Introduction
Immuunsysteem activeringssysteem voorkomt in meerdere nierziekten en pathofysiologische processen 6,10,11,13. Potentiële gebieden actief onderzoek omvatten de verschillende triggers voor activering van het immuunsysteem, verschillende celtypen betrokken, het cytokine / chemokine patroon in een bepaalde instelling ziekte modulatie van alle bovengenoemde processen een bepaald geneesmiddel etc. Om illustreren, ischemie-reperfusie verwonding (een model voor acuut nierfalen), er een toename in immune cellen of beenmerg afgeleide hematopoietische cellen of CD45 + cellen binnen enkele uren, die wordt ondersteund door de periode van herstel of fibrose (6 weken later) 5, 12. Deze immuunsysteem cellen scheiden zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire cytokines en chemokines het herstelproces 5,12 orkestreren. Momenteel is de mogelijkheid om meerdere fluoroforen gelijktijdig om celpopulaties label in een enkele celsuspensie toe met de advertentievent van moderne machines met flowcytometrie 04:56 lasers. Dit heeft een aanzienlijke bijdrage aan de mogelijkheid om de celpopulaties op basis van de functionele status 3,7 discrimineren. Bijvoorbeeld, om nauwkeurig te etiketteren een macrofaag als F4 / 80 laag CD11b hoge Ly6b hoge CD206 laag, ten minste 3 meer fluoroforen nodig zou zijn in hetzelfde monster volume gate voor levende cellen, CD45 + (leukocyten) en Ly6G- (neutrofielen) en dit is zeer goed mogelijk met de nieuwere flowcytometers 3. De stroomafwaartse testen voor cytokine secretie, celproliferatie, cytotoxiciteit, macrofaagactivering en kwantificering van aantallen verschillende subsets van lymfocyten en monocyten moet niet alleen goede kwaliteit (levende cellen, singlets) maar voldoende aantallen cellen.
Het immuunsysteem in de nier is opgebouwd uit zowel adaptieve en aangeboren componenten en meerdere celtypen 1,7,13. Bijvoorbeeld, bij muizen de twee kidneys elkaar worden gerapporteerd aan 2-17% bevatten (28,000-266,000) CD45 + cellen van het totale nier immuuncellen geïsoleerd (1,4 x 10 6 cellen) en ongeveer 5-15% (1,400-4,200) van deze CD4 + -cellen 1 , 5,12. Een klein percentage (5-15%, 70-630) van deze CD4 + cellen Foxp3 + cellen (figuur 1) 1. Door deze trapsgewijze verlaging percentages cellen soms celpopulatie (in dit geval CD45 + CD4 + Foxp3 + cellen) wordt voorgesteld met slechts ~ 100 cellen. Het kleine aantal CD45 + CD4 + Foxp3 + cellen maakt het noodzakelijk dat een groot aantal totale cellen worden geïsoleerd en de cellen zijn van goede kwaliteit voor downstream studies zoals cytokine secretie assays. Bovendien kan het nodig zijn nieren combineren 2-3 muizen aangezien de subpopulaties niet hoog genoeg getallen worden kwantificeerbare assays. Dus betrouwbare en efficiënte isolatie van nier mononucleaire celpopulaties is wenselijk om study de immunologische spectrum geassocieerd met nierziekten.
Traditioneel, voor het isoleren van mononucleaire cellen nieren, onderzoekers hebben verschillende enzymatische digesties zoals collagenase 1A of II zoals DNase 1 1,5,12 gebruikt. Het is bekend dat collagenasen hebben enzymatische activiteit die varieert met lotnummers en bedrijf van vervaardiging, noodzakelijk titratie de optimale concentratie en de incubatie 4,14,15. Daarnaast digestie met collagenase voegt tijd voor hakken de nier in kleine stukjes, noodzakelijk incubatie van de nier stukken in een verwarmde (37 ° C) bad en extra tijd voor incubatie in EDTA voor het stoppen van de reactie. Bovendien kunnen minder steriliteit worden bereikt voor bepaalde stroomafwaartse procedures nodig celkweek. Belangrijker is afhankelijk van de onderzoeker en alle variabelen betrokken, leidt de variabiliteit van de gegevens en interpretatie in laboratoria. Onlangs heeft deontwikkeling van mechanische weefsel verstoorders / homogenisatoren 16, wordt de collagenase digestie stap volledig worden vermeden en vervangen door een eenvoudige mechanische verbreking van de nieren 2. Hierin tonen we een eenvoudige maar efficiënte methode voor het isoleren van de nier immuuncellen voor dagelijks immuuncel extracties. Belangrijk Deze techniek kan worden aangepast aan andere zachte en non-vezelige weefsels zoals de lever en hersenen 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocol stappen uitgevoerd werden beoordeeld en door de Universiteit van Missouri Animal Care en gebruik Comite (ACUC) goedgekeurd. Voor dit protocol werden mannelijke C57BL / 6 muizen 15 weken oud gebruikt hoewel theoretisch geen knaagdieren op elke leeftijd kan worden gebruikt voor experimenten. Aangezien dit een niet-survival operatie wordt euthanasie bereikt door verbloeding en bilaterale pneumothorax.
1. perfusie van de nieren
Opmerking: perfusie van organen zoals hart, lever en nieren verwijdert het bloed die kunnen interfereren met de interpretatie van gegevens. Dus als we perfuseren mogelijk altijd de organen.
- Plaats de muis per isofluraan (3 ml / min) inductie kamer tot hij onbeweeglijk. Verwijder vervolgens de muis uit de kamer, leg het dorsaal op de snijtafel en plaats de isofluraan kegel op de muis neus en duw isofluraan met een snelheid van 1,5 ml / min door de toezichthouder.
- Controleer de teen knijpen response met een pincet te beoordelen of het dier een chirurgische vlak van anesthesie is bereikt. Maak de ventrale buik met een zoutoplossing en opengesneden de buik met een schaar en duw de buikorganen (uit het chirurgische veld) aan de linkerkant van de muis.
- Verzamelen bloed uit de vena cava inferior met een 25 gauge naald bevestigd aan een 1 cc injectiespuit toevoegen aan een 1,5 ml microcentrifugebuis met 10 gl 0,5 M EDTA.
Let op: De inzameling van bloed is optioneel. Plasma kan worden gebruikt voor biochemische metingen. Leukocyten kunnen worden gebruikt voor flowcytometrie assays. - Met een schaar, een kleine snee in de rechter atria te laten uit het mengsel van bloed en PBS uit de volgende stap.
- Neem een 50 cc spuit en vul met ijskoude PBS (20-30 cc). Maak vervolgens een 21-25 G op de spuit, doorboren de linker ventrikel op de top (terwijl het hart voorzichtig tussen forceps) en langzaam perfuseren de linker hartkamer met fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS) in de loop1-2 min.
Opmerking: Het hart blanches onmiddellijk na de eerste paar milliliters perfusie. Let op de lever voor het blancheren, omdat dit aangeeft dat de perfusie wordt het aftappen van bloed uit de lever via veneuze terugkeer door de vena cava. Bovendien, zorg ervoor dat de longen niet zijn uit te breiden tijdens de infusie, omdat dit aangeeft punctie van de rechter hartkamer. Als de longen waren om uit te breiden, in te trekken van de naald enigszins terug in de linker hartkamer en voortzetting van de perfusie. De duur van de eerste incisie tot euthanasie wordt bereikt minder dan 2 minuten
2. Dissectie van Nieren
- Na perfusie is voltooid, gebruik dan een schaar en een tang om de rechter nier van haar bijlagen (bloedvaten, vet en bijnieren) en accijnzen ontleden.
- Verwijder voorzichtig de capsule die de nier door het snijden en ontleden met een pincet. Weeg de nier.
Let op: Wegen van de nier is optioneel. Sommige experimentenkan leiden tot een verandering in nier afmeting / gewicht dat kan worden gebruikt om mobiele opbrengst per gram weefsel normaliseren. - Na weging van de nier, plaats het in 1 ml RPMI-1640 bevattende 0,5% FBS of flowcytometrie kleuring bufferoplossing (50 ml conische schroefdop tube) en plaats de buis op ijs tot verder gebruik.
Opmerking: Voor het gemak van beschrijving, zullen de rest van de isolatie van immuuncellen in de flowcytometrie kleuring bufferoplossing beschrijven. Daarnaast zullen we de isolatie van immuuncellen beschrijven van een nier, hoewel beide nieren of 1 + 1/3 e van de nieren kan worden gebruikt afhankelijk van de stroomafwaartse experimenten (optioneel). 1/3 van de nier kan worden ingevroren voor eiwit / RNA experimenten en 1/3 rd kunnen buffers voor immunohistochemie of transmissie-elektronenmicroscopie worden geplaatst.
3. homogenisering van Nieren
- Label een 5-80 ml homogenisering zak met het monster identificatie-informatie,Verwijder de binnenkant zeef (STR) en gooi deze weg. Vul de zak met 5 ml ijskoude flowcytometrie vlekken buffer bevat en hevel nier aan de buffer. Herhaal dit proces voor een tweede monster of meer monsters die verwerking nodig.
- Vouw de homogenisering zak in tweeën, zodat één helft heeft de nier ondergedompeld in de flowcytometrie Staining Bufferoplossing en de andere helft is gewoon omgevouwen is.
- Zet het weefsel homogenisator en zet deze op een snelle (instelling) rpm. Plaats de gevouwen homogeniseren zak met de nieren tegenover de peddel, nabij de onderrand maar zorg ervoor dat het ondereinde van de zakken niet schuiven onder de onderrand van de schoepen.
- Verwerk de tweede monster tegelijk want er zijn 2 peddels. Selecteer tijd 120 sec. Observeer de schoepen heen en weer te schuiven om de nieren homogeniseren.
Opmerking: Ondertussen kan deze downtime worden gebruikt om 2 meer nier (of ander weefsel) bereid monsters tijdens de eerste twee verwerken. - Na het voltooien van de eerste set van homogenisering, de overdracht van de zakken om ijs en plaats het weefsel homogenisator met de volgende set van monsters en ga zo maar door. Visueel ervoor te zorgen dat de nieren voldoende gehomogeniseerd en er geen grote brokken zichtbaar zijn.
Opmerking: In het algemeen, 2 min in weefselhomogenisator bij hoge rpm is voldoende voor de nier. - Plaats een 100 urn cel zeef in de 50 ml conische buis op ijs. Vervolgens pipet het homogenaat volledig aan de cel zeef. Stel een vloer centrifuge bij 50 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en de samples in de centrifuge.
Opmerking: Centrifugeren zal ervoor zorgen dat alle homogenaat (bevattende cellen) door de cel zeef is gepasseerd. - Verwijder de buizen uit de centrifuge en weer terugplaatsen op ijs. Gooi de cel zeven en houden het homogenaat. Voeg gelijk volume (~ 6 ml) 1x RBC lysis buffer om de celpellet / supernatant en de pipet op en neer meerdere keren een uniforme celsuspensie te maken. Visually, observeren enkele van de rode kleur in de suspensie daling onmiddellijk. Laat de buizen op ijs gedurende 5 min maximaal RBC lysis te bereiken.
Let op: de RBC lysis stap kan worden overgeslagen als de onderzoeker heeft er alle vertrouwen van de nier perfusie en minder celmanipulatie gewenst is. We hebben een aanzienlijke toename niercellijn opbrengst waargenomen door niet onderwerpen van de celsuspensie RBC lysis. - Draai de buizen in de centrifuge die is ingesteld op 500 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten om een celpellet te vormen.
Opmerking: Tijdens stappen 3.6 en 3.7, voor te bereiden op colloïdaal silica (Percoll) op basis van dichtheidsgradiënt centrifugeren.- Neem 10 ml ronde bodem polypropyleen buizen en label ze met de bijbehorende aantallen monsters en leg ze in een buis rek.
Opmerking: Het volgende beschrijft hoe voldoende dichtheidsgradiënt reagentia te maken voor 4 niermonsters. - Neem 7 ml van flowcytometrie vlekken buffer oplossing en pipet het in een 15 ml conische buis. Voeg 1 ml van 2 M sucrose totbereiden 0,25 M sucrose.
- Vervolgens neemt 7,2 ml dichtheidsgradiënt reagens en pipet in een andere 15 ml conische buis. Voeg 1,55 ml flowcytometrie vlekken buffer-oplossing en 1,25 ml van 2 M sucrose voorbereiden 72% dichtheidsgradiënt reagens en 0,25 M sucrose.
- Pipetteer 1 ml van 72% dichtheidsgradiënt reagens in een ronde bodem polypropyleen buis voor elk monster.
- Neem 10 ml ronde bodem polypropyleen buizen en label ze met de bijbehorende aantallen monsters en leg ze in een buis rek.
4. gradiëntcentrifugering
- Na stap 3.7, nemen de buizen uit en voorzichtig decanteren van de bovenstaande vloeistof in een vloeiende beweging en ook decanteren de volgende druppel vloeistof die zich vormt, terwijl de buis ondersteboven wordt gehouden.
Opmerking: Deze stap is belangrijk omdat het achterlaten van overtollige vloeistof kan de dichtheidsgradiënt genoeg variatie in de opbrengst te creëren. Wanneer de buis weer rechtop is ingesteld, ~ 200-300 ul van vloeistof blijft bij de cel pellet. - Pipetteer 1 ml van 0,25 M sucrose op de celpellet en voorzichtig maar krachtig pipet op en neer om brinG de cellen om een uniforme suspensie. Voeg vervolgens de celsuspensie aan 1 ml 72% dichtheidsgradiënt reagens (3.7.4) en opnieuw krachtig pipet om de cellen te mengen met een 36% dichtheidsgradiënt reagens te vormen.
- Neem 1 ml van de 72% dichtheidsgradiënt reagens in een polypropyleen Pasteur (transfer) pipet. Met gelijkmatige druk op de bol (houdt de kolom vloeistof in de punt en voorkomt belvorming), plaatst de Pasteur pipet op de bodem van de celsuspensie (36% dichtheidsgradiënt reagens) voorzichtig en verwijder een 72% dichtheidsgradiënt reagens onder vorming van een verschillende zwaarder laag.
- Zoek het monsterbuizen voorzichtig en plaats in de centrifuge, die bij kamertemperatuur gedurende deze stap. Spin gedurende 20-30 min bij 500 x g.
- Ondertussen bereiden nog twee sets van polypropyleen ronde bodem centrifugebuizen met de bijbehorende sample identifiers.
- Na stap 4.4 is voltooid, verwijdert u het monster met polypropyleen buizen voorzichtig, met een minimum aan schudden en zet het neerop de buis rek.
- Pak de eerste monsterbuis en de bijbehorende lege tube. Met een polypropyleen Pasteur pipet, grondig, maar voorzichtig met gemeten zuiging, verwijder de bovenste "junk layer" of "kleverige materiaal" en zet hem in de lege ronde bodem centrifugebuis.
- Gaat het verwijderen van het bovenste deel van de gradiënt tot de "buffy coat" wordt bereikt (verschijnen gebroken wit met een roodachtige tint [rode bloedcellen]). Stop met het afzuigen als een hoogte van ~ 3 mm is bereikbaar vanaf de "buffy coat".
Opmerking: Zorg ervoor dat dit soort dingen helemaal is verdwenen uit het bovenste gedeelte van de helling alvorens verder te zuigen.
- Gaat het verwijderen van het bovenste deel van de gradiënt tot de "buffy coat" wordt bereikt (verschijnen gebroken wit met een roodachtige tint [rode bloedcellen]). Stop met het afzuigen als een hoogte van ~ 3 mm is bereikbaar vanaf de "buffy coat".
- Neem een frisse Pasteur pipet en een nieuwe ronde bodem centrifugebuis en verwijder voorzichtig de buffy coat. Blijven zuigen 3-5 mm onder de bufferlaag, zodat de meeste van de cellen verzameld en toegevoegd aan de 2e nieuwe ronde bodem buis met geschikte monsteridentificator.
- Voeg 1-2 ml of Flowcytometrie kleuring Bufferoplossing de 2e buis en meng goed door en neer te pipetteren.
- Spin down de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Een 2 e wasstap met flowcytometrie kleuring Buffer oplossing is optioneel. Resuspendeer in 500 pi van flowcytometrie vlekken buffer oplossing en ga aan de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.
5. Optioneel (Cell Labeling)
- Aliqout elk monster voor hetzelfde aantal cellen. Voeg het blokkerende antilichaam bij een verdunning van 0,5 g per 10 6 cellen (anti-CD16 / CD32 FcR) en incubeer op ijs gedurende 15 min.
- Voeg de gewenste cocktail van primaire antilichamen (geconjugeerd met de geschikte fluoroforen) die bepaald goed met elkaar door de onderzoeker vóór het eigenlijke experimenten. Incubeer op ijs gedurende 30 min. Was de cellen met PBS.
Opmerking: Voor de demonstratie van de nieren immuuncel labeling voor dit manuscript, gebruikten we een T-lymphocyte en een macrofaag / dendritische cel panel. De T-lymfocyten panel bestond uit opgelapt levensvatbaarheid Stain FVS510, anti-CD45 (kloon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16) APC, Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Kloon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (kloon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (kloon: 53-6,7) BV785. De macrofaag panel bestond uit opgelapt levensvatbaarheid Stain FVS510, anti-CD45 (kloon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC, anti-CD11b (Clone: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Clone: BM8) APC, Anti-CD 11 c (Clone: N418) BV785. - Voeg de opgelapt levensvatbaarheid Stain en laat op de bank-top gedurende 5 minuten. Was de cellen met flowcytometrie kleuring Buffer oplossing voor overschrijding van de opgelapt levensvatbaarheid Stain verwijderen.
- Voeg Fixatie / permeabiliseringsreagens en incubeer overnacht bij 4 ºC. Wassen in permeabilisatie oplossing.
- Voor intracellulaire kleuring blok opnieuw met anti-CD16 / 32 FcR voor 10min. Voeg de intracellulaire vlekken en incubeer gedurende 20-30 min. Wash 2x in permeabilization oplossing.
- Resuspendeer in Flowcytometrie vlekken buffer oplossing en run monsters door middel van FACS-machine 3,9.
- Verwerk de tweede monster tegelijk want er zijn 2 peddels. Selecteer tijd 120 sec. Observeer de schoepen heen en weer te schuiven om de nieren homogeniseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het aantal panelen kan worden uitgevoerd afhankelijk van het aantal immuuncellen die betrouwbaar uit de nieren kan worden gewonnen. Hierin tonen we de mogelijkheid om panelen 2, een voor T-lymfocyten en voor macrofagen / dendritische cellen in werking. Op de T-lymfocyten panel, moeten we eerst kijken naar de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) patroon en de afbakening van de populatie van belang, zoals weergegeven in figuur 1 (linksboven puntdiagram). Vervolgens levensvatbaarheid marker, in dit geval een fixeerbaar levensvatbaarheid kleuring (FVS510) wordt gebruikt om dode cellen uit de analyse (figuur 1, bovenste middenpunt grondstuk) uitsluiten. CD45, een marker voor beenmerg afgeleide hematopoëtische cellen wordt meestal gebruikt om de nier immuuncellen bakenen en deze variëren meestal 2-18% van de totale nier immuuncellen afhankelijk van de leeftijd, geslacht, ras, ontsteking van de muis (Fig 1, rechtsboven dot plot). Van de CD45 + sup> beenmerg afgeleide hematopoietische cellen, kan men ofwel hek aan CD3 epsilon als marker voor T-lymfocyten of naar het CD4 + / CD8 + om de effector / cytotoxische cellen uit het beenmerg afgeleide hematopoietische cellen scheiden (figuur 1, rechtsonder dot blot). Typisch meer dan CD4 + CD8 + cellen waargenomen. Verdere karakterisering van de CD4 + cellen bleek ~ 8,8% FoxP3 + cellen die waarschijnlijk T-regulerende cellen (Figuur 1, midden onder dot plot) zijn. Meer gedetailleerde karakterisering van merkers zoals CD25 en CD127 bevatten te onderscheiden welke subset veranderd afhankelijk van de populatie van belang. CD127 is grotendeels een marker voor FoxP3- cellen en dit wordt verder ontleed door het gebruik van CD44 als marker van de activering, CD44 + CD127 lo / - best lijken op geactiveerde effector cellen versus CD44 + CD127 + cellen die het best lijken effector geheugencellen.
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Voor de macrofaag / dendritische cel paneel, de eerste poorten zijn hetzelfde, zoals de FVS510 gebaseerde scheiding van levende / dode (figuur 2, bovenste 2e van links dot grondstuk) en CD45 poorten naar het beenmerg afgeleide hematopoietische cellen scheiden (boven 2 e van rechts puntdiagram). Vervolgens worden de CD45 + cellen worden gated verschillende manieren. We gated ze op Ly6G hier om neutrofielen te scheiden van de rest van de monocyten ie macrofagen / dendritische cellen, (figuur 2, rechts boven dot plot). Vervolgens Ly6G- cellen werden gated op CD11b en F4 / 80 tot subsets van macrofagen en dendritische cellen te identificeren (Figuur 2, onder 2e van links dot plot). Gating op Ly6C identificeert het percentage van de infiltrerende / inflammatoire monocyten / macrofagen (bottom 2e van rechts histogram) en CCR2 en CX3CR1 identificeert de macrofagen die werden aangeworven (figuur 2, rechtsonder dot plot). Linksonder most paneel identificeert meeste cellen zoals dendritische cellen, een onderste deel daarvan via CCR2 expressie werden gerekruteerd.
Figuur 1:. Vertegenwoordiger Dot Plots Toon T-lymfocyt subset Isolatie Linksboven is een typisch voorwaartse (FSC) en aan de zijkant (SSC) scatter profiel van de nieren immuuncellen in de Flo Jo software. Top middelste paneel is omheind op een opgelapt levensvatbaarheid Stain (FVS510) en de live bevolking aan de linkerzijde wordt dan gated op CD45 voor beenmerg afgeleide immuuncellen. CD45 + cellen zijn gated voor CD4 (effector) en CD8 (cytotoxische) cellen (Neder-rechter paneel). Middelste paneel toont het aantal CD4 + cellen die zijn Foxp3 + (regulatoire T-cellen). Linker paneel probeert te plagen uit hoeveel van de CD4 + Foxp3- cellen worden geactiveerd effector CD44 + CD127 lo / - versus geheugen effector CD44 + CD127
Figuur 2:. Vertegenwoordiger Dot Plots Display monocyten-Cell subset Isolatie Nogmaals, linksboven is een typisch voorwaartse (FSC) en aan de zijkant (SSC) scatter profiel van de nieren immuuncellen in de Flo Jo software. Top 2e van links dot plot is omheind op een opgelapt levensvatbaarheid Stain (FVS510) en de live bevolking aan de linkerzijde wordt dan gated op CD45 voor beenmerg afgeleide immuuncellen (Top 2e van rechts puntdiagram). CD45 + cellen zijn gated voor Ly6G (neutrofielen, rechtsboven puntendiagram) om te scheiden voor macrofagen en dendritische cellen. Gating op Ly6C identificeert het percentage van de infiltrerende / inflammatoire monocyten / macrofagen (bottom 2e van rechts histogram) en CCR2 en CX3CR1 identificeert de macrofagen die werden aangeworven (figuur 2, rechtsonder dot plot). Linksonder meest paneel identificeert de meeste cellen als dendritische cellen, een lager gedeelte van die via CCR2 expressie werden gerekruteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1:. Reagentia en apparatuur die nodig is voor immuuncel isolatie van de Nier Zie Materials tabel.
Tabel 2:. Lijst die totale cellen en CD45 + geïsoleerd in de Overeenkomstige Prep Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben hier voorgesteld een methode om immune cellen van de nier op betrouwbare en efficiënte wijze te verkrijgen. De belangrijkste wijziging van de veelgebruikte collagenase digestie stap (mechanische verbreking van weefsel) bespaart ongeveer 30 min en de isolatie van een groot aantal levensvatbare immuuncellen duurt minder dan twee uur 4 niermonsters. Bovendien, afhankelijk van onze vraagstelling we nu met een enkele nier (de andere nier kan worden gebruikt voor eiwitanalyse door Western blots, immunohistochemie en mRNA analyse door PCR) voor onze immuuncel isolatie en routinematig krijgen ~ 2 x 10 6 cellen per isolement. We hebben deze methode om een groot aantal immuuncellen uit de lever en hart isoleren (multi-enzym digestie voor het hart in combinatie met mechanische verbreking, gegevens niet getoond), maar zijn ervan overtuigd dat mechanische verbreking kunnen worden toegepast op andere niet-vezelige weefsels zoals de 16 brain.
Zoals bij elk protocol isOlate immuuncellen uit weefsels, die vastzit aan detail is van cruciaal belang voor succes. Als perfusie van de nieren kritisch, de oefening nodig is het plaatsen van de naald in de kern om te voorkomen fibrilleren of doordringen te ver naar rechterventrikel. Een alternatief voor het zetten van een naald in het hart is om de aorta boven de nierslagader canule en perfuseren de nieren 8. Daarnaast zijn er andere suggesties bij de auteurs tot de isolatie van immuuncellen betrouwbaar en uniform te maken. De nieren dienen adequaat gepureerd en er geen grote brokken moet zichtbaar zijn. Indien dit niet het geval is, een herhaling van het mechanisch afbreken moet het probleem oplossen. De mechanisch verstoord weefsel moet door middel van de juiste maat filter worden doorgegeven om cellen van alle soorten en maten op te nemen. Bijvoorbeeld kunnen sommige macrofagen / dendritische cellen populaties uitgesloten bij gebruik van een 40 um maaswijdte tegenstelling tot het gebruik van een 100 urn mesh (macrofagen / dendritische cellen variëren in grootte10-40 pm). Echter, aan de andere kant, meer nier epitheel- en andere cellen kunnen worden opgenomen in de uiteindelijke analyse veranderen van de percentages van immuuncelpopulaties. Wij geloven dat allesomvattend verhoogt de vertegenwoordiging van ondervertegenwoordigd populaties en dus verbetert de betrouwbaarheid van de prep.
Bij het toevoegen van de celsuspensie aan de dichtheidsgradiënt reagens moet de cellen worden geresuspendeerd in maximaal 200-300 pl van flowcytometrie Staining Bufferoplossing. De vorming van de 36%: 72% helling moet worden gewaarborgd. Voor deze, de introductie van de overdracht pipet die de 72% dichtheidsgradiënt reagens in de 36% dichtheidsgradiënt reagens zacht moet zijn, mag niet bellen en een duidelijke afbakening te zien tussen de hellingen te verlaten. Zoveel mogelijk moet centrifugering van cellen in dichtheidsgradiënt reagens worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Volledige verwijdering van het "celresten" aan het bovenoppervlak van het verloop na de spin moet worden gewaarborgd. Anders zal het interfereren met de cel opbrengst en de kwaliteit van de prep. Zorg ervoor dat de kleinste cellen op het hemocytometer uit te sluiten. Deze zijn overgebleven RBC. Dit is vooral belangrijk wanneer de RBC lysis stap wordt weggelaten. Er is een beperking aan de werkwijze. Niet alle cellen die met deze methode een immuuncel. Een groot percentage cellen zijn epitheelcellen (proximale tubulus, distale tubulus en glomerulus). Echter kan deze beperking worden gebruikt om voordeel een onderzoeker als kwesties in verband met niet-immune cellen kan worden beantwoord.
Tot slot is de werkwijze voor de isolatie van de immuuncellen van de nier hier gepresenteerde is algemeen toepasbaar en kunnen worden aangepast door de meeste laboratoria hun onderzoek. Wij geloven dat deze techniek kan worden gebruikt voor andere niet-vezelige weefsels zoals de lever en de hersenen ook. Isolatie van een groot aantal immuuncellen zal ook helpen om ambitieuzere downstream-experimenten zoals pro ontwerpenproliferatie assays, cytokine secretie assays en isoleren van een subset van cellen gebaseerd op oppervlakteantigenen. Uiteindelijk hopen we dat deze methode immuuncel isolatie dwz zal standaardiseren voorkomen dat verschillende niveaus van enzymatische afbraak van oppervlakte-antigenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
