Summary
Ферментативная активность лактазы имеет важное значение для катаболических обработки дисахарид лактоза. Здесь активность лактазы в биологически активных добавок является анализ с использованием колориметрического анализа. Это обеспечивает студентов экспериментальной площадкой для понимания активность лактазы и фермента кинетики.
Abstract
Понимание принципа работы ферментов и это, касающимся примеров из реальной жизни, имеет решающее значение для широкий спектр бакалавра в биомедицинских и биологических науках. Это легко следовать протокол был разработан для студентов первого курса бакалавра фармации и введение начального уровня ферментативных реакций и аналитических процедур для анализа фермента. Фермент выбора является лактазы, поскольку это представляет собой пример коммерчески доступных фермента, имеющих отношение к человеческой болезни/фармацевтическая практика. Лактаза добывается из таблетки добавка и оценить с помощью колориметрических пробирного, основанные на гидролиз искусственным субстратом для лактазы (Орто-нитрофенола -бета-D-галактопиранозид, ONPG). Релиз Орто нитрофенола после гидролитического расщепления ONPG лактазы измеряется изменения поглощения на 420 Нм и влияние температуры на ферментативной реакции оценивается путем проведения реакции на льду, при комнатной температуре и 37 ° C. Более сложный анализ может осуществляться с помощью этого протокола, оценки активность фермента в различных условиях и с использованием различных реагентов.
Introduction
Ферменты представляют собой особый тип протеина, которые действуют как биологические катализаторы химических реакций в живых организмов1. Действие ферментов имеет решающее значение для жизни, обеспечение энергии, утилизации отходов и позволяя организмов функционировать. Таким образом, понимание ферментов имеет решающее значение для полного понимания жизни. Такие знания имеет важное значение для широкого ряда университета степень программы, начиная от медицинских наук в биологии. Хотя подробный справочный, начиная от принципов катализа теоретические модели ферментативной активности могут быть предоставлены студентов с помощью лекций и материалов для чтения, свойства ферментативных реакций лучше осмыслить руки на практическом опыте ферменты в действии, ранее продемонстрировал2. Этот протокол обеспечивает простой следовать экспериментальная парадигма для измерения активности ферментов в лабораторных условиях, с использованием лактазы в качестве примера содержит фермент с активностью, касающимся питания и здоровья людей.
Гликозидная гидролазы лактаза (EC 3.2.1.23/26) — фермент питания важное для млекопитающих3. Активность лактазы высоко сохраняется путем эволюции и вытекает из бета галактозидазы семейства ферментов — семейство подарок от Escherichia coli через Homo sapiens (рис. 1, PDB 1JZ8)4. Решающее значение лактазы в условиях человеческого питания проистекает из ее роли в разрешении разбивка лактозы в его учредительные моносахаридов компоненты, которые затем могут быть использованы для получения энергии в организме. Лактаза катализирует гидролиз гликозидные связи в дисахарид лактоза, выпустив галактозы и глюкозы (рис. 2)5. Затем эти моносахаридов используются главным образом для производства аденозинтрифосфата (АТФ) через цикл лимонной кислоты и окислительного фосфорилирования6. В ходе новорожденным и детского развития лактаза высоко выражается в человеческой пищеварительной системы, разрушения лактозы, полученных от грудного молока, из которых лактоза является основным углеводный компонент и один из ключевых источников питания в первые годы 7. медицинское значение лактазы выделена врожденной лактозной недостаточности (ХЗЛ), редкое аутосомно-рецессивный состояния, вызванные мутации в гене лактаза (LCT), кодирования для фермента лактазы8. Новорожденных с ХПЛ exhibit очень мало активности лактазы, таким образом они не кормили грудным молоком, любые другие виды молока, или формула, содержащая лактозу.
В детстве лактаза выражение обычно уменьшается; Однако это сокращение после отъема географически, меняется с приблизительно 35% взрослых во всем мире продолжает выражать фермента9. Устойчивое выражение лактазы, известный как сохранение лактазы, позволяет людям продолжать переваривать молока и молочных продуктов из целого ряда источников. И наоборот потеря лактазы выражения может привести к непереносимости лактозы, также известный как взрослый типа hypolactasia (ATH), обусловленных невозможностью сломать лактозы в кишечнике. ATH характеризуется построения вверх лактозы в толстой кишке после проглатывания лактозы, содержащих продуктов питания. В толстой кишке накопленные лактозы сбраживается в кишечнике микроорганизмов фауны, выпуска газов, включая водород, метан и двуокись углерода. Производство этих газов в отдельных лиц с недостатками фермента лактазы содействовать вздутие живота, увеличение метеоризм, боли, тошнота и borborygmi (урчание желудка)7. Повышение уровня лактозы в ЖКТ может также привести к жидкий стул.
Контроля за экспрессией генов LCT модулируется полиморфизмы расположен в интронов близлежащих гена MCM6 . Лица с устойчивой выражением лактазы нести полиморфизмы, которые функционируют как сильный дистальной расширители для LCT экспрессии генов, таким образом компенсируя нормальный вниз регуляции транскрипции LCT при отлучке и, следовательно, поддержания лактазы выражение в зрелом возрасте3. Полиморфизмы усилитель было предложено положительно выбраны после приручения крупного рогатого скота и верблюдов на Ближнем Востоке более пяти тысяч лет назад9,10.
Симптомы, обусловленные ATH можно управлять путем сокращения потребления лактозы, например путем удаления молочные продукты из рациона. Альтернативный подход для ATH и метод выбора для ХЗЛ, является использование добавок лактазы, широко доступны в аптеках. Эти добавки обеспечивают лактазы, изолированных из различных источников, в том числе дрожжей и бактерий, в жидкости или таблетки на основе формы, которые могут быть приняты с или добавлены к лактозы, содержащих продуктов питания. Доплата будет гидролизуют доля лактозы, присутствующих в пище глюкозы и галактозы продуктов, таким образом позволяя их поглощения и предотвращения накопления непереваренной лактозы субстрата в кишечнике.
На основе использования лактазы добавки в качестве диетического средства, мы разработали простой энзимологии лабораторный эксперимент подходит для студентов первого курса биомедицинской науки или аптека. Данный лабораторный эксперимент использует коммерчески доступных лактазы добавки и использует Орто-нитрофенола -бета-D-галактопиранозид (ONPG) предоставлять колориметрические конечной точкой для измерения расщепления гликозидных связей лактаза ( Рисунок 3)11. Действует ONPG искусственных субстрат для лактазы, который когда подвергается гидролизу, этот фермент производит D-галактоза и орто нитрофенола. Последний продукт имеет желтый цвет, поглощая свет на длине волны 420 Нм. Путем определения количественных показателей изменения поглощения на 420 Нм следующее воздействие ONPG лактазы, это можно оценить активность этого фермента. Данный лабораторный эксперимент предоставляет демонстрацию гидролазы ферментативной активности. Здание в дополнительных реплицирует и проведения анализов в разных условиях, это возможно для включения более сложных анализов Ферментативная кинетика, обеспечивая ценным примером реальной жизни ферментов в действии, имеющих отношение к здоровью человека.
Protocol
Примечание: В специально построенном обучения лаборатории должно состояться в течение двух часов (включая завершение в классе листов) был разработан протокол ниже. Экспериментальные шаги были намеренно положить вместе, чтобы исключить более детальный анализ кинетики фермента (осуществляется в рамках данного курса, с использованием модели данных); Однако, как отмечалось в ходе обсуждения — протокол предоставляет шаблон для более сложных анализов, в зависимости от времени, зал и студенческие достижения уровня.
Безопасность: Этот практический должно осуществляться в соответствии с правилами хорошей практике химическая лаборатория (GCLP) — средства индивидуальной защиты, включая прикрепленное лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки должны носить все время в лаборатории .
1. Извлечение фермента
- Раздавить одна таблетка лактазы, содержащего 200 мг фермента, даже порошок, используя ступку и пестик.
- Поместите полученный порошок в 15 мл трубки помечены «подвеска» и Ресуспензируйте в 10 мл 100 мм-фосфатный буфер (PBS).
- Вихрь за 1 мин для максимального извлечения фермента.
- Перевести 1 мл от приостановления в 1,5 мл центрифуги и центрифуги за 1 мин на 10000 x g отложений твердых частиц.
- Передать 500 мкл супернатант чистой 1,5 мл трубки помечены «Лактазы Extract».
2. соблюдая колориметрические реакции
- Место 390 µL 100 мм PBS в 1,5 мл трубку маркировку «Реакции A».
- Добавьте 100 мкл раствора ONPG 5 мм и смеси хорошо, vortexing.
Предупреждение: Это практическое использование Орто-нитрофенола -бета-D-галактопиранозид (ONPG) как замену для лактозы. Поскольку ONPG является фенольные соединения, его следует подходить с осторожностью. В случае контакта кожи с ONPG открытые участки кожи должны быть вымыты немедленно. Любых разливов должны быть немедленно стерты с бумажными полотенцами для удаления в соответствующий поток отходов. - Добавьте 10 мкл концентрированного экстракта в реакции А трубки и перемешать хорошо, vortexing.
- Соблюдать реакционной смеси в течение 5 минут и отметить любые колориметрические изменения в решение.
3. измерение активности ферментов
- Созданы две 1,5 мл пробирок: один маркировку «Реакция B», один помечены «контроль».
- 390 мкл 100 мм PBS на реакцию B трубки, 400 мкл, 100 мм PBS для управления трубки, а затем добавить 100 мкл 5 мм ONPG к каждой трубе.
- Смешайте содержимое, vortexing.
- Добавьте 10 мкл концентрированного экстракта лактазы к пробке реакции B, смесь vortexing и позволяют реакции приступить за 1 мин при комнатной температуре.
- По истечении 1 мин, добавьте 500 мкл карбоната натрия 1 М в обеих трубок для ингибирования фермента лактазы, увеличивая рН, таким образом Завершая реакции.
- Перевести 500 мкл от каждой трубы в чистой спектрофотометр кюветы и измерения оптической плотности на 420 Нм, с помощью спектрофотометра.
- Обратите внимание поглощения для реакции B и контрольных образцов, а затем вычесть значение элемента управления от реакции для получения изменения поглощения за счет гидролиза ONPG присутствии активных ферментов.
4. влияние температуры на активность фермента
- Настроить три контроля труб и три трубки реакции, как описано в разделе 3 и обозначить эти «4 ° C», «Комнатной температуре» и «37 ° C».
- После того фермента экстракт, инкубировать одной трубки на льду, при комнатной температуре, а также при 37 ° C (в предварительно нагретой водой ванну).
- Разрешить реакции за 1 мин и затем прекратить реакции путем добавления 500 мкл карбоната натрия 1 М в каждую пробирку.
- Измерение оптической плотности в 420 Нм для каждой трубы, как описано в разделе 3. Запишите значения, вычитания значения элемента управления из значения реакции в каждом конкретном случае.
Representative Results
Представитель результаты протокола для раздела 2 показаны на рисунке 4A. Управления реакции, в отсутствие фермента лактазы, остается ясным, хотя реакция решение, содержащий экстракт из планшета лактазы, желтеет, как ONPG гидролизуется выпускать Орто- нитрофенола. Рисунок 4B показывает количественной оценки с использованием произвольных блоков из раздела 4 протокола, следующий анализ образцов с помощью спектрофотометра. Производство Орто нитрофенола низкие, когда реакция инкубированы на льду и высокие, когда реакция осуществляется при температуре 37 ° C.
Рисунок 1 : E. coli бета галактозидазе. (A) Кристаллическая структура бета-галактозидазы от кишечной палочки, показаны tetrameric структура активного комплекса. (B) аллолактозы (показано красным цветом) обязан на активном узле бета-галактозидазы. Изображения, сгенерированные из PDB 1JZ84. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Ферментативные действий лактазы. Гидролиз лактозы, лактаза производить бета D-галактоза и бета D-глюкозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Гидролиз Орто-нитрофенола - бета-версия -D-галактопиранозид. ONPG гидролиза, лактаза производить бета D-галактоза и орто нитрофенола (который желтого цвета), позволяя оценки активности лактазы путем измерения оптической плотности на 420 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : ONPG гидролиз. Представитель результаты ONPG гидролиза, показаны управления и реакция труб (A) и репрезентативных данных из раздела 4 протокола записанные на листах в классе, показаны сырье поглощения в произвольных единицах на 420 Нм, исправления для фона и на трех различных температурах (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Экспериментальные условия | Экспериментальные переменные |
| Температура | 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C |
| Концентрация субстрата | 0 мм, 1, 5 мм, 10 мм ONPG |
| Конкурентного ингибирования | лактоза ONPG плюс 0, 1 мм, 5 мм или 10 мм 5 мм |
| Зависимость от времени | 0 s, 15 s, 30 s, 1 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин |
| Тепловой денатурации | Лактаза экстракт нагревается до 100 ° C в течение 10 мин до их анализа |
Таблица 1: потенциал расширена экспериментальная условие. Предложил расширенных экспериментов, осуществляться в трех экземплярах, расследовать конкретные аспекты лактазы биологии.
Discussion
Для широкого круга вопросов, охватывающих биология, биомедицина и фармакологии требуется детальное знание и понимание ферментов, ферментативных реакций и Ферментативная кинетика. Протокол, описанные выше использует лактазы в качестве примера отношение к здоровью человека фермента для демонстрации ферментативных реакций, предоставляя ключевые навыки, которые могут быть использованы в более сложных лабораторных экспериментов.
Этот протокол был разработан преднамеренно быть столь надежным, как возможно, позволяя студентам с мало или вообще не мокрые лаборатории опытом интерпретации результатов в короткий промежуток времени. 2014/2015 учебном году в школе университета Ридинга фармации в общей сложности 144 студентов, организованные в группы из 3, провели эксперимент «измерения лактазы», со всеми группами удалось обнаружить некоторые уровня ферментативной активности лактазы таблетки экстракты.
Существует целый ряд важных шагов в этом протоколе. Во-первых важно, что первоначальное извлечение является эффективным, позволяя солюбилизация достаточно активный фермент для последующего анализа. Наш опыт показывает первый год студенты могут добиться этого, следуя протоколу как указано; Однако некоторые указания от лаборатории демонстрантов требовалось на данный момент. Хотя казалось бы точку самоочевидным, ключевым фактором в обеспечении успеха этого протокола является способность тщательно измерить томов, правильно этикетке трубки и следуйте инструкциям. Хотя можно предположить определенный уровень владения языком, для многих студентов, тщательный мониторинг и четкий запрос для студентов попросить помощи в том случае, если они не уверены что делать далее обеспечивает наибольшую вероятность успешного анализа.
Оценки студентов может осуществляться в классе листа (в качестве дополнительного материала), просим студентов обратить внимание на данные из экспериментов, комментировать их результаты и ссылку Справочная информация/чтения от материал лекции, или больше подробные, из класса оценки с модель данных позволяет для кинетического анализа попытка и оцениваться.
Протокол, представленные в настоящем документе приведен простой пример анализа активности лактазы под обучение лабораторных условиях, и есть широкие возможности для повышения сложности эксперимента разрешить дополнительные анализы. В частности представленные протокол представляет собой введение в концепции Ферментативная кинетика, но не позволяют для кинетического анализа экспериментальных данных. Таким образом мы рекомендовали бы Просмотр протокола описаны как первоначального шаблона для классов, с точные детали, адаптировать с учетом конкретных целей и таланты когорте студентов, проводит эксперименты. Примеры расширенных экспериментов могут включать: повторил измерений при различных температурах, используя различные субстрата концентрации для статистического анализа, кинетический анализ данных (подходит для биохимии студентов/майоров), начиная с несколько различных таблеток и позволяет студентам оценивать различные активность фермента в каждом (с добавлением управления таблетки, подходит для студентов/майоров судебно-медицинской науки), оценки воздействия тепловой денатурации или проведение конкурса эксперименты с добавлением лактозы или ингибиторов лактазы (Таблица 1). Подробный протокол для кинетического анализа лактазы ранее были опубликованы12.
Важным преимуществом этого протокола является, что он сочетает в себе основные введение в энзимологии и фермента кинетики реальной жизни тематическое исследование энзимологии в медицине. Это делает этой лаборатории эксперимента особое значение для студентов медицины, фармации, биомедицинских наук и связанным с ними вопросам. Важно отметить, что тот факт, что существует серьезное заболевание и более широко диетических проблема, связанная с лактозы катаболизма обеспечивает возможность поднять широкий спектр медицинских и этических проблем со студентами. Это может включать вопросы, касающиеся генетического тестирования для медицинских условий и связанные обсуждения, связанные с генной терапии и генетическое консультирование, а также использование и продажу лекарственных добавок. Одним из основных ограничений является, что протокол не позволяет для точной оценки концентрации фермента, из-за исходный материал, используемый для извлечения. Изменения для учета этого, однако, будет использовать фермент класса реагент для assay. Главное это также позволит более точный расчет кинетики для фермента лактазы.
В заключение, опробование активность лактазы в лаборатории обучения среда обеспечивает надежный, привлекательные и интересные введение в области биологии фермента для ранней стадии студентов университета.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
PAL финансировался Паркинсона Великобритании исследовательских стипендий (Грант F1002). Эта работа была поддержана MRC новый следователь исследовательский грант (MR/L010933/1) и программой MRC Грант MR/N026004/1, PAL и СИББН студенчества BB/M017222/1-JET. Мы благодарим когорты 2014-15 MPharm часть 1 студентов в университете чтения для участия в первой итерации этого практические и последующей когорты их обратной связи и ввода.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. Biochemistry. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).
- Jittam, P., et al. Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).
- Troelsen, J. T. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression. Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).
- Juers, D. H., et al. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).
- Plimmer, R. H. On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose. Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).
- Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body. The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).
- Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. Lactose intolerance. Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).
- Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia. Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).
- Swallow, D. M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).
- Enattah, N. S., et al. Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture. American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).
- Lowe, G. H. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase. Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).
- Russo, S. F., Moothart, L. Kinetic study of the Enzyme Lactase. Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).
