Abstract
Yarrowia lipolytica bir, patojen olmayan dimorfik ve kesinlikle aerobik maya türüdür. kendine özgü fizyolojik özellikleri ve metabolik özellikleri nedeniyle, bu sıradışı maya sadece mantar farklılaşma temel doğası çalışma için iyi bir model değil, aynı zamanda biyokimyasal üretim ve kapsamlı genetik manipülasyonlar gerektiren çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir mikrobik bir platformdur. Y'nin Ancak genetik manipülasyonlar lipolytica nedeniyle başta KU70 geni isnat edilebilir verimli ve istikrarlı bir genetik transformasyon sisteminin eksikliği yanı sıra homolog olmayan rekombinasyon çok yüksek oranlarda sınırlı olmuştur. Burada, verimli genetik transformasyonu için ve Y gen silinmesi için kolay ve hızlı bir protokol rapor lipolytica Po1g. Y dışsal DNA etkin transformasyonu için İlk olarak, bir protokol lipolytica Po1g kurulmuştur. Second, hedef genlerin daha silinmesi için geliştirilmiş çift çaprazlama homolog rekombinasyon oranı elde etmek için, KU70 gen 1 kb homoloji silah taşıyan bir bozulma kaset dönüştürerek tarafından silindi. Üçüncü olarak, KU70 geninin silindikten sonra gelişmiş gen silme verimliliğini göstermek için, biz tek tek KU70 nakavt platformu zorlanma aynı prosedürler kullanılarak alkol dehidrogenaz ve alkol oksidaz kodlayan 11 hedef genleri silindi. Kesin homolog rekombinasyon oranı silinmesi için en az% 0.5 önemli bir artış gözlenmiştir Po1g KU70 ö 11 hedef genlerin tek gen silinmesi için% 33 -71% ile Po1g içinde KU70 geninin. higromisin B direnç işareti, CRE / LoxP taşıma sistemi bir replikatif plazmit ve maya nakavt suşlarında seçim marker geni, sonunda targe birden fazla tur kolaylaştırmak için Cre rekombinazın ifadesinin uzaklaştırıldıted genetik manipülasyonlar. Ortaya çıkan tek gen silme mutantlar biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalar var.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, geleneksel olmayan bir maya farklı çevresel koşullar 1,2 değişikliklere yanıt olarak maya ya da misel şeklinde büyüyebilir. Böylece, bu iki şekilli maya mantar farklılaşma, morfolojilerinden ve taksonomi 3,4,5 çalışma için iyi bir model olarak kullanılabilir. Genellikle yaygın olarak organik asitler, polialkoller, aroma maddeleri, emülsiyon yapıcılar ve yüzey aktif maddeler 6,7,8,9 gibi gıda katkı maddelerinin çeşitli üretmek için kullanılan bir kasa (GRAS) maya türleri, olarak kabul edilir. Bu kadar hücre kuru ağırlığının 10% 70, zorunlu bir aerobe ve doğal olarak yüksek miktarlarda lipitleri biriken yeteneğine tanınmış yağlı maya, yani. Ayrıca besinlerin 11,12,13 atık kaynaklarının kalıntıların farklı türde de dahil olmak üzere, büyüme için karbon kaynakları geniş bir yelpazede yararlanabilirler. Bu eşsiz özelliklerin tümü Y. yapmak için çok cazip lipolyticaçeşitli biyoteknolojik uygulamalar.
Y'nin tüm genom sekansı, ancak lipolytica 14,15 yayınlandı, bu sıradışı maya genetik manipülasyon diğer maya türleri daha karmaşıktır. İlk olarak, bu maya türlerinin dönüşümü nedeniyle istikrarlı ve verimli bir genetik transformasyon sisteminin 16,17 olmaması çok daha az etkilidir. Doğal epizomal plazmid sistemi bu maya 18 bulunmuştur İkinci olarak, lineer ekspresyon kasetlerinin zahmetli genomik entegrasyon yaygın ilgili genlerin ekspresyonu için kullanılır. Bu maya doğru homolog rekombinasyon yoluyla verimliliği hedefleyen gen düşüktür ve çoğu entegrasyon olayları homolog olmayan sonunda katılmadan (NHEJ) 19 içinden gelmesi nedeniyle genetik knock-out ve knock-ins Üçüncü nesil sınırlıdır.
Bu çalışmada, Y için optimize edilmiş bir transformasyon protokolü rapor lipolytica KU70 geni silinmiş. Optimize edilmiş dönüşüm protokolü kullanılarak ve 1 kb Y. KU70 geni homoloji bölgeleri kuşatan içeren doğrusal bir nakavt kaset dönüştürerek lipolytica Po1g başarıyla silindi. Bu gen silinmesi metodoloji sağlamlığı daha sonra Po1g KU70 Δ suşu alkol dehidrogenaz ve alkol oksidazı genlerini hedef alan ile gösterilmiştir. Bu KU70 delesyon suşu doğal tipte Po1g soyunun daha hedefleme homolog rekombinasyon aracılığıyla gen bir ölçüde daha yüksek bir verimlilik sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, higromisin B direnç taşıyan bir yineleme Cre ifade plazmid işaretleyici kurtarma gerçekleştirmek için inşa edilmiştir. işaretleyici kurtarma th hedef genin birden fazla mermi kolaylaştırırE gen silinmesi Elde edilen mutantlar. Gen silme yanı sıra, burada tarif edilen genetik transformasyonu ve gen silinmesi için protokol özel bir lokus genlerin eklemek için, ve Y alana özgü mutasyonların katılması için uygulanabilir lipolytica genomu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Y 1. Üretim lipolytica KU70 Silme Gerilme
- bozulma kasetinin İnşaatı
Not: polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonda kullanılan tüm primerler için Tablo 1'e bakınız.- LEU2 ekspresyon kaseti PCR kuvvetlendirmek için tasarım primerleri 20 Y'den (Tablo 1 e bakınız) sırasıyla ve uzun ters primer (Tablo 1 # 2); lipolytica ifade vektörü 5 've 3' olarak LoxP yerleri sokacak uzun ileri primer (Tablo 1 # 1), LEU2 kasetinin sona erer. Klonlama işlemi sonraki adım için ilave bir sınırlama mevkisinin katılması için, primer # 1 'de, bir BamHI sınırlandırma bölgesi ekleyin.
- Tablo 2'de ayrıntılı olarak yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanılarak PCR gerçekleştirin.
- PCR purificatio kullanılarak loxp-promoteri-LEU2-terminatör-loxP kaseti PCR ürünü saflaştırmaküreticinin talimatlarına uygun olarak N kiti. Üreticinin talimatlarına uygun olarak 21 saflaştınlmış PCR ürününe 3'-A çıkıntıları ekleyin. Kullanım T4 DNA ligazı, Tablo 3'de belirtilen plazmid T-LEU2 vermek üzere, bir TA klonlama vektörüne A kuyruklu PCR ürünü bağlanması için.
- PCR Y. astarları 3. / 4. kullanarak KU70 geninin 1 kb 5 'yukarı serisini yükseltmek lipolytica Po1g Tablo 2'deki gibi genomik DNA, 22., üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak.
- Çift. Tablo 4 uyarınca Sac II ile BamHI enzimleri ile saflaştınlmış PCR ürünü ve T-LEU2 plazmid hem özet üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Saflaştırılmış bağlanması için T4 DNA ligaz kullanma ve Sac II ile sindirilmiş PCR ürünü / T LEU2 Bam HI bölgelerine vermek üzereTablo 3'de belirtilen plazmid T-LEU2-5E.
- PCR Y. astarları # 5 / # 6 kullanarak KU70 geninin 1 kb 3 'aşağı serisini yükseltmek lipolytica Po1g Tablo 2'deki gibi genomik DNA, 22., üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. Çift saflaştırılmış PCR ürünü ve Tablo 4'te göre değil ben ve Nde enzimlerle T-LEU2-5E plazmid hem sindirmek.
- üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Daha sonra, saflaştırılmış bağlanır ve Not I / nde Tablo 3'de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak plazmid T-KO vermek üzere t-LEU2-5E I sitelerine PCR ürünü ile sindirilmiş.
- Bozulma kasetini üretmek için Tablo 4'de gereğince Sac II ve nde I enzimleri ile plazmid T-KO sindirimi (Şekil 1
- Yetkili Hücre hazırlama ve Y dönüşümü lipolytica Po1g suşu
- Yetkili Hücre hazırlama
- Y. bir koloni aşılamak YPD ortamı 10 ml (% 1 maya özütü,% 2 pepton,% 2 glukoz ve 50 mM sitrat tamponu, pH 4.0) 100 ml'lik bir şişe içinde bir taze maya ekstresi-pepton-dekstroz (YPD) plakadan lipolytica Po1g soyu. Doyum noktasına kadar 20 saat (bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen OD yaklaşık 15 600,) 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 5000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjlenerek pelet hücreleri. 20 ml Tris-EDTA (TE) tampon çözeltisi (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) ile hücrelerin yıkayın ve aşama 1.2.1.2 tarif edildiği gibi hücreler pelet. (Asetik asit ile pH değeri 6.0), 0.1 M lityum asetat, 1 ml hücrelerin tekrar ve oda Tempe 10 dakika süre ile inküberature.
- Steril 1.5 ml tüpler kompetan hücreler (100 ul) kısım. hemen altındaki dönüştürme adımları geçin ya da uzun süreli depolama için -80 ° C'da bir son% 25 konsantrasyonunda (h / h) ve saklamak için gliserol ekleyin.
- dönüşüm
- Yavaşça yetkin hücre 100 ul ile denatüre somon sperm DNA (10 mg / ml) ve saflaştırılmış bozulması kasetinin 1-5 ug, 10 ul karıştırın ve 15 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
- (0.1 M lityum asetat pH 6.0 içinde çözülmüş)% 40 polietilen glikol (PEG) -4000 700 ul eklenir, iyice karıştırılır ve 60 dakika boyunca 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin.
Not: yerine (tipik olarak geleneksel maya transformasyonu kullanılmaktadır) PEG-3350, 4000 ortalama molekül ağırlığına sahip PEG kullanılması önemlidir. - Isı 60 dakika için 39 ° C su banyosu içinde tüp yerleştirmek sureti ile transformasyon karışımı şok.
- 1 ml YPD ortamı ilave edin ve30 ° C'de 2 saat ve 225 rpm'de için geri. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9.000 x g santrifüj, süpernatant kaldırmak ve TE tamponu 1 ml pelletini.
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9.000 x g'de santrifüj ile hücreler repellet ve supernatant atın. TE tamponu, 100 | il pelletini ve seçici plakaları (örneğin, lösin-eksikli plakalar) üzerine plaka ve 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
- 10 tek koloniler 4 Pick up ve YPD orta 2 ml ayrı aşılamak. 225 rpm'de 30 ° C'de ve çalkalama gece boyunca inkübatör içinde inkübe edin. Sırasıyla primer # 55 / # 56, iki set ve # 56 / # 57 kullanılarak Tablo 5'teki gibi transformantların 22 genomik DNA, PCR analizi ile pozitif kolonileri tanımlamak.
Not: Ben pYLEX1 vektörü Y dönüştürülür doğrusallaştırılmış sayısını sayarak transformasyon etkinliğini belirlemek amacıyla lipolytica Po1g kompetan hücrelerug plazmid başına koloni oluşturan birim (CFU) DNA 23 kullanılır.
- Yetkili Hücre hazırlama
2. Marker Kurtarma
- Cre sentezleme plasmidinin yapımı
- pYLEX1-CRE ve pYLEX1-Eden Hastaneler İnşaat
- Tasarım primerleri 20 Cre ve Eden Hastaneler açık okuma çerçevelerini PCR kuvvetlendirmek için. Ileri primer # 82 ve # 84 başlangıç kodonunun üst akışında bir ekstra bir adenin nükleotid ekleyin ve PCR CRE açık okuma çerçevelerini amplifiye ters primerler # 83 ve # 85, durdurma kodonunun aşağı Kpn I kısıtlama bölgelerinin sokulması ve Tablo 2'deki gibi pSH69 (erişim numarası HQ412578) 24 dan hph.
- Cre ve üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak HPH parçaları hem saflaştınlır. Digest hem ben Tabl başına enzim Kpn ile saflaştırılmış CRE ve hph fragmanlarıE 4.. Tablo 4 uyarınca Pml I ve Kpn I enzimleri ile pYLEX1 plazmid sindirimi Çift üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır.
- Y. Pml I / Kpn I sitelerine saflaştırılmış ve sindirilmiş CRE ve hph parçalarını birbirine bağlamak için Tablo 3'de göre T4 DNA ligaz kullanın sırasıyla pYLEX1-CRE ve pYLEX1-hph elde lipolytica ifade vektörü.
- pSL16-CRE-Eden Hastaneler İnşaat
- PCR primerleri, 86. kullanılarak pYLEX1-CRE gelen CRE promotör-gen-sonlandırıcı kaseti amplifiye / 87. Tablo 2'deki gibi Sal I / Pst I sınırlandırma bölgeleri çevreleyen. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak .
- Çift Sal I ile saflaştırılan PCR ürünü ve pSL16-CEN1-1 (227) plazmid 25 hem özetPst Tablo 4'te göre ben enzimleri. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak sindirim karışımı arındırın. Daha sonra, Tablo 3'de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak pSL16-CRE oluşturmak için karşılık gelen bölgelerde pSL16-CEN1-1 (227) saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürünü ligate.
- PCR primerleri kullanılarak pYLEX1-Eden Hastaneler gelen Eden Hastaneler promotör-gen-sonlandırıcı kaseti amplifiye # 88 / # 89. Tablo 2'deki gibi Xho I / Bgl II kısıtlama alanlarını yandan kuşatan, üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak .
- Çift. Saflaştınlmış PCR ürünü ve Tablo 4 uyarınca Xho I ve Bgl II enzimleri ile pSL16-CRE plazmid hem özet üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Daha sonra, karşılık gelen en pSL16-CRE saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürünü ligateYer Tablo 3'de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak pSL16-CRE-hph üretir.
Not: Elde edilen Cre sentezleme plasmidi, pSL16-CRE-HPH, seçilebilir bir higromisin B işaretleyici taşımaktadır ve bir sentromer ve epizomal kopyalayan vektörü (Şekil 2).
- Çift. Saflaştınlmış PCR ürünü ve Tablo 4 uyarınca Xho I ve Bgl II enzimleri ile pSL16-CRE plazmid hem özet üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Daha sonra, karşılık gelen en pSL16-CRE saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürünü ligateYer Tablo 3'de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak pSL16-CRE-hph üretir.
- Tablo 4 uyarınca uygun kısıtlama enzimleri (örneğin, Sal I / Pst I, vektöründen inserti kesip çıkarmak için) ile sindirme ile bütün bileşenleri kontrol edin.
- PCR primerleri, 86. kullanılarak pYLEX1-CRE gelen CRE promotör-gen-sonlandırıcı kaseti amplifiye / 87. Tablo 2'deki gibi Sal I / Pst I sınırlandırma bölgeleri çevreleyen. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak .
- pYLEX1-CRE ve pYLEX1-Eden Hastaneler İnşaat
- Cre rekombinaz aracılık ettiği işaretçi kurtarma
- Yukarıdaki Bölüm 1.2'de açıklanan dönüşüm protokolü aşağıdaki KU70 nakavt suşu yetkili hücrelerine pSL16-CRE-HPH Transform. YPD artı higromisin B üzerine Plaka dönüştürülmüş hücreler (YPDH) plakaları (400 ug / ml higromisin B ihtiva eden) ve 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
- Tablo 5'te göre koloni PCR gerçekleştirin primerler kullanılarak # 84 / # 85 pozitif tespit etmekdönüşümden sonra pSL16-CRE-HPH plazmidi içeren koloniler.
Not: ileri primer 84. ve revers primer 85. hph geni (Tablo 1) kodlama bölgesi içinde yer alır. Sadece pozitif klonlar PCR reaksiyonunda spesifik bir PCR ürünü üretir. - Pozitif klon almak ve YPDH orta 2 ml inoküle ve doygunluk gece boyunca 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin. Spektrofotometre ile hücre OD 600 ölçün. ~ 15 bir OD 600 hücreleri Hasat. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ve steril su, 2 ml ile bir kez yıkanır.
- Bir ilk OD 0.1 600 YPD ortamı 2 ml hücreleri yeniden inoküle ve hücreler, gece boyunca 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe büyümeye olanak sağlar. Streak YPD plakalar üzerine bir gecede hücre kültürü tek koloniler 23 izole etmek. Replika plaka YPD, YPDH üzerine koloniler ve lösin eksik plakalar 23 Not: (Şekil 3), hem LEU2 işaretleyici kaybetmiş ve pSL16-CRE-STEH plazmid sadece YPD plakalar üzerinde büyüyebilir Koloni.
Alkol Dehidrogenaz ve Alkol Oksidaz Genleri 3. Silme
- Y üzerinde bir arama yapın silme 26 gen adaylarını belirlemek için Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) kullanarak lipolytica genom veritabanı. Giriş S. protein dizisidir ŞOK arama aracı haline cerevisiae alkol dehidrojenaz I (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Not: BLAST arama aracı Y en benzer protein dizileri döndürür lipolytica genom veritabanı. - 56. (Tablo 1) primerleri 7. PCR ile yok etme kasetleri Construct ve kısıtlayıcı enzim dijestiyonu ve yukarıdaki bölüm 1.1'de açıklandığı gibi aynı usuller kullanılarak ligasyon reaksiyonları gerçekleştirmek.
- HazırlıkKU70 nakavt suşu yetkili hücreleri vardır dönüşümleri gerçekleştirmek ve yukarıdaki bölüm 1.2'de açıklanan protokol takip ederek 81. (Tablo 1) 55. astar, # 58 ile pozitif koloniler tanımlamak için PCR gerçekleştirin.
Not: Bir örnek olarak, YALI0E17787g gen silme işlemi, Şekiller 4 ve 5'te tarif edilir. homolog rekombinasyon oranı 1 kb ve 2 kb uzunluğunda homolog bölgenin etkileri bildirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lineerleştirilmiş Y. lipolytica ifade vektörü Y genomunda pBR yerleştirme platformu yerleştirildi Tek bir geçit rekombinasyona 27 gerçekleştirerek lipolytica Po1g süzün. Bu çalışmada kurulan hızlı kimyasal dönüşüm prosedürü, doğrusallaştırılmış Y. kullanarak lipolytica ifade vektörü başarıyla> 100 CFU / ug DNA bir transformasyon verimi yabani tip Po1g suşuna transforme edildi. 1 kb homolog dizilerin çevrili bir nakavt kaset Po1g gerginlik dönüştü ve KU70 gen başarıyla (Şekil 1) silindi. Burada ileri primer 56. KU70 geninin 5 'homoloji kolu içinde yer alan sekansına tavlanan. Ters primer 55. LEU2 marker kodlama bölgesi içinde yer almaktadır. Ters primer 57. KU70 geninin kodlama bölgesi içinde yer almaktadır. NasılHiç, 200'den fazla kolonilerin dışarı silinen KU70 geni ile tek bir olumlu koloni çok düşük gen silme oranı (<% 0,5) düşündüren gözlendi. Daha sonra, higromisin B direnç işareti, CRE / LoxP taşıma sistemi bir yineleme plazmid (Şekil 2) inşa edilmiştir ve KU70 nakavt streyninde seçim marker geni, sonunda Cre rekombinazın ifadesinin (Şekil 3) ile çıkarıldı. BLAST araştırma aleti kullanılarak, on putatif alkol dehidrojenaz geni ve bir alkol oksidaz geni Y tespit edilmiştir lipolytica genomu. farazi alkol dehidrojenaz geni YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g bulunmaktadır. farazi alkol oksidaz geni YALI0B14014g olup. KU70 genin silindikten sonra gen silme oranında artışa doğrulamak için, biz tek tek hariç (paralel 11 genleri silindiY. uzun homolog dizilerle bozulma kasetleri kullanarak YALI0A16379g) için lipolytica KU70 nakavt suşu (Şekil 4 ve 5). Burada ileri primerler (P1-F, ve P2-F), hedef genlerin 5 'homoloji kolu içinde yer alan sekansı ile tavlama. Arka primerler (P1-R), LEU2 markörün kodlama bölgesi içinde yer alır. Arka primerler (P2-R), hedef genlerin kodlama bölgesi (Şekil 4) içinde yer alır. Knock-out kasetleri homolog dizilerin ve kısıtlama bölgelerinin (Tablo 1) uzunluğunda sadece biraz farklıdır. Gen silme oranları [homolog rekombinasyon / (homolog rekombinasyon + homolog olmayan rekombinasyon)]% 33 -71% arasında KU70 gen delesyonu üzerinde hedeflenen homolog rekombinasyon frekansı dramatik bir artış düşündüren, elde edildi. Örneğin, YALI0E17787g silinmesi oranı (~ 100 cfu / mg DNA)% 40 idi. ayrıcadaha homolog sekanslar kullanıldığı zaman, gen silinmesi hızında daha fazla artış mümkün olup olmadığı araştırıldı. Bu 2 kb Homolog dizilerle YALI0E17787g gen bozulması kaseti% 87.5 (± 400 CFU / ug DNA) bir silme oranı sağladığını göstermiştir. Buna ek olarak, elde edilen silme mutantları tanıtılan bir seçim işaretçi geni, LEU2, böylece hedefli gen manipülasyon birden fazla tur sağlayan (hp4d- CRE, HPH) vektörü pSL16-CRE-hph transforme uzaklaştırıldı.
Şekil 1. KU70 nakavt kaset İnşaat ve KU70 mutant. A yoksun. KU70 nakavt plazmid T-KO. B. KU70 nakavt kaset şematik diyagramı. Memba ve mansap yenidenKU70 geninin gions (1 kb) 5'- ve homolog rekombinasyon için parçalama kasetinin 3 'ucu için klonlandı. LEU2 sentezleme kaseti iki homolog kuşatıcı diziler arasında sokulmuştur. C. T-KO dan sindirimi Sac II ve nde sonra KU70 silme kasetinin jel elektroforezi. L: 1 kb DNA Ladder; 1: KU70 silme kaset (beklenen bant boyutu 4.3 kb) D.. Y. KU70 gen delesyonu PCR onayı lipolytica Po1g. PCR ürünleri, genomik transformantların DNA (1-10 şeritleri) ve vahşi tip suşu (yol 11) amplifiye edilmiştir. şerit 1 yanlış pozitif gösterirken Şerit 7, olumlu bir nakavt göstermektedir. En jel olarak, 500 bp'lik bir fragmanı, 56 / # 57 ve şeritleri 1 ve alt jel 7'yi sadece yoktur başarılı tırnakları elde edilir 750 bp'lik bir fragman oluşturmak set # primeri ile elde edilen astar # 55 / # 56. T seto 750 bp bandı sadece şerit 7. L görülür. 1 kb DNA Ladder bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Markör kurtarma Cre rekombinaz sentezleme plasmidinin Şekil 2. şematik diyagramı. Epizomal kopyalayan plasmit pSL16-CRE-HPH Cre rekombinaz (CRE), higromisin B direnç işaretleyicisi (HPH), bir ampisilin direnç genini (Amp), bir taşımaktadır Escherichia coli (pMB1) bir replikasyon orijini, Y bir replikasyon orijini lipolytica (ORI1001), Y. bir sentromer DNA sekansı lipolytica (CEN1-1) ve β-galaktosidaz enzimi kodlayan bir lacZ geni. ver bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sion.
Pozitif işaretleyici-az Y. Şekil 3. Büyüme tarama işaretleyici kurtarma sonra lipolytica suşları. Transformantlar (1-4) seyreltilmiş ve sırasıyla YPD plakalar, YPDH plakaları ve lösin eksik plakalar üzerine fark edildi. 30 ° C, pozitif marker transformantların de büyüme 3 gün sonra, (1, 3, 4) sadece Cre rekombinazın ve plazmidin kaybı sentezleme üzerine, LEU2 işaretleyici genin eksizyonuna gösterir YPD plaka, büyüyebilir pSL16- CRE-HPH A:. YPD plaka, B: YPDH plaka, C:. lösin eksik plaka bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hedefli gen silme ve markör kurtarma prosedürü Şekil 4. şematik diyagramı. Gen bozulması kaseti, iki LoxP tanıma siteleri ve iki hedefleme kol (akış yukarı ve akış aşağı eteklenen dizileri) arasına alınmış bir seçim marker geni (LEU2) oluşur. Y olarak bozulması kasetinin transformasyonu sonra lipolytica hücreleri, bir gen değiştirme olayı hedeflenen loküsündeki iki yan homoloji kolları içinde çift çaprazlama homolog rekombinasyon yoluyla gerçekleşir. İki PCR primer seti hedef genomik bölge (P2-F P2-R) bozulması kaseti (P1-F ve P1-R) ve eşzamanlı silme entegrasyonu teyit etmek için kullanıldı. Son olarak, LEU2 işaretçisi kromozomal tek LoxP sitesi geride bırakarak Cre rekombinazın ifadesinin çıkarılır. Hedeflenen gen silme ve YALI0E17787 ge değiştirilmesine burada örnek olarak gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Y. YALI0E17787 gen bozulması Şekil 5. PCR onay lipolytica Po1g. PCR ürünleri vardı Genomik transformantların DNA (1-4 şeritleri) ve vahşi tip suşu (yol 5) amplifiye. şerit 3 yanlış pozitif gösterirken Geçitler 1, 2, 4, pozitif tırnaklar göstermektedir. En jel, başarılı tırnakları P1-F P1-R primer seti ile elde edilen 750 bp'lik, bir fragmanını üretir. 750 bp bandı şeritlerinin 1, 2 görüldüğü gibi, 4, ancak kuşak 3 ve alt jel 5'de, 500 bp'lik bir fragmanı, P2-F P2-R primer seti ile elde edilmiş ve mevcut olan yegane değildir şerit 3, bir bölgesindekind 5. L:. 1 kb DNA Ladder bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo bu çalışmada kullanılan 1. Astarlar. Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.
| PCR bileşeni | ||
| PCR malzemeleri | hacimler | Nihai konsantrasyon |
| PCR tamponu | 10 ul | 1x |
| dNTP karışımı | 1 ul | 200 uM |
| İleri primer | 2.5 ul | 500 nM </ Td> |
| Ters astar | 2.5 ul | 500 nM |
| DNA polimeraz | 0.5 ul | 1 u |
| DNA şablonu (genomik seyreltilmiş veya plazmid DNA) | 0.5-2 ul | 50 ng |
| steril su | kadar 50 ul | |
| PCR koşulları | ||
| Sıcaklık | Zaman | Döngü sayısı |
| 98 ° C | 30 sn | 1 |
| 98 ° C | 10 sn | 30 |
| 55 ° C | 30 sn | |
| 72 ° C | 30 sn | |
| 72 ° C | 10 dk | 1 |
| Term kullanılarak PCR büyütmesi gerçekleştirmekal cycler | ||
Yüksek sadakat DNA polimeraz için Tablo 2. PCR kurulum ve koşullar.
| Bileşen | |||
| Malzemeler | Nihai konsantrasyon | ||
| T4 DNA ligaz tampon | 1x | ||
| Vektör DNA, | 0.03 pmol | ||
| Ek DNA | 0.15 pmol | ||
| T4 DNA ligazı | 400 U | ||
| steril su | kadar 20 ul | ||
| Koşullar | |||
| Sıcaklık | Zaman | ||
| 16 ° C | 16 saat | ||
| Bileşen | |
| Malzemeler | Nihai konsantrasyon |
| Kısıtlama sindirim tampon | 1x |
| DNA (Plasmid ya da PCR ürünü) | 1 ug |
| 1. sınır enzimi | 5 U |
| 2. sınırlama enzimi (isteğe bağlı) | 5 U |
| steril su | kadar 50 ul |
| Koşullar | |
| Sıcaklık | Zaman |
| 37 ° C | <td> 6 saat|
| Tek sınırlama enzimi ile bir sindirim gerçekleştirme | |
| Kısıtlama enzimleri bir çift çift sindirim gerçekleştirme | |
Tablo DNA sınır enzimi sindirimi 4. koşullar.
| PCR bileşeni | ||
| PCR malzemeleri | hacimler | Nihai konsantrasyon |
| PCR tamponu | 2.5 ul | 1x |
| dNTP karışımı | 0.5 ul | 200 uM |
| İleri primer | 0.5 ul | 200 nM |
| reveersin astar | 0.5 ul | 200 nM |
| DNA polimeraz | 0.2 ul | 1 u |
| DNA şablonu (genomik seyreltilmiş veya plazmid DNA) | 0.5-2 ul | 50 ng |
| steril su | kadar 25 ul | |
| PCR koşulları | ||
| Sıcaklık | Zaman | Döngü sayısı |
| 95 ° C | 5 dakika | 1 |
| 95 ° C | 30 sn | 30 |
| 50 ° C | 30 sn | |
| 72 ° C | 30 sn | |
| 72 ° C | 10 dk | 1 |
| Bir termal döngü kullanılarak PCR büyütmesi gerçekleştirmek | ||
| Yerine bir DNA örneği daha PCR doğrudan şablon olarak bir koloni kullanarak koloni gerçekleştirin | ||
Taq DNA polimeraz için Tablo 5. PCR / Koloni PCR set-up ve koşullar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma için Amacımız Y. hedefli gen tırnakları hızlı ve etkin üretimini sağlamaktır Bunu başarmak için lipolytica Po1g suşu. Çeşitli düşünceler ele alınması gerekmektedir. İlk olarak, yüksek bir dönüşüm etkinliği gerekir. Y için Böylece, etkili ve uygun bir kimyasal dönüşümü protokolü lipolytica Po1g suşu Bu çalışmada tanımlanmıştır. PEG-4000 kullanımı, bu soyun başarılı bir transformasyonu için önemli bir faktördür. Bunun yerine, PEG-4000 (S. cerevisiae'nin transformasyonu için) PEG-3350 kullanarak Resim transformant plazmid transformasyonu için elde edilmiştir. Buna ek olarak, yeni hazırlanmış hücreler kullanılarak yetkili hücrelerin hazırlanması, bu suş yüksek dönüşüm etkinliğini elde etmek için gereklidir. İkincisi, bu suş baskın NHEJ ile homolog olmayan rekombinasyon ve rasgele entegrasyon aktiviteleri azaltmak için etkili bir dönüştürme yöntemi, daha sonra KU7 oluşturmak için kullanılmıştır0 nakavt mutant. Üçüncü olarak, uzun bir üst baş kollar (1 kb) yandan kuşatan, homolog rekombinasyon ile, gen değiştirme verimliliğini artırmak için ve hedef genlerin, aşağı doğru gen silinmesi kasetlerinin kullanılmıştır. kesinti kasetlerinde uzun yan homolog bölgeleri, bu suş etkili homolog rekombinasyon için gerekli olan. (S. cerevisiae'nin verimli homolog rekombinasyon için yeterli), 50 bp homologu bölgeleri ile bozulması kasetleri kullanıldığında hiçbir pozitif koloniler elde edilmiştir. Y. tüm bu stratejileri kullanarak, KU70 gen lipolytica Po1g suşu başarıyla silindi. Bununla birlikte, bunun nedeni, Y olmayan homolog rekombinasyon çok yüksek oranda KU70 nakavt suşunu elde etmek için son derece zordur lipolytica Po1g süzün. higromisin B ışığa duyarlı olarak antibiyotik içeren medyaya higromisin B tutarken dikkat edilmelidir. Bozulmuş higromisin B ile medyayı kullanarak sahte pos neden oluradımlar 2.2.1 itives ve 2.2.2 ve 2.2.7 adım yanlış negatifler.
KU70 delesyon suşu alkol dehidrojenazları ve alkol oksidazı kodlayan tek tek genlerin delesyonu üretmek için kullanıldığı zaman, çok daha yüksek bir silme oranı KU70 geninin silinmesi göre elde edilmiştir. Bu KU70 silinmesi platformu suşunun kullanımı homolog rekombinasyon sıklığı dramatik bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Çok düşük homolog rekombinasyon oranı sorunu ele alındı sonra, Y. tarama lipolytica Tek gen nakavt mutantlar çok hızlandırdı edildi. Biz de homolog bölgenin 1 kb uzunluğu hedeflenen gen silinmek üzere yeterince etkili olduğunu kaydetti. daha homolog dizileri (2 kb) kullanıldığında, homolog rekombinasyon frekansında bir artış elde edilebilir. Özellikle, bu genler, alkoller ve ald arasındaki geri dönüşümünü katalize alkol dehidrojenazları ve alkol oksidazı kodlayanehydes. Bu genlerin silinmesi biyoyakıt birikimine ve kısa zincirli yağlı asitlerin, orta zincirli yağ asitleri ve uzun zincirli yağ asitlerinin, hidroksi yağ asitlerinin, alkoller, aldehitler ve lipidler de dahil olmak üzere, biyokimyasal bileşiklerin neden olabilir. Daha ileri çalışmalar, bu olasılığı kontrol etmek için gerçekleştirilir.
Bir PCR aracılı gen bozulması yöntemi Y bildirilmiştir lipolytica Po1d suşu 28. Bununla birlikte, bu yöntem, zahmetli ve zaman alıcı bir iştir. Bu yöntemin bir ana bir sınırlama transformasyon deneyi için gen silinmesi kasetlerinin yeterli miktarlarda elde etme zorluğudur. Başka bir sınırlama bu yöntem URA3 işaretleyici ile sınırlı olmasıdır. Bu çalışmada açıklanan yöntem özellikle sindirim-ligasyon yaklaşım ve Cre / LoxP sistemini birleştirerek PCR tabanlı tekniğinde bu konuları ele alındı. Bu yöntem, farklı antibiyotik ve auxotrophic belirteçlerin kullanımını sağlar ve böylece daha tam tersi olduğunufayans. Bu Y. hızlı gen silme kolaylaştırabilir lipolytica Po1g süzün. Biz burada Y. homolog rekombinasyon yoluyla hedeflenen tek gen silme stratejisinin ayrıntılı bir açıklama sunmak lipolytica Po1g hücreleri. Ancak, bir LoxP sitesi başarılı işaretleyici kurtarma (Şekil 4) sonra genomu içinde bir yara olarak kalır. Birden çok gen silme, çoklu LoxP izleri genom içine dahil edilir ve bu durum, LoxP siteleri arasında gerçekleştirilen olası rekombinasyon olayları genomik instabilite neden olabilir. Bununla birlikte, bu çalışmada yapılan eleme suşları istenmeyen rekombinasyon olayları LoxP yerleri arasında cereyan etmediğini gösteren, çok iyi bir genetik stabilite göstermiştir.
Özetle, etkili bir genetik transformasyon protokolü Y için kurulmuştur lipolytica Po1g süzün. Bu zorlanma tek genlerin hedef silme kavramının bir kanıtı olarak gösterildi. Y. Bu çalışmada yapılan lipolytica Po1g KU70 silinmesi platformu suşu hedefli gen silme, daha kolay ve daha hızlı bir tarama sağlayan çok etkili homolog rekombinasyon frekansını göstermektedir. Böylece, bu platform suş daha verimli bir sistem ve yolu mühendislik ve diğer kromozomal silme mutantlar inşa suşu optimizasyonu uygulamalar için daha iyi bir seçim sağlar. Tarif edilen yöntem ve inşa KU70 delesyon suşu aynı zamanda özel lokuslar halinde hedef genlerin yerleştirilmesi ve genomu içine alana özgü mutasyonların oluşturulmasına uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz minnetle Singapur (ETRP 1201102) Ulusal Çevre Ajansı finansman desteği kabul, Singapur Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK-CRP5-2009-03), Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı Rekabet Araştırmaları Programı ( 1324004108), Küresel Ar-Ge Proje Programı, Bilgi Ekonomisi Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (N0000677), Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ve Sentetik Biyoloji Singapur Ulusal Üniversitesi Girişimi ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
Tags
Genetik Sayı 115 Biyomühendislik Sayı Sıradışı maya,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
