A (см спецификацию в таблице материалов и реактивов), чтобы сохранить расчлененный ткани покрыты. Это улучшает качество клеток при измельчении ткани с лезвием бритвы (этап 2.5). Дополнительный набор из 3-х этапов Растирание с наименьшим стеклянной пипеткой (этап 3.9) и последующей фильтрации со вторым набором ячеек сетчатых (этап 5) удваивает выход клеток и нейронов. Повторное использование сетчатые фильтры клеток забивают фильтры и низкий выход клеток. Будьте нежны с клетками, когда ресуспендирования гранул и во время растирания. Использование умеренно большого наконечника пипетки в течение этих этапов будет уменьшить повреждение клеток из-за напряжения сдвига. Внимательно следите осадок при удалении супернатант после пермеабилизации с этанолом (этап 4.4). Осадок менее компактной и может быть распределено вдоль стенки трубки микроцентрифужных. Грубые расчеты показывают, что выход Фос-позитивных нейронов составляет примерно 10% от исходного числа в рассеченной образце ткани стриатума. Текущий протокол может быть изменен в соответствии с других экспериментальных целей. В текущем протоколе, ткань была собрана через 90 мин после инъекции метамфетамина, так как экспрессия Фос достигает максимальных уровней в это время, что имеет решающее значение для эффективной сортировки Фос-экспрессирующих нейронов. Тем не менее, ткань может быть собрана в любой момент времени для FACS, в зависимости от конкретной цели эксперимента. Для первоначального хранения образцов ткани, мы успешно использовали свеже расчлененный ткани, замороженные ткани после рассечения или замороженной ткани расчлененный из замороженных всего мозга, чтобы изолировать Фос-экспрессирующие нейроны с помощью FACS с последующим КПЦР анализа экспрессии генов. Для фиксации и проницаемости, продолжительности и температуры в этом протоколе (4 ºC в течение 15 мин) был оптимизирован для проницаемыми цитоплазматическую и ядерные мембраны, а также для фиксации ткани. Различия в продолжительности и / или температуры могут изменить конечные результаты. Другие решения, такие как фиксация paraformaldehyde и неионные детергенты , такие как сапонины, которые работали на эмбриональных и постнатальных нейронов 20, может также работать для нейронов взрослого мозга. Кроме того, миелин шарики удаление может быть использован в качестве модификации текущего протокола , как показано в последнее время для FACS из тканей головного мозга 21.
Текущий протокол имеет два важных ограничения, чтобы рассмотреть. Во- первых, этот протокол не подходит для обнаружения маркеров клеточного фенотипа, которые выражаются в основном в синапсах (например, допамина или глутаматных рецепторов) , потому что эти клеточные процессы , удаляются из клеточных тел во время растирание в порошок и диссоциации шагов. Второе возможное ограничение состоит в том, что длины РНК, полученной из FACS отсортированных клеток не может быть достаточно для всех методов анализа РНК. Номера целостности РНК (RIN) РНК, полученной из FACS отсортирован клетки между 2,5- 3,5, что соответствует более короткие средние длины РНК. Здесь, тем короче размер РНК компенсироваласьс использованием относительно коротких ампликонов КПЦР 80 - 100 пар оснований , как это описано ранее 13-15. Мы также использовали эти короткие РНК длиной успешно для анализа микрочипов 11. Тем не менее, короткие отрезки РНК, полученные не может быть адекватным для всех методов анализа РНК. Следует подчеркнуть, что использовались ПЦР-праймеров, которые специфически ориентированные экзон-экзон спаи обнаружены только в полностью сплайсинга мРНК в цитоплазме. Эти праймеры не обнаруживают интрон-содержащих РНК из ядра. Кроме того, ранее мы использовали этот протокол с антителами и свежей ткани мозга , чтобы обнаружить тирозингидроксилазу в цитозоле и D1 дофаминовых рецепторов в клеточной мембране 10. Обнаружение этих цитоплазмы и клеточных мембранных маркеров показали, что процедура диссоциации производит в основном неповрежденные клетки, а не просто ядрами.
В целом, FACS изоляция нейронов из замороженных образцов открывает другие приложения. Нет различий в сортировке или гена expression наблюдались (данные не показаны), когда образцы хранили 3 дня или 3 недели при -80 ºC. Через три недели это разумный период времени, чтобы сортировать все образцы от конкретного эксперимента (20 - 40 образцов) и выделения РНК для экспрессии гена. Используемая РНК также была получена из мозговой ткани хранили в течение 6 месяцев при температуре -80 ° С (данные не показаны здесь). Таким образом, этот протокол может быть полезен для FACS изоляции посмертных замороженных образцов мозга человека, которые хранились в течение нескольких месяцев или даже лет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
