Abstract
Yarrowia lipolytica is een niet-pathogeen, dimorphe en strikt aerobe gistsoorten. Door zijn onderscheidende fysiologische functies en metabole eigenschappen, onconventionele gist niet alleen een goed model voor de studie van het fundamentele karakter van schimmel differentiatie, maar ook een veelbelovende microbiële platform voor biochemische productie en diverse biotechnologische toepassingen, die een uitgebreide genetische manipulaties vereisen. Echter, genetische manipulaties Y. lipolytica zijn beperkt door het ontbreken van een efficiënte en stabiele genetische transformatie systeem en zeer hoge niet-homologe recombinatie die hoofdzakelijk kan worden toegeschreven aan de Ku70 gen. Hier melden wij een gemakkelijke en snelle protocol voor de efficiënte genetische transformatie en voor gen-deletie in Y. lipolytica Po1g. Ten eerste, een protocol voor de efficiënte transformatie van exogeen DNA in Y. lipolytica Po1g werd opgericht. Second, de verbeterde double-crossover homologe recombinatie rate te bereiken voor verdere verwijdering van target-genen, werd de Ku70 gen verwijderd door het transformeren van een verstoring cassette uitvoeren 1 kb homologie armen. Ten derde, de verbeterde gendeletie efficiency met weglating van de Ku70 gen aan te tonen, we individueel verwijderd 11 doelwit genen die coderen voor alcohol dehydrogenase en alcohol oxidase met dezelfde procedures op het Ku70 knockout platform stam. Waargenomen werd dat de snelheid van precieze homologe recombinatie aanzienlijk gestegen van minder dan 0,5% voor verwijdering van de Ku70 gen in Po1g tot 33% -71% van de enkel gen schrapping van de 11 target genen in Po1g Ku70 Δ. Een replicatieve plasmide dat het hygromycine B resistentie marker en het Cre / LoxP systeem werd gebouwd, en de selectie marker-gen in de gist knockout stammen werd uiteindelijk verwijderd door expressie van Cre recombinase om meerdere rondes van targe vergemakkelijkented genetische manipulaties. De resulterende single-gen deletiemutanten hebben potentiële toepassingen in biobrandstoffen en biochemische productie.
Introduction
Unlike Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, een onconventionele gist kan groeien in de vorm van gist of mycelium in reactie op veranderingen in de omgevingscondities 1,2. Aldus kan deze dimorfe gist gebruikt als een goed model voor de studie van schimmels differentiatie, morfogenese en taxonomie 3,4,5. Het wordt algemeen beschouwd als veilig (GRAS) gistsoort, die op grote schaal wordt gebruikt om een verscheidenheid van additieven producten zoals organische zuren, polyalcoholen, aroma stoffen, emulgatoren en oppervlakteactieve 6,7,8,9. Het is een obligaat aërobe en bekende oliehoudende gist kan natuurlijk accumuleren lipiden in grote hoeveelheden, dat wil zeggen tot 70% van de cel drooggewicht 10. Het kan ook gebruik maken van een breed spectrum van koolstofbronnen voor groei, met inbegrip van verschillende soorten vervuiling in afgewerkte middelen als voedingsstoffen 11,12,13. Al deze unieke functies maken Y. lipolytica zeer aantrekkelijkdiverse biotechnologische toepassingen.
Hoewel de gehele genoomsequentie van de Y. lipolytica is gepubliceerd 14,15, genetische manipulatie van deze onconventionele gist is complexer dan andere gistsoorten. Eerste, transformatie van deze gistsoorten veel minder efficiënt door het ontbreken van een stabiele en efficiënte genetische transformatie systeem 16,17. Ten tweede, is bewerkelijk genomische integratie van lineaire expressiecassettes gebruikt voor de expressie van genen van belang geen natuurlijke episomaal plasmide systeem is in deze gist 18. Ten derde, generatie van genetische knock-outs en knock-ins zijn beperkt, omdat de gene targeting efficiency via nauwkeurige homologe recombinatie in deze gist is laag en de meeste integratie evenementen plaatsvinden via niet-homologe end-joining (NHEJ) 19.
In deze studie, melden wij een geoptimaliseerd transformatie protocol voor de Y. lipolytica Ku70 gen, dat een sleutelenzym in de route NHEJ codeert. Met de geoptimaliseerde transformatieprotocol en transformeren van een lineaire knockout cassette die flankerende gebieden van homologie 1 kb, de Ku70 gen van Y. lipolytica Po1g werd succesvol verwijderd. De robuustheid van dit gen deletie methodiek werd vervolgens aangetoond door zich te richten alcohol dehydrogenase en alcohol oxidase genen in de Po1g Ku70 Δ stam. Waargenomen werd dat de Ku70 deletie stam vertoonde een aanzienlijk hogere efficiëntie van homologe recombinatie bemiddelde gerichte mutagenese dan die van de wildtype stam Po1g. Bovendien, een replicatief Cre expressie plasmide dat het hygromycine B resistentie marker werd geconstrueerd om marker rescue voeren. De marker rescue faciliteert meerdere ronden van gen-targeting in the verkregen gen deletiemutanten. Naast gendeletie, kan ons protocol voor genetische transformatie en gendeletie beschreven worden toegepast om genen op specifieke loci voegen, en plaatsspecifieke mutaties te introduceren in de Y. lipolytica genoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van de Y. lipolytica Ku70 Schrapping Strain
- Constructie van de onderbrekingscassette
Opmerking: Zie tabel 1 voor alle primers gebruikt in polymerase kettingreactie (PCR) amplificatie.- Ontwerp primers 20 PCR amplificeren het LEU2 expressiecassette (zie tabel 1) van een Y. lipolytica expressievector en introduceren loxP plaatsen in de 5 'en 3' uiteinden van het LEU2 cassette met een lange voorwaartse primer (# 1, Tabel 1) en trapt reverse primer (# 2, tabel 1), respectievelijk. Om een extra restrictieplaats voor daaropvolgende stappen van het klonen introduceren, voeg een BamHI-restrictieplaats in primer # 1.
- PCR uitvoeren met behulp van een high-fidelity DNA polymerase zoals beschreven in tabel 2.
- Zuiver het PCR product LoxP-promoter-LEU2-terminator-cassette LoxP met een PCR purification kit volgens instructies van de fabrikant. Add 3'-A overhang aan de gezuiverde PCR-product volgens de instructies van de fabrikant 21. Gebruik T4 DNA ligase aan de A-staart PCR product ligeren in een TA-kloneringsvector van het plasmide T-LEU2 werd verkregen volgens tabel 3.
- PCR amplificeren van het 1 kb 5 'stroomopwaartse sequentie van het gen Ku70 gebruikmaking van primers # 3 / # 4 van Y. lipolytica Po1g genomisch DNA 22 volgens tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant.
- Dubbel digest zowel het gezuiverde PCR-product en T-LEU2 plasmide met SacII en BamHI enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Gebruik T4 DNA ligase aan het ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product aan het SacII / BamHI-plaatsen van T-LEU2 het leverenplasmide T-LEU2-5E volgens Tabel 3.
- PCR amplificeren van het 1 kb 3 'stroomafwaartse sequentie van het gen Ku70 gebruik van primers # 5 / # 6 van Y. lipolytica Po1g genomisch DNA 22 volgens tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Dubbel digest zowel het gezuiverde PCR-product en T-LEU2-5E plasmide met NotI en NdeI enzymen volgens Tabel 4.
- Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Vervolgens ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product aan de NotI / NdeI-plaatsen van T-LEU2-5E het plasmide T-KO met T4 DNA ligase zoals in Tabel 3 verkregen.
- Digest het plasmide T-KO met SacII en NdeI enzymen volgens tabel 4 de onderbrekingscassette produceren (Figuur 1
- Bevoegde voorbereiding en transformatie van Y. cel lipolytica Po1g stam
- Bevoegde celpreparaat
- Inoculeer een kolonie van Y. lipolytica Po1g soort uit verse gistextract-pepton-dextrose (YPD) plaat in 10 ml YPD-medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose en 50 mM citraatbuffer pH 4,0) in een 100 ml kolf. Incubeer in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm gedurende 20 uur tot verzadiging (een OD 600 van ongeveer 15, gemeten met een spectrofotometer).
- Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 5000 xg bij kamertemperatuur. Was de cellen met 20 ml Tris-EDTA (TE) -buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5), en de pellet cellen zoals beschreven in stap 1.2.1.2. Resuspendeer de cellen in 1 ml 0,1 M lithium acetaat (pH 6,0, aangepast met azijnzuur) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamer- tempetuur.
- Aliquot de competente cellen (100 pl) in steriele 1,5 ml buizen. Overgaan tot de transformatie onderstaande stappen direct of voeg glycerol tot een uiteindelijke concentratie van 25% (v / v) en bewaar bij -80 ° C voor langdurige opslag.
- transformatie
- Meng 10 pi gedenatureerd zalmsperma-DNA (10 mg / ml) en 1-5 ug van het gezuiverde onderbrekingscassette met 100 pi competente cellen en incubeer bij 30 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg 700 ul van 40% polyethyleenglycol (PEG) -4000 (opgelost in 0,1 M lithium acetaat pH 6,0), mengen en incuberen in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm gedurende 60 min.
Opmerking: Het is belangrijk om PEG te gebruiken met een gemiddeld molecuulgewicht van 4000 in plaats van PEG-3350 (standaard gebruikt in de transformatie van conventionele gist). - Hitteschok het transformatiemengsel door het plaatsen van de buis in een 39 ° C waterbad gedurende 60 minuten.
- Voeg 1 ml YPD medium enherstellen gedurende 2 uur bij 30 ° C en 225 rpm. Centrifugeer bij 9000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml TE-buffer.
- Repellet de cellen door centrifugeren bij 9000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Resuspendeer de pellet in 100 ui TE buffer en plaat op selectieve platen (bijvoorbeeld leucine-deficiënte platen), en incuberen bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.
- Pick 4-10 enkele kolonies en te enten afzonderlijk in 2 ml YPD medium. Incubeer overnacht in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm. Positieve kolonies te identificeren door PCR-analyse van genomisch DNA van de transformanten 22 volgens Tabel 5 met twee sets van primers # 55 / # 56 en # 56 / # 57, respectievelijk.
Opmerking: De Niet lineair I pYLEX1 vector wordt getransformeerd in Y. lipolytica Po1g competente cellen om de transformatie-efficiëntie te bepalen door het tellen van het aantalkolonievormende eenheden (cfu) per ug plasmide DNA dat 23.
- Bevoegde celpreparaat
2. Marker Rescue
- De bouw van het Cre-expressieplasmide
- De bouw van pYLEX1-CRE en pYLEX1-HPH
- Ontwerp primers 20 PCR versterken de open reading frames van CRE en HPH. Voeg een extra adenine nucleotide stroomopwaarts van de start codons in de voorwaartse primers # 82 en # 84, en plaatst KpnI restrictieplaatsen stroomafwaarts van de stopcodons in omgekeerde primers # 83 en # 85 PCR amplificeren van het open reading frames van cre en HPH van pSH69 (toegangsnummer HQ412578) 24 volgens tabel 2.
- Zuiver zowel cre HPH en fragmenten onder toepassing van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Digest zowel de gezuiverde cre en HPH fragmenten met Kpn I enzym als per Table 4. Double verteren de pYLEX1 plasmide met Pml en KpnI enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant.
- Gebruik T4 DNA ligase volgens tabel 3 de gezuiverde en gedigereerde cre HPH en fragmenten Pml I / KpnI-plaatsen van de Y. ligeren lipolytica expressie vector, waarbij pYLEX1-CRE en pYLEX1-HPH respectievelijk.
- De bouw van pSL16-CRE-HPH
- PCR amplificeren van de promoter-gen-terminator cassette cre van pYLEX1-CRE behulp van primers # 86 / # 87 aan weerszijden van de SalI / PstI restrictieplaatsen zoals in tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant .
- Dubbele verteren zowel de gezuiverde PCR-product en pSL16-CEN1-1 (227) 25 plasmide met SalI enPstI enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Vervolgens ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product in pSL16-CEN1-1 (227) aan de overeenkomstige plaatsen met pSL16-CRE maken met T4 DNA ligase zoals in Tabel 3.
- PCR amplificeren van de promoter-gen-terminator cassette HPH van pYLEX1-HPH behulp van primers # 88 / # 89 aan weerszijden van de XhoI / BglII restrictieplaatsen zoals in tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant .
- Dubbel digest zowel het gezuiverde PCR-product en pSL16 CRE-plasmide met XhoI en BglII enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Vervolgens ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product in pSL16-CRE tegen de desbetreffendesites pSL16-CRE-HPH genereren met T4 DNA ligase zoals in Tabel 3.
Opmerking: De resulterende Cre-expressieplasmide, pSL16-CRE-HPH, herbergt een selecteerbare marker en hygromycine B is een centromeer en episomaal replicerende vector (Figuur 2).
- Dubbel digest zowel het gezuiverde PCR-product en pSL16 CRE-plasmide met XhoI en BglII enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Vervolgens ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product in pSL16-CRE tegen de desbetreffendesites pSL16-CRE-HPH genereren met T4 DNA ligase zoals in Tabel 3.
- Controleer alle constructen door digestie met geschikte restrictie-enzymen (bijvoorbeeld SalI / PstI, de insertie van de vector uitsnijden) volgens Tabel 4.
- PCR amplificeren van de promoter-gen-terminator cassette cre van pYLEX1-CRE behulp van primers # 86 / # 87 aan weerszijden van de SalI / PstI restrictieplaatsen zoals in tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant .
- De bouw van pYLEX1-CRE en pYLEX1-HPH
- Cre-recombinase gemedieerde marker rescue
- Transformeer pSL16-CRE-HPH in competente cellen van de Ku70 knock-out stam na de transformatie protocol in paragraaf 1.2 hierboven beschreven. Plaat getransformeerde cellen op YPD plus hygromycine B (YPDH) platen (bevattende 400 ug / ml hygromycine B) en incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.
- Voer kolonie PCR volgens Tabel 5 met behulp van primers # 84 / # 85 te identificeren positiefkolonies die pSL16-CRE-HPH plasmide na transformatie.
Opmerking: De voorwaartse primer # 84 en de reverse primer # 85 bevinden zich in het coderende gebied van HPH gen (tabel 1). Alleen positieve klonen met een specifiek PCR-product in de PCR reactie. - Kies een positieve kloon en te enten in 2 ml YPDH medium, en incubeer in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm overnacht tot verzadiging. Meet de cel OD 600 met een spectrofotometer. Oogst de cellen bij een OD 600 van ~ 15. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en eenmaal wassen met 2 ml steriel water.
- Beënten cellen in 2 ml YPD-medium met een initiële OD 600 van 0,1 en laat de cellen gedurende de nacht groeien in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm. Streak de nachtelijke celkweek op YPD platen om enkele kolonies 23 isoleren. Replica plaat kolonies op YPD, YPDH en leucine-deficiënte platen 23 Opmerking: Kolonies die zowel LEU2-merker hebben verloren en pSL16-CRE-HPH plasmide alleen groeien op YPD platen (figuur 3).
3. Schrapping van alcoholdehydrogenase en Alcohol oxidase Genes
- Voer een zoekopdracht uit op de Y. lipolytica genoom database met behulp van de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) om het gen kandidaten te identificeren voor verwijdering 26. Voer de eiwitsequentie van S. cerevisiae alcohol dehydrogenase I in BLAST onderzoekshulpmiddel (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Opmerking: De BLAST onderzoekshulpmiddel retourneert de meest gelijkende eiwitsequenties in Y. lipolytica genoomdatabank. - Construct de verwijdering cassettes door PCR met primers # 7 tot # 56 (tabel 1), en het uitvoeren van restrictie-enzym vertering en ligatiereacties met behulp van dezelfde methoden zoals beschreven in paragraaf 1.1 hierboven.
- Prepzijn competente cellen van de Ku70 knockout stam voeren transformaties en uitvoeren PCR positieve kolonies identificeren met primers # 55, # 58 tot # 81 (Tabel 1) volgens de in paragraaf 1.2 hierboven beschreven protocol.
Opmerking: Als voorbeeld wordt de procedure voor de YALI0E17787g gendeletie beschreven in figuren 4 en 5. De effecten van 1 kb en 2 kb lange homologe gebied op homologe recombinatie rate worden gerapporteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gelineariseerde Y. lipolytica expressie vector werd ingebracht in de pBR docking platform in het genoom van Y. lipolytica Po1g stam door het uitvoeren van een enkele crossover recombinatie 27. Met de snelle chemische transformatiewerkwijze in dit onderzoek vastgesteld, de gelineariseerde Y. lipolytica expressievector werd met succes getransformeerd in de wild-type stam Po1g in een transformatie-efficiëntie van> 100 cfu / ug DNA. Een knockout geflankeerd door homologe sequenties 1 kb werd getransformeerd in de stam en de Po1g Ku70 gen is verwijderd (Figuur 1). Hier de voorwaartse primer # 56 hybridiseert met de sequentie zich in de 5 'homologie-arm van de Ku70 gen. De reverse primer # 55 is binnen het coderende gebied van het LEU2-merker. De reverse primer # 57 is binnen het coderende gebied van het gen Ku70. Hoeooit uit meer dan 200 kolonies, maar een positieve kolonie aan het verwijderde Ku70 gen werd waargenomen, dat slechts een zeer lage gendeletie rate (<0,5%). Vervolgens werd een replicerend plasmide dat het hygromycine B resistentie merker en Cre / LoxP systeem werd geconstrueerd (Figuur 2), en de selectiemerker-gen in de Ku70 knockout stam werd uiteindelijk verwijderd door expressie van Cre recombinase (figuur 3). Met behulp van de BLAST search tool, elf vermeende alcohol dehydrogenase genen en een alcohol oxidase-gen werden geïdentificeerd in Y. lipolytica genoom. De vermeende alcohol dehydrogenase genen YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. De vermeende alcohol oxidase gen YALI0B14014g. Om de toename van gen-deletie tarief met weglating van de Ku70 gen te controleren, we individueel verwijderd 11 genen in parallel (met uitzondering vanvoor YALI0A16379g) met de verstoring cassettes met lange homologe sequenties in het Y. lipolytica Ku70 knockout stam (figuren 4 en 5). Hier de voorwaartse primers (P1-P2-F en F) hybridiseren met de sequentie zich in de 5 'homologie arm van doelgenen. Het omgekeerde primers (P1-R) bevinden zich in de coderende regio LEU2 marker. Het omgekeerde primers (P2-R) bevinden zich in het coderende gebied van doelgenen (figuur 4). De knock-out cassettes verschillen slechts enigszins in de lengte van de homologe sequenties en restrictieplaatsen (tabel 1). Gendeletie prijzen [homologe recombinatie / (homologe recombinatie + niet-homologe recombinatie)] van 33% -71% wordt behaald, suggereert een dramatische toename van het beoogde homologe recombinatie frequentie via Ku70 gendeletie. Bijvoorbeeld, het schrappen percentage YALI0E17787g was 40% (~ 100 cfu / ug DNA). voortsDe mogelijkheid van verdere verhoging van gendeletie percentage onderzocht bij meer homologe sequenties werden gebruikt. Het bleek dat de YALI0E17787g gen-onderbrekingscassette met 2 kb homologe sequenties gaf een deletie percentage van 87,5% (~ 400 cfu / ug DNA). Bovendien, de geïntroduceerde selectie merkergen LEU2 in de verkregen deletiemutanten werd verwijderd door het transformeren van de vector pSL16-CRE-HPH (hp4d- cre HPH), waardoor meerdere ronden van doelgen manipulaties.
Figuur 1. De bouw van de Ku70 knockout cassette en de Ku70 deficiënt mutant. A. De Ku70 knockout plasmide T-KO. B. Het schema van de Ku70 knockout cassette. Upstream en downstream reregio's (1 kb) van de Ku70-gen werden gekloneerd om 5'- en 3'-uiteinde van de onderbrekingscassette homologe recombinatie. Het LEU2 expressiecassette werd ingebracht tussen twee homologe flankerende sequenties. C. Gel elektroforese van het Ku70 deletie cassette na SacII en Ndel-digestie van T-KO. L: 1 kb DNA ladder; 1: De Ku70 deletie cassette (de verwachte band grootte is 4,3 kb) D.. PCR bevestiging van de Ku70 gen deletie in Y. lipolytica Po1g. PCR-producten werden geamplificeerd uit genomisch DNA van transformanten (lanen 1-10) en wildtype (laan 11). Laan 7 illustreert een positieve knockout, terwijl laan 1 toont een vals positief. In de top gel, wordt een fragment van 500 bp verkregen met de set # 56 / # 57 en is slechts aanwezig in lanen 1 en 7 in de bodem gel, de succesvolle knockouts genereert een fragment van 750 bp, die is verkregen met primer de primer set # 55 / # 56 Thij 750 bp band wordt alleen gezien in baan 7. L:. 1 kb DNA Ladder Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische weergave van het Cre recombinase expressieplasmide voor marker rescue. De episomaal replicerende plasmide pSL16-CRE-HPH draagt een Cre recombinase (CRE), een hygromycine B resistentie merker (HPH), een ampicilline resistentie-gen (Amp) een replicatieoorsprong van Escherichia coli (pMB1), een replicatieoorsprong Y. lipolytica (ORI1001), een centromeer DNA sequentie van Y. lipolytica (CEN1-1) en een lacZ gen dat codeert voor het enzym β-galactosidase. Klik hier om een grotere ver te bekijkending van dit cijfer.
Figuur 3. Groei screening van positieve marker-less Y. lipolytica stammen na marker rescue. Transformanten (1-4) werden verdund en gespot op YPD-platen, YPDH borden en leucine-deficiënte platen, respectievelijk. Na 3 dagen groei bij 30 ° C, positieve merkervrije transformanten (1, 3, 4) kunnen alleen groeien op YPD plaat, die de excisie van LEU2 merkergen geeft na expressie van het Cre recombinase en het verlies van plasmide pSL16- CRE-HPH a:. YPD plaat, B: YPDH plaat, C:. leucine-deficiënte plaat klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Schematische weergave van gerichte gen deletie en marker rescue procedure. Het gen verstoring cassette bestaat uit een selectie merker gen (LEU2) geflankeerd door twee LoxP herkenningsplaatsen en twee targeting armen (upstream en downstream flankerende sequenties). Na transformatie van de onderbrekingscassette in Y. lipolytica cellen, een genvervanging gebeurtenis via dubbele crossover-homologe recombinatie in de flankerende twee homologie-armen aan de gerichte locus. Twee sets van PCR primers werden gebruikt om integratie van de cassette storing (P1-P1-F en R) en gelijktijdige verwijdering van de beoogde genomische regio (P2-F en P2-R) te verifiëren. Tenslotte wordt het LEU2 marker verwijderd door expressie van Cre recombinase, met achterlating van een loxP plaats op het chromosomale locus. Gerichte gen verwijdering en vervanging van YALI0E17787 gene werd hier als voorbeeld getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. PCR bevestiging van YALI0E17787 gen verstoring in Y. lipolytica Po1g. PCR-producten werden geamplificeerd uit genomisch DNA van transformanten (lanen 1-4) en wildtype (laan 5). Lanen 1, 2 en 4 illustreren positieve knockouts, terwijl laan 3 toont een vals positief. In de top gel, de succesvolle knockouts genereert een fragment van 750 bp, die wordt verkregen met de set-F P1 en P1-R primer. De 750 bp band wordt gezien in banen 1, 2 en 4, maar niet in lanen 3 en 5. In de bodem gel, een fragment van 500 bp verkregen met de set P2-P2-F en R primer en is alleen aanwezig in lanen 3 eennd 5. L:. 1 kb DNA Ladder Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Primers gebruikt in deze studie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
| PCR component | ||
| PCR materialen | volumes | eindconcentratie |
| PCR buffer | 10 gl | 1x |
| dNTP mix | 1 pi | 200 uM |
| voorwaartse primer | 2,5 pl | 500 nM </ Td> |
| Reverse primer | 2,5 pl | 500 nM |
| DNA polymerase | 0,5 pl | 1 U |
| DNA-matrijs (verdund genomisch DNA of plasmide) | 0,5-2 pi | 50 ng |
| steriel water | tot 50 gl | |
| PCR-omstandigheden | ||
| Temperatuur | Tijd | Aantal cycli |
| 98 ° C | 30 sec | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 30 |
| 55 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 10 minuten | 1 |
| Voer PCR-amplificatie met een thermal cycler | ||
Tabel 2. PCR set-up en de voorwaarden voor de high-fidelity DNA polymerase.
| bestanddeel | |||
| materialen | eindconcentratie | ||
| T4 DNA ligase buffer | 1x | ||
| vector DNA | 0,03 pmol | ||
| insert-DNA | 0,15 pmol | ||
| T4 DNA ligase | 400 U | ||
| steriel water | tot 20 gl | ||
| Conditie | |||
| Temperatuur | Tijd | ||
| 16 ° C | 16 hr | ||
| bestanddeel | |
| materialen | eindconcentratie |
| Restrictiedigestie buffer | 1x |
| DNA (plasmide of PCR product) | 1 ug |
| 1 st restrictie-enzym | 5 U |
| 2 tweede restrictie-enzym (optioneel) | 5 U |
| steriel water | tot 50 gl |
| Conditie | |
| Temperatuur | Tijd |
| 37 ° C | <td> 6 hr|
| Voer één digestie met een restrictie-enzym | |
| Voer dubbele ontsluiting met een paar restrictie-enzymen | |
Tabel 4. Voorwaarden voor restrictie-enzym digestie van DNA.
| PCR component | ||
| PCR materialen | volumes | eindconcentratie |
| PCR buffer | 2,5 pl | 1x |
| dNTP mix | 0,5 pl | 200 uM |
| voorwaartse primer | 0,5 pl | 200 nM |
| Reverse primer | 0,5 pl | 200 nM |
| DNA polymerase | 0,2 pl | 1 U |
| DNA-matrijs (verdund genomisch DNA of plasmide) | 0,5-2 pi | 50 ng |
| steriel water | tot 25 gl | |
| PCR-omstandigheden | ||
| Temperatuur | Tijd | Aantal cycli |
| 95 ° C | 5 minuten | 1 |
| 95 ° C | 30 sec | 30 |
| 50 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 10 minuten | 1 |
| Voer PCR-amplificatie met behulp van een thermocycler | ||
| Voer kolonie PCR direct met een kolonie als matrijs in plaats van een DNA-monster | ||
Tabel 5. PCR / Colony PCR set-up en de voorwaarden voor Taq DNA polymerase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De doelstelling van dit onderzoek is om snel en efficiënt genereren van gerichte gen knockouts schakelen in de Y. lipolytica Po1g stam. Verschillende overwegingen moeten worden aangepakt om dit te bereiken. Eerst wordt een hoge transformatie-efficiëntie nodig. Aldus wordt een efficiënte en geschikte chemische transformatie protocol voor Y. lipolytica Po1g stam werd beschreven in deze studie. Het gebruik van PEG-4000 is een kritische factor voor de succesvolle transformatie van deze stam. Geen transformanten werden verkregen plasmide transformatie bij gebruik van PEG-3350 (voor de transformatie van S. cerevisiae) in plaats van PEG-4000. Bovendien wordt bereiding van competente cellen met vers bereide cellen nodig om een hoge transformatie-efficiëntie te verkrijgen in deze stam. Ten tweede, om in deze stam te verminderen niet-homologe recombinatie en willekeurige integratie evenementen via dominant NHEJ, werd een efficiënte transformatie methode vervolgens gebruikt om de KU7 construeren0 knockout mutant. Ten derde, om de doeltreffendheid van genvervangende verbeteren door homologe recombinatie, lange flankerende armen (1 kb) stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doelwitgenen werden gebruikt in gendeletie cassettes. De lange flankerende homologe gebieden in de verstoring cassettes zijn essentieel voor efficiënte homologe recombinatie in deze stam. Geen positieve kolonies werden verkregen bij gebruik verstoring cassettes met 50 bp homologe gebieden (voldoende voor efficiënte homologe recombinatie in S. cerevisiae). Gebruikt al deze strategieën de Ku70 gen van Y. lipolytica Po1g stam werd succesvol verwijderd. Toch is het uiterst moeilijk om de Ku70 knockout-stam te verkrijgen door de zeer hoge mate van niet-homologe recombinatie in het Y. lipolytica Po1g stam. Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van het antibioticum hygromycine B bevattende media als hygromycine B is lichtgevoelig. Het gebruik van media met gedegradeerde hygromycine B zal resulteren in valse positives in stappen 2.2.1 en 2.2.2 en valse negatieven in stap 2.2.7.
Wanneer de Ku70 deletie stam werd gebruikt om gerichte deletie van individuele genen die coderen voor Alcoholdehydrogenase en alcohol oxidase genereren, werd een veel hoger percentage verwijdering bereikt in vergelijking met het schrappen van de Ku70 gen. Het toont aan dat het gebruik van het platform Ku70 deletie stam resulteerde in een dramatische toename van homologe recombinatie frequentie. Na de uitgifte van zeer lage homologe recombinatie rate was gericht, screening van Y. lipolytica enkel gen-knockout mutanten was sterk versneld. We hebben ook opgemerkt dat de 1 kb lengte van homologe gebied was efficiënt genoeg voor gerichte gendeletie. Een verhoging van homologe recombinatie frequentie kan worden bereikt bij langere homologe sequenties (2 kb). Met name deze genen coderen Alcoholdehydrogenase en alcohol oxidase, waarbij de omkeerbare omzetting tussen alcoholen en ald katalyserenehydes. De deletie van deze genen kan leiden tot verhoogde accumulatie van biobrandstoffen en biochemische verbindingen zoals kortketenige vetzuren, middellange keten vetzuren, langketenige vetzuren, hydroxy vetzuren, alcoholen, aldehyden en lipiden. Verdere studies zullen worden uitgevoerd om deze mogelijkheid te controleren.
Een PCR-gemedieerde genverstoring werkwijze gerapporteerd in Y. lipolytica Po1d stam 28. Deze methode is omslachtig en tijdrovend. Een belangrijke beperking van deze werkwijze is de moeilijkheid om voldoende hoeveelheden van het gen deletie cassettes voor een transformatie-experiment. Een andere beperking is dat deze methode is beperkt tot de URA3 marker. De werkwijze beschreven in deze studie specifiek deze kwesties in de PCR-gebaseerde techniek combineert de digestie-ligatie benadering en de Cre / LoxP systeem. Deze methode maakt het gebruik van verschillende antibiotica en auxotrofe markers en dus meer versategel. Het kan snelle gendeletie in de Y vergemakkelijken lipolytica Po1g stam. We presenteren hier een gedetailleerde beschrijving van de beoogde enkel gen deletie strategie door middel van homologe recombinatie in Y. lipolytica Po1g cellen. Echter, een loxP plaats blijft als een litteken in het genoom na succesvolle marker rescue (figuur 4). In meervoudige-gendeletie worden meerdere LoxP littekens ingebracht in het genoom en dit kan resulteren in genomische instabiliteit vanwege mogelijke recombinatie gebeurtenissen die kunnen optreden tussen de loxP plaatsen. Niettemin, de knockout stammen geconstrueerd dit onderzoek bleek zeer goede genetische stabiliteit, wat aangeeft dat onbedoelde recombinatie gebeurtenissen niet plaatsvinden tussen de loxP plaatsen.
Samengevat heeft efficiënte genetische transformatie protocol vastgesteld voor Y. lipolytica Po1g stam. De beoogde schrapping van enkele genen in deze stam werd aangetoond als een proof of concept. de Y. lipolytica Po1g Ku70 deletie platform stam geconstrueerd studie toonde zeer efficiënte homologe recombinatie frequentie, die een eenvoudiger en snellere screening van het beoogde gen deleties mogelijk maakt. Zo, dit platform stam zorgt voor een efficiënter systeem en een betere keuze voor toepassingen in de pathway engineering en spanning optimalisatie bij de bouw van andere chromosomale deletiemutanten. De beschreven methode en het geconstrueerde Ku70 deletiestam kan ook worden toegepast voor het inbrengen van doelgenen in specifieke loci en de creatie van plaatsspecifieke mutaties in het genoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen de financiële steun van de National Environment Agency van Singapore (ETRP 1.201.102), de Competitive Research Program van de National Research Foundation van Singapore (NRF-CRP5-2009-03), het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek van Singapore ( 1324004108), Global R & D Project Program, het ministerie van kenniseconomie, de Republiek Korea (N0000677), het Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) en de Synthetische Biologie initiatief van de National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
Tags
Genetics Bioengineering Onconventionele gist,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
