Abstract
Yarrowia lipolytica è una specie di lieviti non patogeni, dimorfe e rigorosamente aerobici. Grazie alle sue caratteristiche fisiologiche distintive e caratteristiche metaboliche, questo lievito non convenzionale non è solo un buon modello per lo studio della natura fondamentale di differenziazione fungina, ma è anche una piattaforma microbica promettente per la produzione biochimica e varie applicazioni biotecnologiche, che richiedono ampie manipolazioni genetiche. Tuttavia, le manipolazioni genetiche di Y. lipolytica stato limitato a causa della mancanza di un sistema di trasformazione genetica efficiente e stabile, così come molto elevati tassi di ricombinazione non omologa che può essere attribuito principalmente al gene KU70. Qui riportiamo un protocollo semplice e rapido per la trasformazione genetica efficiente e per delezione di un gene in Y. lipolytica Po1g. Innanzitutto, un protocollo per la trasformazione efficiente di DNA esogeno in Y. lipolytica Po1g è stato stabilito. secoND, per ottenere il doppio attraversamento tasso di ricombinazione omologa migliorato per l'ulteriore eliminazione di geni bersaglio, il gene KU70 stato eliminato trasformando una cassetta perturbazione che trasporta 1 braccia kb di omologia. In terzo luogo, per dimostrare il gene maggiore efficienza l'eliminazione dopo la cancellazione del gene KU70, abbiamo eliminato singolarmente 11 geni bersaglio che codificano alcol deidrogenasi e alcool ossidasi con le stesse modalità del ceppo piattaforma di eliminazione diretta KU70. È stato osservato che il tasso di preciso ricombinazione omologa notevolmente aumentato da meno del 0,5% per l'eliminazione del gene KU70 in Po1g al 33% -71% per il singolo gene cancellazione dei 11 geni bersaglio in Po1g KU70 Δ. Un plasmide replicativo portando il marcatore di resistenza igromicina B e il sistema Cre / loxP è stato costruito, e il gene marcatore di selezione dei ceppi di lievito knockout finalmente è stato rimosso con espressione di Cre ricombinasi per facilitare vari cicli di targeted manipolazioni genetiche. I risultanti singolo gene mutanti di delezione hanno potenziali applicazioni in biocarburanti e produzione biochimica.
Introduction
A differenza di Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, un lievito non convenzionale, può crescere in forma di lievito o micelio in risposta ai cambiamenti delle condizioni ambientali 1,2. Così, questo lievito dimorphic può essere usato come un buon modello per lo studio della differenziazione fungine, morfogenesi e tassonomia 3,4,5. E 'generalmente considerato come una specie di lievito sicuri (GRAS), che è ampiamente utilizzato per produrre una varietà di additivi alimentari, come acidi organici, polialcoli, composti aromatici, emulsionanti e tensioattivi 6,7,8,9. È un aerobio obbligato e un lievito oleaginosa noto in grado di accumulare naturalmente lipidi in quantità elevate, cioè, fino al 70% del peso secco cellulare 10. Si può anche utilizzare una vasta gamma di fonti di carbonio per la crescita, compresi i diversi tipi di residui nelle risorse usati come sostanze nutrienti 11,12,13. Tutte queste caratteristiche uniche fanno Y. lipolytica molto attraente pervarie applicazioni biotecnologiche.
Nonostante l'intera sequenza del genoma del Y. lipolytica è stato pubblicato 14,15, manipolazione genetica di questo lievito non convenzionale è più complessa di altre specie di lievito. In primo luogo, la trasformazione di questa specie di lievito è molto meno efficace a causa della mancanza di un sistema 16,17 trasformazione genetica stabile ed efficiente. In secondo luogo, laboriosa integrazione genomica di cassette di espressione lineari è comunemente usato per l'espressione di geni di interesse come nessun sistema plasmide episomiale naturale è stato trovato in questo lievito 18. In terzo luogo, la generazione di genetica knock-out e knock-in sono limitati perché il gene targeting efficienza attraverso accurate ricombinazione omologa in questo lievito è basso e la maggior parte degli eventi di integrazione avviene attraverso non omologhe fine di entrare (NHEJ) 19.
In questo studio, riportiamo un protocollo trasformazione ottimizzato per il Y. lipolytica KU70, che codifica per un enzima chiave nella via di NHEJ. Utilizzando il protocollo trasformazione ottimizzato e trasformando una cassetta knockout lineare contenente regioni fiancheggianti omologia di 1 kb, il gene KU70 della Y. lipolytica Po1g è stato cancellato con successo. La robustezza di questa metodologia gene delezione è stato poi dimostrato di mira alcool deidrogenasi e geni alcol ossidasi nel ceppo Po1g KU70 Δ. È stato osservato che la delezione KU70 ceppo mostrato una notevole maggiore efficienza di ricombinazione genica mediata omologa di targeting quella del ceppo selvatico Po1g. Inoltre, un replicativa Cre plasmide di espressione che trasporta la marcatore di resistenza igromicina B è stato costruito per consentire salvataggio marcatore. Il salvataggio marcatore facilita vari cicli di gene targeting in the ottenuto gene mutanti di delezione. Inoltre gene delezione, il protocollo per la trasformazione genetica e gene delezione qui descritto può essere applicato per inserire geni a loci specifici, e di introdurre mutazioni sito-specifiche in Y. lipolytica genoma.
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Protocol
1. Generazione della Y. lipolytica KU70 Soppressione Strain
- Costruzione della cassetta perturbazione
Nota: Vedere la Tabella 1 per tutti i primer utilizzati nella reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazioni.- Progettazione primer 20 PCR amplificare la cassetta di espressione LEU2 (vedi tabella 1) da un Y. lipolytica vettore di espressione e di introdurre siti loxP nella 5 'e 3' estremità della cassetta LEU2 con una lunga primer forward (# 1, Tabella 1) e una lunga primer reverse (# 2; Tabella 1), rispettivamente. Per introdurre un sito di restrizione aggiuntivo per le successive fasi del processo di clonazione, aggiungere un sito di restrizione BamHI nel Primer # 1.
- Eseguire la PCR utilizzando un alta fedeltà DNA polimerasi come indicato nella tabella 2.
- Purificare il prodotto di PCR loxP-promotore-LEU2-terminator-loxP cassette utilizzando un purificatio PCRKit n secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere sporgenze 3'-A al prodotto di PCR purificato secondo le istruzioni 21 del produttore. Ligasi T4 DNA uso per legare il prodotto A-tailed PCR in un vettore di clonaggio TA per dare il plasmide T-LEU2 come da Tabella 3.
- PCR amplifica il 1 kb 5 'sequenza a monte del gene KU70 utilizzando primer # 3 / # 4 dal Y. lipolytica Po1g DNA genomico 22 come da tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore.
- Doppia digerire sia il prodotto purificato PCR e T-LEU2 plasmide con enzimi Sac II e Bam HI come da tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare ligasi T4 DNA per legare il purificato e digerito prodotto di PCR al Sac II / siti Bam HI del T-LEU2 a dare ilplasmide T-LEU2-5E come da tabella 3.
- PCR amplifica il 1 kb 3 'la sequenza a valle del gene KU70 utilizzando primer # 5 / # 6 dalla Y. lipolytica Po1g DNA genomico 22 come da tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore. Doppia digerire sia il prodotto purificato PCR e plasmide T-LEU2-5E con Not I e nde I enzimi come da tabella 4.
- Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Poi, legare il purificato e digerito prodotto di PCR per il Not I / Nde I siti di T-LEU2-5E per dare il plasmide T-KO con ligasi T4 DNA come da tabella 3.
- Digerire il plasmide T-KO con Sac II e Nde I enzimi come da Tabella 4 per produrre la cassetta interruzione (Figura 1
- Preparazione delle cellule competenti e trasformazione di Y. ceppo lipolytica Po1g
- Preparazione delle cellule competenti
- Seminare una colonia di Y. lipolytica Po1g ceppo da una lastra di lievito fresco extract-peptone-destrosio (YPD) in 10 ml di terreno YPD (1% estratto di lievito, 2% di peptone, 2% di destrosio e 50 mM tampone citrato pH 4.0) in un pallone da 100 ml. Incubare a scuotimento incubatore a 30 ° C a 225 rpm per 20 ore fino a saturazione (un OD 600 di circa 15, misurato con uno spettrofotometro).
- Agglomerare le cellule per centrifugazione per 5 min a 5000 xga temperatura ambiente. Lavare le cellule con 20 ml Tris-EDTA (TE) tampone (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5), e agglomerare le cellule come descritto al punto 1.2.1.2. Risospendere le cellule in 1 ml di 0,1 M di acetato di litio (pH 6.0, regolati con acido acetico), e incubare per 10 min at room tempetura.
- Aliquota le cellule competenti (100 ml) in sterili provette da 1,5 ml. Procedere ai passaggi di trasformazione seguito immediatamente, o aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale di 25% (v / v) e conservare a -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
- Trasformazione
- mescolare delicatamente 10 ml di DNA denaturato di sperma di salmone (10 mg / ml) e 1-5 ug del cassetto perturbazione purificato insieme con 100 microlitri di cellule competenti, e incubare a 30 ° C per 15 min.
- Aggiungere 700 ml di 40% di polietilene glicole (PEG) -4000 (disciolto in 0,1 M di litio acetato pH 6,0), mescolare bene e incubare in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm per 60 min.
Nota: È importante usare PEG con peso molecolare medio di 4000, invece di PEG-3350 (tipicamente utilizzato nella trasformazione di lievito convenzionale). - Heat Shock miscela trasformazione ponendo la provetta in un bagno d'acqua 39 ° C per 60 min.
- Aggiungere 1 ml di mezzo YPD erecuperare per 2 ore a 30 ° C e 225 rpm. Centrifugare a 9.000 xg per 1 min a temperatura ambiente, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 ml di tampone TE.
- Repellet le cellule per centrifugazione a 9.000 xg per 1 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere il precipitato in 100 pl di tampone TE e piastra su piastre selettive (ad esempio, piastre leucina-deficient), e incubare a 30 ° C per 2-3 giorni.
- Scelta 4 a 10 singole colonie e inoculare separatamente in 2 ml di terreno YPD. Incubare per una notte in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm. Identificare le colonie positive per l'analisi PCR del DNA genomico da trasformanti 22 come da tabella 5 con due set di primer # 55 / # 56, e # 56 / # 57, rispettivamente.
Nota: Il Non ho linearizzato pYLEX1 vettore si trasforma in Y. lipolytica Po1g cellule competenti per determinare l'efficienza di trasformazione contando il numerodi unità formanti colonia (ufc) per mcg plasmide DNA usato 23.
- Preparazione delle cellule competenti
2. Marker Rescue
- Costruzione del plasmide di espressione Cre
- Costruzione di pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH
- Progettazione primer 20 per PCR amplificare le cornici di lettura aperta di cre e HPH. Aggiungere un nucleotide adenina più a monte dei codoni di inizio nei primer forward # 82 e # 84, e inserire i siti di restrizione Kpn I a valle dei codoni di stop nei primer inverso # 83 e # 85 PCR amplifica le cornici di lettura aperta di cre e HPH da pSH69 (numero di accesso HQ412578) 24 come da tabella 2.
- Purificare sia cre e frammenti HPH utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore. Digest sia CRE e HPH frammenti purificati con Kpn I enzima secondo Table 4. Raddoppia digerire il plasmide pYLEX1 con gli enzimi Pml I e KPN I come da tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare ligasi T4 DNA come da Tabella 3 per legare le CRE e HPH frammenti purificati e digeriti a siti Pml I / Kpn I del Y. lipolytica vettore di espressione, ottenendo pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH, rispettivamente.
- Costruzione di pSL16-CRE-HPH
- PCR amplifica la cassetta promotore-gene-terminatore di cre da pYLEX1-CRE usando primer # 86 / # 87 che fiancheggiano i siti di restrizione Sal I / Pst I di cui alla tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore .
- Doppia digerire sia il prodotto di PCR purificato e pSL16-CEN1-1 (227) plasmide 25 con Sal I ePst I enzimi come da tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Poi, legare il prodotto purificato e digerito PCR in pSL16-CEN1-1 (227) ai siti corrispondenti per creare pSL16-CRE utilizzando T4 DNA ligasi come da Tabella 3.
- PCR amplifica la cassetta promotore-gene-terminatore di HPH da pYLEX1-HPH usando primer # 88 / # 89 fiancheggiano i siti di restrizione Xho I / Bgl II secondo Tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore .
- Doppia digerire sia il prodotto purificato PCR e pSL16-CRE plasmide con enzimi Xho I e Bgl II secondo tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Poi, legare il prodotto purificato e digerito PCR in pSL16-CRE al corrispondentesiti per generare pSL16-CRE-HPH utilizzando ligasi T4 DNA come da tabella 3.
Nota: La risultante Cre plasmide di espressione, pSL16-CRE-HPH, ospita un marcatore igromicina B selezionabile ed è un centromeric e episomally replicare vettore (Figura 2).
- Doppia digerire sia il prodotto purificato PCR e pSL16-CRE plasmide con enzimi Xho I e Bgl II secondo tabella 4. Purificare la miscela di digestione utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Poi, legare il prodotto purificato e digerito PCR in pSL16-CRE al corrispondentesiti per generare pSL16-CRE-HPH utilizzando ligasi T4 DNA come da tabella 3.
- Verificare tutti i costrutti mediante digestione con opportuni enzimi di restrizione (ad esempio, Sal I / Pst I, di asportare l'inserto dal vettore) secondo la Tabella 4.
- PCR amplifica la cassetta promotore-gene-terminatore di cre da pYLEX1-CRE usando primer # 86 / # 87 che fiancheggiano i siti di restrizione Sal I / Pst I di cui alla tabella 2. Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR in base alle istruzioni del produttore .
- Costruzione di pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH
- Cre salvataggio marcatore ricombinasi-mediata
- Trasforma pSL16-CRE-HPH in cellule competenti del ceppo ko KU70 seguendo il protocollo di trasformazione di cui al precedente punto 1.2. cellule piastra trasformato Onto YPD più igromicina B (YPDH) piastre (contenente 400 mg / ml igromicina B), e incubare a 30 ° C per 2-3 giorni.
- Eseguire colonia PCR come da Tabella 5 utilizzando primer # 84 / # 85 per identificare positivocolonie contenenti pSL16-CRE-HPH plasmide dopo la trasformazione.
Nota: Il Forward Primer # 84 e il contrario di fondo # 85 si trovano all'interno della regione codificante del gene HPH (Tabella 1). Solo cloni positivi generano un prodotto di PCR specifico nella reazione PCR. - Scegliere un clone positivo e inoculare in 2 ml di terreno YPDH, e incubare in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm durante la notte alla saturazione. Misurare il diametro esterno delle cellule 600 con uno spettrofotometro. Raccogliere le cellule ad un diametro esterno 600 di ~ 15. Centrifugare a 5000 xg per 5 min a temperatura ambiente, e lavare una volta con 2 ml di acqua sterile.
- Re-inoculate cellule in 2 ml di mezzo YPD con un OD iniziale 600 di 0,1 e permettere alle cellule di crescere in un incubatore scuotimento 30 ° C a 225 rpm durante la notte. Streak la coltura cellulare durante la notte su piastre YPD per isolare singole colonie 23. Colonie piastra Replica Onto YPD, YPDH e piastre leucina-deficienti 23 Nota: Le colonie che hanno perso sia marcatore LEU2 e pSL16-CRE-HPH plasmide può crescere solo su piastre YPD (Figura 3).
3. Soppressione di alcol deidrogenasi e ossidasi alcol Geni
- Eseguire una ricerca sul Y. banca dati del genoma lipolytica utilizzando la base locale Allineamento strumento di ricerca (BLAST) per identificare i geni candidati per l'eliminazione 26. Inserire la sequenza proteica di S. cerevisiae alcol deidrogenasi I in strumento di ricerca BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Nota: Lo strumento di ricerca BLAST restituisce i più simili sequenze proteiche in Y. banca dati del genoma lipolytica. - Costruire le cassette cancellazione di PCR con primer # 7 a # 56 (Tabella 1), ed eseguire la digestione con enzimi di restrizione e le reazioni di legatura che utilizzano gli stessi metodi, come descritto nel precedente paragrafo 1.1.
- Prepsono cellule competenti del ceppo ko KU70, effettuare trasformazioni e di eseguire la PCR per identificare colonie positive con primer # 55, # 58 a # 81 (Tabella 1), seguendo il protocollo descritto al precedente punto 1.2.
Nota: Come esempio, la procedura per il gene delezione YALI0E17787g è descritto nelle figure 4 e 5. sono riportati gli effetti di 1 kb e lungo 2 kb regione omologa sul tasso di ricombinazione omologa.
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Representative Results
Il Y. linearizzato espressione lipolytica vettoriale è stato inserito nella docking piattaforma PBR nel genoma di Y. lipolytica Po1g ceppo eseguendo un unico ricombinazione di crossover 27. Utilizzando la procedura di trasformazione chimica rapida di cui questo studio, il Y. linearizzato espressione lipolytica vettoriale è stato trasformato con successo nel ceppo selvatico Po1g ad una efficienza di trasformazione di> 100 ufc / mg di DNA. Una cassetta knockout affiancato da 1 kb sequenze omologhe è stato trasformato nel ceppo Po1g e il gene KU70 è stato cancellato con successo (Figura 1). Qui, il Forward Primer # 56 annealing alla sequenza situato all'interno del braccio 5 'omologia del gene KU70. L'inverso di fondo # 55 si trova all'interno della regione codificante del marcatore LEU2. Il contrario di fondo # 57 si trova all'interno della regione codificante del gene KU70. Comemai, su oltre 200 colonie, è stata osservata solo una colonia positiva con il gene KU70 eliminato, suggerendo un tasso molto basso gene delezione (<0,5%). Successivamente, un plasmide replicativo trasporta la marcatore di resistenza B igromicina e sistema Cre / loxP stato costruito (Figura 2), e il gene marcatore di selezione nel ceppo KU70 knockout è stato poi rimosso mediante espressione di Cre ricombinasi (Figura 3). Utilizzando lo strumento di ricerca BLAST, undici putativi geni alcol deidrogenasi e un gene ossidasi alcol sono stati identificati in Y. lipolytica genoma. I geni alcol deidrogenasi putativi sono YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. Il gene alcool ossidasi putativo è YALI0B14014g. Per verificare l'aumento del tasso di gene delezione dopo la cancellazione del gene KU70, abbiamo eliminato singolarmente 11 geni in parallelo (ad eccezioneper YALI0A16379g) utilizzando le cassette di turbativa con lunghe sequenze omologhe in Y. lipolytica KU70 ceppo ad eliminazione diretta (figure 4 e 5). Qui, i primer forward (P1-F e P2-F) ricottura alla sequenza situato all'interno del braccio 5 'omologia di geni bersaglio. I primer inverso (P1-R) si trovano all'interno della regione codificante del marcatore LEU2. I primer inversi (P2-R) sono situati all'interno della regione codificante di geni bersaglio (Figura 4). Le cassette knock-out differiscono solo leggermente nelle lunghezze delle sequenze omologhe ed i siti di restrizione (Tabella 1). Tassi di delezione del gene sono stati raggiunti [ricombinazione omologa / (ricombinazione omologa + ricombinazione non omologa)] del 33% -71%, il che suggerisce un drammatico aumento della frequenza di ricombinazione omologa mirata sopra la delezione del gene KU70. Ad esempio, il tasso di soppressione del YALI0E17787g era del 40% (~ 100 cfu / ug di DNA). per di più, La possibilità di ulteriore aumento gene rate delezione è stata studiata quando sono stati usati sequenze omologhe più lunghi. Ha dimostrato che il gene perturbazione cassetta YALI0E17787g con 2 kb sequenze omologhe ha dato un tasso di eliminazione del 87,5% (~ 400 ufc / DNA mg). Inoltre, il marcatore di selezione gene LEU2 introdotto nei mutanti di delezione ottenuti è stato rimosso trasformando il vettore pSL16-CRE-HPH (hp4d- cre, HPH), consentendo in tal modo più cicli di manipolazione genetica mirati.
Figura 1. Costruzione della cassetta KU70 eliminazione diretta e la KU70 carenti mutante. A. Il plasmide KU70 knockout T-KO. B. Lo schema della cassetta KU70 eliminazione diretta. re a monte ea valleregioni (1 kb) del gene KU70 stati clonati 5'- e 3'-end della cassetta disagi per ricombinazione omologa. La cassetta di espressione LEU2 è stato inserito tra due sequenze fiancheggianti omologhe. C. Elettroforesi su gel del KU70 eliminazione cassetta dopo Sac II e Nde ho digestione da T-KO. L: 1 kb DNA Ladder; 1: Il KU70 eliminazione cassetta (la dimensione del gruppo è previsto 4,3 kb) D.. PCR conferma della cancellazione del gene KU70 in Y. lipolytica Po1g. I prodotti di PCR sono stati amplificati dal DNA genomico di trasformanti (corsie 1-10) e il ceppo selvatico (corsia 11). Corsia 7 illustra un ko positivo, mentre corsia 1 mostra un falso positivo. Nel gel superiore, un frammento di 500 bp è ottenuta con il set di primer # 56 / # 57 ed è assente solo in corsie 1 e 7. Nel gel basso, i fori successo generare un frammento di 750 bp, che si ottiene con il primer set # 55 / # 56 Tha 750 bp band è visto solo in corsia 7. L:. 1 kb DNA Ladder Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema del Cre ricombinasi espressione plasmide per il salvataggio marcatore. Il plasmide episomally replicare pSL16-CRE-HPH porta una ricombinasi Cre (CRE), un marker di resistenza igromicina B (HPH), un gene di resistenza all'ampicillina (Amp), un origine di replicazione di Escherichia coli (pMB1), una origine di replicazione di Y. lipolytica (ORI1001), una sequenza di DNA centromero di Y. lipolytica (CEN1-1) e un gene lacZ che codifica per l'enzima β-galattosidasi. Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.
Figura di screening 3. La crescita di Y. marcatore-meno positivi ceppi lipolytica dopo salvataggio marcatore. trasformanti (1-4) sono stati diluiti e avvistati su piastre YPD, piatti YPDH e piastre leucina-deficienti, rispettivamente. Dopo 3 giorni di crescita a 30 ° C, trasformanti marker-free positivi (1, 3, 4) può crescere solo sulla piastra YPD, che indica l'escissione del gene marcatore LEU2 sulla espressione della ricombinasi Cre e la perdita del plasmide pSL16- CRE-HPH a:. piatto YPD, B: piatto YPDH, C:. piastra leucina-carenti cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Schema di delezione genica mirata e la procedura di salvataggio marcatore. La cassetta genica interruzione è costituito da un gene marcatore di selezione (LEU2) affiancato da due siti di riconoscimento LoxP e due bracci di targeting (sequenze a monte ea valle di accompagnamento). Dopo la trasformazione della cassetta smembramento in Y. cellule lipolytica, un evento di sostituzione del gene avviene tramite doppio incrocio ricombinazione omologa all'interno dei due bracci che fiancheggiano omologia al locus mirato. Due serie di primer PCR sono stati usati per verificare l'integrazione della cassetta perturbazione (P1-F e P1-R) e cancellazione concomitante delle regioni genomiche mirati (P2-F e P2-R). Infine, il marcatore LEU2 viene rimosso mediante espressione di Cre ricombinasi, lasciando dietro di sé un unico sito loxP al locus cromosomico. Targeted delezione del gene e la sostituzione di YALI0E17787 gene è stato mostrato come esempio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. PCR conferma di YALI0E17787 gene perturbazione in Y. lipolytica Po1g. I prodotti di PCR sono stati amplificato dal DNA genomico di trasformanti (corsie 1-4) e il ceppo selvatico (corsia 5). Corsie 1, 2, e 4 illustrano ko positivi, mentre corsia 3 mostra un falso positivo. Nel gel superiore, i fori di successo generano un frammento di 750 bp, che si ottiene con il set di primer P1-F e P1-R. La banda 750 bp è visto in corsie 1, 2, e 4, ma non in corsie 3 e 5. Nel gel fondo, un frammento di 500 bp è ottenuta con il set di primer P2-F e P2-R ed è presente solo in corsia 3 aND 5. L:. 1 kb DNA Ladder Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Primer utilizzati in questo studio. Cliccate qui per scaricare questa tabella.
| componente PCR | ||
| materiali PCR | volumi | concentrazione finale |
| tampone PCR | 10 microlitri | 1x |
| mix dNTP | 1 ml | 200 pM |
| Primer forward | 2,5 ml | 500 nM </ Td> |
| primer reverse | 2,5 ml | 500 nM |
| DNA polimerasi | 0,5 ml | 1 U |
| modello di DNA (diluito genomico o DNA plasmide) | 0,5-2 ml | 50 ng |
| acqua sterile | fino a 50 microlitri | |
| condizioni di PCR | ||
| Temperatura | Tempo | Numero di cicli |
| 98 ° C | 30 sec | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 30 |
| 55 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 10 minuti | 1 |
| Eseguire la PCR utilizzando un thermal cycler | ||
Tabella 2. PCR set-up e le condizioni per l'alta fedeltà DNA polimerasi.
| Componente | |||
| materiale | concentrazione finale | ||
| T4 DNA ligasi Buffer | 1x | ||
| Vector DNA | 0.03 pmol | ||
| Inserire DNA | 0,15 pmol | ||
| ligasi T4 DNA | 400 U | ||
| acqua sterile | fino a 20 microlitri | ||
| condizioni | |||
| Temperatura | Tempo | ||
| 16 ° C | 16 ore | ||
| Componente | |
| materiale | concentrazione finale |
| buffer di digestione di restrizione | 1x |
| DNA (plasmide o PCR prodotto) | 1 mcg |
| 1 ° enzima di restrizione | 5 U |
| 2 ° enzima di restrizione (opzionale) | 5 U |
| acqua sterile | fino a 50 microlitri |
| condizioni | |
| Temperatura | Tempo |
| 37 ° C | <td> 6 ore|
| Eseguire singolo digestione con un singolo enzima di restrizione | |
| Eseguire doppia digestione con una coppia di enzimi di restrizione | |
Tabella 4. Condizioni per l'enzima di restrizione digestione del DNA.
| componente PCR | ||
| materiali PCR | volumi | concentrazione finale |
| tampone PCR | 2,5 ml | 1x |
| mix dNTP | 0,5 ml | 200 pM |
| Primer forward | 0,5 ml | 200 nm |
| reverse Primer | 0,5 ml | 200 nm |
| DNA polimerasi | 0,2 ml | 1 U |
| modello di DNA (diluito genomico o DNA plasmide) | 0,5-2 ml | 50 ng |
| acqua sterile | fino a 25 ml | |
| condizioni di PCR | ||
| Temperatura | Tempo | Numero di cicli |
| 95 ° C | 5 minuti | 1 |
| 95 ° C | 30 sec | 30 |
| 50 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 10 minuti | 1 |
| Eseguire la PCR utilizzando un termociclatore | ||
| Eseguire la colonia PCR direttamente utilizzando una colonia come modello, piuttosto che un campione di DNA | ||
Tabella 5. PCR / PCR Colony set-up e le condizioni di Taq DNA polimerasi.
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Discussion
Il nostro obiettivo per questo studio è quello di consentire la generazione rapida e efficiente del knockout genici mirati in Y. lipolytica ceppo Po1g. Diverse considerazioni devono essere affrontate per raggiungere questo obiettivo. Innanzitutto, è richiesta una elevata efficienza di trasformazione. Così, un efficiente e conveniente protocollo trasformazione chimica per la Y. lipolytica Po1g ceppo è stato descritto in questo studio. L'uso di PEG-4000 è un fattore critico per la trasformazione di successo di questo ceppo. Non trasformanti sono stati ottenuti per plasmide trasformazione utilizzando PEG-3350 (per la trasformazione di S. cerevisiae) invece di PEG-4000. Inoltre, la preparazione di cellule competenti che utilizzano cellule preparate al momento è necessaria per ottenere elevata efficienza di trasformazione in questo sforzo. In secondo luogo, per ridurre non omologhi eventi di ricombinazione e di integrazione casuale tramite NHEJ dominante in questo ceppo, un metodo di trasformazione efficiente è stato poi impiegato per costruire il KU70 knockout mutante. In terzo luogo, per migliorare l'efficienza di sostituzione genica per ricombinazione omologa, lungo fiancheggianti bracci (1 kb) a monte ed a valle dei geni bersaglio sono stati usati nel gene delezione cassette. Le lunghe fiancheggianti regioni omologhe nelle cassette di turbativa sono essenziali per un efficiente ricombinazione omologa in questo ceppo. Non colonie positive sono state ottenute per le cassette di turbativa con 50 bp regioni omologhe (sufficienti per un efficiente ricombinazione omologa in S. cerevisiae). Utilizzando tutte queste strategie, il gene KU70 della Y. lipolytica Po1g ceppo è stato cancellato con successo. Tuttavia, è estremamente difficile ottenere il ceppo KU70 knockout grazie all'elevata frequenza di ricombinazione non omologa in Y. ceppo lipolytica Po1g. Bisogna fare attenzione quando si maneggia l'antibiotico igromicina B contenente media come igromicina B è sensibile alla luce. L'utilizzo di supporti con degradata igromicina B si tradurrà in falso positives a passi 2.2.1 e 2.2.2 e falsi negativi al punto 2.2.7.
Quando il KU70 eliminazione ceppo è stato utilizzato per generare l'eliminazione mirata di singoli geni che codificano alcol deidrogenasi e alcool ossidasi, un tasso di eliminazione molto più elevato è stato raggiunto rispetto alla delezione del gene KU70. Ciò dimostra che l'uso del KU70 delezione ceppo piattaforma determinato un drammatico aumento della frequenza di ricombinazione omologa. Dopo l'emissione di bassissimo tasso di ricombinazione omologa è stato affrontato, lo screening di Y. lipolytica singolo gene mutanti knockout era altamente accelerato. Abbiamo anche notato che la lunghezza 1 kb di regione omologa era abbastanza efficace per l'eliminazione mirata del gene. Un aumento della frequenza di ricombinazione omologa potrebbe essere realizzato utilizzando sequenze più omologhe (2 kb). In particolare, questi geni codificano alcol deidrogenasi e alcool ossidasi, che catalizzano la conversione reversibile tra alcoli e aldehydes. L'eliminazione di questi geni può portare ad una maggiore accumulo di biocarburante e biochimici compresi gli acidi grassi a catena corta, acidi grassi a catena media, acidi grassi a catena lunga, acidi grassi idrossilati, alcoli, aldeidi e lipidi. Ulteriori studi saranno effettuati per verificare questa possibilità.
Metodo gene perturbazione PCR-mediata è stata riportata in Y. lipolytica Po1d ceppo 28. Tuttavia, questo metodo è laborioso e richiede tempo. Una limitazione importante di questo metodo è la difficoltà di ottenere quantità sufficienti del gene delezione cassette per un esperimento di trasformazione. Un'altra limitazione è che questo metodo è limitato al marcatore URA3. Il metodo descritto in questo studio specificamente indirizzata questi problemi nella tecnica PCR-based, combinando l'approccio digestione-legatura e il sistema Cre / loxP. Questo metodo consente l'utilizzo di diversi marcatori antibiotici e auxotrofi e quindi è più versapiastrella. Può facilitare una rapida eliminazione gene nel Y. ceppo lipolytica Po1g. Presentiamo qui una descrizione dettagliata della strategia mirata delezione singolo gene tramite ricombinazione omologa in Y. cellule lipolytica Po1g. Tuttavia, un sito loxP rimane come una cicatrice nel genoma dopo il salvataggio marcatore successo (Figura 4). In multipla gene delezione, più cicatrici LoxP vengono introdotti nel genoma e questo può portare a instabilità genomica a causa di potenziali eventi di ricombinazione che possono verificarsi tra i siti loxP. Tuttavia, i ceppi knockout costruiti in questo studio hanno mostrato ottima stabilità genetica, che indica che gli eventi di ricombinazione non intenzionali non si è verificato tra i siti loxP.
In sintesi, un efficiente protocollo di trasformazione genetica è stata stabilita per il Y. ceppo lipolytica Po1g. L'eliminazione mirata di singoli geni in questo ceppo è stato dimostrato come un proof of concept. La Y. lipolytica Po1g KU70 ceppo piattaforma eliminazione costruito in questo studio ha dimostrato frequenza ricombinazione omologa molto efficiente, che permette uno screening più facile e veloce delle delezioni geniche mirate. Così, questo ceppo piattaforma fornisce un sistema più efficiente e una scelta migliore per le applicazioni in ingegneria percorso e ottimizzazione sforzo nella costruzione di altri mutanti di delezione cromosomica. La metodologia descritta e costruito KU70 eliminazione ceppo potrebbero essere applicate anche l'inserimento di geni bersaglio in loci specifici e la creazione di mutazioni sito-specifiche nel genoma.
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Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario da parte dell'Agenzia nazionale per l'ambiente di Singapore (ETRP 1.201.102), il competitivo programma di ricerca del National Research Foundation di Singapore (NRF-CRP5-2009-03), l'Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca di Singapore ( 1324004108), globale R & D Programma di progetto, il Ministero della Economia della Conoscenza, la Repubblica di Corea (N0000677), la difesa dalle minacce Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) e la biologia sintetica Iniziativa della National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
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Genetica Bioingegneria il lievito non convenzionale,
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