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Genetics

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54371

Abstract

Yarrowia의 lipolytica는 비 병원성 동종 이형 엄격 호기성 효모 종입니다. 독특한 생리 기능과 신진 대사 특성으로 인해,이 틀에 얽매이지 않는 효모뿐만 아니라 곰팡이 차별화의 기본 성격의 연구를위한 좋은 모델뿐만 아니라 생화학 적 생산과 광범위한 유전자 조작을 필요로 다양한 생명 공학 응용을위한 유망한 미생물 플랫폼입니다. Y.의 그러나, 유전자 조작 lipolytica 인해 주로 KU70 유전자에 기인 할 수있는, 효율적이고 안정적으로 유전자 형질 전환 시스템의 부족뿐만 아니라 비 - 상 동성 재조합의 매우 높은 속도로 제한되었다. 여기, 우리는 효율적인 유전자 변환에와 Y 유전자 삭제 쉽고 빠른 프로토콜을보고 lipolytica PO1G. Y.로 외래 DNA의 효율적인 변환을위한 우선, 프로토콜 lipolytica PO1G가 설립되었다. 세코ND, 표적 유전자의 추가적인 삭제 향상된 이중 교차 상동 재조합 율을 달성하기 위해 유전자는 KU70 1킬로바이트 동성 암 반송 파쇄 카세트 바뀌는 삭제 하였다. 셋째, KU70 유전자의 삭제 후 향상된 유전자 결실 효율을 입증하기 위해, 우리는 개별적 KU70 녹아웃 플랫폼 균주에서 동일한 절차를 사용하여 알코올 탈수소 효소, 알코올 산화 효소를 코딩하는 11 표적 유전자를 삭제. 이것은 정확한 상동 재조합 속도가 삭제 0.5 % 미만에서 실질적으로 증가하는 것이 관찰 PO1G KU70 Δ 11에서 표적 유전자의 단일 유전자 결실에 대한 33 % -71 %의 PO1G에서 KU70 유전자. 하이 그로 마이신 B 내성 마커와 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 운반하는 복제 성 플라스미드를 구축하고, 효모 녹아웃 균주의 선별 마커 유전자는 결국 타지 여러 발사를 용이 Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의해 제거테드 유전자 조작. 그 결과 단일 유전자 삭제 돌연변이 생물 연료 및 생화학 생산에 응용 가능성이 있습니다.

Introduction

사카로 마이 세스 세레 비지에, Yarrowia의 lipolytica, 비 전통적인 효모와는 달리, 환경 조건의 1, 2의 변화에 대응하여 효모 또는 균사의 형태로 증가 할 수 있습니다. 따라서,이 동종 이형 누룩 곰팡이 분화, 형태 형성 및 분류 3,4,5- 연구를위한 좋은 모델로서 사용될 수있다. 이것은 일반적으로 널리 유기산, 폴리 알콜, 아로마 화합물, 유화제 및 계면 활성제로 -6,7,8,9- 식품 첨가물의 종류를 생성하기 위해 사용되는 안전한 (GRAS) 효모 종으로 간주된다. 이는 최대 10 세포 건조 중량의 70 %를하기 위해, 의무적의 aerobe 자연스럽게 다량으로 지질을 축적 할 수있는 공지의 유성 효모, 즉이다. 또한 영양소 11,12,13 같은 폐 자원 잔기의 종류를 포함한 성장 탄소원의 넓은 스펙트럼을 이용할 수있다. 이러한 독특한 기능은 모두 Y.을 매우 매력적인 lipolytica다양한 생명 공학 응용 프로그램.

Y.의 전체 게놈 서열 비록 lipolytica가 14, 15을 게시되었습니다,이 틀에 얽매이지 않는 효모의 유전자 조작은 다른 효모 종보다 더 복잡합니다. 첫째, 효모 종의 변화로 인해 안정하고 효율적인 유전자 변환 시스템 (16, 17)의 부재에 훨씬 덜 효율적이다. 에피 솜 본연 플라스미드 시스템이 효모 (18)에서 발견되지 않은 둘째, 선형 발현 카세트의 게놈 통합 힘든 공통 관심 유전자의 발현에 사용된다. 이 효모에 정확한 상동 재조합을 통해 효율성을 대상으로 유전자가 낮은 대부분의 통합 이벤트가 비상 동 말단 연결 (NHEJ) (19)를 통해 발생하기 때문에 유전자 노크 아웃 및 노크 인의 셋째, 세대가 제한됩니다.

본 연구에서는 Y.에 최적화 된 변환 프로토콜 신고 lipolytica 유전자를 KU70 삭제. 최적화 된 변환 프로토콜을 사용하고, 1킬로바이트의 Y. KU70의 유전자를 상동 영역을 포함하는 선형 측면 녹아웃 카세트를 변환하여 lipolytica PO1G가 성공적으로 삭제되었습니다. 이 유전자 삭제 방법의 견고성은 다음 PO1G KU70 Δ 변형 알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자를 대상으로 입증되었다. 그것은 KU70 결실 균주는 야생형 균주 PO1G보다도 타겟팅 동성 재조합을 매개 유전자의 상당히 높은 효율을 발휘하는 것이 확인되었다. 또한, 하이 그로 마이신 B 내성의 마커를 운반하는 복제 성 Cre 호텔 발현 플라스미드는 마커 복구를 수행하도록 구성 하였다. 마커 구조는 일에 대상 유전자의 여러 라운드를 용이하게전자는 유전자 결실 돌연변이를 획득했습니다. 유전자 삭제 게다가, 여기에 설명 된 유전자 변형 및 유전자 삭제를위한 우리의 프로토콜은 특정 유전자좌에 유전자를 삽입하고, Y.로 사이트 별 돌연변이를 소개하고 적용 할 수 있습니다 lipolytica 게놈.

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Protocol

Y.의 1 세대 lipolytica KU70 삭제 스트레인

  1. 붕괴 카세트의 건설
    주 : 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 사용 된 모든 프라이머는 표 1 참조.
    1. 는 Leu2 발현 카세트를 증폭하기위한 PCR 프라이머 디자인 (20)는 Y.부터 (표 1 참조) 각각과, 긴 역방향 프라이머 (표 1 # 2) lipolytica 발현 벡터 및 5 '및 3'에에 loxP 부위를 도입 긴 정방향 프라이머 (표 1의 1)과는 Leu2 카세트 끝. 복제 프로세스의 다음 단계에 대한 추가 제한 사이트를 소개하고, 프라이머 # 1에서 HI 제한 사이트를 추가 할 수 있습니다.
    2. 표 2에 설명 된대로 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하여 PCR을 수행한다.
    3. PCR의의 purificatio를 사용에 loxP-프로모터는 Leu2 - 터미네이터에 loxP 카세트 PCR 생성물을 정제하여제조업체의 지침에 따라 n 개의 키트. 제조업체의 지침 (21)에 따라 정제 된 PCR 제품에 3'-A의 돌출을 추가합니다. 사용 T4 DNA 리가 아제는 표 3에 따라 플라스미드 T-는 Leu2를 얻을 수있는 TA 클로닝 벡터에 A-꼬리 PCR 제품을 결찰합니다.
    4. PCR은 프라이머 Y.에서의 # 3 / # 4를 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 5 '상류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA 22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다.
      1. 더블. 표 4에 따라 골목 II의 BamHI 및 효소 정제 된 PCR 생성물 및 T-는 Leu2 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 정제를 결찰하는 T4 DNA 리가 제를 사용하여 골목 II로 PCR 생성물을 분해 / T-는 Leu2의 HI 부위를을 수득표 3에 따라 플라스미드 T-LEU2-5E.
    5. PCR은 프라이머 Y.에서의 # 5 / # 6을 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 3 '하류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA 22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 두 번 정제 된 PCR 제품 및 표 4에 따라 없음 I 및 이니까 I 효소와 T-LEU2-5E 플라스미드를 모두 소화.
      1. 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제. 이어서, 정제를 결찰하고 없음 I / 이니까 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 플라스미드 T-KO를 수득 T-LEU2-5E의 I 사이트로 PCR 생성물을 소화.
    6. 붕괴 카세트를 생산하기 위해 표 4에 따라 골목 II 및 이니까 I 효소로 플라스미드 T-KO 다이제스트 (그림 1
  2. 유능한 세포의 준비와 Y의 변환 lipolytica PO1G 변형
    1. 관할 세포의 준비
      1. Y.의 식민지 접종 YPD 배지 10 ㎖ (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스 트 로즈, 50 mM의 시트르산 염 완충액 pH 4.0) 100 mL의 플라스크에서 신선한 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트로스 (YPD) 플레이트에서 lipolytica PO1G 균주. 포화 될 때까지 20 시간 (분광 광도계를 이용하여 측정 한 OD 약 15의 600)를 위해 225 rpm에서 30 ° C 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션.
      2. 실온에서 5,000 × g으로 5 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛. 20 ml의 트리스 EDTA (TE) 버퍼 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA, pH를 7.5)로 세포를 씻어 단계 1.2.1.2에 설명 된대로 세포 펠렛. (아세트산으로 pH를 6.0으로 조정) 0.1 M 리튬 아세테이트 1 ml의 세포를 재현 탁하고, 실내 템페에서 10 분 동안 배양rature.
      3. 멸균 1.5 ml의 튜브에 관할 세포 (100 μl를) 나누어지는. 바로 아래의 변형 단계로 진행, 또는 장기간 저장을 위해 -80 ℃에서 최종 농도가 25 % (v / v)의 저장에 글리세롤을 추가한다.
    2. 변환
      1. 부드럽게 적격 세포 100 ㎕와 함께 변성 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖) 및 정제 붕괴 카세트 1-5 μg의 10 μL를 혼합하고, 15 분 동안 30 ℃에서 배양한다.
      2. (0.1 M 리튬 아세테이트의 pH 6.0에 용해) 40 % 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) -4000 700 μl를 추가, 잘 혼합하고 60 분 동안 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다.
        주 : 대신에 (일반적으로 종래의 효모의 형질 전환에 사용 된)의 PEG-3350, 4000의 평균 분자량 PEG를 사용하는 것이 중요하다.
      3. 가열은 60 분 동안 39 ° C의 물을 용기에 튜브를 배치하여 전환 혼합물 충격.
      4. 1 ml의를 YPD 매체를 추가하고30 ° C에서 2 시간, 225 rpm으로 대한 복구 할 수 있습니다. 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리기, 상등액을 제거하고 TE 완충액 1 ml 중에 펠렛을 재현 탁.
      5. 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리하여 세포를 Repellet하고 상층 액을 제거한다. TE 완충액 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁하고 선택적 플레이트 (예를 들어, 류신 - 결핍 플레이트) 위에 플레이트 2-3 일 동안 30 ° C에서 배양한다.
      6. 10 단일 콜로니 4를 선택하고 YPD 배지 2 ㎖에 개별적으로 접종. 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 하룻밤 품어. 각각의 프라이머 # 55 / # 56의 두 세트, 그리고 # 56 / # 57을 사용하여 표 5에 따라 형질 전환 (22)로부터 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 긍정적 인 식민지를 확인합니다.
        참고 : 없음 나는 pYLEX1 벡터 (Y)로 변환된다 선형화 수를 카운트하여 변환 효율을 결정하기 위해 lipolytica PO1G는 적격 세포μg의 플라스미드 당 집락 형성 단위 (CFU)의 DNA는 23을 사용했다.

2. 마커 구조

  1. Cre 호텔 발현 플라스미드의 구축
    1. pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH의 건설
      1. 디자인 프라이머 (20)는 CRE와 HPH의 오픈 리딩 프레임을 증폭 PCR합니다. 포워드 프라이머 # 82, # 84에 시작 코돈의 상류 추가 아데닌 뉴클레오티드를 추가하고, PCR은 CRE의 오픈 리딩 프레임을 증폭 역방향 프라이머 # 83, # 85을에서 정지 코돈의 하류 KPN I 제한 사이트를 삽입하고 표 2에 따라 pSH69 (수탁 번호 HQ412578) (24)로부터 HPH.
      2. CRE 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용 HPH 단편 모두 정제. 다이제스트 모두 내가 TABL에 따라 효소 KPN과 정제 된 CRE와 HPH 조각예 4.. 표 4에 따라 PML KPN I 및 I 효소로 pYLEX1 플라스미드 다이제스트 두배 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다.
      3. Y.의 PML I / KPN I 사이트에 정제 및 소화 CRE와 HPH 조각을 결찰 표 3 당으로 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 각각 pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH를 산출 lipolytica 발현 벡터.
    2. pSL16-CRE-HPH의 건설
      1. PCR 프라이머의 # 86을 사용 pYLEX1-CRE에서 CRE의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 / # 87 표 2에 따라, I / pst 파일 I 제한 부위를 플 랭킹. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 .
        1. 난과 함께 정제 된 PCR 제품 및 pSL16-CEN1-1 (227) 플라스미드 (25)을 모두 소화PST 표 4에 따라 I 효소. 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 이어서, 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE을 만드는 대응하는 부위에서 pSL16-CEN1-1 (227)로 분해하고 정제 PCR 생성물을 결찰.
      2. PCR 프라이머를 사용 pYLEX1-HPH에서 HPH의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 # 88 / # 89. 표 2에 따라,을 XhoI /을 BglII 제한 부위를 플 랭킹 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 .
        1. 더블. 정제 된 PCR 생성물 및 표 4에 따라,와을 XhoI을 BglII 효소 pSL16-CRE 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 그리고, 대응에 pSL16-CRE로 정제 절단 PCR 생성물을 결찰위치는 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE-HPH를 생성한다.
          참고 : 결과 Cre 호텔 발현 플라스미드, pSL16-CRE-HPH는, 선택 가능한 하이 그로 마이신 B 마커를 항구 및 센트로 미어와 에피 좀 복제 벡터 (그림 2)입니다.
      3. 표 4에 따라 적절한 제한 효소 (예를 들어, I / 태평양 표준시 나는, 벡터에서 삽입을 절제하는)와 소화에 의해 모든 구조를 확인합니다.
  2. CRE 재조합 효소 매개 마커 구조
    1. 위의 섹션 1.2에 설명 된 변환 프로토콜 다음 KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포로 pSL16-CRE-HPH 변환. YPD 플러스 하이 그로 마이신 B 상에 플레이트 형질 전환 세포 (YPDH) 플레이트 (400 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B를 포함), 그리고 2 ~ 3 일 동안 30 ° C에서 품어.
    2. 표 5에 따라 식민지 PCR을 수행하여 프라이머 # 84 / # 85 긍정적 인 식별변환 후 pSL16-CRE-HPH 플라스미드를 함유하는 콜로니.
      주 : # 84 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 # 85 HPH 유전자 (표 1)의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 양성 클론 만이 PCR 반응에서 특정 PCR 생성물을 생성한다.
    3. 긍정적 인 복제를 선택하고 YPDH 매체 2 ㎖에 접종하고, 포화 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다. 분광 광도계로 OD 셀 (600)을 측정한다. ~ (15)의 OD 600에서 세포를 수확. 실온에서 5 분 동안 5000 × g으로 원심 분리하고, 멸균 수 2 ㎖로 한번 세척 하였다.
    4. 초기 OD 0.1 600 YPD 배지 2 ㎖로 세포를 재 접종하고, 세포를 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 성장을 허용한다. 킬 YPD 플레이트 상에 하룻밤 세포 배양은 단일 콜로니 (23)를 분리합니다. 복제 판 YPD, YPDH 위에 식민지, 그리고 류신 결핍 판 (23) 참고 : (그림 3) 모두는 Leu2 마커를 잃고 pSL16-CRE-HPH 플라스미드는 YPD 플레이트에서 성장할 수 식민지를.

알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자의 3. 삭제

  1. Y.에서 검색을 수행 삭제 26 유전자 후보들을 식별하는 기본 로컬 맞춤 검색 도구 (BLAST)를 사용 lipolytica 게놈 데이터베이스. 입력 S. 단백질 서열 BLAST 검색 도구로 cerevisiae의 알코올 탈수소 효소 I을 (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    주 : BLAST 검색 도구가 Y. 가장 유사한 단백질 서열을 반환 lipolytica 게놈 데이터베이스.
  2. # 56 (표 1)에 프라이머 번호 7 PCR로 결실 카세트를 구축하고, 제한 효소 절단 및 상기 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 동일한 방법을 이용하여 라이 게이션 반응을 수행한다.
  3. 예습KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포는있다 변환을 수행하고 위의 섹션 1.2에 설명 된 프로토콜에 따라 # 81 (표 1)에 # 55 프라이머, # 58 긍정적 인 식민지를 식별하기 위해 PCR을 수행합니다.
    참고 예로서, YALI0E17787g 유전자의 삭제를위한 절차는도 45에 기재되어있다. 상동 재조합 속도에 1킬로바이트 및 2킬로바이트 긴 상동 지역의 효과를보고있다.

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Representative Results

선형화 된 Y. lipolytica 발현 벡터 Y.의 게놈에 PBR 도킹 플랫폼에 삽입 하나의 크로스 오버 재조합 (27)를 수행하여 lipolytica PO1G 변형. 본 연구에서 확립 급속 화학 변환 절차, Y. 선형화를 사용하여 lipolytica 발현 벡터 성공적> 100 CFU / μg의 DNA의 변환 효율 야생형 PO1G 균주에 형질 전환 하였다. 1킬로바이트 상동 서열에 의해 형벌 녹아웃 카세트는 PO1G 균주에 형질 전환하고, KU70 유전자가 성공적으로 (그림 1)을 삭제했습니다. 여기서, 정방향 프라이머 # 56 KU70 유전자의 5 '상 동성 암에 위치한 서열에 어닐링. 역방향 프라이머 # 55이는 Leu2 마커의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 역방향 프라이머 # 57는 KU70 유전자의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 방법지금까지 200 개 이상의 콜로니 가운데 삭제 KU70 유전자 하나만 양성 콜로니는 매우 낮은 유전자 결실 률 (<0.5 %)을 제안 관찰되었다. 이어서, 하이 그로 마이신 B 내성 마커 및 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 운반하는 복제 성 플라스미드 (도 2)를 구성하고, KU70 녹아웃 균주의 선별 마커 유전자는 결국 Cre 호텔 재조합 효소의 발현 (도 3)에 의해 제거 하였다. 블래스트 검색 도구를 사용하여 열한 추정 알코올 탈수소 효소 유전자 일 알코올 옥시 다제 유전자에서 확인 된 Y. lipolytica 게놈. 추정되는 알코올 탈수소 효소 유전자는 YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g 있습니다. 추정되는 알코올 산화 효소 유전자는 YALI0B14014g입니다. KU70 유전자의 삭제 후 유전자 삭제 율의 증가를 확인하기 위해, 우리는 개별적으로 제외 (병렬로 11 유전자를 삭제Y. 긴 동성 시퀀스로 중단 카세트를 사용하여 YALI0A16379g)에 대한 lipolytica KU70 녹아웃 변형 (그림 4, 5). 여기서, 정방향 프라이머 (P1-P2-F 및 F) 표적 유전자의 5 '상 동성 암에 위치한 서열과 어닐링. 역방향 프라이머 (P1-R은)는 Leu2 마커의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 역방향 프라이머 (P2-R)를 표적 유전자의 코딩 영역 (도 4)의 내부에 위치한다. 녹아웃 카세트는 상동 서열 및 제한 사이트 (표 1)의 길이 만 약간 다릅니다. 유전자 결실 률 [상동 재조합 / (상동 재조합 + 비 - 상 동성 재조합)] 33 % -71 %의은 KU70 유전자의 결실을 통해 타겟 상동 재조합 주파수의 급격한 증가를 시사 달성 하였다. 예를 들어, YALI0E17787g의 삭제 속도는 (~ 100 CFU / μg의 DNA를) 40 %였다. 더욱이이상 상동 서열이 사용 된 경우, 유전자 결실 레이트의 점진적 증가의 가능성을 조사 하였다. 그것은 2킬로바이트 상동 서열로 YALI0E17787g 유전자 파괴 카세트는 87.5 %의 (~ 400 CFU / μg의 DNA를) 삭제 율을 준 것으로 나타났다. 또한, 얻어진 결실 돌연변이의 도입 선별 마커 유전자는 Leu2 따라서 표적 유전자 조작을 여러 차례있게 (hp4d- CRE, HPH) 벡터 pSL16-CRE-HPH 변환에 의해 제거 하였다.

그림 1
그림 1. KU70 녹아웃 카세트의 건설 KU70는 돌연변이.을 결핍. KU70 녹아웃 플라스미드 T-KO. B. KU70 녹아웃 카세트의 개략도. 업스트림 및 다운 스트림 재KU70 유전자의 gions (1킬로바이트)은 5'- 및 상동 재조합에 대한 중단 카세트의 3'- 말단에 클로닝 하였다. 는 Leu2 발현 카세트 두 측면 상 동성 서열 사이에 삽입되었다.시켰다. 나는 T-KO에서 소화 골목 II 및 이니까KU70 삭제 카세트의 젤 전기 영동. L : 1킬로바이트 DNA 사다리; 1 : KU70 삭제 카세트 (예상 밴드 크기가 4.3 킬로바이트입니다) D.. Y.에서 KU70 유전자 결실 확인 PCR lipolytica PO1G. PCR 생성물은 형질 전환 체의 게놈 DNA (레인 1-10) 야생형 균주 (레인 11)로부터 증폭 하였다. 레인 1은 위양성을 나타내고있다 레인 7은 포지티브 녹아웃을 나타낸다. 상단 겔 500 염기쌍의 단편을 56 / # 57, 레인 (1) 및 하부 겔 7.에만 존재하지 않고, 성공적인 녹아웃이 얻어진다 750 염기쌍의 단편을 생성 # 설정 프라이머 얻어 프라이머는 # 55 / # 56 T를 설정그는 750 bp의 밴드는 차선 7. L에서 볼 수있다 :. 1킬로바이트 DNA 사다리 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
마커 구조에 ​​대한 Cre 호텔 재조합 발현 플라스미드의도 2 개략도. 에피 좀 복제 플라스미드 pSL16-CRE-HPH는 Cre 호텔 재조합 (CRE), 하이 그로 마이신 B 내성 마커 (HPH), 암피실린 내성 유전자 (앰프) 곰 대장균 (pMB1)의 복제의 기원, Y.의 복제 기원 lipolytica (ORI1001), Y.의 센트로의 DNA 서열 lipolytica (CEN1-1) 및 β - 갈 락토시다 제 효소를 코딩하는 lacZ의 유전자. 버전 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 시온.

그림 3
긍정적 인 마커없는 Y. 그림 3. 성장 심사 마커 구조 후 lipolytica 균주. 형질 전환 (1-4) 희석 각각 YPD 판, YPDH 판과 류신 결핍 판에 발견되었다. 30 ° C, 포지티브 마커 프리 형질에서 성장의 3 일 후에 (1, 3, 4) 만 Cre 호텔 재조합 플라스미드의 손실의 발현시는 Leu2 마커 유전자의 절제를 나타내는 YPD 플레이트에서 성장할 수 pSL16- CRE-HPH A :. YPD 판, B : YPDH 판, C :. 류신 결핍 판 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


대상 유전자 삭제 및 마커 복구 프로 시저의 그림 4. 개략도. 유전자 파괴 카세트 두에 loxP 인식 부위와 두 개의 목표 팔 (업스트림 및 다운 스트림 측면 시퀀스)에 의해 형벌 선택 마커 유전자 (는 Leu2)로 구성되어 있습니다. Y.에 중단 카세트의 변환 후 lipolytica 세포, 유전자 교체 이벤트 대상 궤적의 두 측면 상 동성 암 내에서 이중 교차 상동 재조합을 통해 발생한다. PCR 프라이머 두 세트의 표적 게놈 영역 (P2-P2-F 및 R)의 파괴 카세트 (P1과 P1-F-R)와 동시 삭제 통합을 확인하는 데 사용 하였다. 마지막으로는 Leu2 마커 염색체에서 단일 유전자좌에 loxP 부위 남기고 Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의해 제거된다. 타겟 유전자 삭제 및 YALI0E17787 GE의 교체네브라스카 여기에 예로서 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
Y.에서 YALI0E17787 유전자 파괴의 그림 5. PCR 확인 lipolytica PO1G. PCR 제품이었다 유전자 형질 전환 체의 DNA (1-4 차선) 및 야생형 균주 (레인 5)에서 증폭. 레인 3은 가양 성을 나타내고있다 레인 1, 2, 4, 녹아웃 양을 나타낸다. 겔 상단에 성공한 녹아웃은 P1과 P1-F-R 프라이머 세트로 얻어지는 750 염기쌍의 단편을 생성한다. 750 bp의 밴드는 레인 1, 2에서 본 4 있지만, 레인 (3) 및 바닥 겔 5에서 500 염기쌍의 단편을 P2-F 및 P2-R 프라이머 세트 얻어 만 존재한다되지 레인 3에차 5. L :. 1킬로바이트의 DNA 사다리 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

본 연구에 사용 된 1 프라이머. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

PCR 구성 요소
PCR 재료 볼륨 최종 농도
PCR 버퍼 10 μL 1 배
의 dNTP 믹스 1 μL 200 μM
앞으로 프라이머 2.5 μL 500 nM의 </ TD>
역방향 프라이머 2.5 μL 500 nm의
DNA 중합 효소 0.5 μL 1 U
DNA 템플릿 (게놈 희석 또는 플라스미드 DNA) 0.5 μL 50 NG
멸균 최대 50 μL
PCR 조건
온도 시각 사이클의 수
98 ° C 30 초 1
98 ° C 10 초 (30)
55 ° C 30 초
72 ° C 30 초
72 ° C 10 분 1
칼로리를 사용하여 PCR 증폭을 수행알 자전거 타는 사람

고 충실도의 DNA 중합 효소 표 2. PCR의 설정 및 상태.

T4의 DNA 리가 아제를 이용하여 표 3 DNA 연결 반응 조건.

구성 요소
재료 최종 농도
T4 DNA 리가 아제 버퍼 1 배
벡터 DNA 0.03 pmol의
삽입 DNA 0.15 pmol의
T4 DNA 리가 400 U
멸균 최대 20 μL
정황
온도 시각
16 ° C 16 시간
<TD> 6 시간
구성 요소
재료 최종 농도
제한 소화 버퍼 1 배
DNA (플라스미드 또는 PCR 제품) 1 μg의
1 차 제한 효소 5 U
2 제한 효소 (선택 사항) 5 U
멸균 최대 50 μL
정황
온도 시각
37 ° C
하나의 제한 효소로 하나의 소화를 수행
제한 효소의 두 쌍의 소화를 수행

표 DNA의 제한 효소 절단 4. 조건.

PCR 구성 요소
PCR 재료 볼륨 최종 농도
PCR 버퍼 2.5 μL 1 배
의 dNTP 믹스 0.5 μL 200 μM
앞으로 프라이머 0.5 μL 200 nm의
브RSE 프라이머 0.5 μL 200 nm의
DNA 중합 효소 0.2 μL 1 U
DNA 템플릿 (게놈 희석 또는 플라스미드 DNA) 0.5 μL 50 NG
멸균 최대 25 μL
PCR 조건
온도 시각 사이클의 수
95 ° C 5 분 1
95 ° C 30 초 (30)
50 ° C 30 초
72 ° C 30 초
72 ° C 10 분 1
열 사이 클러를 사용하여 PCR 증폭을 수행
오히려 DNA 샘플보다, PCR 직접 템플릿으로 식민지를 사용하여 식민지를 수행

의 Taq DNA 중합 효소 표 5. PCR / 식민지 PCR 설정 및 상태.

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Discussion

이 연구에 대한 우리의 목적은 Y.에서 대상 유전자 녹아웃의 신속하고 효율적인 생성을 활성화하는 것입니다 이를 위해 lipolytica PO1G 균주. 몇몇 고려 해결 될 필요가있다. 먼저, 높은 변환 효율이 요구된다. Y.에 대한 따라서, 효율적이고 편리한 화학 변환 프로토콜 lipolytica PO1G 균주는 본 연구에서 설명했다. PEG-4000의 사용은이 균주의 성공적인 전환을위한 중요한 인자이다. 대신 PEG-4000의 (S. cerevisiae에의 변환에) PEG-3350을 사용하는 경우 어떤 형질 전환 플라스미드 변환에 얻을 수 없습니다. 또한, 새로 제조 된 세포를 이용한 세포의 제조 능력이 균주 높은 변환 효율을 얻는 것이 필요하다. 둘째로,이 균주에서 지배적 NHEJ 통해 비 - 상 동성 재조합 랜덤 통합 이벤트를 줄이고 효율적인 변환 방법은 다음 KU7를 구성하는데 사용 하였다0 녹아웃 돌연변이. 셋째, 장기 상류 아암 (1 킬로바이트)의 측면에, 상 동성 재조합에 의해 유전자 교환의 효율성을 개선하고, 표적 유전자의 하류 유전자 결실 카세트에 사용 하였다. 붕괴 카세트의 긴 측면 상동 지역이 변형 효율적 상동 재조합에 필수적이다. (S. cerevisiae의 효율적인 상동 재조합에 충분한) 50 bp의 상동 지역으로 중단 카세트를 사용할 때 더 긍정적 인 식민지를 얻을 수 없습니다. Y. 모두 이러한 전략을 사용하여, 유전자 KU70 lipolytica PO1G 변형이 성공적으로 삭제되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 때문에 Y. 비 - 상 동성 재조합의 매우 높은 비율로 KU70 녹아웃 균주를 얻는 것은 매우 어렵다 lipolytica PO1G 변형. 하이 그로 마이신 B 민감한 빛으로 미디어를 포함하는 항생제 하이 그로 마이신 B를 처리 할 때주의해야한다. 성능이 저하 된 하이 그로 마이신 B와 미디어를 사용하는 것은 거짓 POS가 발생합니다단계 2.2.1에서 itives 및 2.2.2 단계 2.2.7에서 위음성.

KU70 결실 균주는 알코올 탈수소 효소, 알코올 산화 효소를 코딩하는 유전자의 개별 표적 결실을 생성하기 위해 사용될 때, 훨씬 높은 삭제 율은 KU70 유전자의 결실에 비해 얻을 수 있었다. 그것은 KU70 삭제 플랫폼 균주의 사용은 상동 재조합 주파수의 급격한 상승으로 이어진 보여준다. 매우 낮은 상동 재조합 속도의 문제가 해결 된 후, Y.의 심사 lipolytica 단일 유전자 녹아웃 돌연변이는 매우 가속화되었다. 우리는 또한 상동 지역의 1킬로바이트 길이가 타겟 유전자 삭제 충분히 효율적이라고 지적했다. 이상 상동 서열 (2 킬로바이트) 사용시 상동 재조합 빈도의 증가가 달성 될 수있다. 특히, 이들 유전자는 알콜 및 ALD의 가역 변환을 촉매 알코올 탈수소 효소, 알코올 산화 효소를 인코딩ehydes. 이러한 유전자의 삭제는 생물 연료의 증가 된 축적 단쇄 지방산, 중쇄 지방산, 장쇄 지방산, 하이드 록시 지방산, 알코올, 알데히드 및​​ 지질을 포함한 생화학 적 화합물을 초래할 수있다. 추가 연구는 이러한 가능성을 확인하기 위해 수행 될 것이다.

PCR 매개 유전자 파쇄 방법 Y.보고되었다 lipolytica Po1d 변형 28. 그러나이 방법은 힘들고 시간 소모적이다. 이 방법의 하나의 주요 제한은 하나의 변환 실험 유전자 결실 카세트의 충분한 양을 획득하는 어려움이다. 또 다른 제한이 방법은 URA3 마커로 제한되어 있다는 것이다. 이 연구에 기술 된 방법은 특히 소화 결찰 방식 및 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 조합하여 PCR 기반 기술에서는 이러한 문제점을 해결. 이 방법은 다양한 항생제 및 영양 요구 마커의 사용을 허용하고, 따라서 더 마찬가지이며타일​​. 그것은 Y. 신속한 유전자 삭제를 용이하게 할 수있다 lipolytica PO1G 변형. 우리는 본원에서 Y. 상동 재조합을 통해 표적 단일 유전자 결실 전략의 상세한 설명을 제시 lipolytica PO1G 세포. 그러나 하나에 loxP 사이트는 성공적인 마커 구조 (그림 4) 후 게놈 내 흉터로 남아있다. 여러 유전자 삭제에서 여러에 loxP 흉터는 게놈에 도입이 때문에에 loxP 사이트간에 발생할 수있는 잠재적 인 재조합 이벤트에 게놈 불안정의 원인이 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 본 연구에서 구축 한 녹아웃 균주는 의도하지 않은 재조합 이벤트가에 loxP 사이트간에 발생하지 않았 음을 나타내는 아주 좋은 유전 적 안정성을 보여 주었다.

요약하면, 효율적인 유전자 변형 프로토콜 Y. 설립되었습니다 lipolytica PO1G 변형. 이 변형 단일 유전자의 대상이 삭제 개념의 증거로 입증되었다. 는 Y. 본 연구에서 구축 lipolytica PO1G KU70 삭제 플랫폼 균주를 대상 유전자 삭제의 쉽고 빠르게 검사 할 수 있습니다 매우 효율적 상동 재조합 빈도를 보였다. 따라서,이 플랫폼의 변형은보다 효율적인 시스템 및 경로 엔지니어링 및 기타 염색체 결실 돌연변이 체를 구성하는 변형 최적화 애플리케이션을위한 더 나은 선택을 제공합니다. 설명 된 방법 및 구성 KU70 결실 균주 특정 유전자좌에 목적 유전자의 삽입 및 게놈에 부위 - 특이 적 돌연변이 생성에 적용될 수있다.

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Acknowledgments

우리는 기꺼이 싱가포르 (ETRP 1201102) 국립 환경 기관에서 자금 지원을 인정, 싱가포르 국립 연구 재단 (NRF-CRP5-2009-03), 싱가포르의 과학, 기술 및 연구를위한 기관의 경쟁력 연구 프로그램 ( 1,324,004,108), 글로벌 R & D 프로젝트 프로그램, 지식 경제부, 한국 (N0000677), 국방 위협 감소기구 (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) 및 합성 생물학 싱가포르 국립 대학의 이니셔티브 ( DPRT / 943 / 09 / (14)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10 Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System
Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase
Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

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References

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