Introduction
A hematopoiese é um processo complexo de desenvolvimento em que as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) brotam endotélio hegemônicos presente numa variedade de sítios hematopoiéticas embrionárias, tais como a aorta-gônadas-Mesonefros e da placenta 1,2. A incapacidade de cultura hsc in vitro evita a análise em profundidade deste processo, bem como a aplicação clínica destes estudos. Para ultrapassar esta limitação, estudos anteriores têm tentado derivar HSCs de novo, quer por meio de diferenciação das células estaminais pluripotentes (PSCs) 3, ou plasticidade induzida em células somáticas e diferenciação dirigida utilizando meios de reprogramação 4,5. Estes estudos, no entanto, não geram células engraftable clinicamente seguras ou permitir o estudo da hematopoiese desenvolvimento definitivo "em um prato."
O romance de trabalho estabelecido por Yamanaka e seus colegas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos somática pferece um quadro de fator de transcrição (TF) estratégias superexpressão baseados em célula destino reprogramação 6,7. Este trabalho levou os pesquisadores em vários campos para gerar tipos de células de escolha através de TF reprogramação de células somáticas de fácil obtenção. O objetivo da estratégia de reprogramação descrito aqui é para induzir um processo hegemônicos a partir de células somáticas de rato usando uma abordagem de reprogramação TF base com o objetivo de traduzir esses achados para o sistema humano para reprogramar fibroblastos específicos do paciente, a fim de estudar hematopoiese humana in vitro e gerar produtos derivados de sangue específicos do paciente para a modelagem de doenças, testes de drogas e transplante de células estaminais.
O primeiro passo para assegurar reprogramação adequada neste sistema de ratinho foi desenvolver uma linha repórter que serviu como uma leitura para a expressão de CD34, um marcador conhecido nas células progenitoras endoteliais e HSCs. Para fazer isso, as linhagens de camundongos transgênicos huCD34-tTA e TetO-H2BGFP foram usadas para generate rato transgénico fibroblastos embrionários duplos (MEFs), agora denotado 34 / H2BGFP, que apresentam fluorescência verde após a ativação do promotor CD34 8. Isto permitiu o rastreio de uma variedade de TFs conhecidos que sejam necessários em diferentes pontos durante a especificação e desenvolvimento hematopoiético. Começando com 18 TFs em PMX vetores retrovial (determinado através da mineração literatura e profiling de etiqueta GFP manter HSCs do descrito anteriormente 34 / H2BGFP ratos), 34 / H2BGFP MEFs foram transduzidas com todos os factores e cultivadas em AFT024 HSC-apoiando células estromais. Após a detecção de 34 / H2BGFP ativação, TFs foram posteriormente removido do cocktail reprogramação até o melhor conjunto de TFs para ativação repórter foi identificado. Após esta primeira tela, os factores foram transferidos para um sistema de vector indutível pFUW DOX para permitir a expressão controlável de TFS. Uma vez que estes dois sistemas controláveis DOX são incompatíveis (34 células / H2BGFP e os vectores indutíveis pFUW), MEFs deDe tipo selvagem C57BL / 6 murganhos foram necessários. Foi também necessário para proporcionar um microambiente adequado permitir hemogenesis para prosseguir e criar progenitores clonog�icas multilinhagem.
Os estudos atuais que tentam reprogramar células somáticas em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (hspCs) reuniram-se níveis variados de sucesso 9-11. Até à data, a geração de ambos rato transplantáveis e hspCs humanos com a longo prazo e capacidade de repovoamento auto-renovação não foi alcançado utilizando o mesmo conjunto de FT. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição detalhada da estratégia previamente estabelecido para induzir reproducibly hemogenesis em MEFs. Nós demonstramos que a introdução de um conjunto mínimo de TFs (GATA2, Gfi1b, CFOs e ETV6) é capaz de instigar um programa complexo de desenvolvimento in vitro que fornece uma plataforma através da qual hematopoiese desenvolvimento e aplicação clínica de reprogramação hematopoiéticas podem ser mais bem estudadas 12.
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Protocol
declaração de ética: linhas de células do rato são derivados seguindo as orientações de cuidados de animais da Icahn Escola de Medicina Monte Sinai, e deve ser feito em conformidade com qualquer instituição de acolhimento.
1. rato embrionário de fibroblastos (MEF) Isolamento de ratinhos C57BL / 6
- Configurar o acasalamento cronometrado 13. Uma vez que um plug vaginal é visualizado, considerar este dia 0,5.
- Separar as fêmeas ligados na data plugue e consultá-los no dia 10-11 para confirmar a gravidez.
- No Dia 13,5-14,5 eutanásia ratos fêmeas grávidas via inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical.
- Mergulhe abdome da fêmea grávida de 70% de etanol, dissecar a cavidade abdominal com uma tesoura esterilizada e pinças para baixo da linha média, e remover cirurgicamente os cornos uterinos contendo os embriões 14. Retire os embriões delicadamente enquanto o corte do tecido abdominal restante.
NOTA: Recuperar cerca de 8 embriões com 4 em cada lado. - Coloque o útero hORNs contendo os embriões numa placa de 10 centímetros, com 5-10 ml de fosfato estéril tamponada gelada solução salina (PBS).
- Com tesouras e pinças esterilizadas, fazer uma incisão ao longo dos cornos uterinos para isolar os sacos que transportam os embriões. Transferir os sacos para uma nova placa de 10 cm com 5-10 ml de PBS estéril refrigerados e colocar em gelo.
- Coloque alguns dos sacos para uma nova placa de 10 cm com 5-10 ml de PBS estéril gelada. Com uma tesoura e uma pinça estéril delicadamente cortados abertos os sacos (sem cortar muito profundo), a fim de evitar a perfuração dos embriões.
- Separa-se os embriões a partir da placenta, cortando o cordão umbilical.
- Transferir os embriões para um novo prato de 10 cm, que inclua 5-10 ml de PBS refrigerados e deixar em gelo ao completar as dissecações restantes.
- Decapitar os embriões usando uma pinça estéril. Cuidadosamente cortar a linha média do embrião usando tesouras e pinças esterilizadas, a partir da área decapitado de abrir o abdômen. Posição forceps baixo tele órgãos viscerais (incluindo o coração, fígado, pulmões e) e raspe-los para fora 15.
- Corte o tecido restante em pequenos pedaços com uma tesoura e pinça e transferência para um tubo cônico de 50 ml contendo 10 ml de tripsina.
- Pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL 20-30 vezes para misturar e dissociar o tecido.
- Incubar a mistura de tecido e tripsina num banho de água a 37 ° C durante 45 min, agitando ocasionalmente.
- Pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL durante cerca de 5 minutos para misturar os conteúdos.
- Adicionar células tripsinizadas a 3X volume de padrão de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com soro bovino fetal a 10% (FBS), 10 ug / mL de penicilina / estreptomicina (P / S), e 1 mM de L-glutamina (G-GLUT) em placas de 10 cm (~ 10 mL) e a cultura a 37 ° C até à confluência (aproximadamente 2-4 dias). Cultura sobre 1-2 embriões por placa de 10 cm.
NOTA: células congelar depois de placas são confluentes. As células congeladas podem ser descongeladas e passadas mais 2 vezes. As células podem ser alternativamentedividir 2 vezes antes da congelação, e então mais uma vez depois de ter sido descongelado.
2. produção virai
- Expandir células 293T em placas de 10 cm com 10 ml de DMEM com 10% de FBS, 1% de P / S, e 1% de L-GLUT para transfecção.
- Tripsinizar as células 293T com 2 ml de tripsina, incuba-se a 37 ° C durante 5 min, recolher as células em tubos de 15 ml, rotação a 300 xg, e placa de forma adequada (10 ml por placa de 10 cm).
- 24 h antes da transfecção, dividir confluentes placa de 10 cm de células 293T 1: 6 e 10 centímetros em sementes revestidas com gelatina (0,1% de gelatina em PBS) placas.
NOTA: 4 placas por vírus será necessário.- Para placas de revestimento em gelatina, adicionar, pelo menos, 2 ml de solução de gelatina a 0,1% para revestir o fundo de placas de 10 cm. Incubar a 37 ° C durante pelo menos 20 min. Aspirar fora gelatina antes da adição de células nas placas.
- Num tubo de 15 ml, adicionar 84 ug de plasmídeo (por exemplo GATA2, Gfi1b, cFos, ou ETV6 (sub-clonado no vect pFUW-TetOou 16) ou FUW-M2rtTA 17), psPAX2 84 ug, 42 ug e pMD2.G. Adicionar água (H 2 O) para compensar o volume de 2 ml. Prepare um tubo para cada fator (por exemplo. GATA2, Gfi1b, CFOs, ETV6 e FUW-M2rtTA).
- Adicionar 250 ul de CaCl2 2M a cada tubo contendo a mistura de 2 ml de composto de 84 ug do gene escolhido (GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 ou FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H2O .
- Usando uma pipeta de Pasteur inserido na pipeta-ajuda, a libertação das bolhas na 2.25 ml de ADN + H 2 O + H 2 2 CaCl mistura. À medida que as bolhas estão a ser produzido, coloque a ponta de uma pipeta P1000 contra o vidro e, lentamente, 2 ml de ejectar mM 100 N, N-bis (2-hidroxietil) -2-aminoetano salina ácido sulfónico (BES) para baixo a uma pipeta de Pasteur ml de cada vez.
- Incubar todos os tubos na capa de cultura à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min.
NOTA: A 4,25 ml de uma mistura (agora ADN + H2O + 2M CaCl2 - À medida que a mistura de incubação, meios aspirado em pratos de 293T e adicionar 10 ml de DMEM + 10% de FBS + 1 mM de L-glutamina + 25 nM de cloroquina.
NOTA: Esta mídia não contém P / S. - Após pelo menos 15 min de incubação (ou até mudar o media em células 293T), adicionar a 4,25 mL de ADN + H2O + 2 M de CaCl2 BES + mistura de solução salina, gota a gota às células 293T, distribuindo uniformemente por 4 placas de células por tubo (ou seja, ligeiramente mais do que 1 ml da mistura por placa).
- Incubar as placas durante a noite (O / N) a 37 ° C.
- 24 horas após a incubação, substituir a mídia em todas as placas com 4 ml DMEM padrão (veja o passo 1.15).
- Manter as células em uma incubadora de 32 ° C a partir de agora.
- 24 horas após a etapa 2.10, recolher mídia em separado tubos de 50 ml. Substitua o material coletado de cada placa com 4 ml de DMEM padrão.
NOTA: 4 placas por resultados iniciais mistura tubo em 16 ml de meio recolhidos.- UMAepois de 12 horas de incubação, recolher mídia novamente nos mesmos tubos de 50 ml e substituir com mais 4 ml de DMEM padrão.
- Após 12 horas de incubação, recolher os meios de comunicação e adicione aos mesmos tubos de 50 ml.
NOTA: cada tubo agora deve conter cerca de 48 ml de meios contendo vírus.
- Para concentrar o vírus coletadas, primeiro filtro da mídia recolhidos através 0,45 filtros de ligação de baixa proteína.
- Despeje a mídia filtrados contendo vírus em virais tubos concentração centrífuga (cerca de 16 ml de cada vez).
- Centrifugação a 4000 xg, a 4 ° C durante 25 min e remover escoamento.
NOTA: Um pequeno volume de meios concentrados e vírus será visível no filtro. - Adicionar mais 16 ml de meios contendo vírus filtrou-se para o volume de suporte + vírus concentrado remanescente no filtro e misturar por inversão do tubo.
- tubo de centrifugação de novo a 4000 xg, a 4 ° C durante 25 min e descarte de fluxo.
- Adicionar restantes filtradacoleção para a mídia + volume de vírus concentrado deixado no filtro e misture invertendo o tubo.
- Girar mais uma vez a 4000 xg, a 4 ° C durante 10-20 minutos (dependendo do volume no filtro) e assegurar que o volume restante de meio concentrado + vírus deixado no filtro é de cerca de 1 ml. Se for maior do que 1 ml de meio concentrado + vírus permanece no filtro, girar novamente a 4.000 xg durante 1 min e repetir até 1 ml é deixado no filtro.
- Alíquota de 200 ul do vírus concentrado em tubos de 1,5 ml e congelamento a -80 ° C ou utilizar imediatamente.
3. Reprogramação MEF
- Pré-revestimento 6 bem-placas com 0,5 ml de 0,1% de gelatina em PBS por poço, assegurando que a gelatina cobre toda a área do poço. Colocar numa incubadora a 37 ° C e incubar durante pelo menos 20 min. Após a incubação, as placas de remover e aspirar a gelatina.
- MEFs placa com DMEM padrão a uma densidade de 25.000 células por poço (150.000 célulaspor placa de 6 poços) na placa de 6 poços gelatinizado (s) a partir do passo 3.1 e deixa-se repousar O / N em uma temperatura de 37 ° C incubadora.
- Preparar um cocktail de vírus de 100 ul por mistura de 50 ul M2rtTA e os restantes 50 ul de uma mistura de GATA2, Gfi1b, cFos, e ETV6 (12,5 ul cada).
- media aspirado de MEFs e adicionar 2 mL DMEM padrão com / ml de brometo de Hexadimetrina 8 mg.
- Transduzir cada poço das placas de MEF com 15 ul de coquetel de vírus e incubar O / N a 37 ° C.
NOTA: Este é o Dia 0 do processo de reprogramação. - No dia 1, após 16-20 h de incubação, à substituição de suportes com 2 ml de DMEM fresco suplementado com padrão de 1 ug / ml de DOX por poço.
- Preparar meios de cultura hematopoiética suplementado com hidrocortisona (10 -6 M), 100 ng / ml de factor de células estaminais (SCF), 100 ng / ml de tirosina-quinase 3 de ligando FMS-relacionados (Flt3L), 20 ng / ml de interleucina-3 (IL- 3), 20 ng / mL de interleucina-6 (IL-6), e 1 ug / ml de DOX.
- No Dia 4 aspirate meios de comunicação de cada poço e lavar as células com 1 ml de PBS por poço.
- Aspirar PBS, dissociar as células com 1 ml de tripsina a 0,05% por poço e recolher as células.
- Contar as células com um hemocitómetro, centrifugação a 300 xg durante 5 min, ressuspender em 12 ml de meio hematopoiéticas descrito no passo 3.7 e placa 60.000 células por placa de 6 poços em placas revestidas com gelatina a 0,1% (2 ml por poço, 10.000 células por poço ).
- Substituir meios com meio de cultura fresco suplementado hematopoiéticas cada 6 dias durante a duração da cultura (35 a 36 dias).
- Analisar a utilização de células intermédios ou células hematopoiéticas-like emergentes através de imuno-coloração 12, a análise FACS 8,12, qRT-PCR 12, e mRNA sequenciamento 12 para confirmar a aquisição de endotelial hegemônicos ou marcadores HSC-like e expressão gênica.
4. unidade de formação (UFC) Ensaios Placentário agregação e Colony em metilcelulose
- Dissecar placentas de C5 grávida7BL / 6 ratinhos como previamente descrito 18 em E12.5 e manter o tecido em gelo.
- Para iniciar placenta dissociação 19, lavar tecido placentário em 2-5 mL de 0,2% de colagenase de tipo I, em PBS com FBS a 20% e mecanicamente dissociar com uma agulha 18G montada numa seringa de 5 ml por passagem da placenta e PBS através da agulha, pelo menos Três vezes.
- Após dissociação mecânica, manter as células da placenta em 2-5 ml de solução de colagenase a 37 ° C durante 1,5 h.
- células passagem por 20-25 agulhas G montado em 5 ml seringas várias vezes para mais mecanicamente dissociar as células da placenta.
- Filtrar suspensões de células individuais através de 70 mm filtros celulares.
- Contagem de células com um hemocitómetro e irradiar a 2.000 cGy para a inativação mitótico 20.
- Adicionam-se 10 ml de meio de cultura hematopoiética suplementado com 100 ng / mL de SCF, com 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, e 10 ng / ml de trombopoietina (TPO) com 10 cm prato.
NOTA: DOX não é necessária nesta fase. - Colocar um filtro de 0,65 uM directamente em meios de cultura hematopoiética no prato, permitindo-lhe flutuar para criar uma interface líquido-gás e ajustar o prato de lado.
- Dissociar dia 25 MEFs transduzidas (derivadas do passo 3.11) como descrito nas etapas 3.8-3.10 e misturar 33000 dos MEFs transduzidas com 167.000 células dos agregados da placenta a partir do passo 4.6 (1: 6, razão).
- Para gerar um agregado 18,21, primeiro giro para baixo do MEF e mix de células da placenta a partir do passo 4.9 por 5 min a 300 x g. Aspirar a mídia e ressuspender as células sedimentadas em 30-50 ul de DMEM padrão, utilizando uma pipeta P200, chamando a suspensão única célula na 200 mL nonbevelled ponta da pipeta.
- Ocluir a ponta da pipeta com a película de parafina. Colocar a ponta bloqueados para um tubo de centrífuga de 15 ml e girar durante 5 minutos a 300 xg de modo forma-se uma pelota no final coberto da ponta.
- Remova a ponta do tubo de 15 ml com cuidado e lugara ponta na extremidade da pipeta P200. Descartar o filme de parafina e extrudir o sedimento de células sobre o filtro flutuante a partir do passo 4.8.
NOTA: A placa, no máximo, 3 agregados por filtro. - Cultura os agregados que flutuam sobre os filtros de 0,65 | iM durante 4-5 dias em 37 ° C com 5% de CO 2.
- Recolher os agregados (no máximo 3 por filtro) com um raspador de células, combiná-los, e digest com 0,2% de colagenase, seguindo o mesmo protocolo, como feito com o conjunto da placenta para dissociar as células (passos 4,2-4,5).
- Após a dissociação, lavar os agregados com 2-5 ml de PBS suplementado com 5% de FBS e gire as células a 300 xg durante 5 min.
- Ressuspender as agregados em 500 ul de DMEM sem FBS, P / S, ou L-GLUT. Aqui esta ressuspensão e 500 ul de adicioná-lo aos 3 ml de 1% de meio de metilcelulose suplementado com 10 ng / ml de TPO, evitando-se cuidadosamente a formação de bolhas. volumes iguais placa desta mistura em placas de cultura de 3 35 x 10 mm não-tratada paraCFU ensaia 12.
- Como controle, a cultura irradiada agregados da placenta sem misturar em MEFs reprogramadas 4-5 dias e coloque em ensaios CFU como descrito acima nos passos 4.7-4.16.
NOTA: Estes agregados por si só não formam colônias. - Contagem das colónias hematopoiéticas manualmente ao microscópio após 10-14 dias de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Cytospin 22 pegou colônias para mostrar fenótipo morfológico de células individuais.
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Representative Results
A hematopoiese é um processo de desenvolvimento complexo que começa em vários locais embrionárias. Células endoteliais hegemônicos residem nestes locais e dar origem a HSCs via celular brotamento 23. Este processo actualmente não pode ser reproduzido pela colocação de HSCs ou precursores hematopoiéticos em cultura, que necessitam de uma metodologia para a obtenção de alguma forma destas células in vitro, quer por HSPC expansão ex vivo ou geração de novo. Este protocolo demonstra a nossa nova tecnologia que tenta obter estas células através de TF superexpressão em MEFs.
A Figura 1 ilustra o processo geral de reprogramação. Após a geração e expansão MEF, as células são transduzidas com GATA2, Gfi1b, CFOs, ETV6 e FUW-M2rtTA. Depois de 3 dias de exposição a expansão e a DOX para iniciar a activação do transgene, as células são dissociadas e dividida no dia 4 em placas revestidas com gelatina ecultivadas em meios hematopoiéticas suplementado.
Na sequência prolongada de transdução de cultura pós com a mídia de reprogramação, as células adoptar alterações morfológicas claras. No dia 20 as células endoteliais adoptar morfologia distinta da MEFs. Além disso a cultura Dia 35 resulta em várias células hematopoiéticas redondos-emergentes como a partir dos intermediários endoteliais semelhantes que são GFP + (quando se utiliza o 34 / H2BGFP MEFs) e mancha positiva para o Sca1 marcadores CD45 e hematopoiéticas (Figura 2). Esta coloração demonstra que estas células de ganho marcadores fenotípicos sugestivos de indução hegemônicos. Além disso cultura resulta em células que expressam CD45, mantendo a expressão do repórter huCD34. Após a cultura de células de agregação placentária adoptar potencial clonogénico e gerar colónias em metilcelulose contendo várias morfologias hematopoiéticas e células blásticas semelhante (Figura 3).
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Figura 1: Estratégia para a indução hegemônicos em MEFs. Diagrama que ilustra o processo de reprogramação e cada passo no seu interior. O processo de reprogramação geral primeira envolve a expansão do MEF, seguido de divisão na densidade adequada em placas de 6 poços revestidos com gelatina. As células são então transduzidas com o coquetel de GATA2, Gfi1b, CFOs, ETV6 e FUW-M2rtTA. As células são ainda cultivadas com DMEM normal suplementado com DOX. No dia 4 as células são tratadas com tripsina e divididas em placas de 6 poços. Cada meios de comunicação 6 dias é alterada e em pontos de tempo escolhidas células podem ser analisadas por FACS, CFU, ou ensaios de expressão de genes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2: Indução de células hematopoiéticas a partir de precursores emergentes. Células positivas para 34 / H2BGFP coradas para Sca1 e CD45 demonstram a indução de um programa hegemônicos. (A) Esta imagem mostra uma fusão de células coradas para CD45 e Sca1 enquanto fluorescente GFP uma imagem de campo claro subjacente das células reprogramadas com. Apenas um subconjunto de população de células plana expressa Sca1, um endotelial / marcador hegemônicos, e apenas arredondado células hematopoiéticas-emergentes como a partir destas células mancha vermelha para CD45, um marcador pan-hematopoiético. (B) Esta imagem mostra as células marcadas e fluorescentes GFP sem a imagem de campo claro, mostrando claramente estreita associação de células CD45 + com o Sca1 + células. Barra de escala = 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Geração de células CD45 + hematopoiéticas. (A) cerca de 12,7% de 34 / H2BGFP MEFs transduzidas com GATA2, Gfi1b, CFOs e ETV6 são GFP + CD45 + após 35 dias de reprogramação. Morfologias mielóides claras e células blásticas-como pode ser visto após coloração H & E (B) após citocentrifugação de CD45 + células classificadas banhados em metilcelulose por 10-14 dias. Isso demonstra o potencial multilinhagens clonal das células reprogramadas que adotam função hematopoiética após a transdução com este conjunto mínimo de TFs. Barra de escala = 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Gerando hspCs de novo a partir de células somáticas facilmente atingíveis oferece um método único para estudar a hematopoiese in vitro, e a oportunidade para potencialmente aplicar esta tecnologia para o sistema humano. Esta tradução iria gerar uma nova ferramenta para o estudo da doença hematológica humano em um prato, bem como fornecer plataformas de teste de drogas e direccionamento de genes oportunidades para o tratamento de numerosas desordens com novos agentes terapêuticos ou de transplante HSC. No campo, os estudos recentes têm expandido sobre a capacidade de gerar hspCs de novo, o que demonstra a importância de várias características do processo de reprogramação. Estes incluem a escolha de populações de células de partida e cocktails TF, bem como a forma como as condições de cultura (co-cultura) de nicho e suplementação (citocinas, moléculas pequenas, etc.) impactar significativamente a eficiência de reprogramação 24-26. Vários estudos estão aplicando a tecnologia de reprogramação para o sistema humano sem passar porA, 27,28 indesejável um passo intermediário pluripotentes nestes processos.
Aqui é um protocolo que foi o primeiro a gerar células-HSC como a partir de células somáticas através de um processo de desenvolvimento enquanto se evita a utilização de factores de pluripotência e a formação de intermediários pluripotentes. As células HSC-como gerados parecem desenvolver através de um processo de desenvolvimento, em primeiro lugar as células exigindo a viajar por um hegemônicos intermédia semelhante a um EHT endotelial. No dia 20 de reprogramação forma endoteliais-como intermediários que contêm perfis de expressão gênica endoteliais e hematopoiéticas. células HSC semelhantes surgem a partir destas células intermédias no dia 35 que contêm superfície celular imuno-fenótipos e perfis de expressão de genes altamente semelhantes a HSCs e pode produzir colónias eritróides e mielóides em ensaios de CFU. Isto sugere que, ao contrário da maioria dos outros estudos, este protocolo reprogramação recapitula um processo complexo de desenvolvimento in vitro, e pode permainda mais estudo de processos de hematopoiese e doença hematológica que envolvem a hematopoiese embrionária. Estes estudos permitem mais pesquisas sobre como tratar e curar a multidão de doenças hematológicas que existem, e como manipular hematopoiese para esse fim. Isto pode ser feito através da indução de um programa hegemônicos em fibroblastos específicos do paciente para estabelecer em modelos de doenças in vitro. Com estes modelos, a hematopoiese normal e doente pode ser finamente dissecados e estudados, bem como sujeita a telas de drogas e de edição de genes para o tratamento de defeitos hematopoiéticas / correcção associados com a doença de interesse.
Usando fibroblastos de rato suporta várias qualidades benéficas deste processo de reprogramação. Os próprios fibroblastos são fáceis de obter a partir de ratos doadores, tornando a aquisição de células simples. Traduzindo essa tecnologia para os humanos, portanto, só necessitam de amostras de pele do paciente, tornando a aquisição de produtos sanguíneos específicos do paciente e subsequente te celularpicar uma opção viável para o tratamento da doença hematológica. Além disso, os fibroblastos são muito epigeneticamente distinta a partir de células hematopoiéticas, demonstrando a capacidade dos TFs escolhidos neste protocolo de reprogramação para tanto a identidade de fibroblastos epigeneticamente repress, e também para instigar um programa hegemônicos alterando a memória epigenética das células a partir 29,30. Embora os estudos de transplante ainda não demonstraram função de enxerto multilinhagens completa dessas células derivadas, vendo se esses fatores induzem um programa hegemônicos que gera células hematopoiéticas totalmente funcionais no sistema humano será de grande interesse.
Vários passos dentro deste protocolo pode ser modificado em caso de dificuldade durante a reprogramação, tais como o número de células plaqueadas antes da transdução e a quantidade de vírus utilizada para a transdução. os melhores resultados foram vistos usando 150.000 células por 6 bem-placa (passo 3.2) com o volume descrito anteriormente de virus (passos 3.3 e 3.5), mas mais células pode ser utilizado em caso de morte celular após exposição ao vírus. Do mesmo modo, os volumes mais pequenos do vírus pode ser utilizada morte celular deve ser um problema, desde que reprogramação prossegue como descrito (que pode ser verificado através de análise de FACS, ensaios de CFU, e perfil genético). Assegurar que os passos 2,13-2,19 originar quantidades adequadas de vírus é necessária para o sucesso do resto do protocolo. Passos 3,5-3,7 também são fundamentais, transdução tão bem sucedido de células é crucial para induzir este programa hegemônicos. A quantidade apropriada de DOX por poço de células transduzidas devem ser mantidos consistentes e fresco para assegurar a expressão dos transgenes (necessitando, portanto, as mudanças frequentes do suporte). Embora não seja absolutamente necessário, cultura de células no escuro quando usando DOX pode ajudar a prevenir a perda da função DOX. Depois de transdução, as células devem ser cuidadosamente monitorizados sob o microscópio pela morfologia e analisadas por vários métodos analíticos (tais como FACS e ensaios CFU) para garantir stransdução viral uccessful e reprogramação. células reprogramadas não podem adoptar como muitas alterações morfológicas como esperado, exigindo que os métodos analíticos mencionados anteriormente para servir como os melhores indicadores de reprogramação adequada.
Estudos recentes têm utilizado diferentes características deste protocolo de reprogramação, como GATA2 no coquetel TF ou fibroblastos como a população de células de partida 31-33. Estas metodologias também parecem induzir programas de desenvolvimento durante o processo de reprogramação. Outras estratégias têm mostrado a importância do nicho hematopoiético durante a reprogramação 9,10,25,26. Identificar todos os fatores que auxiliam na reprogramação será essencial para desenvolver o protocolo que gera HSCs bona fide de células facilmente atingíveis específicos do paciente. Em resumo, aqui descrevemos uma estratégia para gerar células HSC-como de um processo de desenvolvimento induzida em fibroblastos de rato através de inducible GATA2, Gfi1b, CFOs, esuperexpressão ETV6. Esta tecnologia irá ser traduzido para o sistema humano, em que, em combinação com outros estudos publicados, vai permitir a geração de produtos derivados do sangue específicos do paciente adequado para uma variedade de aplicações clínicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45 μM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18 G needles | BD | 305195 | |
| 20 G needles | BD | 305175 | |
| 25 G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65 μM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 mm x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
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