Summary
Den enzymatiske aktivitet af laktase er afgørende for kataboliske behandling af disaccharid laktose. Her, er aktiviteten af laktase findes i kosttilskud analyseret ved hjælp af en kolorimetrisk assay. Dette giver de studerende med en eksperimentel platform for at forstå aktiviteten af laktase og enzym kinetik.
Abstract
Forstå, hvordan enzymer fungerer, og vedrørende det virkelige liv eksempler, er afgørende for en bred vifte af bachelor-grad i de biologiske og biomedicinske videnskaber. Denne nemme at følge protokol blev udviklet for første års bachelor farmaci studerende og giver en entry-level Introduktion til enzym reaktioner og analytiske procedurer for enzymet analyse. Enzym valg er laktase, som dette repræsenterer et eksempel på et kommercielt tilgængelige enzym relevante til menneskers sygdom og medicinalindustrien praksis. Laktase er udvundet fra kosttilskud tabletter, og vurderes ved hjælp af en kolorimetrisk analysen baseret på hydrolyse af et kunstigt substrat for laktase (ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Frigivelse af ortho-nitrofenol efter ONPG hydrolytisk spaltning af laktase er målt ved en ændring af absorbansen ved 420 nm, og effekten af temperaturen på enzymatisk reaktion er evalueret ved at udføre reaktion på is, ved stuetemperatur og 37 ° C. Mere avancerede analyser kan gennemføres ved hjælp af denne protokol ved vurdering af enzymaktivitet under forskellige forhold og ved hjælp af forskellige reagenser.
Introduction
Enzymer er en specialiseret type protein, der fungerer som biologiske katalysatorer til kemiske reaktioner i levende organismer1. Handlingen af enzymer er afgørende for liv, giver energi, bortskaffelse af affald og at tillade organismer til at fungere. Forståelse enzymer er derfor afgørende for en fuld forståelse af livet. Denne viden er afgørende for en lang række Universitet niveau uddannelser, lige fra de medicinske videnskaber til biologi. Mens en detaljeret baggrund spænder fra principperne for katalyse til teoretiske modeller af enzymaktivitet kan gives til studerende ved hjælp af foredrag og læsestof, forstod egenskaberne af enzymet reaktioner bedst af hænder på praktiske erfaringer med enzymer i aktion som tidligere påvist2. Denne protokol giver en enkel at følge eksperimentelle paradigme til måling af enzymaktiviteten under laboratorieforhold, ved hjælp af laktase som et eksempel på et enzym med en aktivitet, der er relevante for human ernæring og sundhed.
Glycosidic hydrolase laktase (EF 3.2.1.23/26) er et enzym af centrale ernæringsmæssige vigtigheden for pattedyr3. Aktiviteten af laktase er meget bevaret gennem evolution, og stammer fra beta-galactosidase familie af enzymer, — en familie stede fra Escherichia coli gennem at Homo sapiens (figur 1, foreløbige budgetforslag 1JZ8)4. Den afgørende betydning af laktase i en menneskelig ernæringsmæssige indstilling stammer fra sin rolle i at tillade nedbrydningen af laktose i sit konstituerende monosakkarid komponenter, som derefter kan bruges til at generere energi i kroppen. Laktase katalyserer hydrolyse af glykosidbindinger i disaccharid laktose, frigive galactose og glucose (figur 2)5. Disse monosakkarider er derefter anvendes primært til generation af adenosin trifosfat (ATP) via citronsyrecyklus og oxidativ fosforylering6. I nyfødte og spædbørn udvikling, er laktase stærkt udtrykt i det menneskelige fordøjelsessystem, nedbryde laktose modtaget fra modermælk som laktose er den primære kulhydrat komponent, og en af de vigtigste kilder til ernæring under tidlige år 7. medicinsk betydningen af laktase er fremhævet af medfødt laktasemangel (CLD), en sjælden autosomal recessiv tilstand forårsaget af mutationer i laktase-genet (LCT) kodning for laktase enzym8. Nyfødte babyer med CLD udviser meget lidt lactase aktivitet, således de kan ikke fodres med modermælk, enhver anden form for mælk eller formel, der indeholder laktose.
I barndommen, er laktase udtryk normalt reduceret; men denne reduktion efter fravænning varierer geografisk, med omkring 35% af voksne over hele verden fortsætter med at udtrykke enzym9. Vedvarende udtryk af laktase, kendt som laktase persistens, tillader enkeltpersoner at fortsætte med at fordøje mælk og mejeri produkter fra en række kilder. Omvendt, tab af laktase udtryk kan føre til laktoseintolerans, også kendt som voksen-type hypolactasia (ATH), som følge af manglende evne til at nedbryde laktose i tarmen. ATH er karakteriseret ved en bygge op af laktose i tyktarmen efter indtagelse af laktose indeholder fødevarer. I tyktarmen, er den akkumulerede laktose gæret ved gut mikrobielle fauna, frigiver gasser herunder brint, metan og kuldioxid. Produktionen af disse gasser i individer med laktase enzym mangler fremme abdominal oppustethed, øget luft i maven, smerter, kvalme og borborygmi (mave rumlen)7. Forhøjet indhold af laktose i mave-tarmkanalen kan også føre til løs afføring.
Kontrol af LCT genekspression moduleres af polymorfier beliggende i introns i det nærliggende MCM6 gen. Personer med varig udtryk af laktase bære polymorfier, der fungerer som stærk distale smagsforstærkere til LCT genekspression, dermed kompensere normale nedregulering af LCT transskription under fravænning, og derfor fastholde laktase udtryk i voksenalderen3. Forstærker polymorfier er blevet foreslået at have været positivt udvalgt efter domesticering af kvæg og kameler i Mellemøsten mere end fem tusinde år siden9,10.
Symptomerne skyldes ATH kan styres ved at reducere indtagelse af laktose, for eksempel ved at fjerne mejeriprodukter fra kosten. En alternativ fremgangsmåde for ATH, og tilgangen af valg for CLD, er brugen af laktase kosttilskud, alment tilgængelig fra apotekerne. Disse kosttilskud indeholder laktase isoleret fra en række kilder, herunder gær og bakterier, i en flydende eller pille-baseret form, der kan tages med eller føjes til laktose indeholdende mad. Tillægget vil hydrolyserer en andel af laktose stede i maden til glucose og galactose produkter, dermed tillade deres absorption og forhindre ophobning af ufordøjede laktose substrat i tarmen.
Baseret på brugen af laktase kosttilskud som et diætetiske støtte, har vi udviklet en simpel enzymology laboratorium eksperiment egnet til første års biomedicinsk videnskab eller apotek studerende. Dette laboratorium eksperiment tager fordel af kommercielt tilgængelige laktase kosttilskud og bruger ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) at give en kolorimetrisk slutpunktet for måling kløvningen af glykosidbindinger af laktase ( Figur 3)11. ONPG fungerer et kunstigt substrat for laktase, som når de udsættes for hydrolyse af dette enzym producerer D-galactose og ortho-nitrofenol. Sidstnævnte vare har en gul farve, absorbere lys med en bølgelængde på 420 nm. Af kvantificere ændringer i absorbansen ved 420 nm følgende eksponering for ONPG laktase, er det muligt at vurdere aktiviteten af dette enzym. Dette laboratorium eksperiment giver en demonstration af enzymatisk hydrolase aktivitet. Ved at bygge i yderligere replikater og udfører assays i forskellige betingelser, er det muligt at indarbejde mere sofistikerede analyser af enzymkinetik, giver en værdifuld virkelige liv eksempel på enzymer i forbindelse med menneskers sundhed.
Protocol
Bemærk: Nedenfor protokol blev udviklet til at blive afholdt i løbet af to timer (herunder færdiggørelse af i klassen regneark) i en specialbygget undervisning laboratorium. De eksperimenterende trin var bevidst sat sammen til at udelukke mere detaljeret analyse af enzymkinetik (udføres i forbindelse med dette kursus bruger modeldata); men – som nævnt i diskussionen-protokollen indeholder en skabelon til mere avancerede analyser afhængig af tid, faciliteter og studerende nå niveau.
SIKKERHED: Dette praktiske bør gennemføres efter reglerne for god kemisk laboratorium praksis (GCLP) — personlige værnemidler, herunder fastspændt laboratoriekittel, engangs handsker og sikkerhedsbriller skal bæres på alle tidspunkter i laboratoriet .
1. udvinding af enzymet
- Knuse en laktase tablet, som indeholder 200 mg af enzymet, at en selv pulver ved hjælp af en morter og pistil.
- Placer den resulterende pulver i en 15 mL tube mærket "suspension" og resuspend i 10 mL af 100 mM fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Vortex for 1 min til at maksimere enzym udvinding.
- Overføres 1 mL fra suspensionen i en 1,5 mL centrifugeglas, og der centrifugeres i 1 minut ved 10.000 x g til sediment faste partikler.
- Overføre 500 µL af supernatanten til en ren 1,5 mL tube mærket "Laktase uddrag".
2. observere colorimetrisk reaktion
- Sted 390 µL af 100 mM PBS til en 1,5 mL tube mærket "Reaktion A".
- Tilføj 100 µL af 5 mM ONPG løsning og bland godt ved vortexing.
Advarsel: Denne praktiske bruger ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) som erstatning for laktose. Da ONPG er et phenolforbindelser sammensatte, skal det håndteres med forsigtighed. I tilfælde af hudkontakt med ONPG, bør udsatte huden vaskes straks. Eventuelle spild skal tørres straks med papirservietter skal bortskaffes i den passende affaldsstrøm. - Tilføje 10 µL af ekstrakt i reaktion A tube og bland godt ved vortexing.
- Observere reaktionsblandingen til 5 minutter og Bemærk kolorimetriske ændringer til løsningen.
3. måling af enzymaktiviteten
- Oprettet to 1,5 mL rør: en mærket "Reaktion B", en mærket "kontrol".
- Tilføje 390 µL af 100 mM PBS til reaktion B tube, 400 µL af 100 mM PBS til kontrol røret og derefter tilsættes 100 µL af 5 mM ONPG til hver tube.
- Bland indholdet af vortexing.
- Tilføje 10 µL af laktase ekstrakt til reaktion B tube, mix af vortexing og tillade reaktion til at gå i 1 minut ved stuetemperatur.
- Når 1 min er udløbet, skal du tilføje 500 µL 1 M natriumkarbonat til begge rør til at hæmme laktase enzym ved at øge pH, dermed afslutter reaktionen.
- Overføre 500 µL af hver tube til ren spektrofotometrets kuvetter og måler absorbansen ved 420 nm ved hjælp af spektrofotometret.
- Bemærk absorbans for reaktion B og kontrolprøver, og fratræk derefter kontrol værdien fra værdien reaktion at udlede ændringen i absorbans på grund af hydrolyse af ONPG i nærværelse af aktive enzym.
4. effekt af temperatur på enzymaktivitet
- Oprette tre kontrol rør og tre reaktion rør, som beskrevet i afsnit 3 og mærke disse "4 ° C", "Værelse Temp" og "37 ° C".
- Efter tilsætning af enzymet ekstrakt, inkuberes en tube på is, en ved stuetemperatur, og en ved 37 ° C (i en forvarmet vandbad).
- Give Reaktionerne videre til 1 min og derefter afslutte reaktionen ved at tilføje 500 µL 1 M natriumkarbonat hver tube.
- Absorbansen ved 420 nm for hver tube som beskrevet i afsnit 3. Registrere værdier, fratrække kontrol fra reaktion værdien i hvert enkelt tilfælde.
Representative Results
Repræsentative resultater for punkt 2 i protokollen er vist i figur 4A. Kontrol-reaktionen i fravær af laktase enzym, forbliver klar, mens den reaktion løsning, der indeholder uddrag af laktase tablet, bliver gul som ONPG er hydrolyseret frigive ortho- nitrofenol. Figur 4B viser kvantificering ved hjælp af arbitrære enheder fra afsnit 4 i denne protokol, følgende analyse af prøver ved hjælp af spektrofotometret. Produktion af ortho-nitrofenol er lavest når reaktionen er udruget på is, og højeste når reaktionen udføres ved 37 ° C.
Figur 1 : E. coli beta-galactosidase. (A) krystalstruktur af beta-galactosidase fra Escherichia coli, viser aktive tetramert struktur komplekse. (B) Allolactose (vist med rødt) bundet til det aktive sted på beta-galactosidase. Billeder genereres fra FBF 1JZ84. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Enzymatisk aktion af laktase. Hydrolyse af lactose af laktase til at producere beta-D-galactose og beta-D-glucose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Hydrolyse af ortho-nitrofenol - beta -D-galactopyranoside. ONPG hydrolyse af laktase til at producere beta-D-galactose og ortho-nitrofenol (som er gul i farven), tillader estimering af lactase aktivitet ved måling af absorbans ved 420 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : ONPG hydrolyse. Repræsentative resultater af ONPG hydrolyse, viser kontrol og reaktion rør (A) og repræsentative data fra afsnit 4 i denne protokol registreres i klassen regnearkene, viser rå absorbans i arbitrære enheder på 420 nm, korrigeret for baggrund og ved tre forskellige temperaturer (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksperimentelle tilstand | Eksperimentelle variabler |
| Temperatur | 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C |
| Substratkoncentration | 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG |
| Konkurrencedygtige hæmning | 5 mM ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM eller 10 mM laktose |
| Tid afhængighed | 0 Sørensen, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min |
| Varme denaturering | Laktase ekstrakt opvarmes til 100 ° C i 10 min forud for analysen |
Tabel 1: potentiale udvidet eksperimentelle tilstand. Foreslået udvidet eksperimenter, skal foretages i tre eksemplarer, undersøge specifikke aspekter af laktase biologi.
Discussion
En detaljeret viden om og forståelse af enzymer, enzymatiske reaktioner og Enzymkinetik er nødvendig for en bred vifte af emner, der spænder over biologi, biomedicin og farmakologi. Protokollen beskrevet ovenfor bruger laktase som et eksempel på et enzym, der er relevante for menneskers sundhed for demonstrerer enzymatiske reaktioner, giver vigtige færdigheder, der kan bruges i mere avancerede laboratorium-baseret eksperimenter.
Denne protokol er blevet bevidst designet til at være så robuste som muligt, tillade studerende med ringe eller ingen våde laboratorium erfaring til at producere fortolkelige resultater på kort tid. I 2014/2015 akademiske år på University of Reading School of Pharmacy udført i alt 144 studerende, organiseret i grupper af 3, "måling laktase" eksperimentet, med alle grupper købedygtig opdager nogle niveau af enzymatisk aktivitet fra laktase tablet ekstrakter.
Der er en række vigtige skridt i denne protokol. For det første er det vigtigt, at den indledende ekstraktion er effektiv, tillader oploesning af nok aktive enzym til efterfølgende analyser. Vores erfaring, første år undergraduates kan opnå dette ved at følge protokollen som skitseret; men nogle vejledning fra laboratoriet demonstranter var nødvendige på dette punkt. Selv om det ville virke et indlysende punkt, er en vigtig faktor i succesen af denne protokol evnen til at omhyggeligt måle diskenheder, korrekt etiket rør og følg instruktionerne. Mens en vis grad af færdigheder kan antages for mange studerende, omhyggelig overvågning og en klar anmodning om studerende til at bede om bistand i tilfælde af, at de er i tvivl om giver hvad de skal gøre næste den største sandsynlighed for en vellykket assay.
Studerende evaluering kan foretages af i klassen regnearket (fås som supplerende materiale), bede eleverne at notere data fra eksperimenter, kommentere deres resultater og link til baggrundskoncentrationen oplysninger fra forelæsning materiale, eller af mere detaljerede, ud af klasse vurdering med modeldata leveres så til kinetiske analyser der forsøgte og vurderes.
Den protokol, der præsenteres heri er et simpelt eksempel på en lactase aktivitet assay under undervisning laboratorieforhold, og der er rig mulighed for at øge kompleksiteten af forsøget at give mulighed for mere avancerede analyser. Især præsenteret protokollen giver en introduktion til begrebet enzymkinetik men tillader ikke kinetic analyse af forsøgsdata. Som sådan, vil vi anbefale visning de beskrevne protokol som en indledende skabelon for klasser, med præcise detaljer tilpasset de specifikke mål og talenter af den studerende kohorte virksomhed eksperimenter. Eksempler på udvidede eksperimenter kunne omfatte: gentagne målinger ved forskellige temperaturer, ved hjælp af forskellige substrat koncentrationer for at tillade statistisk analyse, kinetic analyse af data (egnet til biokemi studerende/majors), begyndende med flere forskellige tabletter og tillader de studerende til at evaluere forskellige aktiviteten af enzymet i hver (med tilføjelse af kontrol tabletter, egnet til retsvidenskabelige studerende/majors), vurdere indvirkningen af varme denaturering eller udfører konkurrence eksperimenter ved tilsætning af laktose eller hæmmere af laktase (tabel 1). En detaljeret protokol for kinetic analyse af laktase har tidligere været udgivet12.
En vigtig styrke i denne protokol er, at det kombinerer en grundlæggende Introduktion til enzymology og enzym kinetik med en real-life casestudie af enzymology i medicin. Dette gør dette laboratorium eksperiment af særlig relevans for studerende på medicin, farmaci, biomedicinske videnskaber og relaterede emner. Vigtigere giver, at der er en alvorlig medicinsk tilstand og en mere udbredt kosten spørgsmål forbundet med laktose katabolisme mulighed for at hæve en bred vifte af medicinske og etiske spørgsmål med eleverne. Dette kunne omfatte de spørgsmål omkring gentest for medicinske tilstande, og forbundet diskussioner vedrørende genterapi og genetisk rådgivning, samt brug og salg af lægemidler kosttilskud. En stor begrænsning er, at protokollen ikke tillader for præcis estimering af enzymet koncentration, på grund af den råvare, der anvendes til udvinding. En ændring for at tage højde for dette, men ville være at bruge reagens grade enzym til analysen. Vigtigere, dette ville også give mulighed for mere præcis beregning af kinetik for laktase-enzymet.
Sammenfattende, paavisning aktiviteten af laktase i en undervisning lab miljø giver en solid, engagerende og interessant Introduktion til feltet af enzymet biologi for tidligt universitetsstuderende.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
PAL blev finansieret af en Parkinsons UK Research Fellowship (grant F1002). Dette arbejde blev støttet af MRC nye Investigator forskning tilskud (hr./L010933/1) og MRC programmet give hr./N026004/1 til PAL og ved BBSRC studentship BB/M017222/1 til JET. Vi takker 2014-15 kohorte af MPharm Del1 studerende på University of Reading for at deltage i den første iteration af denne praktiske, og efterfølgende kohorter for deres feedback og input.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. Biochemistry. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).
- Jittam, P., et al. Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).
- Troelsen, J. T. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression. Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).
- Juers, D. H., et al. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).
- Plimmer, R. H. On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose. Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).
- Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body. The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).
- Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. Lactose intolerance. Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).
- Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia. Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).
- Swallow, D. M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).
- Enattah, N. S., et al. Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture. American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).
- Lowe, G. H. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase. Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).
- Russo, S. F., Moothart, L. Kinetic study of the Enzyme Lactase. Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).
