Introduction
면역 시스템의 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리 학적 과정 6,10,11,13에서 발생합니다. 활발한 연구 발생할 수있는 영역은 면역계의 활성화를위한 다양한 트리거들을 포함, 다양한 세포 유형과 관련된 특정 질환 속에서 사이토킨 / 케 모킨 패턴 등 특정 약물에 의한 상기 프로세스의 모두의 조절은 국소 빈혈 - 재관류에 예증 상해 (급성 신부전에 대한 모델), (6 주 이상) 5 수리 또는 섬유증의 기간을 통해 유지된다 몇 시간 내에 조혈 세포 또는 CD45 + 세포 유래 면역 세포 또는 골수의 증가가,가, 12. 이들 면역 세포가 복구 5,12- 과정을 조율하는 염증성 및 항 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비 모두. 현재, 단일 세포 현탁액으로 세포 집단 라벨을 동시에 다수의 형광체를 사용할 수있는 능력은 광고와 증가4 ~ 5 레이저와 기계 계측법 현대적인 흐름을 배출. 이것은 실질적으로 자신의 기능 상태 3,7에 따라 세포 집단을 구별하는 기능을 추가했습니다. F4 / 80 로우는 CD11b 고 Ly6b 높은 CD206 낮은 적어도 3 개의 형광체는 생균, CD45 + (백혈구) 및 Ly6G- (호중구) 및 위해 게이트에 동일한 샘플 볼륨에 필요한 것 예를 들어, 정확하게 식세포 레이블을 이것은 매우 가능한 새로운 흐름 세포 계측기 3입니다. 그러나, 사이토 카인의 분비, 세포 증식, 세포 독성, 대 식세포 활성화 및 림프구 및 단구의 다양한 서브 세트의 수의 정량 하류 분석법뿐만 아니라 좋은 품질 (생균, 단봉)하지만 세포의 적당한 숫자를 필요로한다.
신장에서의 면역 체계는 적응 및 선천적 부품 및 여러 세포 유형 1,7,13 모두 이루어진다. 예를 들어, 마우스에서 두 아이(1.4 × 106 세포) 및 이들의 약 5~15% (1,400-4,200) 절연 신장 총 면역 세포 neys 함께 2~17%를 포함하는보고 (28,000-266,000)는 CD45 + 세포는 CD4 + 세포이다 한 , 5,12-. 이 CD4 + 세포의 작은 비율 (5-15%, 70-630)는 Foxp3의 + 세포 (그림 1) 일 수 있습니다. 때문에 (이 경우 CD45 + CD4 + Foxp3의 + 세포) 세포의 비율에서 이러한 단계 현명한 감소 관심 때로는 세포 인구 100 ~ 단순한 세포에 의해 표현된다. CD4 + CD45 + 세포 + Foxp3의 소수는 필수적 총 다수의 셀이 분리되어 상기 세포는 시토 킨 분비 분석 등 하류 연구 양질의 것으로한다. 또한, 상기 개체군은 정량 분석을 수행하기 위해 충분히 높은 숫자로 표현되지 않기 때문에 2-3 마우스로부터 신장을 결합 할 필요가있다. 따라서, 신장 단핵 세포 집단의 안정적이고 효율적인 분리 스터드 위해 바람직Y 신장 질환과 관련된 면역 스펙트럼.
전통적으로, 신장 단핵 세포의 분리를 위해, 연구자들은 1 1,5,12 DNase를 포함 콜라게나 1A 또는 II와 같은 효소 digestions 다양한 사용했다. 잘 콜라게나 최적 농도 및 배양 4,14,15의 기간 동안 적정을 필요로, 로트 번호와 제조 회사에 따라 다릅니다 효소 활성을 갖는 것으로 알려져있다. 또한, 콜라게나 제와 소화가 작은 조각으로 신장을 닦지 시간을 추가하여 반응을 정지 EDTA의 배양을위한 가열 (37 ℃로) 목욕 및 추가 시간에 신장 조각의 배양을 필요로한다. 또한, 이하 불임은 세포 배양을 필요로하는 일부의 하류 절차에 대해 달성 될 수있다. 더 중요한 것은, 관련 연구자 모든 변수에 따라, 그것을 실험실에 걸쳐 데이터를 해석 가변성 리드. 최근과티슈 기계 교란 / 균질 기 (16)의 개발은 콜라게나 제 소화 공정을 완전히 피할 신장이 간단한 기계적 파괴로 대체된다. 여기서, 우리는 매일 면역 세포 추출에 대한 신장 면역 세포의 분리를위한 간단하면서도 효율적인 방법을 보여줍니다. 중요한 것은,이 방법은 뇌와 간 (16) 등의 다른 연질 및 비 섬유 성 조직으로 구성 될 수있다.
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Protocol
수행 모든 프로토콜 단계 검토와 미주리 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (ACUC)에 의해 승인되었다. 모든 연령에서 이론적으로 모든 설치류 실험에 사용할 수 있지만,이 프로토콜의 경우, 15주 세 남성 C57BL / 6 마우스를 사용 하였다. 이 비 생존 수술 때문에 안락사 방혈 및 양자 기흉에 의해 달성된다.
신장의 1 관류
참고 : 심장, 간, 신장 등 장기의 관류 데이터의 해석을 방해 할 수 혈액을 제거합니다. 가능하면 따라서, 우리는 항상 장기를 관류.
- 그것은 움직이지 될 때까지 (3 ml / 분) 유도 챔버 이소 플루 란에 마우스를 놓습니다. 다음으로, 챔버에서 마우스를 제거 해부 테이블에 등쪽를 놓고 마우스 코의 이소 플루 란 콘을 배치하고 조절을 통해 1.5 ml / 분의 속도로 이소 플루 란을 누릅니다.
- 발가락 핀치 응 답을 확인동물 마취의 수술 비행기를 달성 한 경우 핀셋 전자는 평가합니다. 식염수 복부 복부를 청소하고 가위로 복부를 열고 잘라 마우스의 왼쪽에 (수술 분야 중) 복부 장기를 밀어 넣습니다.
- 과 하대 정맥에서 혈액을 수집 25 게이지 1 cc의 주사기에 바늘 고정 0.5M EDTA의 10 μl를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 추가합니다.
참고 : 혈액의 컬렉션은 선택 사항입니다. 플라즈마 생화학 적 측정을 위해 사용될 수있다. 백혈구는 유세포 분석을 위해 사용될 수있다. - 가위를 사용하여, 오른쪽 심방에 작은 상처가 다음 단계에서 혈액과 PBS의 혼합물을 수 있도록 할 수 있습니다.
- 50 CC 주사기를 타고 얼음처럼 차가운 PBS (20 ~ 30 CC)를 입력합니다. 다음, 주사기에 21 ~ 25 G 바늘을 부착 (집게 사이에 부드럽게 마음을 잡고)의 정점에서 좌심실에 구멍을 천천히 과정을 통해 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)과 좌심실을 관류1 ~ 2 분.
참고 : 마음이 바로 관류의 처음 몇 밀리리터에 blanches. 이 재관류이 대정맥을 통해 정맥 반환을 통해 간에서 혈액을 배출되어 있음을 나타냅니다 같이 희게의 간을 준수하십시오. 또한,이 우심실의 구멍을 나타냅니다으로 폐 주입시 확대되지 않도록해야합니다. 폐 확장한다면, 약간 뒤로 좌심실에 바늘을 철회하고 재관류를 계속합니다. 달성 안락사까지 제 절개 찍은 시간 미만이 최소 인
신장 2. 해부
- 관류가 완료되면, 첨부 파일 (혈관, 지방과 부신) 및 소비세의 권리 신장을 해부 가위와 집게를 사용합니다.
- 부드럽게 절단 및 포셉으로 해부하여 신장을 덮고있는 캡슐을 제거합니다. 신장의 무게를.
참고 : 신장 무게 것은 선택 사항입니다. 그러나, 일부 실험신장 사이즈 / 조직의 그램 당 셀 수율을 정규화하기 위해 사용될 수있다 중량의 변화가 발생할 수있다. - 신장 무게 후, 0.5 % FBS를 포함하는 RPMI-1640 1 ㎖에 배치 또는 염색 완충 용액 세포 계측법 (50 ML 원뿔 스크류 캡 튜브를) 흐름 및 추가 사용까지 얼음에 튜브를 배치합니다.
참고 설명의 편의상, 우리는 염색 완충액 유세포 면역 세포의 분리의 나머지를 들어 설명한다. 모두 신장 또는 신장의 1 + 1 / 3의 RD (옵션) 하류의 실험에 따라 사용될 수 있지만, 또한, 단일 신장에서의 면역 세포의 분리를 설명한다. 신장의 1/3 RD 단백질 / RNA 실험에 고정 될 수 있고, 1/3 RD는 면역 또는 투과 전자 현미경을위한 버퍼에 배치 될 수있다.
신장의 3 균질화
- 샘플의 식별 정보와 함께 5 내지 80 ml의 용량 균질화 백 레이블링내부 스트레이너 (STR)를 제거하고 폐기합니다. 차가운 얼음 유동 세포 계측법 염색 완충 용액의 5 ml의 가방을 채우고 버퍼에 신장을 전송합니다. 두 번째 샘플 또는 처리가 필요 이상의 샘플에 대해이 과정을 반복합니다.
- 절반은 유동 세포 계측법 염색 완충액에 침지 신장을 가지며, 나머지 절반은 단순히 위로 절첩되도록 반으로 균질화 백 접어.
- 조직 균질의 전원을 켜고 빠른 (설정) rpm으로 설정합니다. 하단 가장자리에 패 직면 신장과 접힌 균질화 가방을 배치하지만 가방의 하단이 패의 아래쪽 테두리 아래로 슬라이딩되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
- 2 패이 있기 때문에 동시에 두 번째 샘플을 처리합니다. 120 초로 시간을 선택합니다. 패는 신장을 균질화 앞뒤로 이동 관찰한다.
주 : 한편, 중단이 처음 두가 처리되는 동안 샘플이 더 신장 (또는 다른 조직)을 제조하는데 사용될 수있다. - 균질화의 첫 번째 세트를 완료 한 후, 얼음에 가방을 전송하는 등 다음의 샘플 세트와 함께 조직 균질를 다시로드합니다. 시각적으로 신장이 충분히 균질화하고 더 큰 덩어리를 볼 수 없는지 확인합니다.
참고 : 일반적으로, 빠른 rpm에서 조직 균질의 2 분의 신장에 적합합니다. - 얼음에 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 다음으로, 셀 스트레이너로 완전하게 균질 피펫. 4 ° C에서 1 분 50 XG에서 바닥 원심 분리기를 설정하고 원심 분리기에 샘플을로드합니다.
참고 : 원심 분리는 모든 균질 (포함하는 셀)을 셀 스트레이너를 통과 한 것을 보장합니다. - 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 얼음에 다시 배치합니다. 셀 스트레이너를 무시하고 균질을 유지합니다. 동일 부피 추가 (~ 6 mL)에 균일 한 세포 현탁액을 만들기 위해 세포 펠렛 / 상등액 피펫 위아래로 수회에 1X RBC 용해 완충액. Visua에서야 베드로, 즉시 정지 감소에 붉은 색의 일부를 관찰합니다. 최대 RBC 용해를 달성하기 위해 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요.
참고 : 연구자는 신장 관류 적은 세포 조작이 필요한 자신감을 경우 RBC 용해 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 우리는 RBC 용해에 세포 현탁액을 실시하지 않음으로써 신장 세포 수율의 현저한 증가를 관찰 하였다. - 5 분 세포 펠렛을 형성하도록 500 XG, 39 ° C로 설정되어있는 원심 분리기에서 튜브를 스핀.
단계 3.6 및 3.7 동안 콜로 이달 실리카 (퍼콜)를 기반으로 밀도 구배 원심 분리 준비 :합니다.- 바닥 폴리 프로필렌 튜브 라운드 10 mL를 취하여 해당 샘플 번호로 레이블과 튜브 랙에 배치합니다.
참고 : 다음은 4 신장 샘플에 대한 충분한 밀도 구배 시약을 만드는 방법을 설명합니다. - 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 7 mL를 취하여 15 ML 원뿔 튜브로 피펫. 2 M 자당의에 1 ML을 추가0.25 M 자당을 준비합니다.
- 다음으로, 또 다른 15 ML 원뿔 관에 밀도 구배 시약과 피펫을 7.2 mL를 취하여. 72 %를 밀도 구배 시약 및 0.25 M 자당을 준비하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 1.55 mL 및 2 M 자당의 1.25 ML을 추가합니다.
- 피펫 각 샘플에 대해 하나의 둥근 바닥의 폴리 프로필렌 튜브에 72 % 농도 구배 시약 1 ㎖.
- 바닥 폴리 프로필렌 튜브 라운드 10 mL를 취하여 해당 샘플 번호로 레이블과 튜브 랙에 배치합니다.
4. 그라데이션 원심 분리
- 단계 3.7 후, 튜브를 꺼내 부드럽게 한 부드러운 움직임에 뜨는을 가만히 따르다 또한 튜브가 거꾸로 유지되는 동안 형성 액체의 다음 드롭을 가만히 따르다.
참고 :이 단계는 수익률의 변화를 만들 수있을만큼 밀도 구배를 변경할 수를 초과하는 액체 뒤에 남겨두고 이후 중요하다. 튜브가 수직으로 다시 설정하면 ~ 액의 200 ~ 300 μL은 세포 펠렛으로 남아있다. - 피펫 조심스럽게 그러나 적극적으로 세포 펠렛 상에 0.25 M 자당 1 ml의 최대 피펫 및 브린 아래로g 균일 한 서스펜션에 세포. 다음에, 36 % 농도 구배 시약을 형성하기 위해 세포를 혼합하여 강하게 피펫 다시 1 ㎖의 72 % 밀도 구배 시약 (3.7.4)에 세포 현탁액을 추가.
- 폴리 프로필렌 파스퇴르 (전송) 피펫으로 72 %의 밀도 구배 시약 1 mL를 취하여. 전구의 압력도 부드럽게 세포 현탁액의 하단에 파스퇴르 피펫 (36 % 농도 구배 시약)을 삽입하고을 형성하는 72 % 농도 구배 시약을 언로드 (선단에서 액체 열을 유지하고 기포 형성을 방지) 별개의 무거운 층.
- 부드럽게 샘플 튜브를 선택하고이 단계 동안 실내 온도에서 원심 분리로 놓는다. 500 X g에서 20 ~ 30 분 스핀.
- 한편, 해당 샘플 식별자 바닥 원심 분리기 튜브의 둘레에 폴리 프로필렌의 다른 두 세트를 준비합니다.
- 단계 4.4이 완료된 후, 최소한의 진탕 부드럽게 폴리 프로필렌 튜브를 함유하는 샘플을 제거하고 아래로 설정할튜브 랙.
- 첫 번째 샘플 튜브 및 해당 빈 튜브를 선택합니다. 폴리 프로필렌 파스퇴르 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 측정 흡입으로, 상단 "정크 층"또는 "끈적 끈적한 물질"을 제거하고 빈 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 넣어.
- (붉은 색조 [적혈구]와 오프 화이트 나타날 수 있습니다) 도달 "버피 코트 '까지 그라데이션의 상단 부분을 제거 진행합니다. ~ 3mm의 높이가 "버피 코트"로부터 도달하면 흡인 정지.
참고 :이 물건이 완전히 흡입을 계속하기 전에 그라데이션의 상부에서 사라 있는지 확인합니다.
- (붉은 색조 [적혈구]와 오프 화이트 나타날 수 있습니다) 도달 "버피 코트 '까지 그라데이션의 상단 부분을 제거 진행합니다. ~ 3mm의 높이가 "버피 코트"로부터 도달하면 흡인 정지.
- 신선한 파스퇴르 피펫과 신선한 둥근 바닥 원심 분리기 튜브를 타고 부드럽게 버피 코트를 제거합니다. 세포의 대부분을 수집하고 적절한 샘플 식별자와 2 차 새로운 둥근 바닥 튜브에 추가되도록, 버피 코트 아래 5mm - 3 흡인 계속합니다.
- 1-2 ml의 O를 추가F 유동 세포 계측법 염색 버퍼 2 차 튜브에 용액로 pipetting 아래로 잘 섞는다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액와 2 차 세척 단계는 선택 사항입니다. 유동 세포 계측법 염색 완충 용액 500 μL와에 재현 탁은 혈구를 사용하여 세포를 계산 진행합니다.
5. 옵션 (셀 라벨)
- 동일한 수의 셀에 대한 각 샘플 Aliqout. 10 6 셀 당 0.5 μg의 (안티 CD16 / CD32 FcRγ 쇄)의 희석에 차단 항체를 추가하고 15 분 동안 얼음에 품어.
- 전에 실제 실험에, 연구자에 의해 서로 잘 작동하도록 결정된다 (적절한 형광 접합) 일차 항체의 원하는 칵테일을 추가합니다. 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. PBS로 세포를 씻으십시오.
참고 :이 원고에 대한 신장 면역 세포 라벨의 데모를 들어, 우리는 T-LY 사용mphocyte 및 대 식세포 / 수지상 세포 패널. BV421, 안티 Foxp3의 (클론 : FJK-16) APC, 안티 CD127 (클론 : A7R34) 다음 T 림프구 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 클론)로 구성 PE / Cy7, 안티 CD44 (클론 : IM7)를 PerCP / Cy5.5, 안티 - CD4 (클론 : RM4-5) APC-Cy7, 안티 - CD8 (클론 : 53-6.7) BV785. BV421, 안티 Ly6G (클론 : 1A8) FITC, 안티 CD11b를 (클론 : M1 / 70)를 PerCP-Cy5.5, 안티 : 대 식세포 패널 고칠 생존 얼룩 FVS510, 항 CD45 (30-F11 복제) 구성 F4 / 80 (클론 : BM8) APC, 안티의 CD11c (클론 : N418) BV785. - 고 정부 생존 얼룩을 추가하고 5 분 동안 벤치 위에 둡니다. 고 정부 생존 얼룩 초과를 제거하는 유동 세포 계측법 염색 완충 용액으로 세포를 씻으십시오.
- 고정 / Permeabilization 시약을 추가하고 4 ºC에서 밤새 품어. permeabilization 용액에 세척 할 것.
- 세포 내 얼룩의 경우, 10 분 동안 항 CD16 / 32 FcRγ 쇄 다시 차단합니다. 세포 내 얼룩을 추가하고 20 ~ 30 분 동안 품어. 체육의 워시 2 배rmeabilization 솔루션입니다.
- FACS 시스템 3.9을 통해 유동 세포 계측법 염색 버퍼 솔루션 및 실행 샘플을 Resuspend.
- 2 패이 있기 때문에 동시에 두 번째 샘플을 처리합니다. 120 초로 시간을 선택합니다. 패는 신장을 균질화 앞뒤로 이동 관찰한다.
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Representative Results
실행될 수있는 패널들의 수를 확실하게 신장에서 추출 될 수 면역 세포의 수에 의존한다. 여기서, 우리는이 패널, T 림프구 용 및 대 식세포 / 수지상 세포를 실행할 수있는 능력을 입증한다. T 림프구 패널에서, 우리는 먼저 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 패턴을보고 그림 1 (왼쪽 상단 도트 플롯)과 같이 관심의 인구를 묘사. 다음에, 생존 마커,이 경우에는 정착 생존 얼룩 (FVS510)의 분석 (도 1, 탑 중간 도트 플롯)에서 죽은 세포를 배제하기 위해 사용된다. CD45 골수 유래 조혈 세포 마커는 일반적으로 신장의 면역 세포를 묘사하기 위해 사용되며, 이들은 일반적으로 나이, 성별, 변형에 따라 전체 신장 면역 세포 2-18 %에서 다양 마우스 염증성 상태 (도 1, 오른쪽 상단 도트 플롯). CD45의 +에서 SUP> 골수 한 게이트 T 림프구에 대한 마커로서 CD3 엡실론에 어느 조혈 세포 수 유래 또는 골수 유래 조혈 세포에서 효과기 / 세포 독성 세포를 분리하는 CD4 + / CD8 +을 진행 (도 1, 오른쪽 아래 도트 오). 일반적으로, CD8 + 세포보다 CD4 +를 볼 수 있습니다. 가능성이 T 규제 세포 (그림 1, 하단 중간 도트 플롯)이다 계시 된 CD4 + 세포 ~ 8.8 %의 Foxp3의 + 세포의 또 다른 특성. 더 자세한 특성은 관심의 인구에 따라 변경되는 부분 집합 구별하는 등의 CD25와 CD127와 같은 마커를 포함 할 수있다. CD127 크게 Foxp3를 세포 마커이며,이 더욱 활성화 마커로서 CD44을 사용하여 해부, CD44 + CD127 LO / - 최상의 효과기 메모리 셀과 유사 CD44 + CD127 + 세포 대 최고 활성과 유사한 이펙터 세포.
NT를 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 식세포 / 수지상 세포 패널의 경우, 초기 게이트 왼쪽 점에서 FVS510 라이브 / 죽은 (그림 2 기반의 분리, 상단 2 차를 포함하여, 동일 플롯) 및 CD45 게이트) (오른쪽 상단 도트 플롯에서 2 차를 골수 유래 조혈 세포를 분리합니다. 다음은 CD45 + 세포가 여러 가지 방법으로 문이 될 수있다. 우리는 단핵 세포, 즉의 나머지 부분에서 호중구를 분리하려면 여기를 Ly6G에 그들을 게이트 대 식세포 / 수지상 세포 (그림 2, 오른쪽 상단 도트 플롯). 다음으로, Ly6G- 세포는 대 식세포와 수지상 세포의 하위 집합을 식별 할 수는 CD11b 및 F4에 / 80 문이되었다 (그림 2 왼쪽 도트 플롯에서 아래 2 차). 게이팅 Ly6C가 침투 / 염증성 단핵구 / 대 식세포 (오른쪽 막대 그래프에서 아래 2 차) 및 CCR2 및 CX3CR1의 비율을 식별에 채용 된 대 식세포 (그림 2, 오른쪽 하단 도트 플롯). 왼쪽 아래 MOS를 식별t 패널은 CCR2 발현을 통해 모집 된 하부있는 수지상 세포, 대부분의 세포를 식별합니다.
그림 1 :. T - 림프구 부분적인 분리를 표시 대표 도트 플롯 맨 왼쪽은 플로 조 소프트웨어의 일반적인 앞으로 (FSC) 및 신장 면역 세포의 측면 (SSC) 산란 프로파일이다. 맨 가운데 패널은 고칠 생존 얼룩 (FVS510)과 왼쪽에있는 라이브 인구에 문이되어 그 후 골수 유래 면역 세포에 대한 CD45에 문이있다. CD45 + 세포는 CD4 (이펙터) 및 CD8 (세포 독성) 셀 (오른쪽 아래 패널)에 대한 문이 있습니다. 중앙 패널은 Foxp3 + (T 조절 세포)입니다 CD4 + 세포의 수를 보여줍니다. 대 메모리 이펙터 CD44 + CD127 - 왼쪽 패널은 어떻게 CD4 + Foxp3를 세포의 많은 활성화 이펙터 CD44 + CD127 보라 /를 애타게 시도
그림 2 :. 단핵구 세포의 부분적인 분리를 표시 대표 도트 플롯 다시, 왼쪽은 플로 조 소프트웨어의 일반적인 앞으로 (FSC) 및 신장 면역 세포의 측면 (SSC) 산란 프로파일이다. 왼쪽 도트 플롯에서 상위 2 번째는 고칠 생존 얼룩 (FVS510)과 왼쪽에있는 라이브 인구에 문이있다는 골수 유래 면역 세포 (오른쪽 도트 플롯에서 상위 2 차)에 대한 CD45에 문이있다. CD45 + 세포는 대 식세포와 수지상 세포 분리하기 위해 Ly6G (호중구, 오른쪽 상단 도트 플롯)에 대한 문이 있습니다. Ly6C에 게이팅 침투 / 염증성 단핵구 / 대 식세포 (봇의 비율을 식별톰 오른쪽 막대 그래프에서 2 차) 및 CCR2 및 CX3CR1는 모집 된 대 식세포 (그림 2, 오른쪽 하단 도트 플롯)를 식별합니다. 하단 패널은 CCR2의 발현을 통해 모집 된 하부있는 수지상 세포, 대부분의 세포를 식별 대부분을 떠났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 :. 시약 및 신장에서 면역 세포의 분리에 필요한 장비 재료 표를 참조하십시오.
표 2 :. 총 세포와 대응 준비에 CD45 + 격리를 묘사 표 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에서 안정적이고 효율적으로 신장에서의 면역 세포를 얻을 수있는 방법을 제시 하였다. 널리 사용되는 콜라겐 분해 공정 (조직의 기계적인 파괴)에 대한 주요 변경은 약 30 분 동안 저장하고, 가능한 면역 세포의 다수의 분리 4 신장 샘플 하에서 2 시간 걸린다. 또한, 연구의 질문에 따라, 우리는 이제 하나의 신장을 사용하는 우리의 면역 세포 분리를위한 (다른 신장은 웨스턴 블랏, PCR에 의한 면역 조직 화학 및 mRNA의 분석에 의한 단백질의 분석을 위해 사용될 수 있음) 일상적 ~ 2 × 106 세포를 얻을 격리 당. 우리는 간, 심장에서 면역 세포의 대량 분리하는이 방법을 사용했다 (기계 파괴와 함께 심장에 멀티 효소 소화, 데이터는 도시하지 않음)하지만 기계적인 파괴가 같은 다른 비 섬유 조직에 적용 할 수 있다고 확신 뇌 16.
모든 프로토콜과 마찬가지로입니다하기세부 사항을 준수하는 것은 성공을 위해 중요하다, 조직에서 면역 세포를 올 레이트. 신장의 관류가 중요한 경우, 실제로는 피 브릴 또는 너무 우심실로 침투하는 것을 방지하기 위해 중심부에 바늘을 배치 필요하다. 심장에 바늘을 성공시키는 대안은 신장 동맥 위의 대동맥을 cannulate 및 신장 팔을 관류하는 것입니다. 또한, 면역 세포의 분리가 안정적이고 균일하게 만들 수있는 저자의 다른 제안이있다. 신장은 적절하게 으깬해야 더 큰 덩어리는 볼 수 없습니다. 그렇지 않은 경우, 기계적 중단의 반복이 문제를 해결한다. 기계적 파쇄 조직 규모의 셀들을 포함하기 위해 적절한 크기의 필터를 통과한다. 예를 들어, 일부 식세포 / 수지상 세포 집단은 100 ㎛의 메쉬를 사용하는 것이 아니라 40 ㎛의 메쉬를 사용하는 경우에는 제외 될 수있다 (대식 세포 / 수지상 세포의 크기에 따라 다를10 ~ 40 μm의). 그러나, 플립 측에 더 신장 상피 세포 및 다른 세포는 면역 세포 집단의 비율을 변경하는 최종 분석에 포함시킬 수있다. 우리는 모두가 포함되는 것은 소수 집단의 표현을 증가시키고 따라서 준비의 신뢰성을 향상 믿습니다.
밀도 구배 시약 세포 현탁액을 첨가하면, 세포는 유동 세포 계측법 염색 완충액 이하 200-300 μL에 재현 탁한다. 36 %를 형성 : 72 % 구배이 보장되어야한다. 이를 위해 부드러운해야 36 %의 밀도 구배 시약에 72 % 밀도 구배 시약을 전달하는 전송 피펫의 도입은 거품과 그라디언트 사이에 보이는 명확한 구분을 두지해야합니다. 가능한 한 밀도 구배 시약의 세포를 원심 분리하여 실온에서 수행한다. 이후의 S 그래디언트의 상면에서 "세포 파편"완전히 제거핀이 보장되어야한다. 그렇지 않으면, 셀 수율 프렙의 품질을 방해 할 것이다. 혈구에서 가장 작은 세포를 제외주의하십시오. 이들은 적혈구 이상 남아 있습니다. 적혈구 용해 단계가 생략되는 경우에 특히 중요하다. 상기 방법에 한계가있다. 없음이 방법을 사용하여 격리 모든 세포는 면역 세포이다. 세포의 큰 비율은 상피 세포 (근위 세뇨관, 원위 세뇨관과 사구체 포함)이다. 그러나,이 제한은 비 - 면역 세포에 관한 질문에 답변 할 수 조사자의 이점에 사용될 수있다.
여기에 제시된 신장에서 면역 세포의 분리 방법이 널리 적용과 연구에 가장 연구소에 의해 적용 할 수 있습니다, 결론을합니다. 우리는이 기술뿐만 아니라 이러한 간 및 뇌와 같은 다른 비 섬유상 조직에 사용될 수 있다고 믿는다. 면역 세포의 다수의 분리는 또한 프로 같은보다 야심 하류 실험 설계 도움월콧 샌더 세이, 사이토 카인 분비 분석 및 표면 항원에 기초하여 셀들의 서브 세트의 분리. 궁극적으로, 우리는이 방법 즉 면역 세포 분리를 표준화 표면 항원의 효소 소화의 다양한 수준을 피할 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
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