Introduction
Hematopoiese is een complex ontwikkelingsproces waarbij hematopoietische stamcellen (HSCs) knop uit hemogenic endothelium aanwezig in diverse embryonale hematopoietische sites zoals de aorta-Gonade-mesonephros en placenta 1,2. Het onvermogen cultuur HSCs in vitro voorkomt de grondige analyse van dit proces en de klinische toepassing van deze studies. Om deze beperking te omzeilen, hebben eerdere studies geprobeerd om af te leiden HSC de novo hetzij via differentiatie van pluripotente stamcellen (PSC) 3, of geïnduceerde plasticiteit in somatische cellen en geregisseerd differentiatie met behulp van het herprogrammeren van media 4,5. Deze onderzoeken echter genereren geen klinisch veilig engraftable cellen of toestaan studie van ontwikkeling definitieve hematopoiese "in een schotel."
De roman werk die door Yamanaka en collega's voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van somatische fibroblasten provides een kader voor transcriptiefactor (TF) op basis van overexpressie strategieën herprogrammering lot van de cel 6,7. Dit werk is in verschillende gebieden gevraagd onderzoekers om celtypen van keuze te genereren via TF herprogrammering van gemakkelijk verkrijgbaar somatische cellen. Het doel van de herprogrammering strategie hier beschreven een hemogenic werkwijze uit muizen somatische cellen met een TF gebaseerde herprogrammering benadering met als doel deze bevindingen neerkomt op het menselijke systeem patiëntspecifieke fibroblasten herprogrammeren om humane hematopoiese onderzoeken in vitro en induceren genereren patiëntspecifieke bloedproducten ziektemodel, drug testen en stamceltransplantatie.
De eerste stap om juiste herprogrammering in deze muis te verzekeren werd een reporter lijn die diende als een uitlezing voor CD34 expressie, een bekende merker in endotheliale progenitorcellen en HSCs ontwikkelen. Om dit te doen, werden de huCD34-tTA en TetO-H2BGFP transgene muis lijnen gebruikt om generate dubbele transgene muis embryonale fibroblasten (MEF), nu aangeduid 34 / H2BGFP, dat groene bij activering van de CD34 promotor 8 fluoresceren. Dit maakte screening van verschillende TF bekend vereist op verschillende momenten tijdens hematopoietische specificatie en ontwikkeling. Beginnend met 18 TF's in PMX retrovial vectoren (bepaald door middel van literatuur en profilering van GFP label behoud van HSC uit de eerder beschreven 34 / H2BGFP muizen), 34 / H2BGFP MEFs werden getransduceerd met alle factoren en gekweekt op AFT024 HSC-ondersteunende stromale cellen. Na de detectie van 34 / H2BGFP activering, werden TF vervolgens verwijderd uit de herprogrammering cocktail tot de optimale set van TFS reporter activering werd geïdentificeerd. Na deze eerste screen werden de factoren naar een DOX pFUW induceerbaar vectorsysteem voor expressie regelbaar van het TF mogelijk. Aangezien beide DOX controleerbare onverenigbaar (de 34 / H2BGFP cellen en de pFUW induceerbare vectoren), MEF uitwild-type C57BL / 6 muizen werden vereist. Het was ook nodig om een geschikte micro-omgeving te laten hemogenesis om verder te gaan en maak multilineage klonogene voorlopercellen te bieden.
Huidige studies een poging om somatische cellen te herprogrammeren in hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) hebben uiteenlopende niveaus van succes 9-11 voldaan. Tot op heden heeft het opwekken van zowel muis en mens transplantable HSPCs met de lange termijn en zelf-vernieuwing repopulatie vermogen niet is bereikt met behulp van dezelfde set van TF's. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de eerder vastgestelde strategie reproduceerbaar hemogenesis induceren in MEFs. We tonen aan dat de invoering van een minimaal aantal TF's (Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6) kan aanzetten tot een complex ontwikkelingsprogramma in vitro dat een platform waarmee ontwikkeling hematopoiese en klinische toepassing van hematopoietische herprogrammering verder kan worden onderzocht 12 verschaft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Muis cellijnen zijn afgeleid volgens de richtlijnen van de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï verzorging van de dieren, en moet worden gedaan in overeenstemming met enige gastinstelling.
1. muis embryonale fibroblast (MEF) Isolatie van C57BL / 6 muizen
- Opzetten getimede paring 13. Zodra een vaginale plug wordt gevisualiseerd, overweeg deze Dag 0,5.
- Scheid de aangesloten vrouwtjes op de stekker datum en controleren op hen op de Dag van 10-11 om zwangerschap te bevestigen.
- Op dag 13,5-14,5 euthanaseren zwangere vrouwelijke muizen via CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Weken zwangere vrouw buik met 70% ethanol, ontleden de buikholte met steriele scharen en pincet langs de middellijn en operatief verwijderen baarmoederhoorns met het embryo 14. Haal de embryo's zachtjes terwijl het afsnijden van de resterende abdominale weefsel.
OPMERKING: Recover ongeveer 8 embryo's met 4 aan elke kant. - Plaats de baarmoeder hORNs die de embryo's in een 10 cm schaal met 5-10 ml gekoelde steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Met een steriele schaar en pincet, maak dan een incisie langs de baarmoeder horens aan de zakken die de embryo's te isoleren. Breng de zakken om een nieuwe 10 cm schotel met 5-10 ml steriele gekoelde PBS en plaats op ijs.
- Plaats een paar van de zakjes in een nieuwe 10 cm schaal met 5-10 ml steriel PBS gekoeld. Met behulp van een steriele schaar en pincet voorzichtig opengesneden de zakken (zonder te snijden te diep) om te voorkomen dat het doorboren van de embryo's.
- Scheid de embryo's uit placenta door het snijden van de navelstreng.
- Overdracht van de embryo's om een nieuwe 10 cm schotel met 5-10 ml koud PBS en laat op ijs bij het invullen van de resterende dissecties.
- Onthoofden het embryo met steriele pincet. Knip voorzichtig langs de middellijn van het embryo met behulp van steriele schaar en pincet, vanaf de onthoofde gebied om het openstellen van de buik. Positie pincet eronder tHij viscerale organen (met inbegrip van het hart, lever en longen) en schrapen ze 15.
- Snijd de resterende weefsel in kleine stukjes met een schaar en pincet overgebracht in een 50 ml conische buis met 10 ml van trypsine.
- Pipet op en neer met een 10 ml pipet 20-30 keer mengen en dissociëren het weefsel.
- Incubeer het weefsel en trypsine mix in een 37 ° C waterbad gedurende 45 min, wervelende af en toe.
- Pipet op en neer met een 10 ml pipet ongeveer 5 minuten om de inhoud te mengen.
- Voeg getrypsiniseerd cellen hoeveelheid gesteld Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 3x 10 ug / ml penicilline / streptomycine (P / S) en 1 mM L-glutamine (L-GLUT) in 10 cm schalen (~ 10 ml) en kweek bij 37 ° C totdat confluente (ongeveer 2-4 dagen). Cultuur ongeveer 1-2 embryo's per 10 cm schotel.
LET OP: Freeze cellen eenmaal platen confluent. Bevroren cellen worden ontdooid en 2 keer doorgekweekt. Cellen kunnen als alternatiefsplit 2 keer voor het invriezen, en dan nog eens na te zijn ontdooid.
2. virusproductie
- Expand 293T cellen in 10 cm platen met 10 ml DMEM met 10% FBS, 1% P / S, en 1% L-GLUT voor transfectie.
- Trypsinize 293T cellen met 2 ml trypsine, incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min, laat de cellen in 15 ml buizen draaien op 300 xg en plaat passend (10 ml per 10 cm schaal).
- 24 uur voorafgaand aan transfectie, splitsen confluente 10 cm plaat van 293T cellen 1: 6 en zaad in 10 cm gelatine beklede (0,1% gelatine in PBS) platen.
LET OP: 4 platen per virus nodig zal zijn.- Bekleden platen in gelatine, voeg ten minste 2 ml van de 0,1% gelatineoplossing bekleden onderaan 10 cm platen. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 20 min. Aspireren uit gelatine voorafgaand aan het toevoegen van cellen aan de platen.
- In een 15 ml buis, voeg 84 ug plasmide (bijv Gata2, Gfi1b, cFos of ETV6 (gesubkloneerd in de pFUW-TetO vectof 16) of FUW-M2rtTA 17), 84 ug psPAX2 en 42 ug pMD2.G. Voeg water toe (H 2 O) om het volume tot 2 ml. Bereid een buis voor elke factor (bijv. Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 en FUW-M2rtTA).
- Voeg 250 gl 2M CaCl2 aan elke buis die het mengsel 2 ml bestaande uit 84 ug van het gekozen gen (Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 of FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H 2 O .
- Met een Pasteur-pipet ingebracht in de pipet-steun afgifte bellen in de 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl2 mengsel. Aangezien de belletjes worden geproduceerd, plaatst de punt van een P1000 tegen de glazen pipet en langzaam uitwerpen 2 ml van 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethaan sulfonzuur (BES) zoutoplossing langs de Pasteur pipet 1 ml per keer.
- Incubeer alle buizen in de cultuur kap bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min.
LET OP: De 4,25 ml mengsel (nu DNA + H 2 O + 2M CaCl2 - Als het mengsel inleggen, zuig media af 293T borden en voeg 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-glutamine + 25 nm chloroquine.
LET OP: Deze media niet P / S bevatten. - Na ten minste 15 min incubatie (of tot het wijzigen van de media op 293T-cellen), H 2 voeg de 4,25 ml DNA + O + 2 M CaCl2 + BES zoutoplossing mengsel druppelsgewijs naar de 293T-cellen, het verspreiden van gelijkmatig verdeeld over 4 cellen platen per buis (gemiddeld iets meer dan 1 ml van het mengsel per plaat).
- Incubeer de platen gedurende de nacht (O / N) bij 37 ° C.
- 24 uur na incubatie media vervangen op alle platen met 4 ml standaard DMEM (zie stap 1.15).
- Houd cellen in een 32 ° C incubator voortaan.
- 24 uur na stap 2,10, het verzamelen van media in afzonderlijke 50 ml buizen. Vervang de verzamelde media uit elke plaat met 4 ml van de standaard DMEM.
LET OP: 4 platen per eerste buis mengsel resultaten in 16 ml van de verzamelde media.- EENN a 12 uur van incubatie, het verzamelen van de media opnieuw in dezelfde 50 ml buizen en vervangen door een andere 4 ml van de standaard DMEM.
- Na 12 uur incubatie, verzamel de media en voeg dezelfde 50 ml buizen.
LET OP: elke buis moet nu bevatten ongeveer 48 ml van de media met virus.
- Om de verzamelde virus, eerste filter de verzamelde media concentreren door middel van 0,45 urn laag-eiwit binding filters.
- Giet het gefiltreerde medium dat virus in virale concentratie centrifugebuizen (ongeveer 16 ml per keer).
- Spin bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 25 minuten en verwijder doorstroming.
OPMERKING: Een klein volume geconcentreerd media en virussen zijn zichtbaar in het filter. - Voeg nog 16 ml gefiltreerd virus-bevattende media aan de geconcentreerde media + virus restvolume in het filter en meng door de buis.
- Spinbuis opnieuw bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 25 min en gooi doorstroming.
- Voeg de resterende gefilterdverzameling aan de geconcentreerde media + virus volume links in het filter en meng door de buis.
- Spin opnieuw bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 10-20 min (afhankelijk van het volume in het filter) en om de laatste deel geconcentreerd media + virus nog in het filter ongeveer 1 ml. Indien groter dan 1 ml geconcentreerd media + virus in het filter blijft draaien opnieuw bij 4000 xg gedurende 1 min en herhaal tot 1 ml overblijft in het filter.
- Aliquot 200 ul van het geconcentreerde virus in 1,5 ml buisjes en bevriezen bij -80 ° C of onmiddellijk gebruik.
3. MEF herprogrammeren
- Pre-coat 6 goed platen met 0,5 ml 0,1% gelatine in PBS per well, ervoor te zorgen dat de gelatine bestrijkt het hele gebied van de put. Plaats in een 37 ° C incubator en incubeer gedurende ten minste 20 min. Na incubatie, verwijder de platen en zuig de gelatine.
- MEF plaat met standaard DMEM bij een dichtheid van 25.000 cellen per putje (150.000 cellenper 6-wells plaat) op de ontsloten 6-well plaat (s) van stap 3,1 en laat O / N zich in een 37 ° C incubator.
- Bereid een 100 ul virus cocktail door 50 gl M2rtTA en de resterende 50 ui van een mengsel van Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6 (12,5 pi elk).
- Aspireren media van MEFs en voeg 2 ml standaard DMEM met 8 ug / ml hexadimethrinebromide.
- Transduceren elk putje van de MEF platen met 15 ul van het virus cocktail en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
LET OP: Dit is de Dag 0 van de herprogrammering proces. - Op dag 1 na 16-20 h incubatie media te vervangen door 2 ml vers standaard DMEM aangevuld met 1 ug / ml per putje DOX.
- Bereid hematopoietische kweekmedium aangevuld met hydrocortison (10 -6 M), 100 ng / ml stamcelfactor (SCF), 100 ng / ml-Fms-gerelateerde tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), 20 ng / ml interleukine-3 (IL 3), 20 ng / ml interleukine-6 (IL-6), en 1 ug / ml DOX.
- Op dag 4 aspirate media uit elk putje en wassen cellen met 1 ml PBS per putje.
- Aspireren PBS, dissociëren cellen met behulp van 1 ml 0,05% trypsine per put en het verzamelen van de cellen.
- Aantal cellen met een hemocytometer, rotatie bij 300 xg gedurende 5 minuten, resuspendeer in 12 ml hematopoietische media in stap 3.7 beschreven en plaat 60.000 cellen per 6-well plaat op 0,1% gelatine beklede platen (2 ml per putje, 10.000 cellen per putje ).
- Vervang de media met verse aangevulde hematopoietische cultuur media om de 6 dagen tijdens de duur van de cultuur (35 tot 36 dagen).
- Analyseer middelbaar cellen of opkomende hematopoietische-achtige cellen via immuno-kleuring 12, FACS-analyse 8,12, qRT-PCR 12 en mRNA sequencing 12 tot en met de overname van hemogenic endotheliale of HSC-achtige markers en gen expressie te bevestigen.
4. Placenta Samenvoeging en kiemgetal (CFU) Testen in Methylcellulose
- Ontleden placenta van zwangere C57BL / 6-muizen zoals eerder beschreven 18 aan E12.5 en houdt weefsel op het ijs.
- Om placenta dissociatie 19 start, wassen placenta weefsel in 2-5 ml 0,2% collagenase type I in PBS met 20% FBS en mechanisch dissociëren met een 18G naald in een 5 ml injectiespuit voorzien door passage van de placenta en PBS door de naald ten minste Drie keer.
- Na mechanische dissociatie Houd placenta cellen in 2-5 ml collagenase oplossing bij 37 ° C gedurende 1,5 uur.
- Passage cellen door 20-25 G naalden aangebracht op 5 ml spuiten meerdere malen verder mechanisch te distantiëren van de cellen van de placenta.
- Filter enkele cel suspensies m 70 micrometer cel zeven.
- Aantal cellen met een hemocytometer en bestralen van 2000 cGy voor mitotische 20 inactivering.
- Voeg 10 ml hematopoietische kweekmedium gesupplementeerd met 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6 en 10 ng / ml trombopoietine (TPO) met een 10 cm schotel.
OPMERKING: DOX is niet op dit moment noodzakelijk. - Plaats een 0,65 urn filter direct op hematopoietische kweekmedia in de schaal, zodat het drijven van een vloeistof-gas-interface en zet de schotel opzij.
- Distantiëren dag 25 getransduceerd MEFs (verkregen uit stap 3,11) zoals beschreven in stap 3,8-3,10 en meng 33.000 van de getransduceerde MEF met 167.000 cellen van de placenta aggregaten van stap 4,6 (1: 6 verhouding).
- Om een aggregaat 18,21, eerste spin langs de MEF en placenta cel mix uit stap 4.9 te genereren gedurende 5 min bij 300 x g. Aspireren de media en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 30-50 ul van standaard DMEM met behulp van een P200 pipet, het tekenen van de enkele celsuspensie in de 200 ul nonbevelled pipet tip.
- Afsluiten van de pipet tip met paraffine film. Plaats de geblokkeerde tip in een 15 ml centrifugebuis en spin down gedurende 5 min bij 300 xg zodat een pellet vormt op het bedekte uiteinde van de punt.
- Haal de tip van de 15 ml buis zorgvuldig en plaatsde punt op het uiteinde van het P200 pipet. Gooi de paraffine folie en extrusie van de celpellet op de drijvende filter uit stap 4.8.
LET OP: Plate ten hoogste 3 aggregaten per filter. - Cultuur de aggregaten op de drijvende 0,65 urn filters gedurende 4-5 dagen in 37 ° C met 5% CO2.
- Verzamel de aggregaten (maximaal 3 per filter) met een cel schraper, combineren en verteren met 0,2% collagenase, volgens hetzelfde protocol als gedaan met de hele placenta om de cellen te scheiden (stappen 4,2-4,5).
- Na dissociatie, was de aggregaten met 2-5 ml PBS aangevuld met 5% FBS en spin down cellen bij 300 g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de aggregaten in 500 pl DMEM zonder FBS, P / S of L-GLUT. Neem deze 500 ul resuspensie toevoegen aan 3 ml 1% méthylcellulose medium aangevuld met 10 ng / ml TPO, daarbij vermijdt blaasvorming. Plate gelijke volumes van dit mengsel in 3 35 x 10 mm niet-behandelde cultuur gerechten voorCFU assays 12.
- Als controle cultuur bestraald placenta aggregaten zonder menging in reprogrammed MEFs 4-5 dagen plaats CFU assays zoals hierboven beschreven in stappen 4,7-4,16.
LET OP: Deze aggregaten alleen niet kolonies vormen. - Aantal hematopoietische kolonies handmatig onder de microscoop na 10-14 dagen kweken bij 37 ° C met 5% CO2.
- Cytospin 22 kolonies uitgekozen morfologische fenotype van afzonderlijke cellen vertonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hematopoiese is een complexe ontwikkelingsstoornis proces dat begint in verschillende embryonale sites. Hemogenic endotheelcellen wonen in deze sites en aanleiding geven tot HSC via de mobiele ontluikende 23 geven. Dit proces kan op dit moment niet worden gereproduceerd door het plaatsen van HSC of hematopoietische voorlopers in de cultuur, noodzakelijk een methode om deze cellen in vitro of andere manier te verkrijgen, hetzij door HSPC uitbreiding ex vivo of generatie de novo. Dit protocol toont onze nieuwe technologie dat de pogingen om deze cellen via TF-overexpressie in MEFs te verkrijgen.
Figuur 1 illustreert het algemene herprogrammeringsproces. Na MEF generatie en uitbreiding, worden de cellen getransduceerd met Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 en FUW-M2rtTA. Na 3 dagen van groei en blootstelling aan DOX om transgene activering start, worden cellen gescheiden en verdeeld op dag 4 op gelatine beklede platen engekweekt in aangevuld hematopoietische media.
Na langdurige cultuur na transductie met herprogrammering media, cellen nemen duidelijke morfologische veranderingen. Op Dag 20 cellen nemen endotheelcellen morfologie onderscheiden van MEF. Verdere cultuur Dag 35 resultaten in verschillende hematopoietische round-achtige cellen die uit de endotheel-achtige tussenproducten die GFP + (bij gebruik van de 34 / H2BGFP MEF) en kleuring positief voor de hematopoïetische merkers SCA1 en CD45 (Figuur 2). Deze kleuring toont aan dat deze cellen krijgen fenotypische markers suggereren hemogenic inductie. Verdere cultuur resulteert in cellen die CD45 met behoud van de expressie van de huCD34 reporter. Bij placenta aggregatie kweekcellen nemen klonogene potentieel en het genereren van kolonies in methylcellulose met verschillende hematopoietische morfologieën en blast-achtige cellen (figuur 3).
ep-together.within-page = "1"> 
Figuur 1: Strategie voor hemogenic inductie in MEF. Diagram dat de herprogrammering proces en elke stap binnen het. De algemene herprogrammeringsproces omvat eerste MEF expansie, gevolgd door splitsing op de juiste dichtheid in met gelatine beklede platen met 6 putjes. De cellen worden vervolgens getransduceerd met de cocktail van Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 en FUW-M2rtTA. De cellen worden verder gekweekt met standaard DMEM aangevuld met DOX. Op dag 4 cellen worden getrypsiniseerd en verdeeld in 6-well platen. Elke 6 dagen medium wordt gewijzigd en op gekozen tijdstippen cellen kunnen worden geanalyseerd door FACS, CFU of genexpressie assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
load / 54372 / 54372fig2.jpg "/>
Figuur 2: Inductie van hematopoietische cellen die uit voorlopers. Cellen positief voor 34 / H2BGFP gekleurd voor SCA1 en CD45 demonstreren inductie van een hemogenic programma. (A) Dit beeld toont een fusie van cellen gekleurd voor CD45 en SCA1 terwijl fluorescerende GFP een onderliggende helderveld beeld van de geherprogrammeerd cellen met. Slechts een deel van de vlakke celpopulatie tot expressie SCA1, een endotheliale / hemogenic marker en alleen afgeronde hematopoietische-achtige cellen die uit deze cellen te kleuren rood voor CD45, een pan-hematopoietische marker. (B) Deze afbeelding toont de bevlekt en GFP fluorescerende cellen imago van de helderveld zonder, waarop duidelijk nauwe betrokkenheid van CD45 + cellen met de SCA1 + cellen. Schaal bar = 100 uM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Genereren van CD45 + hematopoietische cellen. (A) Ongeveer 12,7% van de 34 / H2BGFP MEF getransduceerd met Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6 zijn GFP + CD45 + na 35 dagen van de herprogrammering. Duidelijke myeloïde morfologieën en blast-achtige cellen kan worden waargenomen na H & E kleuring (B) na cytospine van CD45 + gesorteerde cellen uitgeplaat in methylcellulose voor 10-14 dagen. Dit toont de klonale multilineage potentieel van de geherprogrammeerd cellen die hematopoietische functie uit te brengen na transductie met deze minimale set van TF's. Schaal bar = 100 uM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genereren HSPCs de novo uit makkelijk bereikbaar somatische cellen een unieke methode om hematopoëse in vitro, en de mogelijkheid te bestuderen om potentieel deze technologie toe te passen op het menselijk lichaam. Deze vertaling zou een nieuw instrument genereren menselijke hematologische ziekte te bestuderen in een schotel, en verstrekt drug testplatformen en gene targeting mogelijkheden talrijke aandoeningen met nieuwe therapieën of HSC transplantaties behandelen. Ter plaatse recente studies uitgebreid op het vermogen om HSPCs de novo genereren, die het belang aantonen van verschillende functies van het herprogrammeringsproces. Deze omvatten de keuze van het uitgangsmateriaal celpopulaties en TF cocktails, evenals hoe kweekomstandigheden (co-kweek niche) en suppletie (cytokines, kleine moleculen, etc.) aanzienlijk invloed hebben op de efficiëntie van 24-26 herprogrammeren. Verschillende studies toepassen herprogrammering technologie voor het menselijke systeem zonder reizen dooreen pluripotente tussenproduct, 27,28 ongewenste stap in deze processen.
Hier is een protocol dat was de eerste die HSC-achtige cellen van somatische cellen te genereren via een ontwikkelingsproces terwijl het vermijden van het gebruik van de pluripotentie factoren en de vorming van pluripotente tussenproducten. De gegenereerde HSC-achtige cellen lijken te ontwikkelen door middel van een ontwikkelingsproces, waarbij de eerste cellen om te reizen via een hemogenic endotheliale tussenliggende vergelijkbaar met een EHT. Op dag 20 van de herprogrammering endotheel-achtige tussenproducten vorm die endotheliale en hematopoietische genexpressie profielen bevatten. HSC-achtige cellen komen uit deze tussenliggende cellen op dag 35 dat celoppervlak immuno-fenotypes en genexpressie profielen zeer vergelijkbaar met HSCs bevatten en kan erytroïde en myeloïde kolonies in CFU assays produceren. Dit suggereert dat, in tegenstelling tot andere studies, herprogrammering protocol recapituleert een complex ontwikkelingsproces in vitro, en kan permverder onderzoek hematopoiese en hematologische ziekteprocessen die embryonale hematopoiese betrekken. Deze studies laten verder onderzoek over het behandelen en genezen van de veelheid van hematologische aandoeningen die bestaan en hoe hematopoiese manipuleren daartoe. Dit kan door het induceren van een hemogenic programma patiëntspecifieke fibroblasten indienen in vitro ziektemodellen. Met deze modellen, kunnen normale en zieke hematopoiese fijn worden ontleed en bestudeerd, en onderworpen aan drugs schermen en gen editing behandelen / juiste hematopoietische afwijkingen geassocieerd met de ziekte van belang.
Met behulp van de muis fibroblasten ondersteunt verschillende heilzame kwaliteiten van deze herprogrammering proces. De fibroblasten zelf zijn gemakkelijk te verkrijgen van donor muizen, waardoor cel overname eenvoudig. Het vertalen van deze technologie voor de mens zou dus alleen noodzakelijk huid van de patiënt monsters, waardoor overname van patiënt-specifieke bloedproducten en de daaropvolgende cel testeken een haalbare optie voor de behandeling hematologische ziekten. Bovendien, fibroblasten epigenetisch zeer verschillend van hematopoïetische cellen, die het vermogen aantonen van de gekozen TF in herprogrammering protocol zowel epigenetisch Repress fibroblast identiteit, en ook om een hemogenic programma aanzetten door het veranderen van de epigenetische geheugen van de uitgangscellen 29,30. Hoewel transplantatie studies nog niet aantonen volledige multilineage aanslaan functie van deze afgeleide cellen, kijken of deze factoren een hemogenic programma dat volledig functioneel hematopoietische cellen genereert in het menselijk systeem van groot belang zal zijn induceren.
Verschillende stappen in dit protocol kan in geval van nood worden gewijzigd tijdens de herprogrammering, zoals het aantal cellen uitgeplaat voorafgaand aan transductie en de hoeveelheid virus voor transductie. Optimale resultaten werden waargenomen met behulp 150.000 cellen per 6 putjes (stap 3,2) met de eerder beschreven hoeveelheid virus (stappen 3,3 en 3,5), maar meer cellen kunnen worden gebruikt bij celdood na blootstelling aan het virus. Ook kunnen kleinere hoeveelheden van het virus worden gebruikt, moet een probleem cel dood, zolang herprogrammering plaats zoals beschreven (welke via FACS analyse CFU assays en gen profilering gecontroleerd). Zorgen dat stappen 2,13-2,19 opbrengst juiste hoeveelheden virus noodzakelijk voor het succes van de rest van het protocol. Stappen 3,5-3,7 zijn ook kritisch, zo succesvol transductie van cellen is van cruciaal belang voor het induceren van deze hemogenic programma. De geschikte hoeveelheid DOX per putje van getransduceerde cellen moeten consequent en vers worden gehouden om de expressie van de transgenen (dienen daarom de frequente verandering van medium) te waarborgen. Hoewel het niet absoluut noodzakelijk is, kan celkweek in het donker bij het gebruik van DOX helpen verlies van DOX functie te voorkomen. Na transductie moeten de cellen nauwkeurig worden gecontroleerd onder de microscoop door morfologie en bepaald met verschillende analytische werkwijzen (zoals FACS en assays CFU) te waarborgen sUccessful virale transductie en herprogrammering. Geherprogrammeerd cellen niet zoveel morfologische veranderingen zoals verwacht aannemen, waarbij de eerder genoemde analytische methoden om te dienen als de beste indicatoren van een goede herprogrammering.
Recente studies hebben verschillende kenmerken van herprogrammering protocol, zoals Gata2 gebruikt in de TF cocktail of fibroblasten als startpunt celpopulatie 31-33. Deze methoden blijken ook ontwikkelingsprogramma's te induceren tijdens de herprogrammering proces. Andere strategieën hebben het belang van de hematopoietische niche te zien tijdens het herprogrammeren 9,10,25,26. Het identificeren van alle factoren die helpen bij herprogrammering zal van essentieel belang zijn om het protocol dat bonafide HSC uit makkelijk bereikbaar patiënt-specifieke cellen genereert ontwikkelen. Kortom, hier beschrijven we een strategie om de HSC-achtige cellen uit een geïnduceerde ontwikkelingsproces in muizen fibroblasten via induceerbare Gata2, Gfi1b, cFos, en het genereren vanETV6 overexpressie. Deze technologie wordt vertaald naar het menselijke systeem, waarbij, in combinatie met andere gepubliceerde studies, zal genereren van patiëntspecifieke bloedproducten geschikt voor een verscheidenheid aan klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45 μM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18 G needles | BD | 305195 | |
| 20 G needles | BD | 305175 | |
| 25 G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65 μM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 mm x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
- Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
- Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
- Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
- Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
- Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
- Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
- Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
- Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
- Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).
