Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54371
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

Abstract

Yarrowia lipolytica هو غير المسببة للأمراض، ديمبرافيك والهوائية بدقة أنواع من الخميرة. ونظرا لميزاته الفسيولوجية وخصائص التمثيل الغذائي، وهذا الخميرة غير تقليدية ليست سوى نموذج جيد لدراسة الطبيعة الأساسية للتمايز الفطرية ولكن هي أيضا منصة الميكروبية واعدة للإنتاج والكيمياء الحيوية ومختلف تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، والتي تتطلب التلاعب الجيني واسعة النطاق. ومع ذلك، التلاعب الجيني من Y. وقد lipolytica محدود نظرا لعدم وجود نظام التحول الجيني فعال ومستقر وكذلك معدلات عالية جدا من إعادة التركيب غير المتجانس التي يمكن أن تعزى أساسا إلى الجين KU70. هنا، ونحن التقرير بروتوكول السهل والسريع للتحول الوراثي كفاءة وللحذف الجينات في Y. lipolytica Po1g. الأول، وهو بروتوكول للتحول كفاءة من الحمض النووي الخارجية إلى Y. تأسست lipolytica Po1g. سيكوالثانية، لتحقيق تعزيز المزدوج كروس معدل إعادة التركيب مثلي لمزيد من الحذف من الجينات المستهدفة، تم حذف هذا الجين KU70 عن طريق تحويل شريط كاسيت اختلال تحمل 1 الأسلحة كيلوبايت التماثل. ثالثا، للتدليل على تعزيز كفاءة الجينات الحذف بعد الحذف من الجينات KU70، حذفنا فردي 11 الجينات المستهدفة ترميز نازعة الكحول وأوكسيديز الكحول باستخدام نفس الإجراءات على سلالة KU70 خروج المغلوب منصة. ولوحظ أن معدل إعادة التركيب مثلي الدقيق ازداد كثيرا من أقل من 0.5٪ للحذف من الجين KU70 في Po1g إلى 33٪ -71٪ لحذف جين واحد من الجينات المستهدفة 11 في Po1g KU70 Δ. شيد البلازميد تنسخي تحمل علامة مقاومة هيغروميسين B ونظام لجنة المساواة العرقية / LoxP، والجين اختيار علامة في سلالات خروج المغلوب الخميرة أزيل في نهاية المطاف عن طريق التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase لتسهيل جولات متعددة من المستهدفينالتلاعب الجيني تيد. ينتج عن ذلك من المسوخ الحذف جين واحد لها تطبيقات محتملة في الوقود الحيوي وإنتاج والكيمياء الحيوية.

Introduction

وخلافا لخميرة الخباز، Yarrowia lipolytica، والخميرة غير تقليدية، يمكن أن تنمو في شكل الخميرة او mycelium في استجابة للتغيرات في الظروف 1،2 البيئي. وهكذا، وهذا الخميرة ديمبرافيك يمكن استخدامها كنموذج جيد لدراسة التمايز الفطري، التشكل و3،4،5 التصنيف. ويعتبر بشكل عام على أنها آمنة وأنواع من الخميرة (غرا)، والذي يستخدم على نطاق واسع لإنتاج مجموعة متنوعة من المضافات الغذائية مثل الأحماض العضوية، polyalcohols، مركبات رائحة، والمستحلبات والسطحي 6،7،8،9. وهو الميكروب الهوائي تلزم والخميرة الزيتية المعروفة قادرة على تراكم الدهون بشكل طبيعي في كميات عالية، أي ما يصل إلى 70٪ من الوزن الجاف خلية 10. ويمكن أيضا الاستفادة من مجموعة واسعة من مصادر الكربون للنمو، بما في ذلك أنواع مختلفة من المخلفات في الموارد النفايات والمواد الغذائية 11،12،13. كل هذه الميزات الفريدة جعل Y. lipolytica جذابة للغاية للالعديد من التطبيقات في مجال التكنولوجيا الأحيائية.

على الرغم من أن تسلسل الجينوم الكامل للY. وقد تم نشر lipolytica 14،15، والتلاعب الجيني لهذه الخميرة غير تقليدية هو أكثر تعقيدا من الأنواع الخميرة الأخرى. أولا، تحول هذا أنواع من الخميرة هو أقل كفاءة بكثير نظرا لعدم وجود نظام التحول الجيني 16،17 مستقرة وفعالة. ثانيا، يتم استخدام التكامل الجيني شاقة من أشرطة التعبير الخطية عادة للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام كما تم العثور على أي نظام البلازميد episomal الطبيعي في هذه الخميرة 18. الثالث، وتوليد الوراثية تدق الرافضة واضعا الإضافية تقتصر لأن استهداف الجينات الكفاءة عبر إعادة التركيب مثلي دقيق في هذه الخميرة منخفضة وتحدث معظم أحداث التكامل من خلال نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ) 19.

في هذه الدراسة، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول التحول الأمثل لY. lipolytica KU70، الذي يشفر إنزيم أساسي في مسار NHEJ. باستخدام بروتوكول التحول الأمثل وتحويل شريط كاسيت خروج المغلوب الخطية التي تحتوي المرافقة المناطق تناظر من 1 كيلو بايت، الجين KU70 من Y. تم حذف lipolytica Po1g بنجاح. وبعد ذلك أثبتت متانة هذه المنهجية حذف الجينات من خلال استهداف نازعة الكحول والجينات الكحول أوكسيديز في سلالة Po1g KU70 Δ. ولوحظ أن حذف سلالة KU70 أظهرت كفاءة أعلى بكثير من مثلي الجينات بوساطة إعادة التركيب تستهدف من ذلك من البرية من نوع Po1g سلالة. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء لجنة المساواة العرقية التعبير البلازميد تنسخي تحمل علامة مقاومة هيغروميسين B في عملية إنقاذ علامة. إنقاذ علامة يسهل جولات متعددة من استهداف الجينات في اله الحصول على طفرات الحذف الجينات. وبالاضافة الى حذف الجينات، لدينا بروتوكول للتحول الوراثي والجينات الحذف الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على إدراج الجينات إلى مواضع محددة، وإدخال طفرات في مواقع محددة في Y. lipolytica الجينوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الجيل من Y. lipolytica KU70 حذف الانفعال

  1. بناء كاسيت انقطاع
    ملاحظة: انظر الجدول رقم 1 لجميع البادئات المستخدمة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التكبير.
    1. الاشعال تصميم 20 إلى PCR تضخيم كاسيت التعبير LEU2 (انظر الجدول 1) من Y. lipolytica ناقلات التعبير وإدخال مواقع LoxP إلى 5 'و 3' تنتهي من الكاسيت LEU2 مع التمهيدي طويلة إلى الأمام (رقم 1، الجدول 1) والتمهيدي العكسي الطويل (رقم 2، الجدول 1)، على التوالي. لإدخال موقع تقييد إضافي لخطوات لاحقة من عملية الاستنساخ، إضافة موقع تقييد بام مرحبا في التمهيدي # 1.
    2. أداء PCR باستخدام عالية الدقة الحمض النووي بوليميريز كما هو موضح في الجدول رقم (2).
    3. تنقية المنتج PCR LoxP-المروج LEU2-فاصل-LoxP كاسيت باستخدام PCR purificatioن عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إضافة يتدلى 3'-A للمنتج PCR المنقى وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 21. استخدام T4 DNA يغاز لligate في الذيل منتج PCR في ناقلات الاستنساخ TA لانتاج البلازميد T-LEU2 حسب الجدول 3.
    4. PCR تضخيم 1 كيلوبايت 5 'تسلسل المنبع من الجين KU70 باستخدام بادئات # 3 / # 4 من Y. lipolytica Po1g الحمض النووي الجيني 22 كما في الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      1. ضعف هضم كل من المنتج PCR المنقى وبلازميد تي LEU2 مع كيس الثاني وبام مرحبا الإنزيمات حسب الجدول 4. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام يغاز T4 الحمض النووي لligate المطهرون وهضم المنتج PCR للكيس الثاني / مواقع بام مرحبا تي LEU2 لتحققبلازميد تي LEU2-5E حسب الجدول 3.
    5. PCR تضخيم 1 كيلوبايت 3 'تسلسل المصب من الجينات KU70 باستخدام بادئات # 5 / # 6 من Y. lipolytica Po1g الحمض النووي الجيني 22 كما في الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ضعف هضم كل من المنتج PCR المنقى وبلازميد تي LEU2-5E مع ليس أنا وتجربة الاقتراب من الموت أنا الإنزيمات حسب الجدول 4.
      1. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ثم، ligate المطهرون وهضم المنتج PCR ليست I / تجربة الاقتراب من الموت أنا مواقع T-LEU2-5E لانتاج البلازميد T-KO باستخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3.
    6. هضم البلازميد T-KO مع كيس الثاني وتجربة الاقتراب من الموت أنا الإنزيمات حسب الجدول رقم 4 لانتاج الكاسيت تعطيل (الشكل 1
  2. إعداد الخلايا المختصة والتحول من Y. سلالة lipolytica Po1g
    1. إعداد خلية مختصة
      1. تطعيم مستعمرة Y. lipolytica Po1g سلالة من لوحة الخميرة الطازجة استخراج-ببتون-سكر العنب (YPD) في 10 مل من YPD المتوسطة (1٪ خلاصة الخميرة، 2٪ ببتون، 2٪ سكر العنب و 50 ملي سيترات عازلة درجة الحموضة 4.0) في قارورة 100 مل. احتضان في 30 درجة مئوية تهز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة لمدة 20 ساعة حتى تشبع (وهو OD 600 من حوالي 15، وتقاس باستخدام مقياس الطيف الضوئي).
      2. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 5000 x ج في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع 20 مل تريس، EDTA (TE) العازلة (10 ملي تريس، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.5)، وبيليه الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.2. Resuspend الخلايا في 1 مل من 0.1 M خلات الليثيوم (6.0 درجة الحموضة، معدلة مع حمض الخليك)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في تيمبي الغرفةrature.
      3. قسامة الخلايا المختصة (100 ميكرولتر) إلى العقيمة 1.5 مل أنابيب. الشروع في خطوات التحول أدناه مباشرة، أو إضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 25٪ (ت / ت) ومخزن في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
    2. تحويل
      1. المزيج بلطف 10 ميكرولتر من التشويه والتحريف الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (10 ملغ / مل) و1-5 ميكروغرام من الكاسيت اضطراب النقي مع 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. إضافة 700 ميكرولتر من 40٪ البولي ايثيلين جلايكول (PEG) -4000 (المنحلة في 0.1 M الليثيوم خلات درجة الحموضة 6.0)، تخلط جيدا واحتضان في 30 درجة مئوية تهز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
        ملاحظة: من المهم استخدام الربط مع متوسط ​​الوزن الجزيئي 4000، بدلا من PEG-3350 (التي تستخدم عادة في التحول من الخميرة التقليدية).
      3. الحرارة صدمة الخليط التحول عن طريق وضع أنبوب في 39 ° C حمام الماء لمدة 60 دقيقة.
      4. إضافة 1 مل المتوسطة YPD واستعادة لمدة 2 ساعة عند 30 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف و resuspend بيليه في 1 مل من العازلة TE.
      5. Repellet الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من العازلة TE ولوحة على لوحات مختارة (على سبيل المثال، لوحات، ليسين ناقص)، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
      6. اختيار 4-10 المستعمرات واحد وتطعيم بشكل منفصل إلى 2 مل من YPD المتوسطة. احتضان بين عشية وضحاها في هز حاضنة 30 درجة مئوية في 225 دورة في الدقيقة. تحديد المستعمرات الإيجابية عن طريق تحليل PCR من الحمض النووي الجيني من transformants 22 كما في الجدول رقم 5 باستخدام مجموعتين من الاشعال # 55 / # 56 و # 56 / # 57 على التوالي.
        ملاحظة: ليس أنا خطي يتم تحويل pYLEX1 متجه إلى Y. lipolytica Po1g الخلايا المختصة من أجل تحديد كفاءة التحول عن طريق حساب عددمن مستعمرة (كفو) في البلازميد ميكروغرام الحمض النووي المستخدمة 23.

2. علامة الإنقاذ

  1. بناء التعبير البلازميد لجنة المساواة العرقية
    1. بناء pYLEX1-لجنة المساواة العرقية وpYLEX1-الحلمة
      1. الاشعال تصميم 20 إلى PCR تضخيم إطارات القراءة المفتوحة لجنة المساواة العرقية والحلمة. إضافة الأدينين النوكليوتيدات إضافية المنبع من الكودونات بداية في الاشعال إلى الأمام رقم 82 ورقم 84، وإدراج مواقع تقييد كبن أنا المصب من كودونات توقف في الاشعال عكس # 83 و # 85. PCR تضخيم إطارات القراءة المفتوحة لجنة المساواة العرقية و الحلمة من pSH69 (عدد الانضمام HQ412578) 24 كما في الجدول 2.
      2. تنقية كل من لجنة المساواة العرقية وشظايا الحلمة باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملخص كل من تنقيته لجنة المساواة العرقية والحلمة شظايا مع كبن أنا انزيم حسب طبله 4. مضاعفة هضم البلازميد pYLEX1 مع حزب الرابطة الاسلامية الأولى وكبن أنا الإنزيمات حسب الجدول 4. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      3. استخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3 إلى ligate لجنة المساواة العرقية والحلمة شظايا النقاء وهضمها لمواقع حزب الرابطة الاسلامية I / كبن الأول من Y. ناقلات التعبير lipolytica، مما أسفر عن pYLEX1-لجنة المساواة العرقية وpYLEX1-الحلمة، على التوالي.
    2. بناء pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة
      1. PCR تضخيم كاسيت المروج الجينات فاصل من لجنة المساواة العرقية من pYLEX1-لجنة المساواة العرقية باستخدام بادئات # 86 / # 87 المرافقة سال I / الباسيفيكي أنا تقييد مواقع حسب الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة .
        1. ضعف هضم كل من المنتج PCR تنقية وpSL16-CEN1-1 (227) البلازميد 25 مع سال الأول والباسيفيكي أنا الإنزيمات حسب الجدول 4. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ثم، ligate المنتج المنقى وهضمها PCR إلى pSL16-CEN1-1 (227) في المواقع المقابلة لخلق pSL16-لجنة المساواة العرقية باستخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3.
      2. PCR تضخيم كاسيت المروج الجينات فاصل من الحلمة من pYLEX1-الحلمة باستخدام بادئات # 88 / # 89 المرافقة تقييد مواقع Xho I / BGL الثاني كما في الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة .
        1. ضعف هضم كل من المنتج PCR المنقى وpSL16-لجنة المساواة العرقية البلازميد مع إنزيمات Xho الأول والثاني BGL كما في الجدول (4). تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ثم، ligate المنتج المنقى وهضمها PCR إلى pSL16-لجنة المساواة العرقية في المقابلةمواقع لتوليد pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة باستخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3.
          ملاحظة: أدى لجنة المساواة العرقية التعبير البلازميد، pSL16-لجنة المساواة العرقية، الحلمة، يؤوي اختيار علامة هيغروميسين B و هو متجه القسيم المركزي وتكرار episomally (الشكل 2).
      3. التحقق من جميع بنيات عن طريق الهضم مع الانزيمات تقييد المناسبة (على سبيل المثال، سال I / الباسيفيكي الأول، لاستئصال إدراج من ناقلات) كما في الجدول (4).
  2. لجنة المساواة العرقية بوساطة recombinase الإنقاذ علامة
    1. تحويل pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة إلى داخل الخلايا المختصة من سلالة خروج المغلوب KU70 بعد بروتوكول التحول هو موضح في القسم 1.2 أعلاه. لوحة تتحول الخلايا على YPD بالإضافة إلى هيغروميسين ب (YPDH) لوحات (التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل هيغروميسين B)، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
    2. أداء مستعمرة PCR كما في الجدول رقم 5 باستخدام بادئات # 84 / # 85 لتحديد إيجابيالمستعمرات التي تحتوي على pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة البلازميد بعد التحول.
      ملاحظة: إلى الأمام التمهيدي 84 # و 85 عكس التمهيدي # تقع داخل المنطقة الترميز من الحلمة الجين (الجدول 1). إلا استنساخ الإيجابية تولد منتج PCR محددة في رد فعل PCR.
    3. اختيار استنساخ إيجابي وتطعيم إلى 2 مل من YPDH المتوسطة، واحتضان في 30 درجة مئوية تهز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها إلى التشبع. قياس OD خلية 600 مع معمل. حصاد الخلايا في أحد OD 600 من ~ 15. أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرة واحدة مع 2 مل من الماء المعقم.
    4. إعادة تلقيح الخلايا في 2 مل من YPD المتوسطة مع OD الأولي 600 من 0.1 وتسمح للخلايا أن تنمو في 30 ° C هز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها. خط لزراعة الخلايا بين عشية وضحاها على لوحات YPD لعزل المستعمرات واحد 23. المستعمرات لوحة طبق على YPD، YPDH، واللوحات، ليسين ناقص 23 ملاحظة: المستعمرات التي فقدت كلا علامة LEU2 وpSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة البلازميد يمكن أن تنمو فقط على لوحات YPD (الشكل 3).

3. حذف الكحول هيدروجيناز والكحول أوكسيديز الجينات

  1. إجراء بحث على Y. قاعدة بيانات الجينوم البشري lipolytica باستخدام المحلية محاذاة البحث أداة الأساسية (انفجار) للتعرف على المرشحين الجيني للحذف 26. إدخال تسلسل البروتين من S. خميرة الكحول نازعة أنا إلى أداة البحث انفجار (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence؟prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    ملاحظة: أداة البحث انفجار ترجع تسلسل البروتين الأكثر مماثلة في Y. قاعدة بيانات الجينوم البشري lipolytica.
  2. بناء أشرطة الحذف بواسطة PCR مع الاشعال رقم 7 إلى رقم 56 (الجدول 1)، وأداء تقييد انزيم الهضم وردود الفعل ربط باستخدام نفس الأساليب كما هو موضح في القسم 1.1 أعلاه.
  3. الإعداديةهي خلايا المختصة من سلالة خروج المغلوب KU70، إجراء تحولات وأداء PCR لتحديد المستعمرات الإيجابية مع الاشعال # 55، # 58 إلى رقم 81 (الجدول 1) باتباع البروتوكول هو موضح في القسم 1.2 أعلاه.
    ملاحظة: وكمثال على ذلك، وصفت الإجراء لحذف الجينات YALI0E17787g في أرقام 4 و 5. يتم الإبلاغ عن آثار 1 كيلو بايت والمنطقة المتجانسة 2 كيلوبايت طويلة على معدل إعادة التركيب مثلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وY. خطي تم إدراج ناقلات التعبير lipolytica إلى منصة لرسو السفن ببر في الجينوم من Y. lipolytica Po1g سلالة طريق إجراء كروس إعادة التركيب واحد (27). باستخدام الإجراء التحول الكيميائي السريع التي أنشئت في هذه الدراسة، وY. خطي تم تحويل ناقلات التعبير lipolytica بنجاح في البرية من نوع Po1g سلالة في كفاءة تحويل> 100 وت / ميكروغرام الحمض النووي. تم تحويل شريط كاسيت خروج المغلوب يحيط بها 1 كيلو بايت متواليات مثلي في سلالة Po1g والجينات KU70 تم حذف بنجاح (الشكل 1). هنا، وإلى الأمام التمهيدي رقم 56 anneals إلى تسلسل تقع داخل الذراع 5 'التماثل من الجين KU70. يقع عكس التمهيدي رقم 55 داخل المنطقة الترميز من علامة LEU2. يقع عكس التمهيدي رقم 57 داخل المنطقة ترميز الجين KU70. كيفمن أي وقت مضى، من أصل أكثر من 200 المستعمرات، وقد لوحظ واحد فقط مستعمرة إيجابية مع الجين KU70 حذف، مما يشير إلى معدل حذف الجينات منخفضة جدا (<0.5٪). وفي وقت لاحق، تم بناء البلازميد تنسخي تحمل هيغروميسين ب علامة المقاومة ونظام لجنة المساواة العرقية / LoxP (الشكل 2)، وهذا الجين علامة التحديد في سلالة KU70 خروج المغلوب أزيل في نهاية المطاف عن طريق التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase (الشكل 3). باستخدام أداة بحث الانفجار، وتم تحديد أحد عشر جينات الكحول نازعة المفترضة واحد الجينات أوكسيديز الكحول في Y. lipolytica الجينوم. الجينات الكحول نازعة المفترضة هي YALI0E17787g، YALI0D25630g، YALI0A16379g، YALI0E15818g، YALI0D02167g، YALI0A15147g، YALI0E07766g، YALI0F09603g، YALI0B10175g، YALI0F08129g، YALI0E07810g. الجين الكحول أوكسيديز المفترض هو YALI0B14014g. للتحقق من زيادة معدل الحذف الجين بعد حذف الجينات KU70، حذفنا فردي 11 الجينات بالتوازي (باستثناءلYALI0A16379g) باستخدام أشرطة انقطاع مع متواليات مثلي طويلة في Y. lipolytica KU70 سلالة خروج المغلوب (الأرقام 4 و 5). هنا، الاشعال إلى الأمام (P1-F و P2-F) يصلب لتسلسل تقع داخل الذراع 5 'التماثل من الجينات المستهدفة. وتقع الاشعال العكسية (P1-R) داخل المنطقة الترميز من علامة LEU2. وتقع الاشعال العكسية (P2-R) داخل المنطقة ترميز الجينات المستهدفة (الشكل 4). أشرطة خروج المغلوب تختلف إلا قليلا في أطوال سلاسل مثلي وتقييد مواقع (الجدول 1). معدلات الجينات الحذف تحققت [إعادة التركيب مثلي / (إعادة التركيب مثلي + إعادة التركيب غير المتجانس)] من 33٪ -71٪، مما يشير إلى زيادة كبيرة في وتيرة إعادة التركيب مثلي المستهدفة خلال حذف KU70 الجينات. على سبيل المثال، كان معدل حذف YALI0E17787g 40٪ (~ 100 وت / ميكروغرام DNA). علاوة على ذلك، ودراسة إمكانية زيادة أخرى في معدل حذف الجينات عندما استخدمت متواليات مثلي أطول. وبينت ان YALI0E17787g تعطيل الجين كاسيت مع 2 كيلو بايت متواليات مثلي أعطى معدل الحذف من 87.5٪ (~ 400 وت م / DNA ميكروغرام). وبالإضافة إلى ذلك، تم إزالة LEU2 الجين اختيار علامة قدم في المسوخ الحذف التي تم الحصول عليها عن طريق تحويل ناقلات pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة (hp4d- لجنة المساواة العرقية، الحلمة)، وبالتالي تمكين جولات متعددة من التلاعب الجيني المستهدفة.

شكل 1
ناقصة الشكل 1. بناء الكاسيت KU70 خروج المغلوب وKU70 متحولة. A. وKU70 خروج المغلوب البلازميد T-KO. ب. الرسم التخطيطي للكاسيت KU70 خروج المغلوب. إعادة المنبع والمصبتم استنساخ املناطق (1 كيلوبايت) من الجين KU70 إلى 5'- و3'-نهاية الكاسيت تعطل لإعادة التركيب مثلي. تم إدراج كاسيت التعبير LEU2 بين اثنين مثلي متواليات المرافقة. C. هلام الكهربائي من الكاسيت KU70 الحذف بعد الحويصلة الثاني وتجربة الاقتراب من الموت أنا الهضم من T-KO. L: 1 كيلو بايت الحمض النووي سلم. 1: كاسيت KU70 الحذف (حجم الفرقة المتوقع 4.3 كيلوبايت) D. تأكيدا PCR من حذف KU70 الجينات في Y. lipolytica Po1g. وتضخمت منتجات PCR من الحمض النووي الجيني من transformants (الممرات 1-10) ونوع السلالة البرية (حارة 11). لين 7 يوضح بالضربة القاضية إيجابي، بينما حارة 1 يظهر إيجابية كاذبة. في هلام العلوي، يتم الحصول على جزء من 500 نقطة أساس مع التمهيدي وضع # 56 / # 57 وتغيب فقط في الممرات 1 و 7. في هلام السفلي، وبالضربة القاضية ناجحة توليد جزء من 750 سنة مضت، والتي يتم الحصول عليها مع التمهيدي تعيين # 55 / # 56. Tفهو ينظر إلى 750 فرقة بي بي فقط في ممر 7. L: 1 كيلو بايت الحمض النووي سلم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. رسم تخطيطي لجنة المساواة العرقية التعبير البلازميد recombinase لإنقاذ علامة. البلازميد تكرار episomally pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة يحمل recombinase لجنة المساواة العرقية (لجنة المساواة العرقية)، علامة مقاومة هيغروميسين ب (الحلمة)، جين المقاومة الأمبيسلين (الأمبير)، وهو أصل تكرار كولاي (pMB1)، أصل تكرار Y. lipolytica (ORI1001)، تسلسل الحمض النووي السنترومير من Y. lipolytica (CEN1-1) والجين lacZ ترميز انزيم β غالاكتوزيداز. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الاصدار سيون من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم فحص 3. نمو Y. الإيجابي علامة أقل وكانت مخففة سلالات lipolytica بعد الانقاذ علامة. Transformants (1-4)، ورصدت على لوحات YPD، لوحات YPDH ولوحات، ليسين ناقصة، على التوالي. بعد 3 أيام من النمو عند 30 درجة مئوية، transformants خالية من علامة إيجابية (1، 3، 4) يمكن أن تنمو فقط على لوحة YPD، مما يدل على استئصال الجين LEU2 علامة على التعبير عن recombinase لجنة المساواة العرقية وفقدان البلازميد pSL16- لجنة المساواة العرقية-الحلمة ج: لوحة YPD، B: لوحة YPDH، C: لوحة، ليسين نقص الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ضمن الصفحات = "1"> الشكل (4)
الشكل 4. رسم تخطيطي لحذف الجينات المستهدفة وإجراء الإنقاذ علامة ويتكون كاسيت اختلال الجينات الجين اختيار علامة (LEU2) يحيط بها موقعين الاعتراف LoxP واثنين من استهداف الأسلحة (متواليات المرافقة المنبع والمصب). بعد تحويل الكاسيت اضطراب في Y. خلايا lipolytica، يحدث الحدث استبدال الجيني عن طريق المزدوج كروس إعادة التركيب مثلي في هاتين المرافقة الأسلحة التماثل في موضع المستهدفة. استخدمت مجموعتين من الاشعال PCR للتحقق التكامل بين كاسيت انقطاع (P1-F وP1-R) والحذف المتزامن للمناطق الجينوم المستهدفة (P2-F و P2-R). وأخيرا، يتم إزالة علامة LEU2 من التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase، تاركا وراءه موقع LoxP واحد في موضع الكروموسومات. حذف الجينات المستهدفة واستبدال YALI0E17787 جنرال الكتريكشمال شرق عرضت هنا كمثال. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. التأكيد PCR من اضطراب الجينات YALI0E17787 في Y. كانت منتجات lipolytica Po1g. PCR تضخيمها من الحمض النووي الجيني من transformants (الممرات 1-4) ونوع السلالة البرية (حارة 5). الممرات 1 و 2 و 4 توضح بالضربة القاضية إيجابية، بينما حارة 3 يظهر إيجابية كاذبة. في هلام العلوي، وبالضربة القاضية ناجحة توليد جزء من 750 سنة مضت، والتي يتم الحصول عليها مع التمهيدي وضع P1-F وP1-R. وينظر الى الفرقة 750 نقطة أساس في الممرات 1 و 2 و 4، ولكن ليس في الممرات 3 و 5. في هلام القاع، ويتم الحصول على جزء من 500 نقطة أساس مع التمهيدي وضع P2-F و P2-R وموجود فقط في الممرات 3 لالثانية 5. L: 1 كيلو بايت الحمض النووي سلم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

عنصر PCR
المواد PCR مجلدات التركيز النهائي
عازلة PCR 10 ميكرولتر 1X
مزيج dNTP 1 ميكرولتر 200 ميكرومتر
التمهيدي إلى الأمام 2.5 ميكرولتر 500 نانومتر </ td>
التمهيدي عكسي 2.5 ميكرولتر 500 نانومتر
البلمرة DNA 0.5 ميكرولتر 1 U
قالب الحمض النووي (المخفف الجينومية أو DNA البلازميد) 0،5-2 ميكرولتر 50 نانوغرام
الماء المعقم ما يصل الى 50 ميكرولتر
شروط الاسترداد
درجة الحرارة مرة عدد الدورات
98 ° C 30 ثانية 1
98 ° C 10 ثانية 30
55 ° C 30 ثانية
72 ° C 30 ثانية
72 ° C 10 دقائق 1
أداء PCR التضخيم باستخدام الحرارياتآل cycler على

الجدول 2. PCR الإعداد والظروف لالبلمرة DNA عالية الدقة.

الجدول 3. الحمض النووي ظروف التفاعل ربط باستخدام يغاز T4 DNA.

مكون
المواد التركيز النهائي
T4 DNA يغاز العازلة 1X
ناقلات الحمض النووي 0.03 بمول
إدراج الحمض النووي 0.15 بمول
يغاز T4 DNA 400 U
الماء المعقم ما يصل الى 20 ميكرولتر
الظروف
درجة الحرارة مرة
16 ° C 16 ساعة
<td> 6 ساعات
مكون
المواد التركيز النهائي
عازلة الهضم تقييد 1X
الحمض النووي (البلازميد أو PCR المنتج) 1 ميكروغرام
1 شارع انزيم التقييد 5 U
2 ND انزيم التقييد (اختياري) 5 U
الماء المعقم ما يصل الى 50 ميكرولتر
الظروف
درجة الحرارة مرة
37 ° C
أداء الهضم واحد مع انزيم تقييد واحد
أداء الهضم مزدوجة مع زوج من الإنزيمات تقييد

الجدول 4. شروط انزيم الهضم تقييد الحمض النووي.

عنصر PCR
المواد PCR مجلدات التركيز النهائي
عازلة PCR 2.5 ميكرولتر 1X
مزيج dNTP 0.5 ميكرولتر 200 ميكرومتر
التمهيدي إلى الأمام 0.5 ميكرولتر 200 نانومتر
ريفالعلاقات والتعليم الجنسي التمهيدي 0.5 ميكرولتر 200 نانومتر
البلمرة DNA 0.2 ميكرولتر 1 U
قالب الحمض النووي (المخفف الجينومية أو DNA البلازميد) 0،5-2 ميكرولتر 50 نانوغرام
الماء المعقم ما يصل إلى 25 ميكرولتر
شروط الاسترداد
درجة الحرارة مرة عدد الدورات
95 ° C 5 دقائق 1
95 ° C 30 ثانية 30
50 ° C 30 ثانية
72 ° C 30 ثانية
72 ° C 10 دقائق 1
أداء PCR التضخيم باستخدام cycler الحرارية
أداء مستعمرة PCR مباشرة باستخدام مستعمرة كقالب، بدلا من عينة الحمض النووي

الجدول 5. PCR / مستعمرة PCR انشاء وشروط البلمرة طق الحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهدفنا في هذه الدراسة هو تمكين جيل سريع وفعال بالضربة القاضية جين المستهدفة في Y. lipolytica Po1g سلالة وتحتاج العديد من الاعتبارات التي يتعين معالجتها لتحقيق هذا. أولا، لا بد من كفاءة تحويل عالية. وهكذا، فإن بروتوكول التحول الكيميائي فعالة ومريحة للY. وقد وصفت lipolytica Po1g سلالة في هذه الدراسة. استخدام PEG-4000 هو عامل حاسم للتحول الناجح لهذه السلالة. لم يتم الحصول على transformants للتحول بلازميد عند استخدام PEG-3350 (للتحول من البيرة س) بدلا من PEG-4000. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إعداد الخلايا المختصة باستخدام خلايا الطازجة للحصول على كفاءة عالية التحول في هذه السلالة. ثانيا، للحد من إعادة التركيب والتكامل عشوائي الأحداث غير المتجانسة عبر المهيمن NHEJ في هذه السلالة، ثم استخدمت طريقة التحول الفعال لبناء KU70 خروج المغلوب متحولة. ثالثا، لتحسين كفاءة استبدال الجينات بإتحاد مثلي، المرافقة لفترة طويلة الأسلحة (1 كيلوبايت) المنبع والمصب استخدمت من الجينات المستهدفة في أشرطة حذف الجينات. المناطق المتجانسة المرافقة لفترة طويلة في أشرطة اضطراب ضرورية لإعادة التركيب مثلي فعال في هذه السلالة. وقد تم الحصول على أي مستعمرات إيجابية عند استخدام أشرطة انقطاع مع مناطق متماثلة 50 سنة مضت (كافية لإعادة التركيب مثلي كفاءة في البيرة س). استخدام جميع هذه الاستراتيجيات، الجين KU70 من Y. تم حذف lipolytica Po1g سلالة بنجاح. ومع ذلك، فإنه من الصعب للغاية الحصول على سلالة KU70 خروج المغلوب نظرا لنسبة عالية جدا من إعادة التركيب غير المتجانس في Y. lipolytica Po1g سلالة. يجب توخي الحذر عند التعامل مع هيغروميسين B المضادات الحيوية التي تحتوي على وسائل الاعلام كما هيغروميسين B خفيف حساسة. وذلك باستخدام وسائل الإعلام مع تدهور هيغروميسين B يؤدي في نقاط البيع كاذبةitives في خطوات 2.2.1 و 2.2.2 وسلبيات كاذبة في الخطوة 2.2.7.

عندما تم استخدام الحذف سلالة KU70 لتوليد حذف المستهدف من الجينات الفردية ترميز الكحول ديهيدروجيناز وأوكسيديز الكحول، وحققت نسبة الحذف أعلى بكثير بالمقارنة مع حذف الجينات KU70. وهذا يوضح أن استخدام منصة سلالة KU70 حذف أدى إلى زيادة كبيرة في وتيرة إعادة التركيب مثلي. وبعد تناول هذه المسألة من الانخفاض الشديد في معدل إعادة التركيب مثلي، وفحص Y. وقد أسرعت lipolytica-جين واحد المسوخ خروج المغلوب عالية تصل. لاحظنا أيضا أن طول 1 كيلو بايت من المنطقة المتجانسة وفعالة بما فيه الكفاية للحذف الجينات المستهدفة. ويمكن تحقيق زيادة في وتيرة إعادة التركيب مثلي عند استخدام تسلسل يعد مثلي (2 كيلو). والجدير بالذكر أن هذه الجينات ترميز الكحول ديهيدروجيناز وأوكسيديز الكحول، والتي تحفز تحويل عكسها بين الكحول ومحددة المدةehydes. حذف هذه الجينات يمكن أن يؤدي إلى زيادة تراكم من الوقود الحيوي والمركبات الكيميائية الحيوية بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والأحماض الدهنية متوسطة السلسلة، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة، والأحماض الدهنية هيدروكسي، والكحول، والألدهيدات والدهون. سيتم تنفيذ إجراء المزيد من الدراسات للتحقق من هذا الاحتمال.

تم الإبلاغ عن طريقة تعطيل الجينات بوساطة PCR في Y. lipolytica Po1d السلالة 28. ومع ذلك، وهذه الطريقة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. أحد أوجه القصور الرئيسية لهذا الأسلوب هو صعوبة الحصول على كميات كافية من أشرطة حذف الجينات لتجربة التحول واحدة. الحد الآخر هو أن هذا الأسلوب يقتصر على علامة URA3. الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة تناول على وجه التحديد هذه القضايا في تقنية PCR القائم من خلال الجمع بين نهج الهضم ربط ونظام لجنة المساواة العرقية / LoxP. وتسمح هذه الطريقة استخدام مختلف علامات المضادات الحيوية وبعامل نمائي، وبالتالي هو أكثر بالعكسالبلاط. ويمكن أن تسهل حذف الجينات السريع في Y. lipolytica Po1g سلالة. نقدم هنا وصفا تفصيليا لاستراتيجية تستهدف الحذف جين واحد من خلال إعادة التركيب مثلي في Y. خلايا lipolytica Po1g. ومع ذلك، لا يزال الموقع LoxP واحد كما ندبة داخل الجينوم بعد إنقاذ علامة النجاح (الشكل 4). في الحذف متعددة الجينات، ويتم تقديمها ندوب LoxP متعددة في الجينوم، وهذا قد يؤدي إلى عدم الاستقرار الجيني بسبب أحداث إعادة التركيب المحتملة التي يمكن أن تحدث بين المواقع LoxP. ومع ذلك، فإن سلالات خروج المغلوب التي شيدت في هذه الدراسة أظهرت الاستقرار الجيني جيد جدا، مشيرا إلى أن أحداث إعادة التركيب غير مقصودة لم يحدث بين المواقع LoxP.

وباختصار، تم إنشاء بروتوكول التحول الجيني كفاءة لY. lipolytica Po1g سلالة. وقد تجلى حذف الموجهة للجينات واحدة في هذه السلالة كدليل على المفهوم. وY. أظهر lipolytica Po1g KU70 منصة حذف السلالة التي شيدت في هذه الدراسة فعالة جدا تردد إعادة التركيب مثلي، والتي تمكن من فحص أسهل وأسرع من الحذف الجينات المستهدفة. وبالتالي، فإن هذا الضغط منصة نظام أكثر كفاءة وأفضل خيار للتطبيقات في الهندسة الطريق والضغط الأمثل عند بناء طفرات الكروموسومات حذف أخرى. ويمكن أيضا أن تطبق منهجية وصفها وشيدت KU70 سلالة الحذف لإدخال الجينات المستهدفة في مواضع محددة، وخلق طفرات في مواقع محددة في الجينوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نحن الامتنان الدعم بتمويل من وكالة البيئة الوطنية في سنغافورة (برنامج التعليم والتدريب 1201102)، وبرنامج البحوث التنافسية للمؤسسة القومي للبحوث في سنغافورة (جبهة الخلاص الوطني، CRP5-2009-03)، وكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث في سنغافورة ( 1324004108)، العالمية R & D برنامج مشروع، وزارة اقتصاد المعرفة، وجمهورية كوريا (N0000677)، وكالة خفض التهديد الدفاعي (اثناء اجتماع السلطة، HDTRA1-13-1-0037) وعلم الأحياء الاصطناعية مبادرة من الجامعة الوطنية في سنغافورة ( DPRT / 943/09/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10 Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		 Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		 Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Tags

علم الوراثة، العدد 115، الهندسة الحيوية، العدد، الخميرة غير تقليدية،
الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K.,… More

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K., Ling, H., Cho, H. S., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter