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Immunology and Infection

किडनी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्वसनीय और उच्च क्षमता निष्कर्षण

Published: August 19, 2016 doi: 10.3791/54368
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 2Division of Biomedical Sciences, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 3Division of Endocrinology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital

Introduction

इम्यून सिस्टम सक्रियण कई गुर्दे की बीमारियों और pathophysiological प्रक्रियाओं 6,10,11,13 में होता है। सक्रिय अनुसंधान के संभावित क्षेत्रों की प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के लिए विभिन्न चलाता धरना, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं शामिल है, किसी विशेष बीमारी की स्थापना में साइटोकाइन / केमोकाइन पैटर्न, एक विशेष दवा आदि से ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाओं के सभी के मॉडुलन ischemia-reperfusion में उदाहरण देना करने के लिए, चोट (तीव्र गुर्दे की चोट के लिए एक मॉडल), वहाँ कुछ ही घंटों के भीतर hematopoietic कोशिकाओं या CD45 + कोशिकाओं ली गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं या बोन मैरो में वृद्धि हुई है, जो मरम्मत या फाइब्रोसिस की अवधि के माध्यम से निरंतर है (6 हफ्ते बाद) 5 है, 12। ये प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मरम्मत 5,12 की प्रक्रिया आर्केस्ट्रा दोनों समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines छिपाना। वर्तमान में, एक एकल कक्ष निलंबन में सेल आबादी लेबल करने के लिए एक साथ कई fluorophores उपयोग करने की क्षमता विज्ञापन के साथ बढ़ गया हैचार से पांच लेज़रों के साथ मशीनों cytometry आधुनिक प्रवाह के वेंट। यह काफी हद तक सेल उनके कार्यात्मक स्थिति 3,7 के आधार पर आबादी भेदभाव करने की क्षमता को जोड़ा गया है। उदाहरण के लिए, सही रूप में एक बृहतभक्षककोशिका लेबल करने के लिए के रूप में F4 / 80 कम CD11b उच्च Ly6b उच्च CD206 कम है, कम से कम 3 अधिक fluorophores ही नमूना मात्रा में गेट को जीवित कोशिकाओं, CD45 + (ल्यूकोसाइट्स) और Ly6G- (न्यूट्रोफिल) और के लिए आवश्यक होगा यह बहुत ज्यादा नए प्रवाह cytometers 3 के साथ संभव है। हालांकि, साइटोकाइन स्राव, सेल प्रसार, cytotoxicity, बृहतभक्षककोशिका सक्रियण और लिम्फोसाइटों और monocytes के विभिन्न कैंपेन्स के नंबरों की मात्रा का ठहराव के लिए नीचे की ओर assays न केवल अच्छी गुणवत्ता (जीवित कोशिकाओं, singlets), लेकिन कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या की जरूरत है।

गुर्दे में प्रतिरक्षा प्रणाली को दोनों अनुकूली और सहज घटकों और अनेक प्रकार की कोशिकाओं 1,7,13 से बना है। उदाहरण के लिए, चूहों में दो बच्चेneys एक साथ 2-17% रोकने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं (28,000-266,000) CD45 + कुल गुर्दे की प्रतिरक्षा (1.4 x 10 6 कोशिकाओं) और 5-15% के बारे में (1,400-4,200) इनमें से अलग कक्षों की कोशिकाओं CD4 + कोशिकाओं कर रहे हैं 1 , 5,12। इन सीडी 4 + कोशिकाओं के एक छोटे प्रतिशत (5-15%, 70-630) Foxp3 + कोशिकाओं (चित्रा 1) कर रहे हैं 1। कोशिकाओं के प्रतिशत में ये कदम बुद्धिमान कटौती, ब्याज की कभी कभी सेल की आबादी (इस मामले CD45 + CD4 + Foxp3 + कोशिकाओं में) के कारण एक मात्र ~ 100 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है। CD45 + CD4 + Foxp3 + कोशिकाओं की संख्या में छोटे यह जरूरी कुल कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या अलग कर रहे हैं और कोशिकाओं ऐसे साइटोकाइन स्राव assays के रूप में नीचे की ओर अध्ययन के लिए अच्छी गुणवत्ता के हैं कि बनाता है। इसके अलावा, यह 2-3 चूहों से गुर्दे गठबंधन करने के बाद उप-जनसंख्या उच्च पर्याप्त संख्या में प्रतिनिधित्व मात्रात्मक assays प्रदर्शन करने के लिए नहीं कर रहे हैं आवश्यक हो सकता है। इसलिए, गुर्दे mononuclear सेल आबादी के विश्वसनीय और कुशल अलगाव आदेश संवर्धन करने में वांछनीय हैY प्रतिरक्षात्मक गुर्दे की बीमारियों के साथ जुड़े स्पेक्ट्रम।

परंपरागत रूप से, गुर्दे की कोशिकाओं mononuclear के अलगाव के लिए, जांचकर्ताओं ऐसे कोलैजिनेज़ 1 ए या DNase 1 1,5,12 सहित द्वितीय के रूप में एंजाइमी digestions की एक किस्म का इस्तेमाल किया है। यह सर्वविदित है कि collagenases enzymatic गतिविधि है कि, बहुत संख्या के साथ और निर्माण की कंपनी से भिन्न होता है इष्टतम एकाग्रता और ऊष्मायन 4,14,15 की अवधि के लिए अनुमापन की जरूरत महसूस की है। इसके अलावा, कोलैजिनेज़ साथ पाचन छोटे टुकड़ों में गुर्दे क़ीमा के लिए समय कहते हैं, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए EDTA में एक गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) स्नान और ऊष्मायन के लिए अतिरिक्त समय में गुर्दे टुकड़े के ऊष्मायन जरूरी है। इसके अलावा, कम बाँझपन कुछ नीचे की ओर प्रक्रियाओं सेल संस्कृति की जरूरत के लिए प्राप्त किया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, अन्वेषक और सभी चर शामिल पर निर्भर करता है, यह परिवर्तनशीलता के लिए प्रयोगशालाओं में डेटा और व्याख्या में ले जाता है। हाल ही में, के साथयांत्रिक ऊतक disruptors / homogenizers 16 के विकास, collagenase पाचन कदम पूरी तरह से परहेज है और गुर्दे 2 के एक सरल यांत्रिक व्यवधान की जगह है। इस के साथ साथ, हम हर रोज प्रतिरक्षा सेल एक्सट्रेक्शन के लिए गुर्दे की प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरल अभी तक कुशल विधि का प्रदर्शन। महत्वपूर्ण बात है, इस तकनीक को इस तरह के जिगर और मस्तिष्क के रूप में 16 अन्य शीतल और गैर रेशेदार ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

प्रदर्शन सभी प्रोटोकॉल कदम की समीक्षा की और मिसौरी पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (ACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया। इस प्रोटोकॉल के लिए, पुरुष C57BL / 6 15 सप्ताह की आयु के चूहों हालांकि किसी भी उम्र में सैद्धांतिक रूप से किसी भी कृंतक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपयोग किया गया। चूंकि, यह एक गैर-अस्तित्व सर्जरी है, इच्छामृत्यु exsanguination और द्विपक्षीय वातिलवक्ष द्वारा हासिल की है।

1. गुर्दे का छिड़काव

नोट: इस तरह के दिल, जिगर और गुर्दे के रूप में अंगों के छिड़काव रक्त जो डेटा की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हटा। इसलिए, यदि संभव हो तो हम हमेशा अंगों छिड़कना।

  1. एक isoflurane में माउस प्लेस (3 मिलीग्राम / मिनट) प्रेरण कक्ष तक यह स्थिर है। अगला, चैम्बर के बाहर माउस को दूर विदारक मेज पर पीछे की ओर इसे रखना और माउस नाक पर isoflurane कोन जगह और नियामक के माध्यम से 1.5 मिलीग्राम / मिनट की दर से isoflurane धक्का।
  2. पैर की अंगुली चुटकी respons चेकचिमटी के साथ ई आकलन करने के लिए अगर पशु संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान हासिल की है। नमक के साथ उदर पेट साफ और कटौती की कैंची के साथ पेट खोलने के लिए और माउस के बाएं तरफ करने के लिए (शल्य चिकित्सा क्षेत्र से बाहर) पेट अंगों धक्का।
  3. साथ अवर रग Cava से खून ले लीजिए एक 25 गेज एक 1 सीसी सिरिंज सुई तय की और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge 0.5M EDTA के 10 μl युक्त ट्यूब में जोड़ें।
    नोट: रक्त का संग्रह वैकल्पिक है। प्लाज्मा जैव रासायनिक माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ल्यूकोसाइट्स से फ्लो assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. कैंची का प्रयोग, अगले कदम से खून और पीबीएस के मिश्रण से बाहर जाने के लिए सही अटरिया में एक छोटे से काट कर।
  5. एक 50 सीसी सिरिंज ले लो और ठंडा पीबीएस (20-30 सीसी) के साथ भरें। अगला, सिरिंज के लिए एक 21-25 जी सुई देते हैं अपने शीर्ष पर बाएं वेंट्रिकल पंचर (जबकि संदंश के बीच धीरे दिल पकड़) और धीरे धीरे पाठ्यक्रम पर फॉस्फेट बफर खारा 7.4 पीएच (पीबीएस) के साथ बाएं वेंट्रिकल छिड़कना1-2 मिनट की।
    नोट: दिल तुरंत छिड़काव के पहले कुछ मिलीलीटर पर Blanches। , Blanching के लिए जिगर का निरीक्षण के रूप में यह इंगित करता है कि छिड़काव रग कावा के माध्यम से शिरापरक वापसी के माध्यम से जिगर से बाहर रक्त draining है। इसके अलावा, यकीन है कि फेफड़ों निषेचन के दौरान का विस्तार नहीं कर रहे हैं के रूप में यह सही वेंट्रिकल की पंचर इंगित करता है बनाते हैं। फेफड़ों का विस्तार करने के लिए गए थे, सुई बाएं वेंट्रिकल में थोड़ा वापस वापस लेने और छिड़काव जारी है। समय इच्छामृत्यु हासिल की है जब तक पहले चीरा से लिया कम से कम 2 मिनट है

2. गुर्दे के विच्छेदन

  1. छिड़काव के बाद पूरा हो, उसके संलग्नक (रक्त वाहिकाओं, वसा और अधिवृक्क ग्रंथि) और उत्पाद शुल्क से सही गुर्दे काटना करने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें।
  2. धीरे काटने और एक संदंश के साथ विदारक से गुर्दे को कवर कैप्सूल को हटा दें। गुर्दे वजन।
    नोट: गुर्दा वजनी वैकल्पिक है। हालांकि, कुछ प्रयोगोंगुर्दे आकार / वजन जो ऊतक के प्रति ग्राम सेल उपज को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में परिवर्तन हो सकता है।
  3. गुर्दे वजन के बाद, RPMI 1640 में 0.5% FBS युक्त के 1 मिलीलीटर में जगह या धुंधला बफर समाधान प्रवाह cytometry (50 मिलीलीटर शंक्वाकार पेंच टोपी ट्यूब) और आगे उपयोग तक बर्फ पर ट्यूब जगह है।
    नोट: विवरण में आसानी, हम धुंधला बफर समाधान प्रवाह cytometry में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के बाकी का वर्णन होगा। इसके अलावा, हम, एक भी गुर्दे से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करेंगे, हालांकि दोनों गुर्दे या गुर्दे की 1 + 1/3 बहाव के प्रयोगों (वैकल्पिक) के आधार पर किया जा सकता है। गुर्दे की 1/3 प्रोटीन / आरएनए प्रयोगों के लिए जमे हुए किया जा सकता है और 1/3 immunohistochemistry या संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए बफ़र्स में रखा जा सकता है।

3. गुर्दे के homogenization

  1. नमूना पहचान की जानकारी के साथ एक 5-80 मिलीलीटर क्षमता homogenization बैग लेबल,अंदर झरनी (एसटीआर) को हटाने और यह त्यागें। बर्फ के ठंडे फ्लो का बफर धुंधला समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ बैग भरें और बफर करने के लिए गुर्दे हस्तांतरण। एक दूसरा नमूना या अधिक नमूने है कि संसाधन की जरूरत के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  2. छमाही में homogenization बैग मोड़ो, कि इस तरह के एक आधा गुर्दे से फ्लो धुंधला बफर समाधान में डूबे हुए है और दूसरे आधे बस इस पर जोड़ रहा है।
  3. ऊतक homogenizer पर मुड़ें और तेजी से (सेटिंग) rpm के लिए यह निर्धारित किया है। चप्पू, नीचे बढ़त के करीब का सामना करना पड़ गुर्दे के साथ जोड़कर homogenization के बैग की जगह है, लेकिन यकीन है कि बैग के निचले सिरे पैडल के निचले सीमा से नीचे फिसलने नहीं कर रहे हैं।
    1. एक साथ दूसरा नमूना प्रक्रिया के रूप में वहाँ 2 पैडल हैं। 120 सेकंड के रूप में समय का चयन करें। निरीक्षण पैडल गुर्दे homogenize करने के लिए आगे और पीछे ले।
      नोट: इस बीच, इस डाउनटाइम जबकि पहले दो कार्रवाई कर रहे हैं 2 अधिक गुर्दा (या अन्य ऊतक) तैयार करने के लिए नमूने का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. homogenization के पहले सेट के साथ पूरा करने के बाद, बर्फ के लिए बैग हस्तांतरण और नमूने के अगले सेट और इसी के साथ ऊतक homogenizer पुनः लोड। दिखने में यह सुनिश्चित करें कि गुर्दे पर्याप्त रूप से homogenized हैं और कोई बड़ा हिस्सा दिखाई दे रहे हैं।
      नोट: आम तौर पर, तेजी से rpm पर ऊतक homogenizer में 2 मिनट के गुर्दे के लिए पर्याप्त है।
    3. एक 100 माइक्रोन सेल झरनी बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखें। अगले, सेल छलनी करने के लिए पूरी तरह से पर homogenate पिपेट। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 50 XG पर एक मंजिल सेंट्रीफ्यूज सेट और अपकेंद्रित्र में नमूने लोड।
      नोट: केन्द्रापसारण यह सुनिश्चित करेंगे कि सभी homogenate (युक्त कोशिकाओं) सेल झरनी के माध्यम से पारित कर दिया गया।
    4. सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों निकालें और बर्फ पर उन्हें वापस जगह है। सेल strainers त्यागें और homogenate रहते हैं। बराबर मात्रा में जोड़ें (~ 6 मिलीग्राम) सेल गोली / तैरनेवाला और पिपेट ऊपर और नीचे कई बार करने के लिए 1x आरबीसी lysis बफर एक समान सेल निलंबन बनाने के लिए की। visually, तुरंत निलंबन कमी में लाल रंग के कुछ निरीक्षण करते हैं। 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों छोड़ दो अधिकतम आरबीसी सेल प्राप्त करने के लिए।
      नोट: यदि अन्वेषक गुर्दे छिड़काव और कम सेल हेरफेर वांछित है का पूरा भरोसा है आरबीसी lysis कदम को छोड़ दिया जा सकता है। हम आरबीसी सेल सेल निलंबन subjecting नहीं द्वारा गुर्दे सेल उपज में उल्लेखनीय वृद्धि मनाया गया है।
    5. सेंट्रीफ्यूज कि 500 ​​XG, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया गया है 5 मिनट के लिए एक सेल गोली के रूप में करने के लिए में ट्यूबों स्पिन।
      नोट: कदम 3.6 और 3.7 के दौरान, कोलाइडयन सिलिका (Percoll) आधारित घनत्व ढाल centrifugation के लिए तैयार करते हैं।
      1. 10 मिलीलीटर दौर नीचे polypropylene ट्यूबों रखना और उन्हें इसी नमूना संख्या के साथ लेबल और उन्हें एक ट्यूब रैक में जगह है।
        नोट: निम्न कैसे 4 गुर्दे के नमूने के लिए पर्याप्त घनत्व ढाल अभिकर्मकों बनाने के लिए वर्णन करता है।
      2. फ्लो का बफर धुंधला समाधान के 7 मिलीलीटर ले लो और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पिपेट। करने के लिए 2 एम सुक्रोज के 1 मिलीलीटर जोड़ें0.25 एम सुक्रोज तैयार करते हैं।
      3. इसके बाद, एक और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में घनत्व ढाल अभिकर्मक और यह पिपेट के 7.2 मिलीलीटर ले। 2 एम सुक्रोज के 1.25 मिलीलीटर 1.55 से फ्लो धुंधला बफर समाधान के मिलीग्राम और 72% घनत्व ढाल अभिकर्मक और 0.25 एम सुक्रोज तैयार करने के लिए जोड़ें।
      4. पिपेट प्रत्येक नमूना के लिए एक दौर नीचे polypropylene ट्यूब में 72% घनत्व ढाल अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर।

    4. ढाल centrifugation

    1. 3.7 चरण के बाद, ट्यूब बाहर ले और धीरे एक निर्बाध गति में सतह पर तैरनेवाला छानना और भी जबकि ट्यूब उल्टा आयोजित किया जाता है कि रूपों तरल के अगले बूंद छानना।
      नोट: यह कदम अतिरिक्त तरल के पीछे छोड़ने के घनत्व ढाल पैदावार में बदलाव बनाने के लिए पर्याप्त बदल सकते हैं के बाद से महत्वपूर्ण है। जब ट्यूब वापस सीधा खड़ा कर दिया जाता है, ~ तरल के 200-300 μl सेल गोली के साथ रहता है।
    2. पिपेट और धीरे लेकिन सख्ती सेल गोली पर 0.25 एम सुक्रोज के 1 मिलीलीटर विंदुक ऊपर और ब्रिन के लिए नीचेजी एक समान निलंबन के लिए कोशिकाओं। अगले, 1 मिलीलीटर 72% घनत्व ढाल अभिकर्मक (3.7.4) के लिए सेल निलंबन जोड़ सकते हैं और एक बार फिर से सख्ती पिपेट एक 36% घनत्व ढाल अभिकर्मक के लिए फार्म कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए।
    3. एक polypropylene पाश्चर (हस्तांतरण) पिपेट में 72% घनत्व ढाल अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर ले लो। यहां तक ​​कि बल्ब पर दबाव के साथ (टिप में तरल स्तंभ रहता है और बुलबुला गठन से बचाता है), सेल निलंबन की तह तक पाश्चर विंदुक (36% घनत्व ढाल अभिकर्मक) सम्मिलित धीरे और 72% घनत्व ढाल अभिकर्मक उतारना एक फार्म के लिए अलग भारी परत।
    4. नमूना ट्यूबों धीरे उठाओ और सेंट्रीफ्यूज, जो इस कदम के लिए कमरे के तापमान पर है में जगह है। कम 500 x जी 20-30 मिनट के लिए स्पिन।
    5. इस बीच, दौर इसी नमूना पहचानकर्ता के साथ नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब polypropylene से एक और दो सेट तैयार करते हैं।
    6. चरण 4.4 पूर्ण होने के बाद धीरे polypropylene ट्यूबों युक्त, कम से कम झटकों के साथ नमूना हटा दें और इसे नीचे सेटट्यूब रैक पर।
    7. पहला नमूना ट्यूब और अपनी इसी खाली ट्यूब उठाओ। एक polypropylene पाश्चर विंदुक के साथ, धीरे लेकिन मापा सक्शन साथ अच्छी तरह से, ऊपरी "जंक परत" या "भावुक सामग्री" को हटा दें और इसे खाली दौर नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब में डाल दिया।
      1. "बफी कोट" पहुँच जाता है जब तक ढाल के ऊपरी भाग को दूर करने के लिए आगे बढ़ें (एक लाल रंग [लाल रक्त कोशिकाओं] के साथ बंद सफेद प्रकट हो सकता है)। suctioning यदि का ~ 3 मिमी ऊंचाई "बफी कोट" से पहुँच जाता है बंद करो।
        नोट: यह सुनिश्चित करें कि यह सब पूरी तरह से सक्शन करने के लिए जारी रखने से पहले ढाल के ऊपरी भाग से चला गया है।
    8. एक ताजा पाश्चर विंदुक और एक ताजा दौर नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब ले लो और धीरे बफी कोट को हटा दें। बफी कोट के नीचे 5 मिमी, यह सुनिश्चित करने के लिए है कि कोशिकाओं के सबसे एकत्र कर रहे हैं और उचित नमूना पहचानकर्ता के साथ 2 एन डी नए दौर नीचे ट्यूब को जोड़ा - 3 चूषण के लिए आगे बढ़ें।
    9. जोड़े 1-2 मिलीलीटर ओ2 एन डी ट्यूब के लिए एफ से फ्लो धुंधला बफर समाधान और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह मिला लें।
    10. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं स्पिन। फ्लो का बफर धुंधला समाधान के साथ एक 2 एन डी धोने कदम वैकल्पिक है। फ्लो का बफर धुंधला समाधान के 500 μl में Resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती करने के लिए आगे बढ़ें।

    5. वैकल्पिक (सेल लेबलिंग)

    1. कोशिकाओं के एक ही नंबर के लिए प्रत्येक नमूना Aliqout। 10 6 कोशिकाओं प्रति 0.5 माइक्रोग्राम (विरोधी CD16 / CD32 एफसीआर) के कमजोर पड़ने पर अवरुद्ध एंटीबॉडी जोड़ें और 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी (उचित fluorophores संयुग्मित) है कि अच्छी तरह से पहले वास्तविक प्रयोगों के लिए, अन्वेषक द्वारा एक दूसरे के साथ काम करने के लिए निर्धारित कर रहे हैं के वांछित कॉकटेल जोड़ें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
      नोट: इस पांडुलिपि के लिए गुर्दे की प्रतिरक्षा सेल लेबलिंग के प्रदर्शन के लिए, हम एक टी-ly इस्तेमाल कियाmphocyte और एक बृहतभक्षककोशिका / वृक्ष के समान सेल पैनल। BV421, विरोधी Foxp3 (क्लोन: FJK -16) एपीसी, एंटी-CD127 (क्लोन: A7R34): टी-लिम्फोसाइट पैनल फिक्स व्यवहार्यता दाग FVS510, विरोधी CD45 (30-F11 क्लोन) के शामिल पीई / Cy7, विरोधी CD44 (क्लोन: IM7) PerCP / Cy5.5, विरोधी सीडी 4 (क्लोन: RM4-5) एपीसी-Cy7, विरोधी सीडी 8 (क्लोन: 53-6.7) BV785। BV421, विरोधी Ly6G (क्लोन: 1A8) FITC, विरोधी CD11b (क्लोन: एम 1/70) PerCP-Cy5.5, विरोधी: बृहतभक्षककोशिका पैनल फिक्स व्यवहार्यता दाग FVS510, विरोधी CD45 (30-F11 क्लोन) के शामिल F4 / 80 (क्लोन: BM8) एपीसी, विरोधी CD11c (क्लोन: N418) BV785।
    3. फिक्स व्यवहार्यता दाग जोड़ें और 5 मिनट के लिए बेंच शीर्ष पर छोड़ दें। फिक्स व्यवहार्यता दाग से अधिक दूर करने के लिए फ्लो का बफर धुंधला समाधान के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    4. निर्धारण / Permeabilization अभिकर्मक जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। permeabilization समाधान में धो लें।
    5. intracellular दाग के लिए, 10min के लिए विरोधी CD16 / 32 एफसीआर के साथ फिर से ब्लॉक। intracellular दाग जोड़े और 20-30 मिनट के लिए सेते हैं। पीई में धो 2xrmeabilization समाधान।
    6. FACS मशीन के माध्यम से 3,9 से फ्लो धुंधला बफर समाधान करने और चलाने के नमूने में Resuspend।

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Representative Results

पैनल है कि चलाया जा सकता है की संख्या प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि मज़बूती से गुर्दे से बाहर निकाला जा सकता है की संख्या पर निर्भर करता है। इस के साथ साथ, हम 2 पैनलों, टी लिम्फोसाइटों के लिए एक और मैक्रोफेज / वृक्ष के समान कोशिकाओं के लिए एक चलाने की क्षमता प्रदर्शित करता है। टी लिम्फोसाइट पैनल पर, हम पहली बार आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) पैटर्न को देखने के लिए और के रूप में चित्रा 1 (ऊपर छोड़ दिया डॉट साजिश) में दिखाया गया ब्याज की आबादी को चित्रित। अगले, एक व्यवहार्यता मार्कर, इस मामले में एक फिक्स व्यवहार्यता दाग (FVS510) विश्लेषण (चित्रा 1, शीर्ष मध्य डॉट साजिश) से मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। CD45, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न hematopoietic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर आम तौर पर गुर्दे की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चित्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और ये आमतौर पर कुल गुर्दे की प्रतिरक्षा आयु, लिंग, तनाव के आधार पर कोशिकाओं के 2-18% से लेकर, माउस के भड़काऊ हालत (चित्रा 1, शीर्ष सही डॉट साजिश)। CD45 + से sup> अस्थि मज्जा hematopoietic कोशिकाओं व्युत्पन्न, एक कर सकते हैं या तो टी लिम्फोसाइटों के लिए एक मार्कर के रूप CD3 एप्सिलॉन पर फाटक या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न hematopoietic कोशिकाओं से प्रेरक / साइटोटोक्सिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए सीडी 4 + / सीडी 8 + के लिए आगे बढ़ना (चित्रा 1, नीचे सही डॉट धब्बा)। आमतौर पर, सीडी 8 + कोशिकाओं की तुलना में अधिक सीडी 4 + देखा जाता है। सीडी 4 + की संभावना है कि टी कोशिकाओं नियामक (चित्रा 1, नीचे मध्य डॉट साजिश) कर रहे हैं पता चला कोशिकाओं ~ 8.8% Foxp3 + कोशिकाओं के आगे लक्षण वर्णन। इसके अलावा विस्तृत लक्षण वर्णन भेद करने के लिए जो सबसेट ब्याज की जनसंख्या के आधार पर बदल रहा है ऐसे CD25 और CD127 के रूप में मार्कर शामिल हो सकते हैं। CD127 काफी हद तक FoxP3- कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है और यह आगे CD44 सक्रियण के मार्कर के रूप में उपयोग करके बाहर विच्छेदित है, CD44 + CD127 लो / - बनाम CD44 + CD127 + कोशिकाओं है कि सबसे अच्छा प्रेरक स्मृति कोशिकाओं सदृश सबसे अच्छा सक्रिय सदृश प्रेरक कोशिकाओं।

NT "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> बृहतभक्षककोशिका / वृक्ष के समान सेल पैनल के लिए, प्रारंभिक फाटक, वही कर रहे हैं लाइव / मृत (चित्रा 2 की FVS510 आधारित जुदाई, छोड़ा डॉट से शीर्ष 2 एन डी सहित साजिश) और CD45 फाटकों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न hematopoietic कोशिकाओं (ऊपर अलग करने के लिए सही डॉट साजिश से 2 एन डी)। अगले, CD45 + कोशिकाओं के कई रास्ते gated जा सकता है। हम उन्हें Ly6G यहाँ पर गेटेड monocytes यानी के बाकी हिस्सों से अलग करने के लिए न्यूट्रोफिल मैक्रोफेज / वृक्ष के समान कोशिकाओं (चित्रा 2, शीर्ष सही डॉट साजिश)। अगले, Ly6G- कोशिकाओं CD11b और F4 पर / 80 gated थे मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं के सबसेट की पहचान करने के लिए (चित्रा 2, छोड़ा डॉट साजिश से नीचे 2 एन डी)। गेटिंग Ly6C घुसपैठ / भड़काऊ monocytes / मैक्रोफेज (नीचे 2 सही हिस्टोग्राम से एन डी) और CCR2 और CX3CR1 के प्रतिशत को दिखाता है पर मैक्रोफेज कि भर्ती थे (चित्रा 2, नीचे सही डॉट साजिश)। नीचे बाईं राज्यमंत्री पहचानतीटी पैनल वृक्ष के समान कोशिकाओं, एक निचले हिस्से जिनमें से CCR2 अभिव्यक्ति के माध्यम से भर्ती थे के रूप में सबसे कोशिकाओं को पहचानती है।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रतिनिधि डॉट भूखंडों टी लिम्फोसाइट सबसेट अलगाव प्रदर्शित ऊपर छोड़ दिया एक ठेठ आगे (एफएससी) और फ़्लो जो सॉफ्टवेयर में गुर्दे की प्रतिरक्षा कोशिकाओं के पक्ष (एसएससी) तितर बितर प्रोफाइल है। शीर्ष मध्यम पैनल एक फिक्स व्यवहार्यता दाग (FVS510) और बाईं तरफ लाइव आबादी पर gated है तो अस्थि मज्जा व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए CD45 पर gated है। CD45 + कोशिकाओं सीडी 4 (प्रेरक) और सीडी 8 (साइटोटोक्सिक) कोशिकाओं (लोअर सही पैनल) के लिए gated हैं। मध्यम पैनल सीडी 4 + कोशिकाओं है कि Foxp3 + (टी नियामक कोशिकाओं) कर रहे हैं की संख्या दर्शाता है। बनाम स्मृति प्रेरक CD44 + CD127 - निचले बाएं पैनल कैसे CD4 + Foxp3- कोशिकाओं के कई सक्रिय कर रहे हैं प्रेरक CD44 + CD127 लो / बाहर तंग करने का प्रयास यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रतिनिधि डॉट भूखंडों प्रदर्शित Monocyte-सेल सबसेट अलगाव फिर, ऊपर छोड़ दिया एक ठेठ आगे (एफएससी) और फ़्लो जो सॉफ्टवेयर में गुर्दे की प्रतिरक्षा कोशिकाओं के पक्ष (एसएससी) तितर बितर प्रोफाइल है। छोड़ दिया डॉट साजिश से शीर्ष 2 एन डी एक फिक्स व्यवहार्यता दाग (FVS510) और बाईं तरफ लाइव आबादी पर gated है तो अस्थि मज्जा व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं (2 सही डॉट साजिश से एन डी) के लिए CD45 पर gated है। CD45 + कोशिकाओं आदेश मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं के लिए अलग करने में Ly6G (न्यूट्रोफिल, शीर्ष सही डॉट साजिश) के लिए gated हैं। Ly6C पर gating घुसपैठ / भड़काऊ monocytes / मैक्रोफेज (बीओटी के प्रतिशत को दिखाता हैटॉम सही हिस्टोग्राम से 2 एन डी) और CCR2 और CX3CR1 मैक्रोफेज कि भर्ती थे (चित्रा 2, नीचे सही डॉट साजिश) को पहचानती है। नीचे सबसे बाएं पैनल वृक्ष के समान कोशिकाओं, एक निचले हिस्से जिनमें से CCR2 अभिव्यक्ति के माध्यम से भर्ती थे के रूप में सबसे कोशिकाओं को पहचानती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1:। अभिकर्मकों और गुर्दे से प्रतिरक्षा सेल अलगाव के लिए आवश्यक उपकरण देखें सामग्री तालिका।

तालिका 2:। टेबल कुल कोशिकाओं और CD45 + इसी तैयारी में अलग चित्रण इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम यहाँ एक विश्वसनीय और कुशल तरीके से गुर्दे से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत किया है। व्यापक रूप से इस्तेमाल collagenase पाचन कदम (ऊतक के यांत्रिक व्यवधान) के प्रमुख संशोधन के बारे में 30 मिनट की बचत होती है और व्यवहार्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के अलगाव 4 गुर्दे के नमूने के लिए दो घंटे के तहत लेता है। इसके अलावा, हमारे अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है, हम अब केवल एक ही गुर्दे का उपयोग हमारी प्रतिरक्षा सेल अलगाव के लिए (अन्य गुर्दे पश्चिमी blots, immunohistochemistry और पीसीआर द्वारा mRNA विश्लेषण द्वारा प्रोटीन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) और नियमित ~ 2 x 10 6 कोशिकाओं मिल अलगाव प्रति। हम जिगर और दिल से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बड़ी संख्या को अलग-थलग करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है (यांत्रिक व्यवधान के साथ संयुक्त दिल के लिए multienzyme पाचन, डेटा नहीं दिखाया गया है), लेकिन विश्वास है कि यांत्रिक व्यवधान जैसे अन्य गैर रेशेदार ऊतकों को लागू किया जा सकता है मस्तिष्क 16।

किसी भी प्रोटोकॉल के साथ के रूप हैऊतकों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं olate, विस्तार का पालन सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। अगर गुर्दे के छिड़काव के लिए महत्वपूर्ण है, तो अभ्यास दिल में सुई रखकर यह fibrillating से या बहुत सही वेंट्रिकल को दूर मर्मज्ञ से रोकने के लिए की जरूरत है। दिल में एक सुई डालने के लिए एक वैकल्पिक वृक्क धमनी के ऊपर महाधमनी cannulate और गुर्दे 8 छिड़कना है। इसके अलावा, वहाँ लेखकों से अन्य सुझावों प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव विश्वसनीय और वर्दी बनाने के लिए कर रहे हैं। गुर्दे पर्याप्त रूप से मैश किए हुए किया जाना चाहिए और कोई बड़ा हिस्सा दिखाई जानी चाहिए। यदि यह मामला नहीं है, तो यांत्रिक व्यवधान की पुनरावृत्ति समस्या का समाधान करना चाहिए। यंत्रवत् बाधित ऊतक आदेश सभी आकार की कोशिकाओं को शामिल करने में सही आकार फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, कुछ बृहतभक्षककोशिका / वृक्ष के समान कोशिकाओं आबादी के रूप में एक 100 माइक्रोन जाल का उपयोग करने का विरोध किया है एक 40 माइक्रोन जाल का उपयोग कर यदि बाहर रखा जा सकता है (बृहतभक्षककोशिका / वृक्ष के समान सेल आकार के बीच भिन्न हो10-40 माइक्रोन)। हालांकि, दूसरी तरफ अधिक गुर्दे की उपकला और अन्य कोशिकाओं अंतिम विश्लेषण प्रतिरक्षा सेल आबादी के प्रतिशत में बदलने के लिए शामिल किया जा सकता है। हम मानते हैं कि सभी समावेशी जा रहा है underrepresented आबादी का प्रतिनिधित्व बढ़ जाती है और इसलिए प्रस्तुत करने की विश्वसनीयता में सुधार।

जब घनत्व ढाल अभिकर्मक सेल निलंबन जोड़ने, कोशिकाओं से फ्लो धुंधला बफर समाधान का कोई भी अधिक 200-300 μl में resuspended किया जाना चाहिए। 36% का गठन: 72% ढाल सुनिश्चित किया जाना चाहिए। इस के लिए, 36% घनत्व ढाल अभिकर्मक में 72% घनत्व ढाल अभिकर्मक ले जाने कोमल होना चाहिए हस्तांतरण पिपेट का परिचय, बुलबुले और एक स्पष्ट सीमांकन ढ़ाल के बीच देखा नहीं छोड़ना चाहिए। जहां तक ​​संभव हो, घनत्व ढाल अभिकर्मक में कोशिकाओं की centrifugation कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए। ढाल के ऊपर की सतह पर 'सेल मलबे "का पूरी तरह हटाने के बाद रोंपिन सुनिश्चित किया जाना चाहिए। अन्यथा, यह सेल उपज और प्रस्तुत करने की गुणवत्ता के साथ हस्तक्षेप करेगा। hemocytometer पर सबसे नन्हा कोशिकाओं को बाहर करने के लिए ध्यान रखना। ये लाल रक्त कोशिकाओं पर छोड़ दिया जाता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर आरबीसी lysis कदम छोड़ा जाता है। वहाँ विधि करने के लिए एक सीमा है। नहीं इस विधि का उपयोग कर अलग हर कोशिका एक प्रतिरक्षा सेल है। कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत उपकला कोशिकाओं (समीपस्थ छोटी नली, बाहर छोटी नली और glomerulus भी शामिल है) कर रहे हैं। हालांकि, इस सीमा के रूप में गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं से संबंधित सवालों के जवाब दिए जा सकती है, एक अन्वेषक के लाभ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

समाप्त करने के लिए, यहाँ प्रस्तुत गुर्दे से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए विधि व्यापक रूप से लागू है और उनके शोध के लिए सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है। हम मानते हैं कि इस तकनीक को इस तरह के जिगर और मस्तिष्क के रूप में अन्य गैर रेशेदार ऊतकों के लिए के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के अलगाव भी इस तरह के समर्थक के रूप में और अधिक महत्वाकांक्षी बहाव के प्रयोगों डिजाइन करने में मदद मिलेगीliferation assays, साइटोकाइन स्राव assays और सतह एंटीजन के आधार पर कोशिकाओं के एक सबसेट के अलगाव। अंत में, हम आशा करते हैं कि इस विधि यानी प्रतिरक्षा सेल अलगाव के मानकीकरण सतह एंटीजन के enzymatic पाचन के विभिन्न स्तरों से बचना होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stomacher 80 Biomaster lab system Seward
Stomacher 80 Classic bags Seward BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge Thermo Scientific Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Analytical flow cytometer BD LSR-X20 Fortessa
Percoll  Sigma P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) Gibco, Life Technologies 14190-250
Polypropylene tubes, no cap Becton Dickinson 352002
Fixable Viability Stain BD Biosciences  FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93) EBioscience 14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421  BD Pharmingen 103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC EBioscience 17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 Biolegend 135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 Biolegend 103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 Biolegend 100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 Biolegend 100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC Biolegend 127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 Biolegend 101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC Biolegend 123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 Biolegend 117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 Biolegend 145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE Biolegend 137803/4
100 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml Fisher Or equivalent equipment 
Fisherbrand Tubes 15 ml Fisher Or equivalent equipment 
Sucrose Fisher chemical S5-3
Transfer pipette fine tip Samco Scientific 232 Or equivalent equipment 
Flow Cytometery Staining Buffer Solution EBioscience 00-4222-26 Or equivalent equipment 
1x RBC Lysis Buffer EBioscience 00-4333-57 Or equivalent equipment 

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References

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  3. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
  4. Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
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  8. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
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Nistala, R., Meuth, A., Smith, C., Annayya, A. Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells. J. Vis. Exp. (114), e54368, doi:10.3791/54368 (2016).

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