Abstract
解脂耶氏是一种非致病的，二相性和严格的有氧酵母物种。由于其独特的生理功能和代谢特征，这非常规酵母不仅对真菌分化的基本性质的研究的良好模型，但也用于生化生产和各种生物技术应用，其需要大量的基因操作一个有希望的微生物的平台。不过，Y的遗传操作解脂一直有限由于缺少一种有效的和稳定的遗传转化系统以及可主要归因于KU70基因的非同源重组率很高。在这里，我们报告一个简单而快速的协议为高效遗传转化并为Y.基因缺失解脂 Po1g。首先，外源DNA的高效转化为Y.协议解脂 Po1g成立。山高次，以达到增强的双交换同源重组速率为靶基因的进一步缺失，所述KU70基因通过转化中断箱运送1kb的同源臂删除。第三，以展示KU70基因的缺失后增强的基因缺失的效率，我们单独删除11编码上使用KU70淘汰赛平台菌株的相同程序乙醇脱氢酶和醇氧化酶的靶基因。据观察，精确的同源重组的速率从低于0.5％大幅增加为删除 在Po1g的KU70基因到33％-71％，为单基因缺失Po1g KU70Δ11靶基因。复制型质粒携带潮霉素B抗性标记和酶Cre / loxP系统构建，并最终被Cre重组酶表达去除酵母基因敲除菌株的选择标记基因便于多轮圆盾的特德遗传操作。所得单基因缺失突变体具有在生物燃料和生化生产的应用潜力。
Introduction
不像酿酒酵母 ， 解脂耶氏，一个非常规酵母，可以响应于环境条件1,2-变化在酵母或菌丝的形式生长。因此，这种二形酵母可用作真菌分化，形态发生和分类3,4,5的研究的良好模型。它通常被认为是安全的（GRAS）的酵母物种，它被广泛用于生产各种食品添加剂如有机酸，多元醇，芳香化合物，乳化剂和表面活性剂6,7,8,9这样。它是专性需氧菌和能够以高含量自然积累脂质的公知的含油酵母， 即高达细胞干重10的70％。它也可以利用碳源的广泛增长，其中包括浪费资源的养分11,12,13不同种类的残留物。所有这些独特的功能使Y.为解脂非常有吸引力各种生物技术应用。
虽然Y的全基因组序列解脂已发表14,15，这种非常规酵母的基因操作比其它酵母种更加复杂。第一，该酵母物种的转化是有效的要少得多，由于不存在稳定高效的遗传转化系统16,17的。第二，线性表达盒的费力的基因组整合通常用于感兴趣基因的表达，因为没有天然游离质粒系统已经在该酵母18被发现。第三，代遗传敲奏和敲造访受到限制，因为该基因通过准确同源重组在该酵母靶向效率是低的，并通过非同源末端连接（NHEJ）19最积分事件发生。
在这项研究中，我们报道了Y.优化改造协议解脂 KU70基因，其编码在NHEJ途径的关键酶。通过使用优化的改造方案和改造含有侧翼的1 kb的同源地区，Y的KU70基因的敲除线性磁带解脂 Po1g被成功删除。这种基因缺失的方法的稳健性然后通过在Po1g KU70Δ应变靶向乙醇脱氢酶和醇氧化酶基因的证明。据观察，在KU70缺失菌株表现出同源重组介导的基因的一个相当高的效率比野生型Po1g应变的定位。此外，携带潮霉素B抗性标记的复制的Cre表达质粒构建以执行标记救援。标记救援促进多轮基因在针对第Ë获得的基因缺失突变体。除了 基因缺失，我们对这里描述的遗传转化和基因缺失协议可应用到插入基因的具体位点，并引入位点特异性突变引入Y.解脂基因组。
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Protocol
1.新一代的Y的解脂 KU70删除应变
- 中断盒建设
注：请参阅表1为聚合酶链反应（PCR）扩增使用的所有引物。- 设计的引物20进行PCR扩增LEU2表达盒（ 见表1）从一个Y.和一个长的反向引物（＃2; 表1）分别; 解脂表达载体并引入LoxP位点到5'和3'LEU2启动盒与长正向引物（ 表1＃1）结束。引入用于克隆过程的后续步骤的额外限制性位点，加在引物＃1的巴姆 HI限制性位点。
- 使用高保真DNA聚合酶如表2中详述的进行PCR。
- 使用PCR purificatio纯化PCR产物loxP的启动子 - LEU2 - 终止-LoxP位盒根据制造商的说明Ñ套件。根据制造商的说明21 ...添加3'-A突出的纯化的PCR产物。使用T4 DNA连接酶结扎A-尾PCR产物入TA克隆载体，产生质粒T-LEU2按表3。
- 用PCR引物＃3/4＃从Y.扩增基因KU70的1 kb的5'上游序列解脂 Po1g按表2的基因组DNA 22。纯化使用根据制造商的说明一个PCR纯化试剂盒将PCR产物。
- 双重消化两个纯化的PCR产物和T-LEU2质粒用Sac II和BamHⅠ酶按表4。使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化消化混合物。使用T4 DNA连接酶，以结扎纯化和消化的PCR产物的囊 II / T-LEU2的巴姆 HI位点，得到质粒T-LEU2-5E按表3。
- 使用引物＃5 /＃6从Y.扩增KU70基因的1kb的3'下游序列解脂 Po1g按表2的基因组DNA 22。纯化使用根据制造商的说明一个PCR纯化试剂盒将PCR产物。双重消化两个纯化的PCR产物和用Not I和的Nde I酶按表4的T-LEU2-5E质粒。
- 纯化使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明将消化混合物。然后，结扎纯化和消化的PCR产物的未 I / 的Nde I位点的T-LEU2-5E的，得到使用T4DNA连接酶按表3质粒的T-KO。
- 消化质粒T-KO用Sac II和NDE我酶按表4，产生中断盒（ 图1
- 感受态细胞制备和Y改造解脂 Po1g应变
- 感受态细胞制备
- 接种Y.的殖民地从在10ml YPD培养基（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖和50mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.0）中的100毫升烧瓶中新鲜酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）板解脂 Po1g菌株。孵育在30℃振荡培养箱中于225rpm下20小时，直到饱和度（的OD为约15 600，使用分光光度计测量）。
- 通过在室温下以5000 xg离心离心5分钟沉淀细胞。清洗细胞用20ml的Tris-EDTA（TE）缓冲液（10mM的Tris，1mM EDTA中，pH值7.5），并如在步骤1.2.1.2所述细胞沉淀。重悬在1ml的0.1M乙酸锂（pH值6.0，用乙酸调节）的细胞中，并孵育在室温坦佩10分钟叉涂抹。
- 分装感受态细胞（100微升）进入无菌1.5毫升管。进行到转化步骤下面马上或在-80℃下长期贮存添加甘油至25％的终浓度（体积/体积），并存储。
- 转型
- 轻轻10微升变性的鲑精子DNA（10毫克/毫升）和1-5微克纯化的破坏盒的与100微升的感受态细胞混合在一起，并在30℃下孵育15分钟。
- 加入700微升40％聚乙二醇（PEG）-4000（溶于0.1M醋酸锂pH值为6.0）中，拌匀，并在225转速在30℃摇床孵育60分钟。
注意：使用的PEG 4000平均分子量，代替PEG-3350（典型地在常规的酵母的转化中使用）是重要的。 - 热火通过将管在39℃水浴60分钟震荡转化混合物。
- 加入1 ml YPD中，恢复为在30℃下2小时，225转。离心机以9000rpm的XG在室温下1分钟，除去上清液和重悬沉淀在1ml TE缓冲液中。
- Repellet通过离心将细胞以9000rpm的XG的在室温下1分钟，并弃去上清液。重悬在100μlTE缓冲液中的沉淀和板到选择平板（ 例如 ，亮氨酸缺陷型板），并在30°C孵育2-3天。
- 选择4至10个单菌落，并分别接种入2ml YPD培养基。在225rpm下在30℃振荡培养箱中孵育过夜。从转化22识别由基因组DNA的PCR分析阳性菌落按使用两组引物＃55 /＃56和＃56 /＃57 表5中 ，分别。
注意： 未 I线性pYLEX1载体转化到Y.解脂 Po1g感受态细胞，以便通过计数的数目来确定转化效率每微克质粒的菌落形成单位（cfu）的DNA用于23。
- 感受态细胞制备
2.标记救援
- 华创表达载体的构建
- pYLEX1-CRE和pYLEX1-HPH建设
- 设计的引物20进行PCR扩增CRE和HPH的开放阅读框。添加额外的腺嘌呤核苷酸的起始密码子上游的正向引物＃82和＃84，和插入在反向引物＃83和＃85的终止密码子的下游的PCR扩增CRE的开放读框的KpnI限制性位点和从pSH69（登录号HQ412578）24 HPH按表2。
- 净化既CRE和使用根据制造商的说明一个PCR纯化试剂盒HPH片段。既消化酶我按照TABL与KPN纯化的综合招聘考试及HPH片段E 4。双酶切与PML和KpnI酶按表4中的pYLEX1质粒。用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化消化混合物。
- 使用T4 DNA连接酶按表3结扎纯化和消化CRE和HPH片段至Y的PML的I / 的KpnI位点解脂表达载体，产生pYLEX1-CRE和pYLEX1-HPH分别。
- pSL16-CRE-HPH建设
- 使用引物＃86放大来自pYLEX1-CRE CRE的启动子-基因-终止子盒/＃87侧翼萨尔的I /PstⅠ限制位点按表2中 。根据制造商的说明纯化使用PCR纯化试剂盒将PCR产物。
- 双重消化两个纯化的PCR产物和pSL16-CEN1-1（227）的质粒25用Sal I和的PstⅠ酶按表4。纯化使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明将消化混合物。然后，在相应的位点结扎纯化和消化的PCR产品放入pSL16-CEN1-1（227），使用T4 DNA连接酶按表3来创建pSL16-CRE。
- PCR使用引物扩增来自pYLEX1-HPH HPH的启动子-基因-终止子盒＃88 /＃89侧翼Xho I 位 /BglⅡ位限制性位点按表2中 。使用PCR纯化试剂盒根据制造商的说明纯化PCR产物。
- 双重消化两个纯化的PCR产物和用Xho I和BglⅡ酶切酶按表4 pSL16-CRE质粒。用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化消化混合物。然后，结扎纯化和消化的PCR产品放入pSL16-CRE在相应的网站使用T4DNA连接酶按表3，以产生pSL16-CRE-HPH。
注意：将所得的Cre表达的质粒，pSL16-CRE-HPH，怀有可选择潮霉素B的标记，是着丝粒和附加型复制载体（ 图2）。
- 双重消化两个纯化的PCR产物和用Xho I和BglⅡ酶切酶按表4 pSL16-CRE质粒。用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化消化混合物。然后，结扎纯化和消化的PCR产品放入pSL16-CRE在相应的网站使用T4DNA连接酶按表3，以产生pSL16-CRE-HPH。
- 验证所有通过消化适当的限制性内切酶（ 例如 ， 萨尔我/ PST我，切除从载体插入）按表4的结构。
- 使用引物＃86放大来自pYLEX1-CRE CRE的启动子-基因-终止子盒/＃87侧翼萨尔的I /PstⅠ限制位点按表2中 。根据制造商的说明纯化使用PCR纯化试剂盒将PCR产物。
- pYLEX1-CRE和pYLEX1-HPH建设
- Cre重组酶介导的标记救援
- 变换pSL16-CRE-HPH进入淘汰赛KU70菌株的感受态细胞按照上述第1.2节所述的改造方案。板转化细胞到YPD加潮霉素B（YPDH）板（含有400微克/毫升潮霉素B），并孵育在30℃下2-3天。
- 进行菌落PCR按表5中使用引物＃84/85＃识别正面含改造后pSL16-CRE-HPH质粒的菌落。
注意：正向引物＃84和反向引物＃85位于潮霉素基因（ 表1）的编码区内部。只阳性克隆产生在PCR反应的特定PCR产物。 - 挑选阳性克隆，接种于2ml YPDH培养基中，并在225rpm下在30℃振荡培养箱中孵育过夜饱和。测量用分光光度计细胞OD 600。收获细胞以约15的OD 600。离心机在5000 xg离心在室温下5分钟，并用2毫升无菌水中洗一次。
- 再接种细胞于2ml YPD培养基具有初始OD为0.1 600和允许细胞在30℃振荡培养箱中于225rpm下生长过夜。条纹过夜细胞培养到YPD平板分离单菌落23。复制品板菌落到YPD，YPDH和亮氨酸缺陷型板23 注：已经失去了LEU2标记，pSL16-CRE-HPH质粒只能生长在YPD平板（ 图3）菌落。
3.乙醇脱氢酶和醇氧化酶基因的缺失
- 执行对Y.搜索使用基本局部比对搜索工具（BLAST）来识别要删除的26基因的候选解脂基因组数据库。输入S的蛋白质序列酵母的乙醇脱氢酶我到BLAST搜索工具（http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa）。
注：BLAST搜索工具将返回最相似的蛋白质序列中的Y.解脂基因组数据库。 - 构建通过PCR缺失盒用引物＃7至＃56（ 表1），并执行酶切，并使用上文第1.1节描述的相同的方法连接反应。
- 预备是KU70敲除菌株的感受态细胞，进行转化和进行PCR通过以下在上述1.2节中描述的协议用 引物＃55，＃58〜＃81（ 表1），以确定阳性菌落。
注意：作为一个例子，对于YALI0E17787g基因缺失的方法在图4和5进行说明。报告的1 kb和2 kb的同源区域同源重组率的影响。
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Representative Results
线性Y.解脂表达载体插入到PBR对接平台在Y的基因组解脂 Po1g应变通过执行一个交叉重组27。通过使用本研究建立的快速化学转化过程中，线性Y.解脂表达载体在> 100个/微克DNA的转化效率被成功转化到野生型Po1g菌株。由1kb的同源序列侧接敲除盒转化到Po1g菌株和KU70基因被成功删除（ 图1）。这里，正向引物＃56退火到位于KU70基因的5'同源臂内的序列。反向引物＃55位于LEU2启动标记的编码区内部。反向引物＃57位于KU70基因的编码区内部。怎么样以往，出超过200菌落，只观察到一个具有删除KU70基因阳性菌落，这表明非常低的基因缺失率（<0.5％）。接着，复制的质粒携带潮霉素B抗性标记和酶Cre / loxP系统构建（ 图2），并最终被Cre重组酶的表达（ 图3）中除去在KU70敲除菌株的选择标记基因。使用BLAST搜索工具，十一推定醇脱氢酶的基因和一种醇氧化酶基因中Y.被确定解脂基因组。推定的乙醇脱氢酶基因YALI0E17787g，YALI0D25630g，YALI0A16379g，YALI0E15818g，YALI0D02167g，YALI0A15147g，YALI0E07766g，YALI0F09603g，YALI0B10175g，YALI0F08129g，YALI0E07810g。推定的醇氧化酶基因是YALI0B14014g。为了验证基因缺失率KU70基因删除后的增加，我们单独删除并行的11个基因（除对于YALI0A16379g）通过使用具有长同源序列的破坏盒中的Y.解脂KU70敲除菌株（ 图4和5）。这里，正向引物（P1-F和P2-F），退火到位于靶基因的5'同源臂内的序列。反向引物（P1-R）是位于LEU2标记的编码区内部。反向引物（P2-R）是位于靶基因的编码区（ 图4）的内部。该敲除盒的同源序列和限制性位点（ 见表1）的长度仅略有不同。基因缺失率[同源重组/（同源重组+非同源重组）的33％-71％的实现，这表明在定向同源重组频率在KU70基因缺失的显着增加。例如，YALI0E17787g的删除率为40％（约100个/微克DNA）。此外当使用较长的同源序列，进行了调查的基因缺失率进一步增加的可能性。它表明，2 KB的同源序列的YALI0E17787g基因破坏盒给了87.5％的删除率（〜400 CFU /微克DNA）。此外，通过转化载体pSL16-CRE-HPH除去在所获得的缺失突变体导入选择标记基因的LEU2（hp4d- CRE，HPH），从而使多轮靶基因操纵。
图1. KU70 淘汰赛盒 建设 和 KU70 缺陷突变， 一个 。在淘汰赛KU70质粒T-KO; B。所述KU70基因敲除盒的示意图。上游和下游的重所述KU70基因的gions（1 kb的）克隆到5'-和中断盒用于同源重组的3'-末端。 LEU2启动表达盒插入两个同源的侧翼序列之间。℃。 萨克 II和NDE后KU70缺失盒我从T-KO消化凝胶电泳。 L：1 kb的DNA梯; 1：KU70缺失盒（预期带大小为4.3 KB）D。在Y的KU70基因缺失的PCR确认解脂 Po1g。 PCR产物从转化体的基因组DNA（泳道1-10）和野生型菌株（泳道11）扩增。泳道7示出了一个正敲除，而泳道1示出了假阳性。在顶部凝胶，与设置＃56 /＃57，并且仅在泳道1和7中的底部凝胶不存在，则成功的击倒产生750碱基对的片段，它与所得到的引物得到的500碱基对的片段引物组＃55 /＃56Ť他750 bp的条带仅见于车道7 L：1 kb的DNA阶梯请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 标记救援Cre重组酶表达质粒的示意图。该附加型复制的质粒pSL16-CRE-HPH负有Cre重组酶（CRE），潮霉素B抗性标记（HPH），氨苄青霉素抗性基因（AMP），一大肠杆菌 （pMB1）的复制起点，Y的复 制起点解脂 （ORI1001），Y的着丝粒DNA序列解脂 （CEN1-1）和编码β半乳糖苷酶的lacZ基因。 请点击此处查看大版本这个数字的锡永。
图3. 成长阳性标志少 Y. 筛选 标记救援后 解脂 菌株。转化（1-4）稀释和分别点样到YPD平板，YPDH板和亮氨酸缺陷型板。后在30℃，正无选择标记的转化生长3天（1，3，4）只能生长在YPD板，其在Cre重组酶和质粒丧失的表达指示LEU2标志物基因的切除pSL16- CRE-HPH A：YPD板，B：YPDH板，C：亮氨酸缺乏的板请点击此处查看该图的放大版本。
图4 靶基因的缺失 和标记救援过程 的示意图 。该基因破坏盒包括由两个loxP识别位点和两个定位臂（上游和下游侧翼序列）侧接的选择标记基因（LEU2）的。中断盒转化到Y.后解脂亚罗威阿酵母细胞中，基因置换事件经由在目标轨迹两个侧翼同源臂内双交换同源重组发生。使用了两套PCR引物，以验证中断盒（P1-F和P1-R）和并发缺失目标基因组区域（P2-F和P2-R）的融合。最后，LEU2标记是由Cre重组酶的表达除去，留下在染色体基因座的单LoxP位点。有针对性的基因缺失和更换YALI0E17787戈在这里作为一个例子所示东北。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 在 Y. YALI0E17787基因破坏的PCR确认 解脂 Po1g。PCR产物 从转化体的基因组DNA（泳道1-4）和野生型菌株（泳道5）扩增。泳道1，2，和4示出正的击倒，而泳道3示出假阳性。在顶部凝胶，成功击倒生成750碱基对，其与组P1-F和P1-R的引物所得的片段。 750 bp条带可见于泳道1,2和4中，而不是在泳道3和5中的底部凝胶，与设置的P2-F和P2-R的引物得到的500碱基对的片段，仅存在在车道3第二5. L：1 kb的DNA阶梯请点击此处查看该图的放大版本。
表1. 在本研究中使用的底漆。 请点击此处下载此表。
| PCR组件 | ||
| PCR材料 | 卷 | 最终浓度 |
| PCR缓冲液 | 10微升 | 1X |
| dNTP混合物 | 1微升 | 200μM |
| 正向引物 | 2.5微升 | 500纳米</ TD> |
| 反向引物 | 2.5微升 | 500纳米 |
| DNA聚合酶 | 0.5微升 | 1 U |
| DNA模板（摊薄基因组或质粒DNA） | 0.5-2微升 | 50纳克 |
| 无菌水 | 多达50微升 | |
| PCR条件 | ||
| 温度 | 时间 | 周期数 |
| 98℃ | 30秒 | 1 |
| 98℃ | 10秒 | 三十 |
| 55°C | 30秒 | |
| 72℃ | 30秒 | |
| 72℃ | 10分钟 | 1 |
| 使用千卡进行PCR扩增人循环仪 | ||
表2的PCR的设置和条件的高保真DNA聚合酶。
| 零件 | |||
| 物料 | 最终浓度 | ||
| T4 DNA连接酶缓冲 | 1X | ||
| 载体DNA | 为0.03pmol | ||
| 插入DNA | 0.15皮摩尔 | ||
| T4 DNA连接酶 | 400单位 | ||
| 无菌水 | 多达20微升 | ||
| 条件 | |||
| 温度 | 时间 | ||
| 16℃， | 16小时 | ||
| 零件 | |
| 物料 | 最终浓度 |
| 酶切缓冲 | 1X |
| 的DNA（质粒或PCR产物） | 1微克 |
| 1 日限制性内切酶 | 5单位 |
| 第二限制性内切酶（可选） | 5单位 |
| 无菌水 | 多达50微升 |
| 条件 | |
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | <TD> 6小时|
| 与单一限制性内切酶进行单消化 | |
| 有一对限制性内切酶进行双酶切 | |
表4条件DNA的限制酶消化。
| PCR组件 | ||
| PCR材料 | 卷 | 最终浓度 |
| PCR缓冲液 | 2.5微升 | 1X |
| dNTP混合物 | 0.5微升 | 200μM |
| 正向引物 | 0.5微升 | 200纳米 |
| Reve酒店RSE底漆 | 0.5微升 | 200纳米 |
| DNA聚合酶 | 0.2微升 | 1 U |
| DNA模板（摊薄基因组或质粒DNA） | 0.5-2微升 | 50纳克 |
| 无菌水 | 多达25微升 | |
| PCR条件 | ||
| 温度 | 时间 | 周期数 |
| 95℃ | 5分钟 | 1 |
| 95℃ | 30秒 | 三十 |
| 50℃ | 30秒 | |
| 72℃ | 30秒 | |
| 72℃ | 10分钟 | 1 |
| 使用热循环仪进行PCR扩增 | ||
| 进行PCR直接使用菌落为模板的殖民地，而不是一个DNA样本 | ||
表5 PCR /菌落PCR设置和条件 的 Taq DNA聚合酶。
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Discussion
我们对这项研究的目的是来实现快速，高效的新一代靶向基因敲除在Y.解脂 Po1g应变。有好几个因素需要加以解决，以实现这一目标。首先，需要一个高转化效率。因此，高效，便捷的化学转化协议为Y.解脂 Po1g菌株在本研究中所描述。使用的PEG-4000的是该菌株的成功转化的关键因素。用PEG-3350时（为酿酒酵母的转化）代替PEG-4000质粒转化获得没有转化体。此外，需要使用新制备的细胞感受态细胞的制备在该菌株以获得高转化效率。第二，为了减少在该菌株通过主导NHEJ非同源重组和随机整合事件，一个有效的变换方法，然后用于构建KU70敲除突变体。第三，通过同源重组提高基因置换的效率，长的侧翼臂（1 kb的）上游和靶基因的下游是在基因缺失盒使用。在中断盒长侧翼同源区是在该菌株高效的同源重组是必不可少的。使用具有50个基点同源区（足够用于在酿酒酵母中高效的同源重组）破坏盒时，获得无阳性菌落。使用这些策略中，Y的KU70基因解脂 Po1g株成功删除。然而，这是非常困难的，得到KU70敲除菌株由于Y.非同源重组的非常高的速度解脂 Po1g应变。必须小心处理包含媒体潮霉素B对光敏感抗生素潮霉素B时服用。利用媒体与降级潮霉素B会导致错误的POS在步骤2.2.1 itives和2.2.2和在步骤2.2.7假阴性。
当KU70缺失菌株用于生成编码乙醇脱氢酶和醇氧化酶单个基因靶向缺失，高得多的缺失率相比，KU70基因的缺失来实现。它说明了使用的KU70缺失平台菌株导致同源重组频率的显着增加。后极低的同源重组率的问题被解决，Y的筛选解脂单基因敲除突变的高度加快。我们还注意到，同源区的1 kb的长度是有针对性的基因缺失足够的效率。在同源重组频率的增加可能使用较长的同源序列（2 KB）时可实现。值得注意的是，这些基因编码乙醇脱氢酶和醇氧化酶，其催化醇和ALD之间的可逆转换ehydes。这些基因的缺失可导致生物燃料的累积增加的和生化化合物，包括短链脂肪酸，中链脂肪酸，长链脂肪酸，羟基脂肪酸，醇，醛和脂质。进一步的研究将被执行以验证这种可能性。
的PCR介导的基因破坏方法已报道在Y。解脂 Po1d株28。然而，该方法是费力和耗时的。这种方法的一个主要局限性是获得足够数量的基因缺失盒的一个转化实验的难度。另一个限制是，该方法是有限的URA3标记。在这项研究中所描述的方法通过组合消化结扎方法和酶Cre / loxP系统具体处理在基于PCR的技术这些问题。这种方法允许不同的抗生素和营养缺陷型标记的使用，因此是更亦然瓦。它可以方便快速基因缺失在Y.解脂 Po1g应变。这里我们通过在Y。同源重组呈现有针对性的单基因缺失策略的详细描述解脂 Po1g细胞。然而，一个loxP序列仍作为成功标记营救（ 图4）后的基因组内的疤痕。在多基因缺失，多LoxP位伤痕被引入到基因组中，这可能会导致基因组不稳定性，由于可以在LoxP位点之间发生的潜在的重组事件。然而，在这项研究中构建的敲除菌株显示非常良好的遗传稳定性，这表明非预期重组事件没有在LoxP位点之间发生。
总之，一个有效的遗传转化协议已经建立了Y.解脂 Po1g应变。在该菌株单个基因的靶向缺失证实作为概念证明。在Y。本研究构建解脂Po1g KU70缺失平台菌株显示非常有效的同源重组频率，使靶基因缺失的更容易和更快的筛选。因此，该平台菌株提供了一种更有效的系统和用于在途径工程和构建其他染色体缺失突变体时应变优化应用的更好的选择。所描述的方法和构造KU70缺失菌株也可以适用于插入靶基因的成特定位点和创建位点特异性突变的入基因组。
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Acknowledgments
我们非常感谢来自新加坡（ETRP 1201102）的国家环境局的资金支持，新加坡国立研究基金会（NRF-CRP5-2009-03），该机构对新加坡科学技术研究的竞争研究计划（ 1324004108），全球R＆D项目计划，知识经济部，韩国（N0000677），国防威胁降低局（DTRA，HDTRA1-13-1-0037）和合成生物学新加坡国立大学倡议（ DPRT / 943/09/14）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
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遗传学，第115，生物工程问题，非常规酵母，
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