Introduction
Polymer microarrays er miniaturiserede high-throughput platforme, hvor op til 7.000 polymerer 1 er trykt på objektglas til parallel analyse med prokaryote eller eukaryote celler 2. Fremgangsmåden præsenteres her bygger på det, som vi først beskrevet i 2010 3. Denne screening system er blevet anvendt på en lang række celletyper, herunder humane hepatocytter 4, stamceller 5, renale tubulære epitelceller 2, bakterier 3,6 og protozopatogener 7. I hvert tilfælde blev polymerer, der fremmer eller modstå bindende af cellerne under undersøgelsen identificeret otte. Komplekser af DNA med syntetiske polykationiske polymerer er også blevet anvendt i mikroarrayformat for high-throughput screening af gentransfektion kandidater 9. Samt screening for celle-substrat-interaktioner, har polymer microarrays også blevet anvendt til evaluering materialeegenskaber 10.
"> Evnen af syntetiske polymerer til at modulere binding af bakterier til en overflade er veletableret 3,6,11. Talrige faktorer, herunder ladning, hydrofobicitet og overfladeruhed polymeroverfladen er kendt for at påvirke bakterielle bindende. De konventionelle metoder til at opdage biomaterialer at modstå binding af bakterier gennem sekventielt eller empirisk designe og teste ét materiale ad gangen er arbejdskrævende, kostbare og tidskrævende processer. Polymer microarrays tilbyde et attraktivt alternativ til at omgå sådanne begrænsninger.Overfladeaktive-associerede bakterier vokse som en kompleks population kaldes en biofilm - sådanne biofilm er meget resistente over mange miljømæssige belastninger og antibiotika. Dette er til dels på grund af deres tætte ekstracellulære matrix (bestående af proteiner, polysaccharider og nukleinsyrer) 12 og dels på grund af den øgede tilstedeværelse af robuste "persistor" celler i biofilm 13. although de præcise mekanismer overflade forening og efterfølgende biofilmdannelse er vanskelige at karakterisere, er det generelt mente, at der er tre forskellige stadier af overflade vækst 14-16. Initial, reversibel vedhæftning efterfølges af stærkere vedhæftning af celler, etablering af en biofilm ved produktion af et ekstracellulært protein og polysaccharid matrix og celleproliferation. Endelig de modne biofilm frigiver fritlevende planktoniske celler, som kan initiere nye infektioner andre steder. Bakterier-frastødende polymerer, som forhindrer den oprindelige binding af bakterier, og dermed forhindrer tidlige stadier af biofilmdannelse, repræsenterer potentielt en fremragende løsning til minimering infektioner. I betragtning af den stigende antibiotikaresistens (og også den iboende større modstand af overflade-associerede bakterier 12), antibiotika-fri middel til at reducere infektioner er af særlig interesse. I et hospital, bakterier-frastødende polymerbelægninger kan have en direkte medicinsk anvendelse i reduktionen af nosokomielle infektioner, som almindeligvis dannes omkring implanterede anordninger 17.
Her er en høj-throughput fremgangsmåde til screening af 381 polymerer til afvisende aktivitet mod en række patogene bakterier forbundet med nosokomielle infektioner, efterfulgt af hit validering og efterfølgende coating og assay af centralt venekateter materialer, beskrevet (figur 1). Kort fortalt blev polymererne plettet på agarose-coatede objektglas ved kontakt trykning og, efter tørring og sterilisering blev de miniaturiserede arrays inkuberet med klinisk vigtige bakteriekulturer. Efter inkubation blev microarrays forsigtigt vasket og adhærerende bakterieceller blev farvet og visualiseret ved fluorescens. Efterfølgende blev polymerer, der inhiberede bakteriel binding undersøgt i større målestok ved overtrækning på dækglas og visualiseret ved elektronmikroskopi. Valgt repellånte polymerer blev derefter coatet på kommercielle katetre og vist at reducere binding af bakterier ved næsten 100 gange.
Protocol
1. Udarbejdelse af agarosecoatet Slides
BEMÆRK: Før opdigte polymer mikroarrays, er aminoalkylsilane-coatede objektglas belagt med agarose IB for at minimere ikke-specifik baggrund binding og tillade evaluering af polymerer, der binder eller frastøde bakterier 6. Silancoating letter bindingen af agarose til objektglassene.
- Udgør en 2% (w / v) opløsning af agarose IB i destilleret vand i en 250 ml flaske.
- Efter capping flasken løst, opvarmes suspensionen i en mikrobølgeovn i 30 sek perioder indtil opløsning. Sørg for, at låget ikke er tæt lukket for at undgå enhver potentiel pres opbygge. Fjern flasken regelmæssigt og bland forsigtigt.
- Sikre, at det faste stof er opløst, og opløsningen er klar. Hæld denne agaroseopløsning i et 100 ml bægerglas, og sted i en 65 ° C vandbad for at opretholde en flydende opløsning.
- Dyp silan-coatede objektglas i agaroseopløsningen, hvilket sikrer ensartet belægning, og wipe bagsiden af objektglasset med en serviet.
- Tør dias, med den coatede side opad, i et støvfrit miljø (f.eks inde et skab eller stinkskab) i mindst 24 timer.
- Bekræft en ensartet belægning ved visuel inspektion. Coating kan let vurderes ved at trække vejret på slide - kondens vil danne på ubestrøget regioner. Kun objektglas overtrukket helt og jævnt bør anvendes til microarray udskrivning.
2. Udarbejdelse af Polymer Løsninger til udskrivning
- Forbered opløsninger (1% vægt / volumen) af et udvalg af foruddannede polymerer bestående af polyacrylater, polyacrylamider og polyurethaner i N-methylpyrrolidon (NMP) i hætteglas. (Forberede 1 ml af hver polymer). Vortex indtil polymeren er fuldstændigt opløst. Syntese af polymerer er beskrevet andetsteds 6.
- Ved hjælp af en mikro-pipette, fylde hver brønd af en 384 mikrobrøndsplade med 25 pi polymeropløsning, der sikrer, at der ikke er nogen cross contamelse og hver brønd indeholder en unik polymer. Brug NMP som en negativ kontrol i mindst 2 brønde. Registrering af identiteten af polymer opløsning i hver brønd på en plade med skabelon eller regnearkfil.
3. Udskrivning Polymer Microarrays Brug af en Kontakt printer
BEMÆRK: Trykning af mikroarrays blev udført under anvendelse af en kontakt printer. Specifikke instruktioner om polymer microarray udskrivning er angivet nedenfor. For generelle retningslinjer for brug af anbefalingerne printer og sikkerhed, følg brugervejledningen fra producenten. Selvom vi bruger en kontakt printer, kan en egnet manuel stempling anordning også anvendes.
- Som rådgivet i printerens brugsanvisning, oprette en rutine (se trin 3.3), der tillader udskrivning af 384 væsker (polymeropløsningerne eller NMP) i firdobbelte, ved hjælp af en 32-bens microarraying hoved (arrangeret som 8 rækker og 4 kolonner).
- Udskriv 1.536 spots arrangeret som 48 rækker og 32 kolonner. Programmere rutine at udskrive i 12 afsnits, dvs.., 32 løsninger på et tidspunkt, så printeren kan stoppes efter udskrivning hver sektion for at give mulighed for rengøring af stifter.
- For at oprette et trykkeri rutine:
- Åbn softwaren og fra de tilgængelige muligheder vælg 'Opret en ny rutine ". Vælg fanebladet "Beskrivelse" til input detaljer af eksperimentet. Vælg fanen 'hoved' og vælg '32 -pin microarraying hoved '.
- Vælg fanen 'Source' og vælg plade holder (kilde plade holder (1x5)), plade type (plade 384 x 6000), alt plader (1) og kilde orden (ved kolonner).
- I fanebladet 'Slide design', vælg '3x1' 'slide' og vælg gruppere med 'Felt nummer «. Vælg derefter 'gruppering mønster «. Input 'Spot view "som" layout "og" Mønster dimensioner «som' Række count« (6), "Kolonne tæller« (8), 'Række bane «(750) og" Column bane «(560). Vælg en sektion til at udskrive first.
- I "Slide layout 'fanen input antallet af slides bruges til udskrivning. Vælg fanebladet "Udskriv" for at indtaste trykning parametre (antal frimærker pr rentegning: 1, antal frimærker pr plet: 5, stempling tid: 200 ms, inking tid: 100 ms).
BEMÆRK: En rutine er nu oprettet til udskrivning 384 væsker (polymeropløsningerne eller NMP) i firdobbelte, ved hjælp af en 32-bens microarraying hoved (arrangeret som 8 rækker og 4 kolonner). I alt rutine bør udskrive 1.536 spots arrangeret som 48 rækker og 32 kolonner med en række pitch på 750 um og kolonne pitch på 560 um.
- Placer agarose-coatede objektglas på platformen og sikre en god vakuumtætning at holde objektglassene i position.
- Juster trykhovedet, således at alle benene er i samme højde. Kontrollere dette ved manuelt at sænke hovedet på et objektglas og bekræfter, at stifterne bevæge sig op på samme tid. Hvis der er nogen uoverensstemmelser med højden, justeres ved hjælp af sleeve på stiften op eller ned.
- Placer brønds plade på pladen holder i den korrekte orientering, dvs.., Godt A1 er til øverst til højre i holderen og sikre brønds plade sidder fast.
- Ved hjælp af højden indstillende, at højden af holderen pladen er sådan, at når picking polymeropløsningerne, behøver stifterne ikke røre bunden af brøndene.
BEMÆRK: Dette er vigtigt for ensartet polymer spotting og også for at undgå at spilde af polymeropløsninger ind i tilstødende brønde, hvorved krydskontaminering. - Vælg fanebladet 'Start' og vælg 'Kør typen' som 'Normal'. Klik på 'Kør', og bekræfter, at dias, brønde mv, er i position, når du bliver bedt om.
- Udskriv en sektion ad gangen (32 løsninger ad gangen, 12 sektioner), der giver mulighed for rengøring af stifter mellem sektioner. Rens benene grundigt med køkkenrulle dyppet i acetone, efterfulgt af tør silkepapir at sikre benene er helt tørre.
- Ved afslutningen af trykningen af mikroarrays, placere dem i et dias holder og tør dem natten over i en vakuumovn indstillet til 45 ° C for at fjerne NMP i polymeren pletter. Efter sterilisering med UV-lys i 30 minutter, mikroarrayene er klar til inokulering af bakterier.
- Før pode slides med bakterier, tage en måling af baggrund fluorescens (som beskrevet i afsnit 5). Brug denne måling i beregningen af bakteriel binding.
4. Podning af Polymer Microarrays med bakterier
BEMÆRK: Sørg for god aseptisk teknik. Al håndtering af kulturer bør udføres i et sterilt miljø: enten under anvendelse af en bunsenbrænder eller i et stinkskab. Kulturer bør dyrkes med ilt tilgængelighed, vækstmedium og temperaturen justeret til kravene i hver art.
- Forbered overnatskulturer ved inokulering 5 ml Luria-Bertani-bouillon (LB: 10 g L -1 bactotrypton, 5 g L -1 NaCl, og 10 g L <sup> -1 gærekstrakt) med en koloni fra en plade. Inkuber natten over ved 37 ° C, rystning ved 200 rpm.
- Forbered fryseanlæg til lagre af overnatskulturer ved tilsætning af glycerol (10% koncentration i alt) og opbevares lager ved -80 ° C.
- For at bestemme de celle numre fra prøver af de optøede bakterielle lagre, udføre serielle fortyndinger af hver bestand og vokse bakterier natten over på faste medier. Nøjagtig bestemmelse af celletal i lagrene sikrer hensigtsmæssig podning af hver art 6.
- Forbered podemateriale til microarray. Enkelt art dyrkes som ovenfor og anvendes direkte på microarrays. BacMix-1 er en bakteriel blanding af Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), og Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 er en bakteriel blanding bestående af Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus K. pneumoniae og Enterococcus faecalis (E. faecalis).
- At producere enten blandet kultur, bland overnights i lige store volumener (3 ml hver) og fortyndes fire gange med frisk LB (til omkring 50 ml slutvolumen).
- Placer UV-steriliseret polymer microarrays i rektangulære 4-brønds plader og inkuberes dem med 6 ml blandede bakteriekulturer ved 37 ° C med forsigtig omrøring (30 rpm) i 5 dage.
- Efter inkubation forsigtigt skylle microarrays to gange med phosphatbufret saltvand (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) og inkuberes med en opløsning af 1 ug ml-1 af 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) plet i PBS i 30 min.
- Vask de farvede microarray glider i en frisk plade med ved at dække med PBS og hvirvlende forsigtigt, ændre PBS én gang. Dry under en strøm af luft. Påfør et dækglas til microarray dias og segl på plads med lim. Når dRy, sterilisere den ydre overflade med 70% (v / v) ethanol.
- Sikker bortskaffes af kulturer i henhold til deres indeslutningsniveau.
5. Microarray Imaging og analyse
- Capture enkelte billeder for hver polymer stedet i lysfelt og DAPI (Ex / Em = 358 nm / 361 nm) kanaler. Udføre denne manuelt med en fluorescerende mikroskop eller anvendelse af en automatiseret fluorescens-mikroskop (med en XYZ trin styres af en billedoptagelse software) forsynet med en 20 x objektiv.
BEMÆRK: Se vejledningen 18 for brug af softwaren og justere mikroskop til at opnå billeder med lysfelt og DAPI-kanaler. Sikre, at forstærkningen og eksponeringstid for billedoptagelse for alle mikroarrays er ens. - Få den gennemsnitlige fluorescensintensitet af hver plet i DAPI kanal ved at vælge pletareal og kvantificering af fluorescensen med et billedbehandlingssoftware.
- For baggrundsfluorescens af hver plet, SKAFFESi billeder af de polymere pletter på en gengivelse microarray inkuberes kun med medier uden bakterier. Fratrække baggrundsfluorescens fra intensiteten af pletten til opnåelse fluorescens fra bakterier.
- Beregn gennemsnitlig normaliseret værdi fra de fire pladser, der repræsenterer hver polymer, der anvendes til at sammenligne bakterier binding af forskellige polymerer 6.
- Identificer de polymerer, der udviser den mindste bakteriel binding (laveste fluorescens) som "hit" polymerer 6.
6. Coating af Cover Slips til 'Hit' Validering
- At belægge Dækglas med polymerer:
- Forbered opløsninger af "hit" polymerer (~ 2% vægt / volumen) i tetrahydrofuran (THF) eller et andet egnet opløsningsmiddel.
- Spin coat cirkulære dækglas af passende størrelse med polymeren løsninger ved hjælp et spin coater ved 2.000 rpm i 10 sek.
BEMÆRK: I mangel af et spin coater, dækglas og andet materiale kan være dip overtrukket, selv om spin-overtræk frembringer en mere ensartet overflade. - Tør de coatede dækglas i en konvektionsovn ved 40 ° C natten over, og der steriliseres under anvendelse af UV lys i 30 minutter før inokulering bakterier.
- Til Coat Dækglas med agarose for negative kontroller:
- Clean dækglas enten ved plasma behandling for 10 min eller neddykning i 1 M NaOH i 4 timer.
- Fordybe dækglassene i acetonitril indeholdende 1% (3-aminopropyl) triethoxysilan natten over. Rengør dækglassene med acetone 3 gange og sættes i en ovn (100 ° C) i 1 time.
- Dip coate tørrede dækglas med 1% agarose vandig opløsning holdes i et vandbad ved 60 ° C. Placer agarosecoatet dækglas på flad overflade i støvfri omgivende betingelser i 24 timer, og der steriliseres under anvendelse af UV lys i 30 minutter før inokulering bakterier.
7. Attachment og analyse af Cover Slip Brug Scanning Electron Microscope (SEM)
- Eftersterilisering med UV-lys i 30 minutter, placere dækglas (polymer / agarose overtrukket eller ikke-overtrukket glas) som en standard 12-brønds plade eller plade med 24 brønde (afhængigt af størrelsen af dækglassene) og inkuberes med bakterier som beskrevet i afsnit fire.
- Efter inkubation med bakterier, vaske uovertrukne og overtrukne dækglas to gange med 0,1 M cacodylatbuffer (pH 7,4) og derefter fastgøres med 2,5% (w / v) glutaraldehyd i 0,1 M cacodylatbuffer (pH 7,4) i 2 timer.
- Post-fix prøver med 1% (vægt / volumen) osmiumtetroxid i 1 time ved stuetemperatur og dehydrere med sekventielle ethanol vaske ved 50, 70, 90 og 100% (v / v) i 30 min hver.
- Tørre prøver i CO 2 overensstemmelse med standard protokoller 19. Tørretid vil afhænge af arten af prøven.
- Coat-prøver i en guld / palladium-legering (60/40%) under anvendelse af en pådampningsbelægningsmaskinen med strøm ved 30 mA og vakuum ved 0,75 Torr. Undersøg under et elektronmikroskop som pr standard protokoller 20.
BEMÆRK: EnsUre tilstrækkelige sikkerhedsforanstaltninger til at styre risici som følge af opbevaring, håndtering og bortskaffelse af Osmiumtetroxid, da det er meget giftigt. - sammenligne Visuelt billeder af ikke-coatede dækglas og dem belagt med agarose eller "hit" polymerer for at bekræfte bakterielle bindende / frastødende evner polymerer.
BEMÆRK: Resistens for fastgørelse skal være let synlige som en reduktion af tilstedeværende celler. - Vælg den mest lovende 'hit' ikke-bindende polymerer til belægningen studier med medicinsk udstyr (f.eks centrale venøse katetre) 6.
8. Valg af Solvens til Coating Katetre
- Evaluere forskellige opløsningsmidler til deres forenelighed med den iboende del af kateteret, samt deres evne til at opløse "hit" polymer. Skær dele af cath-1 og ind cylindriske stykker 5 mm i længden, og måle med en digital Vernier kaliberen.
- Evaluere forskellige opløsningsmidler, såsom ACETic acid, ammoniak, acetone, acetonitril, diethylether, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamid (DMF), N-methyl-2-pyrrolidon (NMP), ethanol, methanol, ethylenglycol, toluen og xylen. Fordybe kateter stykker i opløsningsmidlerne i 12 timer og evaluere visuelt for integritet kateter og klarhed af opløsningsmiddel.
BEMÆRK: Vælg et opløsningsmiddel, som ikke forårsager katetrene til at svulme op eller desintegrere eller resultere i en uklar opløsningsmiddel. Opløsningsmidlet skal opløse "hit" polymerer.
9. Analyse af Bakteriel Attachment på Katetre ved konfokal mikroskopi
- Forbered 2,5% (vægt / volumen) polymeropløsninger i acetone eller andet egnet opløsningsmiddel som bestemt i afsnit 8. Place 5 mm kateter stykker i en lille hætteglas (5 ml) og fordybe dem i 1 ml af polymeropløsningen i 2 min . Fjern overskydende polymeropløsningen og tørre kateter stykker natten over i en vakuumovn ved 40 ° C.
- Forbered inokulum ved at blande optøet bakteriel stocks at give ca. 10 6 celler af hver art i 50 ml LB 6.
- Sterilisere overtrukne og uovertrukne kateter stykker med UV-lys i 30 minutter og inkuberes med 1 ml inokuleret LB i en 24-brønds plade ved 37 ° C i 3 dage, under forsigtig omrøring 6.
- Efter inkubation vaskes katetrene med PBS (2x, 2 ml) og fikseres bakterierne med 10% paraformaldehyd i PBS i 30 min, og vask med PBS (1 ml). Farve bakterierne på kateter stykker med DAPI (1 ug ml - 1) i 20 min og vask med PBS (1 ml).
- Få konfokale billeder af kateteret stykker ved hjælp af følgende indstillinger: 405nm blå diode laser, detektor range 414-502 nm, pin hole - Airy1, billede Størrelse - 1.024 × 1.024 pixels, voxel bredde - 105,2 nm, Z-stakke afstandseffekter 0.5μ m , forstørrelse - 40X 1.25.
- Gennemfør konfokal billeddannelse ved Z-stabling 50 billeder på tværs 100 um længde af kateteret.
- Analyser billederne ved hjælp suitable analyse software: flade Z-stacked billeder i Z-planet, ved hjælp af funktionen til at udvide dybdeskarphed, for at skabe et enkelt billede af et kateter stykke.
BEMÆRK: Dette billede skal derefter analyseres for at finde et område af kateteret er dækket af bakterier, efter background-korrektion ved hjælp af 'flade baggrund' funktion.
10. Analyse af Bakteriel Attachment på Katetre ved SEM
- Forbered 10% polymeropløsning (w / v) i acetone.
- Tryk på en pipettespids (for 200 pi mikropipette) ind midterdelen af det afskårne stykke af katetret til at holde den og dyppe stykket i polymeropløsningen i ca. 30 sek. Tør det overtrukne stykke i omgivelsesbetingelser i 30 minutter. Påfør et andet overtræk ved at neddyppe igen i polymeropløsningen og tør natten over i omgivelsesbetingelser.
- Efter UV-behandling og inkubation med bakterier vaskes stykkerne (n = 3) med PBS (2x, 1 ml) og overføre dem i 48-brønds plader indeholdende 10% formaldehyd i PBS i 30 min. Efter fiksering vaskes stykkerne med PBS (1 ml), tørt natten over ved stuetemperatur, montere på stubbe med ledende carbon diske, og guld frakke anvendelse af en pådampningsbelægningsmaskinen (se trin 7.5).
- Anskaf billeder ved hjælp af en scanning elektron mikroskop 6.
Representative Results
Figur 2 viser bakteriel fastgørelse (normaliseret fluorescens intensitet) til et antal polymerer som bestemt ved microarray analyse. Steder trykt uden polymer (NMP kun) er den negative kontrol, som agarose stærkt modstår bakteriel binding 6 - registreres fluorescens er meget lav. De viste polymerer er alle lav-bindende men i de fleste tilfælde, de frastødende egenskaber af en polymer varierer betydeligt mellem testede bakteriearter. Det afspejler de store forskelle mellem vedhæftede mekanismer på tværs af forskellige arter. Valget af en passende polymer er derfor afhængig af anvendelsen, men de lave-bindende polymerer er let identificeres ved sammenligning med agarose. Højtbindende polymerer er tilbøjelige til at blive identificeret i en matrix, og kan anvendes som positive kontroller til efterfølgende eksperimenter. For polymerer, som ikke viser autofluorescens i DAPI kanal, kvalitativ comparison plettens billeder kan gøres visuelt (som vist i figur 3, der fremhæver en repræsentant på højt polymer og tre eksempel low-bindende polymerer). En sådan sammenligning, men samtidig give færre oplysninger end den statistiske analyse, kan være et nyttigt visuel validering af intensitetsværdierne beregnet.
Med identificeret 22 passende polymerer ved hjælp af microarray, er skala-up eksperimenter udført for at bekræfte deres bakterier afvisende ejendom, når de anvendes til belægning større flader. Vist er de bedste resultater eksempler, der anvendes til at belægge dækglas (analyseret af SEM (figur 4 og 5)) og kateter skiver (analyseret ved konfokal mikroskopi (figur 6) og SEM (figur 7)). Begge mikroskopiske metoder har fordelen ved at tillade direkte celletal på overfladen, giver entydig data; reduktion i cellebinding er let visible. Disse belægninger, som bedst bibeholdt repellent ejendomme i opskalering, samt at det er muligt at foretage en omfattende belægningsteknikker blev undersøgt yderligere. De viste resultater illustrerer de bedste resultater polymerer fra hver etape.
Figur 1:. Trin i identifikationen af bakterier frastødende polymerer gennem polymer microarrays for biomedicinske anvendelser SEM = scanningselektronmikroskopi.
Figur 2:. Bakteriel bindende for en række af polymerer, bestemt ved microarray analyse lav bakteriel binding set på en række polyacrylater / acrylamider (PA) og polyurethaner (PU). Resultater fra polymere microarrays probet med flere bakterielle s pecies (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, og to konsortier BacMix-1 og BacMix-2) er vist. Bakteriel binding udtrykt som baggrund korrigeret middelværdi DAPI fluorescensintensitet (normaliseret). Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. Tilpasset fra henvisning 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Eksempel billeder af polymer pletter Fluorescence (DAPI) og lysfelt mikroskopi billeder af BacMix-2 viser bakteriel fastgørelse på repræsentative polymerer. Et stærkt polymer er inkluderet til sammenligning med flere ikke-bindende polymerer (PU-20, PA-336 og PU-179). Scale bar = 100 um. Tilpasset fra henvisning 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Scale-up eksperimenter med dækglas SEM billeder, der viser bakteriel vedhæftet fil på ubestrøget glas og glas beklædt med "hit" polymerer (eksempler valgt fra tabel 1).. Scale barer = 20 pm.
Figur 5:. Bakteriel binding kvantificeres ved celletal fra SEM billeder Sammenligning af celler knyttet per arealenhed af overflader belagt med de bedste "hit" polymerer. Agarose blev anvendt som kontrol "ikke-bindende" overflade, med glas som kontrol bindende overflade. Fejlsøjler repræsentererstandardafvigelse.
Figur 6: Sammenligning af bakteriel binding på bestrøget og ubestrøget kateter skiver Konfokal billeder sammenligne ubehandlet kateter (cath-1) (A) og kateter overtrukket med PA13 (B) efter inkubation med BacMix-2.. Billeder taget med en 40X objektiv (Scale bar = 20 um). Tilpasset fra henvisning 6.
Figur 7:. Sammenligning af bakteriel binding på bestrøget og ubestrøget kateter skiver SEM billeder viser sammenligning af ubehandlet kateter (cath-1) (A) og kateter overtrukket med PA13 (B) efter inkubation med en bakteriel cocktail bestående af BacMix-2 Scale. barer = 101; m. Tilpasset fra henvisning 6.
| Polymer | Monomer 1 | Monomer 2 | Monomer 3 | Forholdet mellem monomerer | ||
| PA465 | MEMA | DEAEMA | HEA | 8 | 1 | 1 |
| PA475 | MEMA | DEAEA | HEMA | 6 | 1 | 3 |
| PA513 | MEMA | DEAEMA | MMA | 8 | 1 | 1 |
| PA515 | MEMA | DEAEA | MMA | 6 | 1 | 3 |
| PA13 | DMAA | - | 9 | 1 | - | |
| PU1 | PEG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU16 | PEG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU161 | PEG2000 | MDI | BD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU7 | PEG900 | Bich | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU83 | PEG900 | HMDI | BD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU227 | PPG-PEG-1900 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU129 | PPG425 | Bich | DMAPD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU10 | PTMG2000 | Bich | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU179 | PTMG2000 | HDI | NMAPD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU20 | PTMG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU5 | PTMG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
Tabel 1: Sammensætning af bakterierne ikke-bindende "hit" polymerer i figur 2.
Discussion
Fastgørelse af bakterier på en overflade er en kompleks proces bestemt af en lang række faktorer afhængig af de bakteriearter, egenskaberne af overfladen, det omgivende medium og det fysiske miljø. Selvom visse kemiske grupper er kendt for at påvirke bakterielle binding (polyglycoler, for eksempel typisk modstå fastgørelse 11), korrelering af biologiske indvirkning polymerer med deres kemiske strukturer er vanskeligt, hvilket gør rationelt design af polymerer til specifikke funktioner udfordrende. I mangel af detaljerede fastgørelsesmekanismer, har andre undersøgelser forsøgt at efterligne naturligt forekommende frastødende overflader, med langvarig og omfattende optimering processer 21. Den miniaturiserede high-throughput metode præsenteres her overvinder disse udfordringer ved at lette parallel screening af hundredvis af polymerer til at identificere leads til yderligere undersøgelse.
Resultater fra microarray metode hovedsageligt tjener til IDEntify sandsynligt føre kandidater. Figur 2 illustrerer 22 kandidater med lav binding af mindst én art, mens figur 3 viser tydelig reduktion i bindingskapacitet. Alle 22 lav-bindende polymerer er vist i i Figur 2 blev taget frem til scale-up eksperimenter, hvorunder det bedste (i form af Repellence og overtræksegenskaber) blev bestemt til at være PU83, PA13, og PA515 (figur 4 og 5). Polyacrylater giver større fleksibilitet med hensyn til polymerisationsmetoder og så den laveste bindende polyacrylat, PA13, blev valgt til kateter belægning undersøgelser (figur 6 og 7). Mere detaljeret videre arbejde med andre kandidater blev udført og er blevet rapporteret andetsteds 6.
Gennem en række eksperimentelle iterationer fandt vi en række mindre skridt var nøglen til succes og reproducerbarhed. Samt lette adhæsionen afpolymerer til objektglas ved brug af en agarose under-belægning giver en ren baggrund, som agarose er meget modstandsdygtigt over for bakteriel kolonisering. Ligeledes konsistens i polymeren blev selv, både inden for samme array og mellem arrays, er afgørende, og derfor trykningen af de arrays skal omhyggeligt kontrolleres. Omhyggelig justering af stifterne i print-hoved og også ensartet fyldning af 384 brønde er forpligtet til at sikre ensartet spotting. Som nogle af polymererne vi anvendte udviste en vis grad af autofluorescens under baggrund fluorescensdata for hvert objektglas før inkubation med bakterier var afgørende. For at tage højde for variationer og for at opnå robuste data gentagelser af mikroarrays rådes.
Den anvendes her farvning (DAPI) har ingen selektivitet for bakteriearter, bindende ikke-specifikt til DNA. Derfor god aseptisk teknik er afgørende, når bakteriekulturer introduceres som forureninger kan gå upåagtet hen, forvirrende fortolk-førelsen af resultaterne. Det samme gælder for senere eksperimenter under anvendelse af scanningselektronmikroskopi, hvor det kun er muligt at skelne stænger og kokker, men ikke slægt eller art.
Efter microarray screening, bør lovende polymerer vælges for yderligere validering. I eksemplet præsenteret her blev syv polymerer af interesse identificeres ved deres klar reduktion i fluorescens på mikroarrayet og deres inhibering af binding blev bekræftet ved at coate dem på større flader. Figur 4 og 5 viser reduktionen i binding opnået på dækglas, en praktiske midler til at teste opførslen af polymererne bulk overtræk snarere end som microarray pletter. Efterfølgende blev disse polymerer belagt på medicinsk udstyr til fuldt ud at kvantificere reduktion i bakteriel vedhæftet fil. Det er vigtigt, at opløsningsmidlet vælges (se protokol afsnit 8) for disse coating studier er godartet til den ønskede substrat (her kateteret), mens beholdeing evne til at opløse polymeren af interesse, for at tillade belægning. Her anvendte vi acetone, der, såvel som egenskaberne nævnt, har et lavt kogepunkt og fordamper hurtigt til at give en ensartet coating.
Midlerne til validering valgt, vil afhænge af den specifikke anvendelse, der undersøges. Som observation af celler ved elektronmikroskopi og fluorescens mikroskopi giver mulighed for direkte kvantificering af enkelte celle vedhæftet fil, vi valgte disse teknikker som et supplement til bulk farvning microarray analyse. Resultater er vist i figur 6 og 7, som viser, hvor vigtigt det gratis valideringsmetoder. De konfokale billeder i figur 6 giver meget klare billeder af individuelle celler, mens SEM har den ekstra fordel, at en vurdering af overfladen af polymeren, som er her glat og ensartet. Disse fremgangsmåder er begrænset af synsfeltet af mikroskoper anvendte, og det er derfor important til at tage en række snapshots til at have tillid til resultaterne. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan ikke kvantificere bakteriel adhærens over hele overfladen, kun udlede dækning fra en række af små regioner. Vi mener, at dette er tilstrækkeligt for anvendelsen beskrevet. Reduktion i bakteriel binding kunne vurderes ved optælling klæbet bakterier på hele og uden overtræk kateter stykker med metoder som beskrevet andetsteds 22. Sådanne fremgangsmåder kræver biomaterialet overflader screenet med ensartede overfladeareal, som er vanskeligt at opretholde, når analyser udføres med medicinsk udstyr, der ofte har kompleks geometri.
Det er klart, skal enhver anordning bestemt til klinisk brug gennemgår betydelige yderligere test for at sikre sikkerhed og effektivitet i mennesker. Fremgangsmåden præsenteres her repræsenterer begyndelsen af denne proces og yderligere arbejde skal omfatte bekræftelse af in vivo-aktivitet. I dette tilfælde studerer venøs catheters, indledende arbejde kunne undersøge bindingen af blodkomponenter og hele celler til polymeren. Bør også overvejes Effekten af blodkomponenter på bakteriel binding, eventuelt ved at gentage de bindende assays i tilstedeværelsen af inaktiveret serum eller de-fibrinated blod 23. Den endelige test af teknologi ske i en in vivo model, såsom et subkutant implantat infektion model 24.
Vi demonstrerer potentialet af polymeren microarray metode til screening af overfladen-ændring polymerer. Sådanne polymerer (både modstand og fremmer bakteriel binding) har et stort antal ansøgninger inden for medicin, fødevareindustrien og bioteknologi, hvilket betyder denne metode kan være nyttig i mange forskningsområder. Selv om arbejdet her anvender bakterier, kunne fremgangsmåden tilpasses til andre celletyper og ligeledes andre kemiske microarrays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).
- Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).
- Kuo, J. Electron microscopy methods and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
