Summary
Aquí se presenta un protocolo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para estudiar las alteraciones moleculares en Fos-expresión de conjuntos neuronales a partir de tejido cerebral en fresco y congelados. El uso de tejido congelado permite el aislamiento FACS de muchas áreas del cerebro a través de múltiples sesiones para maximizar el uso de sujetos animales valiosos.
Abstract
El estudio de la neuroplasticidad y alteraciones moleculares en los comportamientos aprendidos está cambiando a partir del estudio de las regiones de todo el cerebro para el estudio de un conjunto específico de neuronas activadas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales que median las asociaciones aprendidas. La fluorescencia de células activadas (FACS) ha sido recientemente optimizado para el tejido de cerebro de rata adulta y se permitió el aislamiento de las neuronas activadas usando anticuerpos contra el marcador neuronal NeuN y proteínas Fos, un marcador de neuronas fuertemente activados. Hasta ahora, las neuronas que expresan Fos y otros tipos de células fueron aisladas de tejido fresco, lo que supuso el proceso de días largos y permiten un número muy limitado de muestras de cerebro para ser evaluados después de procedimientos largos y complejos de comportamiento. Aquí encontramos que los rendimientos de las neuronas y ARNm de Fos estriado dorsal Fos-expresión fueron similares entre el tejido y el tejido diseccionado recién congelado a -80 ºC durante 3 - 21 días. Además, se confirmó el fenotipode las células clasificadas NeuN-positivos y NeuN-negativas mediante la evaluación de la expresión de genes de neuronal (NeuN), astrocitos (GFAP), oligodendrocíticos (oligo2) y marcadores microgial (Iba1), lo que indica que el tejido congelado también se puede utilizar para el aislamiento FACS de tipos de células gliales. En general, es posible recoger, analizar y congelar el tejido cerebral para las sesiones múltiples de FACS. Esto maximiza la cantidad de datos obtenidos a partir de sujetos animales valiosos que a menudo han sido sometidos a procedimientos largos y complejos de comportamiento.
Introduction
Durante el aprendizaje, los animales forman asociaciones entre conjuntos complejos de estímulos muy específicos. Esta información de alta resolución se cree que está codificada por alteraciones en los patrones específicos de neuronas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales. Conjuntos neuronales han sido recientemente identificado por la inducción de genes inmediatamente tempranos (IEGs) como Fos, Arco, y Zif268 y sus productos proteicos en las neuronas que se activan durante el fuerte comportamiento o exposición a estímulos. Las neuronas que expresan Fos, en particular, se ha demostrado que desempeñan un papel causal en el contexto y los comportamientos aprendidos 1-4-cue específica. Por lo tanto, neuroadaptaciones moleculares únicas dentro de estas neuronas que expresan Fos-activados son los mejores candidatos para los mecanismos neuronales que codifican las asociaciones formadas durante los trastornos de aprendizaje y aprendizaje normales, anormales, como la adicción y trastorno de estrés postraumático (TEPT) 5 aprendidas.
FluoreScence de células activadas (FACS) ha permitido recientemente análisis de neuroadaptaciones moleculares únicas dentro de las neuronas que expresan Fos. La citometría de flujo y clasificación de células se desarrollaron en la década de 1960 6,7 para caracterizar y aislar células de acuerdo con sus características de dispersión de luz y de inmunofluorescencia, y han sido utilizados en la inmunología y la investigación del cáncer. Sin embargo citometría de flujo y FACS requiere células individuales disociados que son difíciles de obtener a partir de tejido de cerebro adulto. FACS se utilizó primero para aislar y analizar la proteína verde fluorescente (GFP) que expresan las neuronas del cuerpo estriado de los ratones transgénicos que no requiere etiquetado anticuerpo 8,9. Hemos desarrollado un método FACS basada en anticuerpos 10 para aislar y evaluar alteraciones moleculares en las neuronas activadas por drogas y / o señales en los animales de tipo salvaje 11-15 Fos-expresión. En este método, las neuronas se marcaron con un anticuerpo contra el marcador neuronal NeuN en general, mientras que las neuronas activado fuertementeson etiquetados con un anticuerpo contra Fos. A pesar de que nuestro método inicial necesaria puesta en común de hasta 10 ratas por muestra de tejido fresco, modificaciones posteriores del protocolo permitió el aislamiento FACS de Fos-expresión de las neuronas y de la polimerasa cuantitativa Reacción en Cadena de análisis (qPCR) de áreas discretas del cerebro a partir de una sola rata 13-15 . En general, no se encontraron alteraciones moleculares únicas en las neuronas activadas durante una variedad de comportamientos y al contexto de referencia en la investigación activados por la adicción 12,14,15 Fos-expresión.
Un importante problema logístico con la realización de FACS en tejido fresco es que se necesita un día entero para disociar el tejido y el proceso por FACS. Además, sólo cuatro muestras pueden ser procesadas por día. Esto generalmente significa que sólo un área del cerebro puede ser evaluado de cada cerebro y las restantes áreas del cerebro tienen que ser desechados. Este es un problema importante para los procedimientos de comportamiento bajo rendimiento, tales como la auto-administración y trai extinciónNing que requiere cirugía y de muchas semanas de entrenamiento intensivo. Además, los procedimientos largos y complicados de comportamiento en el día de la prueba hace que sea difícil llevar a cabo FACS en el mismo día. Sería una ventaja significativa para poder congelar los cerebros de los animales inmediatamente después de las pruebas de comportamiento, y luego aislar las neuronas que expresan Fos-de una o más áreas del cerebro en diferentes momentos de la elección de los investigadores.
Aquí demostramos que nuestro protocolo de FACS se puede utilizar para aislar las neuronas que expresan Fos-(y otros tipos de células) de tejido cerebral fresco y congelado. Como ejemplo, se aislaron neuronas de cuerpo estriado de rata después de las inyecciones de metanfetamina agudos y de ratas ingenuas sin inyecciones (condición control) Fos-expresión. Sin embargo, este protocolo FACS se puede utilizar después de cualquier tratamiento conductual o farmacológico. análisis de qPCR posterior de las muestras indicó que la expresión de genes a partir de estos tipos de células puede ser evaluada con similar la eficiencia a partir de tejido en fresco y congelados.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de laboratorio 16.
Nota: Todos los pasos siguientes utilizan tubos de centrífuga de bajo vinculante que se mantuvieron en hielo a menos que se especifique lo contrario.
1. Preparación Antes de Recogida de tejido
- Establecer la centrífuga a 4 ° C
- esmalte de fuego un conjunto de tres pipetas Pasteur de vidrio con diámetros decrecientes de aproximadamente 1,3, 0,8, y 0,4 mm para cada muestra.
- Preparar etiquetados 1,7 ml tubos que contienen 1 ml de tampón frío A y mantener los tubos en hielo.
- Preparar una bandeja de hielo que contiene el cerebro de cortar la matriz, espátulas y placas de vidrio (o placa de Petri de vidrio invertida) en los que realizar la disección. Pre-enfriamiento de dos o más hojas de afeitar en el papel placas de vidrio y tejidos de uso para secar todos los instrumentos que tocan el tproblema.
- Descongelar la solución de enzima a temperatura ambiente (RT) durante 30 min antes de la recogida de tejidos.
2. Tejido Recogida y disección
- Iniciar el comportamiento o el tratamiento farmacológico 90 minutos antes de la recogida de tejidos.
NOTA: Para obtener los resultados que se muestran aquí, inyecciones intraperitoneales agudos de 5 mg metanfetamina / kg en ratas en un ambiente nuevo (condición de prueba) y ingenuo ratas se mantienen en sus jaulas de origen (condición de control) se realizaron. - Anestesiar la rata, colocándolo en un frasco de vidrio con isoflurano desecador saturada y decapitar a la rata de 30 - 60 segundos más tarde usando una guillotina.
Use las tijeras para quitar la piel y los músculos de la cabeza y exponer el cráneo. Utilice unas pinzas para cortar el cráneo y abrir el agujero occipital y quitar la parte posterior del cráneo. Utilice unas pinzas para cortar a lo largo de los bordes superiores del cráneo para exponer el cerebro. Tenga cuidado de no dañar el cerebro. Use una espátula para sacar suavemente bajo unad elevar el cerebro. Elevar el cerebro y cortar los nervios hasta el cerebro está libre 17. - Diseccionar tejido usando hojas de afeitar.
NOTA: Obtener muestras de tejido utilizando cualquiera de los métodos siguientes: (2.3.1) del tejido recién disecados; (2.3.2) de tejido congelado después de la disección; o (2.3.3) de tejido congelado diseccionado de todo el cerebro congelado. Mantener la matriz de corte en rodajas de cerebro, hojas de afeitar y la placa de vidrio seco durante la disección y procesos como el agua condensada picado puede conducir a la lisis hipotónica de las células. Use lentes de aumento para garantizar la disección precisa.- Para el tejido recién disecados, coloque el cerebro recién extraída en una matriz de corte en rodajas de cerebro (una rata en forma de cerebro-molde de metal con ranuras para las hojas de afeitar a intervalos de 1 mm) que se ha enfriado en hielo. Inserte dos o más hojas de afeitar pre-refrigerados en las ranuras para cortar rodajas coronales que contienen la región (s) de cerebro de interés. Coloque el tramo cortado en la placa de vidrio frío.
Nota: diseccionar el cerebro regions de interés sobre una placa de vidrio frío. - Para tejido congelado después de la disección, la disección de la región (s) de interés cerebro de rodajas de cerebro recién extraída, similar a la descrita anteriormente en el apartado 2.3.1. Coloque el tejido diseccionado en un microtubo y rápidamente congelar el tejido sumergiendo el microtubo en -40 ºC isopentano durante 20 s. Mantener el tejido diseccionado congelado en todo momento en un congelador ºC -80 hasta su posterior procesamiento.
- Para tejidos congelados, congelar inmediatamente el cerebro recién extraída de -40 ºC isopentano y guardar en una bolsa sellada a -80 ºC durante un máximo de 6 meses.
- En el día de la disección, coloque el cerebro congelado en un criostato fijada en aproximadamente -20 ºC (no más caliente que -18 ºC) durante aproximadamente 2 horas para equilibrar la temperatura.
NOTA: Los cerebros se pueden cortar fácilmente a esta temperatura, mientras que las temperaturas mucho más frías hacen que el cerebro demasiado frágil para ser cortado de forma segura. - Utilice hojas de afeitar para cortar 1 - 2 mm de cortes coronaleslos cerebros congelados en un criostato. Use una aguja de 12 a 16 de calibre romo para obtener golpes de tejido de estos cortes en condiciones de congelación. Mantener el tejido diseccionado congelado en todo momento hasta su posterior procesamiento.
- En el día de la disección, coloque el cerebro congelado en un criostato fijada en aproximadamente -20 ºC (no más caliente que -18 ºC) durante aproximadamente 2 horas para equilibrar la temperatura.
- Para el tejido recién disecados, coloque el cerebro recién extraída en una matriz de corte en rodajas de cerebro (una rata en forma de cerebro-molde de metal con ranuras para las hojas de afeitar a intervalos de 1 mm) que se ha enfriado en hielo. Inserte dos o más hojas de afeitar pre-refrigerados en las ranuras para cortar rodajas coronales que contienen la región (s) de cerebro de interés. Coloque el tramo cortado en la placa de vidrio frío.
- Añadir 1 - 2 gotas de tampón A para cubrir el tejido diseccionado con anterioridad al picado. Eliminar la mayor parte de la sustancia blanca del tejido utilizando dos hojas de afeitar para evitar la pérdida de las neuronas durante el resto del proceso de trituración. Si a partir de tejido congelado, y luego permitir que el tejido se descongele en la placa de vidrio en frío, por no más de 1 minuto antes de aplicar la solución tampón A.
- Picar el tejido 100 veces en cada dirección ortogonal con una hoja de afeitar sobre una placa de vidrio frío. Mantenga la cuchilla de afeitar vertical a la placa de vidrio cuando picado.
NOTA: picar carne a fondo es crítico para todos los pasos del protocolo. - Utilice hojas de afeitar para transferir el tejido picado en tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de tampón frío A. Invertir el tubo 3 - 5 veces para keep todo el tejido picado en la solución.
La disociación 3. célula
NOTA: El uso final suave sobre la mezcla de todas las siguientes etapas finales. No utilice un mezclador de vórtice y evitar burbujas de aire que causan daño celular.
- Centrifugar los tubos de muestras a 110 xg durante 2 min a 4 ºC. sobrenadante de descarte. Añadir lentamente 1 ml de solución de enzima recién descongelado frío (que contiene una mezcla de enzimas proteolíticas) por la pared interior del microtubo. Inmediatamente succionar todo el sedimento y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo sólo 4 veces con una pipeta moderadamente grande diámetro de la punta para dispersar el sedimento de tejido picado.
- Invertir los microtubos de inmediato para evitar el sedimento se pegue a la parte inferior y se incuban las muestras con la mezcla de extremo a extremo durante 30 min a 4 ° C
- Después de la digestión enzimática de tejidos, centrifugar los tubos a 960 xg durante 2 min a 4 ºC. Eliminar el sobrenadante y añadir 0,6 ml de tampón A. fría immediately después de añadir el tampón A, utilice la misma punta de la pipeta para dispersar el sedimento al absorber todo el sedimento y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 5 veces.
- Mecánicamente se tritura el tejido digerido y recoger en tubos de 15 ml utilizando los siguientes pasos. Para cada muestra, utilice un conjunto separado de 3 pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego con descendiendo diámetros de aproximadamente 1,3, 0,8 y 0,4 mm unidas a las bombillas de látex.
- tritura suavemente cada muestra 10 veces con la pipeta de vidrio de 1,3 mm. Deje que la muestra se conforma con 2 minutos en hielo (los restos y células disociadas se depositan en el fondo). Recoger el sobrenadante (~ 0,6 ml) y transferir a un tubo cónico de 15 ml (tubo # 1).
- Añadir 0,6 ml de tampón de una solución al sedimento restante. Se tritura la muestra 10 veces con la pipeta de vidrio 0,8 mm. Deje que la muestra se conforma con 2 minutos en hielo. Recoger el sobrenadante (~ 0,6 ml) y la transferencia de los mismos 15 ml tubo cónico # 1.
- Añadir 0,6 ml de tampón A a la solución restante pellet. Se tritura la muestra 10 veces con la pipeta de vidrio 0,4 mm. Deje que la muestra se conforma con 2 minutos en hielo. Recoger el sobrenadante (~ 0,6 ml; sin tocar el pellet con las células no disociadas) y la transferencia a los mismos 15 cónica tubo # 1 ml.
NOTA: Mantener la pipeta de 0,4 mm de diámetro en el tubo # 1 para las siguientes etapas de trituración. - Repita el paso 3.4.3 tres veces más utilizando la pipeta de vidrio más pequeño (~ 0,4 mm de diámetro), y recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 ml separados (tubo # 2).
- Triturar las suspensiones celulares recogidas en tubos # 1 y # 2 de 10 veces más utilizando la pipeta de vidrio de 0,4 mm y mantener en hielo.
4. Fijación y permeabilización de la célula
- Preparar 4 microtubos por muestra (dos microtubos de células de tubo # 1 y dos para las células de tubo # 2) mediante la adición de 800 l de etanol al 100% frío (almacenado a -20 ° C antes de su uso) en cada tubo y mantenerlos en hielo . Nota: El final de etanolconcentración será 50%.
- Pipetear 800 ~ l de las suspensiones de células (de tubo # 1 y el tubo # 2) en cada uno de los 4 tubos que contenían etanol frío y invertir los tubos para mezclar las muestras.
- Incubar los tubos en hielo durante 15 min mientras invirtiendo los tubos cada 5 min.
- Después de la fijación / permeabilización, centrifugar los tubos a 1.700 xg durante 4 minutos a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Deja 50 l de solución para evitar la pérdida de células.
NOTA: Los pellets en esta etapa son de color blanco y se adhieren menos a la pared de los tubos que antes permeabilización. Por lo tanto, eliminar el sobrenadante con cuidado al tocar la pared del microtubo donde no hay pellets y elaborar el sobrenadante lentamente utilizando una micropipeta.
5. La filtración de la célula
- Vuelva a suspender los pellets desde el paso 4.4 con PBS frío de la siguiente manera:
- Añadir 550 l de PBS frío a uno de los dos microtubos procedentes de tubo # 1, y el uso de un pi moderadamente diámetro grandela punta de la pipeta suavemente pette a la suspensión de células arriba y abajo 5 veces. Repetir el mismo para un microtubo que viene de tubo # 2.
- Para las células de tubo # 1, utilizando la misma pipeta, transferir la primera suspensión de células a la segunda pellet. Resuspender el segundo precipitado pipeteando suavemente la suspensión celular combinada arriba y abajo 5 veces.
- Para las células de tubo # 2, resuspender y combinar los gránulos (es decir, microtubos tercero y cuarto) como se describe en 5.1.2.
- Filtrar las dos suspensiones de células de los pasos 5.1.2 y 5.1.3 por separado utilizando dos pares diferentes de coladores celulares (100 micras y 40 micras tamaños de poros) como sigue:
- Pre-húmedo cada filtro de células mediante la adición de PBS en el interior del filtro. Usar una pipeta para eliminar el exceso de PBS desde el exterior del filtro.
- Pipetear la suspensión de células de la etapa 5.1.2 uniformemente sobre el primer filtro de células con tamaño de poro de 100 micras. Recoger el flujo a través en un tubo de 50 ml en hielo. Utilice la pipette para recoger el Flow través adjunta en la parte inferior lado exterior del filtro de células.
- Utilice la misma pipeta para transferir el flujo a través de la filtro de células 100 micras para el filtro de células 40 micras. Recoger este flujo a través de otro tubo de 50 ml en hielo. Al transferir el flujo a través del filtro de 40 micras de células, cambiar a las nuevas puntas de pipeta para evitar la contaminación del filtro de 100 micras de células.
- Repita estos pasos para la suspensión de células de la etapa 5.1.3 utilizando un nuevo conjunto de filtros.
- Combinar los dos de flujo a través de cada muestra para un volumen final de aproximadamente 1 ml por muestra.
6. La incubación con anticuerpos
NOTA: Utilice pequeñas alícuotas de las suspensiones de células del cerebro para preparar múltiples muestras de control para ajustar el flujo apropiado citómetro de configuración antes de ejecutar la muestra principal. Para cada anticuerpo etiquetado, preparar muestras de control que incluyen anticuerpos, no sólo el SEanticuerpo cundaria (u otro marcador fluorescente), y luego ambos anticuerpos primarios y secundarios (u otro marcador fluorescente). Utilice estos controles para ajustar las puertas que separan específica frente etiquetado no específica en el citómetro de flujo. Cuando sea posible, utilice fluorocromos que no requieren compensación. Aumentar el volumen final de las muestras de control gating a un volumen final de 700 l mediante la adición de PBS antes de la adición de los anticuerpos primarios.
- Preparar de dispersión de luz y DAPI muestra de control mediante la transferencia de una muestra de 100 l de las células filtradas a un microtubo de 1,7 ml. Añadir 600 l de PBS frío con 1 mg / ml DAPI para la tinción de los núcleos. Incubar durante 10 min con mezcla de extremo a extremo, y lavar (como se indica en los pasos 6.4.2 a 6.4.5) antes de pasar a través del citómetro de flujo.
Nota: este ejemplo sólo se utiliza para establecer el / puerta de células núcleos antes de la clasificación de las células que quedan en la máquina de FACS. - Preparar muestras de control inmunomarcadas individuales mediante la transferencia de 100 & #181; l de las células filtradas a un microtubo de 1,7 ml. Añadir 600 l de PBS frío con un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo NeuN). Añadir 600 l de PBS frío a un microtubo con otro anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo Fos). Añadir el anticuerpo secundario correspondiente si no es un anticuerpo primario directa conjugado.
NOTA: Estas muestras se utilizan para determinar el voltaje del tubo fotomultiplicador apropiado (PMT), y para evaluar la superposición de las dos señales fluorescentes si es necesario. Las concentraciones de anticuerpos deben titularse para lograr la mejor relación señal-ruido en todos los canales. La superposición de señales fluorescentes también pueden ser compensadas por la calibración interna de los diferentes canales fluorescentes dentro del citómetro de flujo. - Preparar doble muestra de control negativo marcado fluorescente mediante la transferencia de 100 l de las células filtradas a un microtubo de 1,7 ml. Añadir 600 l de PBS frío con los anticuerpos secundarios por sí solos o anticuerpos primarios directa conjugados de IgG.
NOTA: Thimuestra de control s se puede utilizar cada vez que antes de la clasificación para determinar la fluorescencia de fondo para cada fluoróforo. - Preparar la prueba principal para ser ordenados.
- Transferir 700 l de las células filtradas en un microtubo de 1,7 ml. Añadir 7 l (1: 100) de anticuerpo primario conjugado Fos directamente a Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) y 1,4 l (1: 500) de anticuerpo primario NeuN conjugado directamente con ficoeritrina (anti-NeuN-PE). Incubar los tubos durante 30 min a 4 ºC con mezcla de extremo a extremo.
- Al final de la incubación, añadir 800 l de PBS frío a cada microtubo, incluyendo la muestra principal y las muestras de control, y mezclar por inversión.
- microtubos centrifugar a 1.300 xg durante 3 min a 4 ºC. Descartar el sobrenadante, dejando 50 l sobrenadante para prevenir la pérdida de células.
- Añadir 1 ml de PBS frío a las células de pellets y resuspender utilizando una pipeta con un diámetro de la punta moderadamente grande.
- Centrifugar a 1300 xg durante 3 min a 4 ºC. reiscard el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el precipitado en 500 l de PBS frío (Ajustar el volumen final en función del tamaño de la pastilla).
- Transferencia y filtrar la suspensión en un tubo de ensayo FACS de fondo redondo con una tapa de filtro celular (40 micras). Mantener las células immunolabeled en hielo e inmediatamente realizar FACS. Nota: Para el filtrado, toque la punta de la pipeta verticalmente en la tapa del filtro y empuje la suspensión celular a través de él.
- Establecer citómetro de flujo puertas utilizando muestras de control.
- Utilice la dispersión de la luz y DAPI muestra de control para identificar la población de células neuronales de los eventos totales y restos celulares.
NOTA: Los cuerpos celulares en esta preparación son solamente 1 - 2% de los eventos totales (el resto son desechos y procesos celulares rotas). Sobre la base de la señal fluorescente DAPI (indicando núcleos) y dispersión frontal (tamaño de la celda), es posible localizar los cuerpos celulares y la puerta hacia atrás sobre la base del primero y la cara propiedades de la luz de dispersión delas células (como se muestra en la Figura 1 A, B). - Usa los individuales muestras de control inmunomarcadas para determinar los valores de voltaje PMT, y analizar desbordamiento de la emisión de un fluorocromo específico en otro filtro / canal (por ejemplo, Alexa Fluor 488 / FITC o ficoeritrina). Si las señales fluorescentes se superponen, corregir el solapamiento mediante el ajuste de los niveles de compensación manualmente.
- Utilice el doble control negativo marcado con fluorescencia para establecer el umbral para la población positiva.
NOTA: La señal procedente de esta muestra se piensa que es debido a la auto-fluorescencia y las células de la muestra principal situado por encima de este umbral puede ser considerado como positivo. Por lo general, los parámetros de umbral para la clasificación son más estrictos y aproximadamente 2/3 de la parte superior de las células marcadas por encima del control negativo en realidad están ordenados.
- Utilice la dispersión de la luz y DAPI muestra de control para identificar la población de células neuronales de los eventos totales y restos celulares.
- Ordenar las neuronas de la muestra principal por FACS en microtubos de 1,7 ml. Recoger las células en 50 l de RNAtampón de extracción. Después de la clasificación, vortex y centrifugar el tubo y mezclar la suspensión con la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces para recuperar todas las células seleccionadas de las paredes del tubo.
- Incubar la suspensión celular ordenada a 42 ºC durante 30 min para asegurar que todas las células se lisan antes de la extracción de ARN, y luego centrifugar a 2800 xg durante 2 min a 4 ºC.
- Transferir el sobrenadante a un tubo de RNasa libre para el almacenamiento a largo plazo a -80 ºC o inmediatamente procesar la muestra para el aislamiento de ARN, síntesis de ADNc, gen diana de pre-amplificación y qPCR, como se describió anteriormente 13-15.
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Representative Results
Clasificación de las neuronas Fos-positivos y negativos de Fos-tejido estriado dorsal frescos y congelados de ratas individuales después de las inyecciones de metanfetamina agudas.
El protocolo descrito anteriormente se utiliza para ordenar las neuronas Fos-positivos y Fos-negativos de una sola rata dorsal estriado 90 min después de una inyección intraperitoneal de metanfetamina (5 mg / kg). ingenuo ratas en sus jaulas se utilizaron como controles. Dorsal se procesó tejido estriado ya sea inmediatamente después de su recolección (tejido fresco) o transformados después de haber sido congelados y almacenados en -80 ºC durante 1, 7 o 21 días. Los resultados de estos puntos de tiempo de congelación no fueron significativamente diferentes entre sí, por lo que se combinaron los datos.
Para configurar las condiciones para ordenar en el instrumento, las muestras de control (descrito anteriormente) con el control de la jaula hogar o methamphetaSe utilizaron grupos de minas inyectado. Cuando cada partícula o evento en estas muestras pasa a través de la celda de flujo en el citómetro, se les da un número de identificación que está asociado con características de dispersión de luz y fluorescencia del evento y se registra en una hoja de cálculo. Los acontecimientos de esta hoja pueden ser organizados en los diagramas de dispersión o gráficos de densidad de estas características (Figura 1). Eventos con características similares a continuación, se pueden agrupar o "gated" por diferentes pares de características para determinar las puertas, tales como las células que contienen, neuronas, o neuronas Fos-positivos. Una vez que las puertas se determinan usando las muestras de control descritas anteriormente, la muestra principal se inyecta en el citómetro de flujo y ordenadas de acuerdo con estas puertas. La población celular estaba cerrado desde todos los eventos (células y escombros) en función de su dispersión de luz frontal (FSC; una indicación del tamaño de la partícula) y la dispersión de la luz lateral (SSC; una indicación de g de la partícularanularity). Como se muestra en la FSC frente a SSC gráfico de puntos (Figura 1A y 1B), el gráfico de densidad de todos los eventos revela una pequeña población homogénea con el tamaño y la granularidad similares, además de una gran población heterogénea (Figura 1A y 1B). Una pequeña población homogénea que contiene cuerpos celulares se identificó y cerrada como "células", basado en el FSC y SSC características de los estudios anteriores 11,13-15 y etiquetado con DAPI. Un poco más alto porcentaje de células se obtuvieron a partir de tejido congelado (2,6%) que a partir de tejido fresco (1,9%). La gran población heterogénea es en su mayoría escombros, presumiblemente de dendritas y axones.
A continuación, las células individuales de la puerta "células" fueron identificados en base a su tamaño, que fue indicado por el ancho de la señal de FSC para cada evento en el eje x. Eventos que eran más grandes que las células individuales se consideraron los agregados de células y excluidos de la "puerta de células individuales. Todas las etapas de análisis posteriores se llevaron a cabo dentro de esta" puerta de células individuales "(Figura 1C y 1D). La mayoría de esta población de células individuales (> 92%) fueron positivos para la tinción con DAPI (datos no mostrado).
En primer lugar, se identificaron las neuronas en función de su intensidad de fluorescencia PE que indica NeuN-inmunoreactividad (Figura 1E y 1F). Las neuronas componen aproximadamente el 24% de todos los eventos de la puerta "de células individuales" de tejido fresco y el 38% de tejido congelado. Casi todos los eventos en esta puerta "neurona" (98% en el tejido fresco y el 99% en el tejido congelado) fueron positivas para la tinción DAPI de ADN en los núcleos de las células (Figura 1G y 1H). Los eventos marcados con DAPI que quedan en la puerta de células individuales son NeuN-negativas e incluyen la glia, oligodendrocitos y microglia, según lo confirmado por qPCR en la Figura 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> A continuación, las neuronas se clasificaron como neuronas Fos-positivo o negativo Fos-647 en función de su señal de fluorescencia Alexa Fluor (Fos-inmunoreactividad) A diferencia de los marcadores de tipo celular, Fos. los niveles de expresión en las neuronas aumenta gradualmente debido a los diferentes niveles de la actividad neuronal y la evolución en el tiempo. por lo tanto, no habrá un umbral clara entre Fos-positivas frente a las neuronas Fos-negativos. en la primera etapa (utilizado sólo para análisis fuera de línea para calcular porcentajes de neuronas Fos-positivo), que define el umbral para las neuronas Fos-positivas basadas en la fluorescencia máxima Alexa-647 (por Fos) de la población NeuN-negativo en el control de ratas jaula no tratados previamente. neuronas Fos-positivas se indican los cuadrados azules de diferentes condiciones experimentales de la Figura 2 en ambos tejidos frescos y congelados, el porcentaje de Fos-positivas las neuronas de ratas inyectadas con la metanfetamina. (1.9 a 2.2%, Figura 2C y 2D) fue el doble de compared a ratas jaula (0,7 - 0,8%, Figura 2A y 2B).Confirmación de genes específicos de tipo celular a partir de células clasificadas-FACS utilizando gen diana pre-amplificación y RT-PCR.
En el segundo paso, para garantizar la clasificación de sólo neuronas Fos-positivas a partir de la muestra principal de mRNA posterior análisis y la reducción de la inclusión de células Fos-negativas, se elevó el umbral de fluorescencia Alexa-647 de manera que sólo los dos tercios superiores de Fos -positivos eventos en los cuadrados azules fueron ordenados y recogidos. Este umbral tiene al menos 10 veces mayor de fluorescencia (mayor expresión Fos por célula) que el umbral utilizado anteriormente para calcular el porcentaje de neuronas Fos-positivos en las muestras. Cuatro poblaciones de células fueron ordenados a partir de una única muestra de tejido, incluyendo NeuN-negativas + Fos-negativo (~ 5.000 eventos), NeuN-negativas + Fos-positivo (osciló de 25 - 83 eventos), NeuN-positivo + Fos-negativa (~ 5.000 eventos) y NeuN-positivo + Fos-positivas (osciló de 44 - 133 eventos en el grupo base, 185 - 450 eventos en el grupo metanfetamina). En primer lugar, se confirmó la expresión de genes específicos de tipo celular en NeuN-positivos (incluyendo tanto Fos-positivo y Fos-negativo) de la población y NeuN-negativas (incluyendo tanto Fos-positivo y Fos-negativo) (Figura 3). GAPDH se utilizado como gen de referencia / limpieza de habitaciones, basándose en los resultados de nuestro estudio previo 13. Para el control de los diferentes niveles de RNA en la muestra y de ADNc en las reacciones de PCR, reacciones de qPCR dúplex se realizaron usando cebadores tanto para el gen diana y GAPDH cDNA. Los valores de Ct para la limpieza de genes Gapdh se mantuvieron entre 15 y 31 para las medidas exactas. Por tanto tejido fresco y congelado, los niveles de ARNm de NeuN fueron significativamente mayores (aproximadamente 8 veces) en la población NeuN-positivas que en la población NeuN-negativo (p <0,05; Figura 3A GFAP (marcador de células glial; Figura 3B) y oligo2 (marcador de células de oligodendrocitos; Figura 3C) los niveles de mRNA fueron mayores en la población NeuN-negativas que en la población NeuN-positivos (p <0,05 ). Una tendencia similar de mayor Iba1 (marcador de células microglial; Figura 3D) los niveles de mRNA se observó en la población NeuN-negativa, pero esto no fue estadísticamente significativo. Algunas muestras contenidas extremadamente bajos niveles de mRNAs particulares que no podía ser medido con precisión en un tipo celular particular (por ejemplo, GFAP ARNm en las neuronas marcadas con NeuN). Los valores máximos de Ct se definen como 35 para eliminar los valores que eran demasiado baja para ser detectada con precisión. Los valores más altos de Ct excedieron el límite de confianza en nuestros ensayos de qPCR.
Fos mRNA expresión fueexaminado en la población neuronal NeuN-positivas a partir de las ratas que recibieron una sola inyección de metanfetamina (Figura 4). Por tanto tejido fresco y congelado, los niveles de ARNm de Fos fueron mayores en las neuronas Fos-positivas que en las neuronas Fos-negativas (p <0,05). Además, mientras que hubo un aumento de 3 veces de Fos ARNm en las neuronas Fos-positivas a partir del tejido fresco, un aumento de 11 veces de Fos ARNm en las neuronas Fos-positivos desde el tejido congelado fue detectado. Tomados en conjunto, estos resultados confirman la identidad de ARNm de las neuronas Fos-positivas, las neuronas Fos-negativas y población no neuronal, tanto de tejido fresco y congelado. Por otra parte, los teléfonos genes específicos de tipo y otros genes de interés también pueden ser analizados a partir de células clasificadas en condiciones tanto frescos como congelados.
Figura 1. Supresión de DisLas células no asociados y etiquetados de Frescos y Congelados Rat dorsal estriado. La puerta '' Las células se determinó por delante y propiedades de dispersión lateral (AD) y confirmado por el etiquetado positiva con DAPI nuclear (GH). La puerta '' Las neuronas dentro de la población '' Las células se determinó por fluorescencia para NeuN (PE; EF). (A - B) de puerta de la célula: representación lineal de todos los eventos, en función de su dispersión hacia adelante (eje X, tamaño de la celda) y dispersión lateral (eje Y, granularidad). (C - D) células individuales puerta: representación lineal de la altura de dispersión hacia adelante (eje Y) y la anchura (eje X) dentro de la puerta de células se muestra en AB. (E - F) Neuron puerta: representación logarítmica de inmunofluorescencia para NeuN marcado con PE (eje Y) dentro de la puerta de las células individuales se muestra en la CD revela neuronas en el grupo superior de los eventos y las células no neuronales de la agrupación inferior. (G H) Los núcleos de tinción: representación logarítmica de la fluorescencia de los núcleos marcados con DAPI (eje Y) dentro de la puerta de las células neuronales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Supresión de las neuronas Fos-positivos y negativos de Fos-Frescos y Congelados Rat dorsal estriado Basado en el doble etiquetado para NeuN y Fos. El fresco y congelado estriado dorsal de ratas (tomado directamente de su jaula o 90 minutos después de una sola inyección intraperitoneal de metanfetamina) se disociaron y se marcó con los anticuerpos conjugados directamente contra NeuN y Fos y ordenadas utilizando una máquina FACS. Ordenando se basó en la ficoeritrina (PE) marcado con NeuN inmunofluorescencia (eje X) y Alexa 647 marcado con immunofluo Foscencia (eje Y). Fos-positivos (puntos azules) y Fos-negativas (puntos rojos) las neuronas se encuentran en los cuadrantes superior e inferior derecho, respectivamente. Los gráficos de puntos muestran las células NeuN-positivos (neuronas) y células NeuN-negativas (puntos grises); los cuadrados azules indican neuronas con por encima del umbral de expresión de Fos. (A - B) Grupo: ingenuo ratas tomadas directamente de sus jaulas. (C - D) del grupo metanfetamina: las ratas que recibieron inyecciones únicas de metanfetamina. Se seleccionaron los umbrales para las neuronas Fos-positivas que ser justo por encima de la máxima Alexa-647 de fluorescencia (Fos-IR) observado para las células NeuN-negativas en el grupo de control jaula. Mientras 0,7 - 0,8% de todas las neuronas son Fos-positivo en el grupo base, 1.9 a 2.2% de todas las neuronas son Fos-positiva en el grupo metanfetamina.
Figura 3. de tipo celular expresión de genes específicos en células de Frescos y Congelados Rat dorsal estriado FACS-ordenados. neuronas NeuN-positivos (Fos-positivas y Fos-negativas) y NeuN-negativas (Fos-positivas y Fos-negativas) utilizando el protocolo descrito y los niveles de mRNA de expresión de genes específicos de tipo celular se utilizaron para confirmar la clasificación de células. (a) NeuN es un marcador de las células neuronales. (B) GFAP es un marcador para las células gliales. (C) oligo2 es un marcador para las células de oligodendrocitos. (D) Iba1 es un marcador de las células microgliales. Para NeuN mRNA, los datos se presentan como media ± SEM de los valores de veces en relación con los niveles de expresión en las células NeuN-negativas del tejido fresco (n = 9 - 14). Para GFAP (n = 6-12), oligo2 (n = 9-11) y Iba1 (n = 5-8) mRNA, los datos se presentan como media ± SEM de los valores de veces en relación con los niveles de expresión en NeuN-células positivas del tejido fresco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los niveles de mRNA en neuronas Fos-FACS ordenados, frescas o congeladas Rat dorsal estriado después de neuronas metanfetamina por inyección. Fos-positivas y negativas-Fos se clasificaron como se describe en el protocolo anterior y se confirmó niveles de mRNA de Fos. Los datos se presentan como media ± SEM de los valores de veces en relación con los niveles de expresión en las neuronas Fos-negativas del tejido fresco (n = 3 - 4).
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Discussion
FACS se pueden utilizar para clasificar las neuronas y otros tipos de células de cualquiera de los tejidos del cerebro adulto fresca o congelada. Como se mencionó en la introducción, la capacidad de utilizar tejido congelado permite la utilización óptima de muestras de animales que han sido sometidos a procedimientos conductuales complejas y prolongadas, tales como estudios de autoadministración y la recaída en la adicción a la investigación. Estos procedimientos conductuales suele tardar 1 - 2 horas o más, y requieren que todos los animales (10 - 20 en total), se examinen en el mismo día 13,18. Se necesita ~ 4 horas para procesar 4 muestras de tejido cerebral recién disecados, que incluye la disección del cerebro, la disociación celular, la permeabilización y inmunomarcación. Después del procesamiento, clasificación por FACS cada muestra dura entre 20 - 30 min. El paso final de calentamiento de las células clasificadas en el tampón de lisis requiere otro 30 min. En total, ~ 7 horas se requiere la disección de cerebro para el paso de la solución de lisis celular que contiene ARN final. Sin embargo, ahora es posible congelar Brai todons o recién disecados regiones del cerebro inmediatamente después de las pruebas, y las procesan posteriormente. Esto simplifica enormemente la prueba y permite múltiples áreas del cerebro que ser ordenados en un día diferente. Congelar el tejido antes de la FACS también puede mejorar los resultados. Más neuronas NeuN-positivos se obtienen a partir de muestras de tejido congelado. Esto podría ser explicado en parte por el aumento de NeuN-etiquetado debido a la interrupción de las membranas celulares durante la congelación y posterior descongelación, lo que aumentaría el acceso de anticuerpos a las proteínas intracelulares, tales como NeuN y Fos. Efectos similares se han observado con fibroblastos, células epiteliales y células HeLa 19.
El rendimiento de las células y las neuronas se puede maximizar el uso de los siguientes pasos. Durante la disección de los tejidos, eliminar la mayoría de la materia blanca (cuerpo calloso y la comisura anterior para los accumbens estriado dorsal y el núcleo, respectivamente). Esto evita que el tejido se adhiera a la punta de plástico y pipetas de vidrio en el ste subsiguientePD. Uso tampón A (ver especificaciones en la Tabla de Materiales y Reactivos) para mantener el tejido diseccionado cubierta. Esto mejora la calidad de las células durante el picado del tejido con la hoja de afeitar (paso 2.5). El juego extra de 3 pasos de trituración con la pipeta de vidrio más pequeño (paso 3.9) y posterior filtrado con un segundo conjunto de tamices de células (paso 5) duplica el rendimiento de células y neuronas. La reutilización de los filtros celulares va a obstruir los filtros y el rendimiento de células inferior. Sea amable con las células cuando la resuspensión de los sedimentos y durante la trituración. El uso de una punta de pipeta moderadamente grande durante estos pasos reducirá el daño celular debido al esfuerzo cortante. Tenga mucho cuidado con la pastilla cuando se retira el sobrenadante después de la permeabilización con etanol (paso 4.4). El sedimento es menos compacto y se puede distribuir a lo largo de la pared del tubo de microcentrífuga. Los cálculos aproximados sugieren que el rendimiento de las neuronas Fos-positivos es de aproximadamente 10% del número a partir de la muestra de tejido estriatal diseccionado. El actual protocolo puede ser modificado para adaptarse a otros objetivos experimentales. En el protocolo actual, se recogió el tejido 90 minutos después de las inyecciones de metanfetamina porque Fos expresión alcanza niveles máximos en este momento, que es crucial para la clasificación eficiente de las neuronas que expresan Fos. Sin embargo, el tejido se pueden recoger en cualquier punto de tiempo para FACS, dependiendo del objetivo específico del experimento. Para el almacenamiento de la muestra inicial del tejido, se ha utilizado con éxito el tejido recién disecados, tejido congelado después de la disección, o tejido congelado diseccionado de todo el cerebro congelado para aislar neuronas que expresan Fos-utilizando FACS seguido por análisis de qPCR de la expresión génica. Para la fijación y permeabilización, la duración y la temperatura en este protocolo (4 ºC durante 15 min) fue optimizado para permeabilizar ambas membranas citoplasmáticas y nucleares, así como para fijar el tejido. Las variaciones en la duración y / o la temperatura pueden cambiar los resultados finales. Otras soluciones de fijación, tales como paraformaldehyde y detergentes no iónicos tales como saponina, que han trabajado para que las neuronas embrionarias y postnatales 20, también pueden trabajar para las neuronas de un cerebro adulto. Además, los granos de eliminación de mielina se pueden utilizar como una modificación del protocolo actual, como se muestra recientemente por FACS a partir de tejido cerebral 21.
El protocolo actual tiene dos limitaciones importantes a considerar. En primer lugar, este protocolo no es adecuado para la detección de marcadores de fenotipo de células que se expresan principalmente en las sinapsis (receptores por ejemplo, dopamina o glutamato) debido a que estos procesos celulares se retiran de los cuerpos celulares durante las etapas de trituración y disociación. Una segunda limitación es posible que las longitudes de ARN obtenido de células clasificadas-FACS pueden no ser suficientes para todos los métodos de análisis de RNA. números de la integridad del ARN (RIN) para ARN obtenido de FACS ordenados células son entre 2.5- 3.5, que corresponde a longitudes de ARN promedio más corto. Aquí, el tamaño más corto RNA fue compensado porutilizando amplicones relativamente cortos qPCR de 80 a 100 pb, como se describió anteriormente 13-15. También hemos utilizado estos ARN de longitud más corta con éxito para el análisis de microarrays 11. Sin embargo, las longitudes cortas de ARN obtenidos pueden no ser adecuados para todos los métodos de análisis de ARN. Debe hacerse hincapié en que se utilizaron cebadores de PCR que exón-exón cruces dirigidos específicamente encuentran sólo en el ARNm totalmente empalmado en el citosol. Estos cebadores no detectan ARN que contiene intrón del núcleo. Además, hemos utilizado previamente este protocolo con anticuerpos y el tejido cerebral fresco para detectar la tirosina hidroxilasa en los receptores de dopamina D1 en citosol y la membrana celular 10. La detección de estos marcadores de membrana citosólica y de células indicó que el procedimiento de disociación produce células intactas en gran medida, y no simplemente núcleos.
En general, FACS aislamiento de las neuronas a partir de muestras congeladas abre otras aplicaciones. No hay diferencias en la clasificación o expre gense observaron fisión (datos no mostrados) cuando las muestras se almacenaron 3 días o 3 semanas a -80 ºC. Tres semanas es un tiempo razonable para ordenar todas las muestras de un experimento específico (20 - 40 muestras) y aislar el ARN para la expresión génica. RNA utilizable también se ha obtenido a partir de tejido cerebral almacenado durante 6 meses a -80 ºC (datos no presentados aquí). Por lo tanto, este protocolo podría ser útil para el aislamiento FACS de congelados muestras de cerebro humano post-mortem que se almacena durante varios meses o incluso años.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
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