Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Omprogrammering mus embryonale Fibroblaster med transkripsjonsfaktorer for å indusere en Hemogenic Program

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

Hematopoiesis er en kompleks utviklingsprosess der blodkreft stamceller (HSCs) knopp av hemogenic endotelet til stede i en rekke embryonale blodkreft steder som Aorta-Gonade-Mesonephros og morkaken 1,2. Den manglende evne til kulturen HSCs in vitro hindrer grundig analyse av denne fremgangsmåten, så vel som den kliniske anvendelsen av disse studiene. For å omgå denne begrensningen, har tidligere studier forsøkt å utlede HSCs de novo enten via differensiering av pluripotente stamceller (PSC avtaler) 3, eller indusert plastisitet i somatiske celler og rettet differensiering ved hjelp omprogrammering medier 4,5. Disse studiene har imidlertid ikke generere klinisk trygge engraftable celler eller tillate studie av definitive utviklings hematopoiesis "i en skål."

Romanen arbeid etablert av Yamanaka og kolleger til å generere induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra somatisk fibroblaster provides et rammeverk for transkripsjon faktor (TF) basert overekspresjon strategier i omprogrammering celle skjebne 6,7. Dette arbeidet har bedt etterforskerne på flere områder for å generere celletyper av valg via TF omprogrammering av lett oppnåelig somatiske celler. Målet med reprogrammerings strategien som er beskrevet her er for å indusere en hemogenic prosess fra musesomatiske celler ved hjelp av et TF basert reprogrammerings tilnærming med det mål å oversette disse funnene til det menneskelige system for å omprogrammere pasientspesifikke fibroblaster for å undersøke human hematopoese in vitro og generere pasientspesifikke blodprodukter til sykdom modellering, narkotika testing, og stamcelletransplantasjon.

Det første skrittet for å sikre riktig omprogrammering i denne musen systemet var å utvikle en reporter linje som fungerte som en lese-out for CD34 uttrykk, et kjent merke i endoteliale progenitorceller og HSCs. For å gjøre dette, ble de huCD34-TTA og Teto-H2BGFP transgene mus linjer som brukes til å generate doble transgene mus embryonale fibroblaster (MEFs), nå betegnet 34 / H2BGFP, som fluoresce grønt ved aktivering av CD34 arrangøren 8. Dette tillot screening av et utvalg av TFS som er kjent for å være nødvendig ved forskjellige punkter i løpet av hematopoetiske spesifikasjon og utvikling. Fra og med 18 TFS i PMX retrovial vektorer (bestemt gjennom litteratur gruvedrift og profilering av GFP etikett beholde HSCs fra de tidligere omtalte 34 / H2BGFP mus), 34 / H2BGFP MEFs ble omformet med alle faktorer og kultivert på AFT024 HSC-støtte stromale celler. Etter påvisning av 34 / H2BGFP aktivering, ble TF'er deretter fjernet fra reprogrammerings-cocktail inntil den optimale settet med TFS for reporter-aktivering ble identifisert. Etter denne startbildet, ble faktorer overført til en DOX induserbar pFUW vektorsystem for å tillate kontrollerbar ekspresjon av TFS. Siden disse to DOX kontrollerbare systemer er uforenlig (de 34 / H2BGFP celler og pFUW induserbare vektorer), MEFs fravilltype C57BL / 6 mus ble nødvendig. Det var også nødvendig å gi en passende mikromiljøet for å tillate hemogenesis å fortsette og lage multilineage klonogene stamfedre.

Aktuelle studier som forsøker å omprogrammere somatiske celler i hematopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs) har møtt ulike nivåer av suksess 9-11. Til dags dato har generering av både mus og mennesketrans HSPCs med langsiktig og selvfornyende repopulating evne ikke er oppnådd ved hjelp av det samme settet av TFS. I denne protokollen, gir vi en detaljert beskrivelse av tidligere etablert strategi for å reproduserbart indusere hemogenesis i MEFs. Vi viser at innføring av et minimalt sett med TFS (Gata2, Gfi1b, cFos, og Etv6) er i stand til å sette i gang en kompleks utviklings program in vitro som gir en plattform der utviklings hematopoiesis og klinisk anvendelse av blodkreft omprogrammering kan bli ytterligere undersøkt 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Musecellelinjer er avledet følge retningslinjene fra Icahn School of Medicine ved Mount Sinai dyr omsorg, og bør gjøres i samsvar med enhver vertsinstitusjonen.

1. Mouse Embryonic fibroblast (MEF) Isolering av C57BL / 6 Mus

  1. Sett opp tidsbestemt parring 13. Når en vaginal plugg er visualisert, tenk på dette Dag 0,5.
  2. Skill plugget kvinner på pluggen dato og se på dem på dag 10-11 for å bekrefte graviditeten.
  3. På dag 13,5 til 14,5 avlive gravide hunnmus via CO 2 innånding fulgt ved halshugging.
  4. Sug gravid kvinne magen med 70% etanol, dissekere bukhulen med steril saks og pinsett ned midtlinjen, og kirurgisk fjerne livmor horn som inneholder embryoene 14. Ta ut embryoene forsiktig mens kutte av de resterende abdominal vev.
    MERK: Gjenopprette ca 8 embryoer med fire på hver side.
  5. Plasser livmor hOrns innehold embryoene i en 10 cm skål med 5-10 ml sterilt avkjølt fosfatbufret saltvann (PBS).
  6. Med steril saks og pinsett, gjør et snitt langs livmor horn for å isolere de blærer bærer embryoer. Overfør sekker til en ny 10 cm tallerken med 5-10 ml sterilt kjølt PBS og legg på is.
  7. Legg noen av sekker inn i en ny 10 cm tallerken med 5-10 ml steril kjølt PBS. Ved hjelp av steril saks og pinsett forsiktig kutte åpne sekker (uten å kutte for dypt) for å unngå piercing embryoene.
  8. Separer embryoer fra morkaken ved å kutte navlestrengen.
  9. Overfør embryoene til en ny 10 cm tallerken inneholder 5-10 ml kjølt PBS og la på is når du skal fylle de resterende disseksjoner.
  10. Halshogge embryoene bruker steril tang. Skjær forsiktig ned midtlinjen av embryo ved hjelp av steril saks og pinsett, med start fra halshugget området for å åpne opp magen. Posisjon tang under than innvendige organer (inkludert hjerte, lever og lunger) og skrape dem ut 15.
  11. Skjær de resterende vevet i små biter med saks og pinsett og overføring til en 50 ml konisk rør som inneholder 10 ml trypsin.
  12. Pipettes opp og ned med en 10 ml pipette 20-30 ganger for å blande og dissosiere vevet.
  13. Inkuber vev og trypsin blanding i et 37 ° C vannbad i 45 minutter, virvlende av og til.
  14. Pipet opp og ned med en 10 ml pipette i ca 5 minutter for å blande innholdet.
  15. Legg trypsinisert cellene 3 ganger volumet av standard Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 10 ug / ml penicillin / streptomycin (P / S), og 1 mM L-glutamin (L-GLUT) i 10 cm skåler (~ 10 ml) og kulturen ved 37 ° C inntil sammenflytende (ca. 2-4 dager). Kultur om 1-2 embryoer pr 10 cm tallerken.
    MERK: Freeze celler gang platene er konfluent. Frosne celler kan tines og passert 2 flere ganger. Cellene kan alternativt væredelt 2 ganger før frysing, og deretter enda en gang etter å ha blitt tint.

2. Viral Produksjon

  1. Utvide 293T-celler i 10 cm plater med 10 ml DMEM med 10% FBS, 1% P / S og 1% L-GLUT for transfeksjon.
    1. Trypsineres 293T-celler med 2 ml trypsin, Inkuber ved 37 ° C i 5 minutter, samle cellene inn i 15 ml rør, sentrifugering ved 300 xg, og platen hensiktsmessig (10 ml pr 10 cm skål).
  2. 24 timer før transfeksjon, splitte konfluent 10 cm plate av 293T celler 1: 6 og frø i 10 cm gelatin belagt (0,1% gelatin i PBS) plater.
    MERK: 4 plater per viruset vil være nødvendig.
    1. For å belegge platene i gelatin, legge til minst 2 ml av den 0,1% gelatinoppløsning for å belegge bunnen av 10 cm plater. Inkuber ved 37 ° C i minst 20 min. Sug av gelatin før tilsetning av celler til platene.
  3. I en 15 ml tube, tilsett 84 ug plasmid (f.eks Gata2, Gfi1b, cFos, eller Etv6 (sub-klonet inn i pFUW-Teto Vecteller 16) eller FUW-M2rtTA 17), 84 mikrogram psPAX2, og 42 mikrogram pMD2.G. Tilsett vann (H 2 O) for å gjøre opp volumet til 2 ml. Forbered en tube for hver faktor (f.eks. Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 og FUW-M2rtTA).
  4. Tilsett 250 ul av 2 M CaCl2 til hvert rør inneholdende 2 ml blanding bestående av 84 ug av det valgte genet (Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 eller FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H 2 O .
  5. Ved hjelp av en Pasteur-pipette inn i pipetten-hjelpemiddel, bobler slipper inn i 2,25 ml DNA + H2O + 2 M CaCl2-blanding. Ettersom boblene blir produsert ved å plassere spissen av en P1000 mot glasset pipette og langsomt støte ut 2 ml av 100 mM N, N-bis (2-hydroksyetyl) -2-aminoethansulfonsyre (BES) saltvann nedover Pasteur-pipette 1 ml om gangen.
  6. Inkuber alle rør i kultur hetten ved romtemperatur i minst 15 min.
    MERK: 4,25 ml blanding (nå DNA + H 2 O + 2M CaCl 2
  7. Som blandingen ruger, aspirer media utenfor 293T plater og legge til 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-glutamin + 25 nM klorokin.
    MERK: Dette mediet inneholder ikke P / S.
  8. Etter minst 15 min av inkubasjon (eller til å endre media på 293T celler), tilsett 4,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES saltblandingen slippe lurt til 293T celler, fordele jevnt over 4 celle plater per tube (dvs. litt mer enn 1 ml av blandingen per plate).
  9. Inkuber skålene over natten (O / N) ved 37 ° C.
  10. 24 timer etter inkubasjon, erstatte media på alle platene med 4 ml standard DMEM (se trinn 1.15).
  11. Hold celler i en 32 ° C inkubator fra nå av.
  12. 24 timer etter trinn 2.10, samle media i separate 50 ml rør. Bytt ut de innsamlede media fra hver plate med 4 ml standard DMEM.
    MERK: 4 plater per første rør blandingen resulterer i 16 ml av innsamlede media.
    1. ENfter 12 timers inkubasjon, samle media igjen i de samme 50 ml rør og erstatte med en annen 4 ml standard DMEM.
    2. Etter 12 timers inkubasjon, samle media og legge til de samme 50 ml rør.
      MERK: hvert rør skal nå inneholde ca 48 ml av medier som inneholder virus.
  13. Å konsentrere samlet viruset, første filteret de innsamlede media gjennom 0,45 lav-protein bindende filtre.
  14. Hell de filtrerte medier som inneholder virus til viruskonsentrasjon sentrifugerør (ca 16 ml om gangen).
  15. Sentrifugering ved 4000 xg ved 4 ° C i 25 minutter og fjern gjennomstrømning.
    MERK: Et lite volum av konsentrerte medier og viruset vil være synlig i filteret.
  16. Legge til ytterligere 16 ml filtrert virusholdig medium til den konsentrerte medium + viruset gjenværende volum i filteret og bland ved å snu røret.
  17. Spinnrøret igjen ved 4000 xg ved 4 ° C i 25 min og kaste gjennomstrømning.
  18. Legg rester filtrertsamling til den konsentrerte medium + virus volum igjen i filteret og bland ved å snu røret.
  19. Spinne en gang til ved 4000 xg ved 4 ° C i 10-20 minutter (avhengig av volumet i filteret) og sikre at det gjenværende volum av konsentrert medium + virus igjen i filteret er ca. 1 ml. Dersom den er større enn 1 ml konsentrert medium + virus forblir i filteret, spinn igjen ved 4000 xg i 1 min og gjenta til 1 ml blir igjen i filteret.
  20. Alikvoter 200 ul av den konsentrerte virus i 1,5 ml rør og fryse ved -80 ° C eller brukes umiddelbart.

3. MEF Omprogrammering

  1. Pre-coat 6 brønners-plater med 0,5 ml 0,1% gelatin i PBS per brønn, som sikrer at gelatin dekker hele området av brønnen. Plasser i en 37 ° C inkubator og inkuberes i minst 20 min. Etter inkubasjon fjerne platene og aspirer gelatin.
  2. Plate MEFs med standard DMEM i en tetthet på 25.000 celler per brønn (150.000 cellerper 6-brønn plate) på den gelatinerte seks-brønns plate (e) fra trinn 3.1 og tillat avsetning O / N i en 37 ° C inkubator.
  3. Forbered en 100 mL virus cocktail ved å blande 50 pl M2rtTA og de resterende 50 pl en blanding av Gata2, Gfi1b, cFos, og Etv6 (12,5 mL hver).
  4. Sug media fra MEFs og tilsett 2 ml standard DMEM med 8 mikrogram / ml hexadimethrine bromide.
  5. Transdusere hver brønn i MEF platene med 15 pl av viruset cocktail og inkuberes O / N ved 37 ° C.
    MERK: Dette er dag 0 av omprogrammering prosessen.
  6. På dag 1, etter 16-20 timers inkubasjon, erstatte media med 2 ml fersk standard DMEM supplert med 1 mg / ml DOX per brønn.
  7. Forbered blodkreft kultur media supplert med hydrokortison (10 -6 M), 100 ng / ml stamcellefaktor (SCF), 100 ng / ml Fms-relatert tyrosin kinase 3 ligand (Flt3L), 20 ng / ml interleukin-3 (IL- 3) 20 ng / ml interleukin-6 (IL-6), og 1 ug / ml DOX.
  8. På dag fire aspirate mediet fra hver brønn og vask cellene med 1 ml PBS per brønn.
  9. Aspirat PBS, dissosiere celler ved hjelp av 1 ml av 0,05% trypsin per brønn og samle cellene.
  10. Cellene telles med et hemocytometer, sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter, resuspendert i 12 ml av hematopoetiske media som er beskrevet i trinn 3.7 og platen 60.000 celler per seks-brønns plate på 0,1% gelatin-belagte plater (2 ml per brønn, 10.000 celler pr brønn ).
  11. Erstatte mediet med friskt supplert hematopoetiske vekstmedier hver 6. dag for varigheten av kulturen (35 til 36 dager).
  12. Analyser enten mellom celler eller nye blodkreft-lignende celler via immunofarging 12, FACS analyse 8,12, QRT-PCR 12, og mRNA sekvensering 12 for å bekrefte kjøpet av hemogenic endothelial eller HSC-lignende markører og genuttrykk.

4. Morkake aggregering og kolonidannende enhet (CFU) Analyser i Methylcellulose

  1. Dissekere placentas fra gravid C57BL / 6-mus som tidligere beskrevet 18 ved E12.5 og holder vev på is.
  2. For å starte placenta dissosiasjon 19, vask placenta-vev i 2-5 ml 0,2% kollagenase type I i PBS med 20% FBS og mekanisk dissosierer med en 18G nål montert i en 5 ml sprøyte ved aging placenta og PBS gjennom nålen i det minste 3 ganger.
  3. Etter mekanisk dissosiasjon, holde placenta cellene i 2-5 ml collagenase oppløsning ved 37 ° C i 1,5 timer.
  4. Passage celler gjennom 20-25 G kanyler montert på 5 ml sprøyter flere ganger for å ytterligere mekanisk distansere placenta cellene.
  5. Filter enkeltcellesuspensjoner gjennom 70 mikrometer celle siler.
  6. Telle celler med en hemocytometer og strålebehandling i 2000 cGy for mitotisk inaktive 20.
  7. Tilsett 10 ml av hematopoetiske kulturmedium supplert med 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, og 10 ng / ml trombopoietin (TPO) til en 10 cm matrett.
    MERK: DOX er ikke nødvendig på dette stadiet.
  8. Plasser en 0,65 mikrometer filter direkte på blodkreft kultur media i fatet, slik at det å flyte å skape en væske-gass-grensesnittet og sette parabolen til side.
  9. Dissosiere dag 25 transduserte MEFs (som stammer fra trinn 3.11) som beskrevet i trinnene 3.8-3.10 og bland 33000 av de transduserte MEFs med 167.000 celler av de placentale aggregatene fra trinn 4,6 (1: 6 ratio).
  10. For å generere et samlet ved 18,21, første spinn ned MEF og morkakeceller blanding fra trinn 4,9 i 5 minutter ved 300 x g. Aspirer media og resuspender pelleterte cellene i 30-50 mL av standard DMEM bruke en P200 pipette, tegning enkelt celle suspensjonen i 200 mL nonbevelled pipette.
  11. Tilstoppe pipettespissen med parafin film. Plassere den blokkerte spiss inn i et 15 ml sentrifugerør og spinne ned i 5 minutter ved 300 xg så en pellet skjemaer på dekket enden av spissen.
  12. Fjern spissen fra 15 ml tube nøye og stedspissen på enden av den P200 pipetten. Kast parafin film og ekstrudere cellepelleten på flytende filter fra trinn 4.8.
    MERK: Plate høyst 3 aggregater per filter.
  13. Kultur aggregatene på de flytende 0,65 mikrometer filtre for 4-5 dager i 37 ° C med 5% CO 2.
  14. Samle aggregatene (maksimalt 3 per filter) med en celleskrape, kombinere dem, og fordøye med 0,2% kollagenase, etter samme protokoll som gjøres med hele placentas å distansere cellene (trinn 4,2-4,5).
  15. Etter dissosiering, vask aggregatene med 2-5 ml PBS supplert med 5% FBS og spinne ned cellene ved 300 xg i 5 minutter.
  16. Suspender aggregatene i 500 mL av DMEM uten FBS, P / S, eller L-GLUT. Ta denne 500 mL resuspensjon og legge den til 3 ml 1% methylcellulose media supplert med 10 ng / ml TPO, nøye unngå dannelse av bobler. Plate like volumer av denne blanding i 3 35 x 10 mm ikke-behandlede kulturskåler forCFU-analysene 12.
  17. Som en kontroll kultur bestrålt placen aggregatene uten å blande inn omprogrammerte MEFs 4-5 dager og plasseres i CFU-analyser som beskrevet ovenfor i trinn 4.7-4.16.
    MERK: Disse aggregatene alene ikke danner kolonier.
  18. Telle hematopoietiske kolonier manuelt under mikroskopet etter 10-14 dagers dyrking ved 37 ° C med 5% CO2.
  19. Cytospin 22 plukket kolonier vise morfologiske fenotype av enkeltceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hematopoiesis er en kompleks utviklingsprosess som begynner i ulike embryonale nettsteder. Hemogenic endotelceller bor i disse områdene og gi opphav til HSCs via celle spirende 23. Denne prosessen foreløpig ikke kan reproduseres ved å plassere HSCs eller blodkreft forløpere i kultur, nødvendiggjør en metode for å liksom få disse cellene in vitro, enten ved HSPC utvidelse ex vivo eller generasjon de novo. Denne protokollen viser vår nye teknologier som forsøker å få tak i disse cellene via TF overekspresjon i MEFs.

Figur 1 illustrerer det generelle omprogrammering prosessen. Etter MEF generasjon og ekspansjon, blir cellene transduced med Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 og FUW-M2rtTA. Etter 3 dager med ekspansjon og eksponering for DOX å starte transgenet aktivering ble cellene dissosiert og delt på dag 4 på gelatin belagte plater ogdyrkes i supplert blodkreft media.

Etter lengre tids kultur post transduksjon med omprogrammering media, celler vedta klare morfologiske endringer. På dag 20 celler vedta endothelial morfologi forskjellig fra MEFs. Videre kultur til dag 35 resulterer i flere runde hematopoetiske-lignende celler som kommer ut av de endoteliale-lignende mellomprodukter som er GFP + (ved bruk av 34 / H2BGFP MEFs) og beis positivt for hematopoetiske markører Sca1 og CD45 (figur 2). Dette farging viser at disse cellene få fenotypiske markører som kan tyde på hemogenic induksjon. Videre kulturen resulterer i celler som uttrykker CD45 og samtidig opprettholde ekspresjon av huCD34 reporter. Ved morkake aggregering kultur celler vedta klonogene potensial og generere kolonier i metylcellulose inneholder ulike blodkreft morfologi og blast-lignende celler (figur 3).

ep-together.within-page = "1"> Figur 1
Figur 1: Strategi for hemogenic induksjon i MEFs. Diagram som illustrerer reprogrammerings-prosessen, og hvert trinn i den. Den generelle omprogrammering prosessen først omfatter MEF utvidelse, etterfulgt av splitting ved passende tetthet i gelatinbelagt 6-brønns plater. Cellene blir deretter omformet med cocktail av Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6, og FUW-M2rtTA. Cellene er videre dyrket med standard DMEM supplert med DOX. Ved dag 4 celler blir trypsinert og delt inn i 6-brønners plater. Hver 6 dager mediet endres og ved valgte tidspunkter celler kan bli analysert ved FACS, CFU, eller genekspresjon analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

belastning / 54372 / 54372fig2.jpg "/>
Figur 2: Induksjon av hematopoetiske celler dukker opp fra forløpere. Celler positive for 34 / H2BGFP farget for Sca1 og CD45 demonstrere induksjon av en hemogenic program. (A) Dette bildet viser en sammenslåing av celler farget for CD45 og Sca1 mens fluorescerende GFP med en underliggende lysfelt bilde av omprogrammeres celler. Bare et delsett av den flate cellepopulasjon uttrykker Sca1, en endothelial / hemogenic markør, og bare avrundede hematopoietiske-lignende celler som kommer ut fra disse cellene flekke rødt for CD45, en pan-hematopoetisk markør. (B) Dette bildet viser flekker og GFP fluorescerende celler uten lysfelt bildet, som viser nær tilknytning av CD45 + celler med Sca1 + celler. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 3: Generering av CD45 + hematopoetiske celler. (A) om 12,7% av 34 / H2BGFP MEFs transduced med Gata2, Gfi1b, cFos, og Etv6 er GFP + CD45 + etter 35 dager med omprogrammering. Klare myeloide morfologi og blast-lignende celler kan sees etter H & E farging (B) etter cytospin av CD45 + sorterte cellene belagt i metylcellulose i 10-14 dager. Dette viser klonal multilineage potensialet i omprogrammeres celler som vedtar blodkreft funksjon etter transduksjon med minimalt sett med TFS. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generering HSPCs de novo fra lett oppnåelige somatiske celler tilbyr en unik metode for å studere hematopoiesis in vitro, og muligheten til å potensielt bruke denne teknologien til det menneskelige systemet. Denne oversettelsen vil generere et nytt verktøy for å studere menneskelig hematologisk sykdom i en skål, samt gi narkotika testing plattformer og genet målretting muligheter til å behandle en rekke lidelser med nye terapeutiske eller HSC transplantasjoner. I feltet, har nyere studier utvidet på evnen til å generere HSPCs de novo, noe som viser viktigheten av flere trekk ved omprogrammering prosessen. Disse inkluderer valg av startcellepopulasjoner og TF cocktails, samt hvordan dyrkningsforhold (co-kultur nisje) og tilskudd (cytokiner, små molekyler, etc.) ha betydelig innvirkning på effektiviteten av omprogrammering 24-26. Flere studier søker omprogrammering teknologi til den menneskelige systemet uten å reise gjennomen pluripotent middels, 27,28 en uønsket skritt i disse prosessene.

Her er en protokoll som var den første til å generere HSC-lignende celler fra somatiske celler via en utviklingsprosess samtidig unngå bruk av pluripotency faktorer og dannelsen av pluripotente mellomprodukter. De genererte HSC-lignende celler synes å utvikle via en utviklingsprosess, først krever cellene til å reise gjennom en hemogenic endothelial mellom ligner en EHT. På Dag 20 av omprogrammering endothelial lignende mellom form som inneholder endotelceller og blodkreft genuttrykk profiler. HSC-lignende celler dukke opp fra disse mellomliggende cellene ved dag 35 som inneholder celleoverflate Immuno-fenotyper og genuttrykk profiler svært lik HSCs og kan produsere erytropoide og myeloide kolonier i CFU analyser. Dette tyder på at, i motsetning til de fleste andre studier, rekapitulerer dette omprogrammering protokollen en komplisert utviklingsprosess in vitro, og kan permdet videre studier av hematopoiesis og hematologisk sykdom prosesser som involverer embryonale hematopoiesis. Disse studiene tillate videre forskning på hvordan å behandle og kurere mange hematologiske lidelser som finnes, og hvordan du kan manipulere hematopoiesis til dette formål. Dette kan gjøres ved å fremkalle en hemogenic program i pasientspesifikke fibroblaster til å etablere in vitro sykdomsmodeller. Med disse modellene kan normalt og sykt hematopoiesis bli fint dissekert og undersøkt, så vel som utsatt for narkotika-skjermer og genet redigering for å behandle / riktige hematopoetiske defekter forbundet med lidelsen av interesse.

Ved hjelp av musen fibroblaster støtter ulike helsebringende kvaliteter av denne omprogrammering prosessen. De fibroblaster selv er lett å få tak i fra giver mus, noe som gjør cellen oppkjøpet enkel. Sette denne teknologien for mennesker vil derfor bare kreve pasient hudprøver, noe som gjør kjøpet av pasientspesifikke blodprodukter og påfølgende celle tesvi et levedyktig alternativ for hematologisk sykdom behandling. I tillegg fibroblaster er meget epigenetiske forskjellig fra hematopoetiske celler, noe som viser evnen til de valgte TF'er i denne omprogrammering protokollen til både epigenetiske undertrykke fibroblast identitet, og også for å sette i gang en hemogenic program ved å endre epigenetisk minne av utgangscellene 29,30. Selv om transplantasjonsstudier ennå ikke vise til full multilineage engraftment funksjonen til disse avledet celler, se om disse faktorene indusere en hemogenic program som genererer fullt funksjonelle hematopoetiske celler i menneske systemet vil være av stor interesse.

Flere trinn i denne protokollen kan bli modifisert i tilfelle problemer i løpet av omprogrammeringen, slik som antallet celler belagt før transduksjon og mengden av virus anvendes for transduksjon. Optimale resultater ble oppnådd ved å bruke 150.000 celler per seks-brønns plate (trinn 3.2) med den tidligere beskrevne volumet VIrus (trinn 3.3 og 3.5), men flere celler kan brukes i tilfelle av celledød ved eksponering for viruset. Likeledes kan mindre mengder virus benyttes bør celledød være et problem, så lenge reprogrammerings foregår som beskrevet (som kan kontrolleres via FACS-analyse, CFU-analyser, og genet profilering). Sikre at trinn 02.13 til 02.19 avkastning riktige mengder av viruset er nødvendig for å lykkes med resten av protokollen. Trinn 3.5 til 3.7 er også kritisk, er så vellykket transduksjon av celler avgjørende for indusering av dette hemogenic programmet. Den passende mengde av DOX per brønn av transduserte celler må holdes konsekvent og frisk for å sikre ekspresjon av transgener (noe som nødvendiggjør hyppige medie endringer). Selv om det ikke er absolutt nødvendig, kan cellekultur i mørket når du bruker DOX bidra til å hindre tap av DOX funksjon. Etter transduksjon, bør cellene overvåkes nøye under mikroskopet ved morfologi og analysert ved forskjellige analytiske metoder (slik som FACS og CFU-analyser) for å sikre sVellykket viral transduksjon og omprogrammering. Omprogrammeres celler kan ikke innta så mange morfologiske forandringer som ventet, noe som krever den tidligere nevnte analytiske metoder for å tjene som de beste indikatorene for riktig omprogrammering.

Nyere studier har benyttet ulike funksjonene i denne omprogrammering protokoll, for eksempel Gata2 i TF cocktail eller fibroblaster som startcellepopulasjonen 31-33. Disse metoder synes også å indusere utviklingsprogrammene under omprogrammering prosessen. Andre strategier har vist betydningen av blodkreft nisje under omprogrammere 9,10,25,26. Identifisere alle faktorene som bistår i omprogrammering vil være avgjørende for å utvikle protokollen som genererer bona fide HSCs fra lett oppnåelige pasientspesifikke celler. I sammendraget, her beskriver vi en strategi for å generere HSC-lignende celler fra en indusert utviklingsprosess i musefibroblastere via induserbare Gata2, Gfi1b, cFos, ogEtv6 overekspresjon. Denne teknologien vil bli oversatt til det menneskelige system, hvor det i kombinasjon med andre publiserte studier, vil tillate generering av pasient-spesifikke blodprodukter er egnet for en rekke kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Tags

Developmental Biology fibroblaster hematopoiesis stamcelle omprogrammering transkripsjonsfaktorer celle skjebne konvertering hemogenesis
Omprogrammering mus embryonale Fibroblaster med transkripsjonsfaktorer for å indusere en Hemogenic Program
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, M. G., Pereira, C. F.,… More

Daniel, M. G., Pereira, C. F., Bernitz, J. M., Lemischka, I. R., Moore, K. Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program. J. Vis. Exp. (118), e54372, doi:10.3791/54372 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter