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Bioengineering

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

doi: 10.3791/54382 Published: November 5, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

Microarrays polymères sont miniaturisés plates - formes à haut débit dans lequel jusqu'à 7.000 polymères 1 sont imprimés sur des lames de verre pour analyse parallèle avec des cellules procaryotes ou eucaryotes 2. La méthode présentée ici se fonde sur ce que nous avons décrit la première en 2010 3. Ce système de contrôle a été appliqué à de nombreux types de cellules , y compris les hépatocytes humains 4, des cellules souches 5, les cellules épithéliales des tubules rénaux 2, les bactéries 3,6 et protozoaires pathogènes 7. Dans chaque cas, les polymères qui favorisent ou résistent à la liaison des cellules à l'étude ont été identifiés 8. Complexes d'ADN avec des polymères polycationiques synthétiques ont également été utilisés sous la forme de puces à ADN pour le criblage à haut débit des candidats de transfection du gène 9. Ainsi que le dépistage des interactions cellule-substrat, des microréseaux de polymères ont également été utilisés pour l' évaluation des propriétés des matériaux 10.

"> La capacité des polymères synthétiques pour moduler la fixation des bactéries à une surface est bien nombreux facteurs , y compris la charge, le caractère hydrophobe et la rugosité de surface de la surface du polymère sont connus pour affecter. Les approches conventionnelles de liaison bactériennes de la découverte biomatériaux établie 3,6,11. qui résistent à la liaison de bactéries par séquentiellement ou empiriquement concevoir et tester un matériau à la fois sont de main-d'œuvre, coûteux et processus de temps. microarrays polymères offrent une alternative intéressante pour contourner ces limitations.

les bactéries de surface associée à grandir comme une population complexe appelé un biofilm - ces biofilms sont très résistants à de nombreuses contraintes et des antibiotiques environnementaux. Ceci est en partie en raison de leur matrice extracellulaire dense (composé de protéines, des polysaccharides et des acides nucléiques) 12 et en partie en raison de la présence accrue de robustes "persistor" cellules dans les biofilms 13. although les mécanismes précis de l' association de surface et la formation de biofilm ultérieure sont difficiles à caractériser, il est généralement admis qu'il existe trois différents stades de croissance de la surface 14 - 16. , La fixation réversible initiale est suivie d'une adhérence plus forte des cellules, la mise en place d'un biofilm par la production d'une protéine extracellulaire et de la matrice de polysaccharide et de la prolifération cellulaire. Enfin, les biofilms matures libère les cellules planctoniques, qui peuvent initier de nouvelles infections ailleurs vivant en liberté. polymères qui empêchent la fixation initiale des bactéries, et donc empêchent premières étapes de la formation de biofilm de bactéries repoussant, représentent potentiellement une excellente solution pour minimiser les infections. Compte tenu de l'augmentation de la résistance aux antibiotiques (et aussi la plus grande résistance intrinsèque des bactéries associées à la surface 12), un moyen sans antibiotique pour réduire les infections sont particulièrement intéressantes. Dans un milieu hospitalier, polymère bactéries repoussantrevêtements peuvent avoir une application médicale directe dans la réduction des infections nosocomiales, qui forment généralement des dispositifs implantés autour de 17.

Ici, une méthode à haut débit pour le criblage de 381 polymères pour l' activité répulsive contre une gamme de bactéries pathogènes associés aux infections nosocomiales, suivie de la validation de succès et revêtement ultérieur et le dosage des matériaux centraux de cathéter veineux, est décrit (Figure 1). En bref, les polymères ont été repérés sur agarose revêtu des lames de verre par l'impression de contact et, après le séchage et la stérilisation, les réseaux miniaturisés ont été incubées avec des cultures bactériennes cliniquement importantes. Après incubation, les puces à ADN ont été doucement lavées et les cellules bactériennes adhérentes ont été colorées et visualisés par fluorescence. Par la suite, des polymères qui inhibent la liaison des bactéries ont été étudiées sur une plus grande échelle par enduction sur des lamelles de verre et visualisés par microscopie électronique. repel sélectionnépolymères prêtés ont ensuite été appliqués sur des cathéters commerciaux et montrés pour réduire l'attachement des bactéries de près de 100 fois.

Protocol

1. Préparation des lames Agarose Coated

REMARQUE: avant la fabrication des puces à ADN de polymère, des lames de verre revêtues aminoalkylsilane sont revêtues d'agarose IB pour minimiser la liaison de fond non spécifique et permettre une évaluation des polymères qui se lient ou se repoussent les bactéries 6. revêtement Silane facilite la liaison d'agarose aux diapositives.

  1. Constituer une solution à 2% d'agarose IB dans de l'eau distillée dans une bouteille de 250 ml (p / v).
  2. Après coiffage la bouteille lâche, chauffer la suspension dans un four à micro-ondes dans les 30 périodes sec jusqu'à dissolution. Assurez-vous que le bouchon ne soit pas bien fermé pour éviter tout risque de pression accumulation. Retirez la bouteille régulièrement et agiter doucement.
  3. Veiller à ce que le solide soit dissous et la solution est claire. Versez cette solution d'agarose dans un bécher de 100 ml, et le placer dans un bain-marie à 65 ° C pour maintenir une solution liquide.
  4. Plonger les lames de silane enrobées dans la solution d'agarose, assurant un revêtement uniforme, et wipe le dos de la lame avec un mouchoir en papier.
  5. Sécher les lames, avec le côté revêtu haut, dans un environnement exempt de poussière (par exemple, à l' intérieur d' une armoire ou hotte) pour un minimum de 24 heures.
  6. Confirmer un revêtement uniforme par inspection visuelle. Revêtement peut être facilement évaluée par la respiration sur la lame - la condensation se forme sur les régions non revêtues. Seules les lames revêtues entièrement et uniformément devraient être utilisés pour l'impression de biopuces.

2. Préparation des solutions de polymères pour l'impression

  1. Préparer des solutions (1% p / v) d'une sélection de polymères préformés , comprenant des polyacrylates, des Polyacrylamides et des polyuréthannes dans de la N - méthylpyrrolidone (NMP) dans des flacons en verre. (Préparer 1 ml de chaque polymère). Vortex jusqu'à ce que le polymère est complètement dissous. Synthèse de polymères est décrit ailleurs 6.
  2. L'utilisation d'un micro-pipette, remplir chaque puits d'une plaque à 384 micropuits avec une solution de polymère de 25 pi, assurant qu'il n'y a pas de croix contamination et chaque puits contient un polymère unique. Utiliser la NMP comme témoin négatif dans au moins 2 puits. Noter l'identité de solution de polymère dans chaque puits sur un fichier et de modèle de plaque ou feuille de calcul.

3. Impression de polymère Microarrays Utilisation d'un contact imprimante

REMARQUE: L'impression de biopuces a été réalisée en utilisant une imprimante de contact. Des instructions spécifiques concernant l'impression de microréseau de polymère sont donnés ci-dessous. Pour obtenir des directives générales sur l'utilisation des recommandations de l'imprimante et de sécurité, suivez le mode d'emploi du fabricant. Même si on utilise une imprimante de contact, un dispositif d'emboutissage manuel approprié pourrait également être utilisé.

  1. Comme indiqué dans le mode d'emploi de l'imprimante, créer une routine (voir l'étape 3.3) qui permet l'impression de 384 liquides (les solutions de polymères ou NMP) en quatre exemplaires, en utilisant une tête de microréseau 32 broches (disposées comme 8 lignes et 4 colonnes).
  2. Imprimer 1.536 points disposés en 48 rangées et 32 ​​colonnes. Programmer la routine pour imprimer en 12 sections, ie., 32 solutions à la fois, de sorte que l'imprimante peut être arrêtée après l' impression de chaque section pour permettre le nettoyage de broches.
  3. Pour créer une routine d'impression:
    1. Ouvrez le logiciel et les options disponibles choisissent «Créer une nouvelle routine. Sélectionnez l'onglet «Description» aux détails d'entrée de l'expérience. Sélectionnez l'onglet 'Head' et choisissez '32 -pin tête de microréseau.
    2. Sélectionnez l'onglet 'Source' et choisissez support de plaque (support de plaque de source (1x5)), le type de plaque (plaque 384 x 6000), plaques totales (1) et de l'ordre de source (par des colonnes).
    3. Dans l'onglet 'Slide design', choisissez '3x1' 'slide' et choisissez par rangeant 'Numéro de champ'. Ensuite, sélectionnez «motif de formation de réseau». Entrée 'Vue Spot' comme «mise en page» et «dimensions Pattern» comme «Nombre de lignes» (6), «Nombre de colonnes» (8), «pitch Row» (750) et «pas Colonne» (560). Choisissez une section à imprimer sapinst.
    4. Dans le 'Slide layout' entrée onglet le nombre de diapositives utilisé pour l'impression. Sélectionnez l'onglet 'Imprimer' pour saisir les paramètres d'impression (nombre de timbres par encrage: 1, nombre de timbres par point: 5, horodatage: 200 msec, le temps d'encrage: 100 msec).
      NOTE: Une routine est maintenant créé pour l'impression de 384 liquides (les solutions de polymères ou NMP) en quatre exemplaires, en utilisant une tête de microréseau 32 broches (disposées comme 8 lignes et 4 colonnes). Au total, la routine doit imprimer 1.536 points disposés en 48 lignes et 32 ​​colonnes avec un pas de ligne de 750 um et la hauteur de la colonne de 560 um.
  4. Placer les lames d'agarose revêtues sur la plate-forme et d'assurer une bonne étanchéité de vide pour maintenir les lames en position.
  5. Ajustez la tête d'impression de telle sorte que toutes les broches sont à la même hauteur. Vérifiez ceci en abaissant manuellement la tête sur une lame de verre et de confirmer que les broches se déplacent en même temps. S'il y a des divergences avec la hauteur, régler en utilisant le sleeve sur la tige vers le haut ou vers le bas.
  6. Placer la plaque de puits sur le support de plaque dans le bon sens, à savoir., Bien A1 est en haut à droite du support et assurer la plaque bien est fixé fermement.
  7. À l'aide du dispositif de réglage en hauteur, en sorte que la hauteur du support de plaque est telle que lors de la cueillette des solutions de polymères, les broches ne touchent pas le fond des puits.
    NOTE: Ceci est important pour les taches de polymère uniforme et aussi pour éviter de renverser des solutions de polymères dans des puits adjacents, provoquant ainsi la contamination croisée.
  8. Sélectionnez l'onglet «Démarrer» et choisissez «type Run» comme «normale». Cliquez sur "Exécuter", et confirmer cette diapositive, bien plaque, etc., sont en position lorsque vous êtes invité.
  9. Imprimer 1 section à la fois (32 solutions à la fois; 12 sections), permettant le nettoyage des broches entre les sections. Nettoyez les broches à fond avec une serviette en papier trempé dans de l'acétone, suivie par du papier de soie sèche pour assurer les broches sont complètement sec.
  10. A la fin de l'impression des microarrays, placez-les dans un support de diapositives et les sécher pendant la nuit dans une étuve sous vide réglée à 45 ° C pour éliminer le NMP dans les points de polymère. Après stérilisation à la lumière UV pendant 30 minutes, les microréseaux sont prêts pour l'inoculation des bactéries.
  11. Avant inoculant diapositives avec des bactéries, de prendre une mesure de fluorescence de fond (comme décrit dans la section 5). Utiliser cette mesure dans le calcul de la liaison bactérienne.

4. Ensemencement des polymères microarrays avec des bactéries

REMARQUE: Veiller à une bonne technique aseptique. Toutes les manipulations des cultures doit être réalisée dans un environnement stérile: soit à l'aide d'un brûleur Bunsen ou dans une hotte à flux. Les cultures doivent être cultivées avec la disponibilité de l'oxygène, le milieu de croissance, et la température ajustée aux exigences de chaque espèce.

  1. Préparer cultures d'une nuit en inoculant 5 ml Luria-Bertani bouillon (LB: 10 g L -1 bactotryptone, 5 g L -1 NaCl et 10 g L <sup> -1 extrait de levure) avec une colonie d'une plaque. Incuber une nuit à 37 ° C, en agitant à 200 tours par minute.
  2. Préparer les stocks de congélation des cultures d'une nuit par addition de glycérol (10% concentration globale) et stocker le stock à -80 ° C.
  3. Afin de déterminer le nombre de cellules à partir d'échantillons des souches bactériennes décongelés, effectuer des dilutions en série de chaque stock et faire croître les bactéries pendant la nuit sur des supports solides. La détermination précise du nombre de cellules dans les stocks assure l' inoculation appropriée de chaque espèce 6.
  4. Pour préparer des inoculums microréseau. cultures monospécifiques sont cultivées comme ci-dessus et appliqués directement sur les microréseaux. BacMix-1 est un mélange bactérien de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), et Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 est un mélange de bactéries constitué par Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus K. pneumoniae et Enterococcus faecalis (E. faecalis).
  5. Pour produire soit une culture mixte, mélanger overnights en volumes égaux (3 ml chacun) et diluer quatre fois avec LB frais (à environ 50 ml de volume final).
  6. Placez microarrays de polymère stérilisé aux rayons UV dans des plaques 4 puits rectangulaires et les incuber avec 6 ml de cultures bactériennes mixtes à 37 ° C avec une légère agitation (30 rpm) pendant 5 jours.
  7. Après incubation, rincer doucement les microréseaux deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS: NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4) et on incube avec une solution de 1 pg ml - 1 de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) tache dans du PBS pendant 30 min.
  8. Laver les lames microarray colorées dans une plaque de puits fraîche en couvrant avec du PBS et remuant doucement, en changeant le PBS une fois. Sec sous un courant d'air. Appliquer une lamelle de verre à la diapositive de microréseaux et le joint en place avec de la colle. Une fois dry, stériliser la surface extérieure avec 70% (v / v) d'éthanol.
  9. Mettez au rebut des cultures en fonction de leur niveau de confinement.

5. Microarray Imaging and Analysis

  1. Capture d'images individuelles pour chaque tache polymère clair et DAPI (/ Em = 358 nm / 361 nm Ex) canaux. Effectuer cette opération manuellement avec un microscope à fluorescence ou à l'aide d'un microscope à fluorescence automatisée (avec une platine XYZ commandé par un logiciel d'acquisition d'image) équipé d'un objectif 20X.
    REMARQUE: Se reporter au manuel 18 pour faire fonctionner le logiciel et le réglage du microscope pour obtenir des images en utilisant des canaux de fond clair et DAPI. Assurez-vous que le gain et le temps d'exposition pour la capture d'image pour tous les microarrays sont les mêmes.
  2. Obtenir l'intensité de fluorescence moyenne de chaque spot dans le canal DAPI en choisissant la zone spot et la quantification de la fluorescence avec un logiciel de traitement d'image.
  3. Pour la fluorescence de chaque tache de fond, bénéficier du droitdans les images des points de polymère sur un microréseau répliquée incubé seulement avec les médias sans bactéries. Déduire la fluorescence de fond de l'intensité de la tache pour obtenir la fluorescence des bactéries.
  4. Calculer la valeur normalisée moyenne des quatre points, ce qui représente chaque polymère, utilisé pour comparer les bactéries de liaison de divers polymères 6.
  5. Identifier les polymères qui présentent la liaison (fluorescence la plus basse) moins bactérienne que les polymères «hit» 6.

6. Revêtement de la couverture Slips pour la validation 'Hit'

  1. Pour Lamelles Coat avec Polymers:
    1. Préparer des solutions de polymères «hit» (~ 2% p / v) dans du tétrahydrofurane (THF), ou un autre solvant approprié.
    2. revêtement par rotation des lamelles en verre circulaire de taille appropriée avec les solutions de polymères en utilisant une tournette à 2000 tours par minute pendant 10 s.
      NOTE: En l'absence d'une tournette, des lamelles ou d'autres matériaux peut être enduit par trempage, bien essoragele revêtement produit une surface plus uniforme.
    3. Sécher les lamelles enrobées dans un four à convection à 40 ° C pendant une nuit et stériliser à l'aide d'une lumière UV pendant 30 minutes avant l'inoculation des bactéries.
  2. Pour Lamelles Manteau avec Agarose pour les contrôles négatifs:
    1. Nettoyer les lamelles soit par traitement au plasma pendant 10 min ou immersion dans NaOH 1 M pendant 4 heures.
    2. Immerger les lamelles couvre-objet dans de l'acétonitrile contenant 1% (3-aminopropyl) triéthoxysilane pendant une nuit. Nettoyer les lamelles avec de l'acétone 3 fois et les mettre dans un four (100 ° C) pendant 1 heure.
    3. manteau de Dip Les lamelles séchées avec 1% solution aqueuse d'agarose maintenues dans un bain d'eau à 60 ° C. Placer les agarose revêtu des lamelles sur une surface plane dans des conditions ambiantes sans poussière pendant 24 h et stériliser en utilisant la lumière UV pendant 30 minutes avant de bactéries inoculer.

7. Fixation et analyse de la couverture Slip utilisant microscope électronique à balayage (MEB)

  1. Aprèsla stérilisation à la lumière UV pendant 30 minutes, placez les lamelles (polymère / verre agarose revêtu ou non) dans une plaque de 12 puits standard ou plaque de 24 puits (en fonction de la taille des lamelles) et incuber avec des bactéries comme décrit dans la section 4.
  2. Après incubation avec des bactéries, se laver les lamelles couchés et non couchés à deux reprises avec 0,1 M de tampon cacodylate (pH 7,4), puis fixer avec 2,5% (p / v) de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,1 M (pH 7,4) pendant 2 heures.
  3. échantillons post-fixage avec 1% (p / v) de tétroxyde d'osmium pendant 1 h à température ambiante et on déshydrate avec des lavages successifs à l'éthanol à 50, 70, 90 et 100% (v / v) pendant 30 minutes chacune.
  4. Des échantillons secs de CO 2 selon les protocoles standards 19. Le temps de séchage dépendra de la nature de l'échantillon.
  5. échantillons de manteau dans un alliage or / palladium (60/40%) en utilisant une coucheuse par pulvérisation cathodique avec un courant à 30 mA et vide à 0,75 Torr. Examiner sous un microscope électronique , selon des protocoles standard 20.
    NOTE: Ensure mesures de sécurité adéquates pour gérer les risques résultant du stockage, la manipulation et l'élimination des Osmium tétraoxyde, car il est très toxique.
  6. comparer visuellement les images des lamelles non revêtues et celles revêtues d'agarose ou les polymères «hit» pour confirmer bactériennes capacités de liaison / répulsives des polymères.
    NOTE: La résistance de l'attachement doit être facilement visible comme une réduction des cellules présentes.
  7. Choisissez les plus prometteurs «hit» des polymères non contraignants pour les études de revêtement avec des dispositifs médicaux (par exemple, des cathéters veineux centraux) 6.

8. Sélection d'un solvant pour revêtement de cathéters

  1. Évaluer divers solvants pour leur compatibilité avec la partie inhabitation du cathéter, ainsi que leur capacité à dissoudre le polymère «hit». Coupez les parties de cath-1 et en morceaux cylindriques de 5 mm de longueur, et de mesurer avec un pied à coulisse numérique.
  2. Évaluer divers solvants tels que acetl' acide ique, l' ammoniac, l' acétone, l' acétonitrile, l' éther diéthylique, le tétrahydrofuranne (THF), le diméthylformamide (DMF), le N - méthyl-2-pyrrolidone (NMP), l' éthanol, le méthanol, l' éthylène glycol, le toluène et le xylène. Immerger morceaux de cathéters dans les solvants pendant 12 heures et à évaluer visuellement l'intégrité du cathéter et la clarté du solvant.
    REMARQUE: Choisissez un solvant qui ne provoque pas les cathéters à gonfler ou se désintègrent ou se traduisent par un solvant turbide. Le solvant doit dissoudre les polymères «hit».

9. Analyse de la fixation des bactéries sur les cathéters par microscopie confocale

  1. Préparer 2,5% (p / v) des solutions de polymères dans de l'acétone ou un autre solvant approprié tel que déterminé dans la section 8. Placer 5 pièces mm de cathéter dans un petit flacon de verre (5 ml) et les plonger dans 1 ml de la solution de polymère pendant 2 min . Retirer la solution de polymère en excès et sécher les morceaux de cathéter pendant une nuit dans une étuve sous vide à 40 ° C.
  2. Préparer inoculum en mélangeant décongelé st bactériennetroupeaux pour donner environ 10 6 cellules de chaque espèce dans 50 ml LB 6.
  3. Stériliser morceaux de cathéter couchés et non couchés avec une lumière UV pendant 30 min et incuber avec 1 ml inoculées LB dans une plaque de 24 puits, à 37 ° C pendant 3 jours, avec agitation douce 6.
  4. Après incubation, laver les cathéters avec du PBS (2x, 2 ml), fixer les bactéries avec 10% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 30 min, et laver avec du PBS (1 ml). Colorer les bactéries sur des morceaux de cathéter avec du DAPI (1 pg ml - 1) pendant 20 minutes et on lave avec du PBS (1 ml).
  5. Obtenir des images confocale des pièces de cathéter en utilisant les paramètres suivants: 405nm bleu diode laser, plage de détecteur 414-502 nm, trou d'épingle - Airy1, l'image Taille - 1.024 × 1.024 pixels, largeur de voxel - 105,2 nm, Z-piles d'espacement 0.5μ m , grossissement - 40X 1,25.
  6. Terminez l'imagerie confocale par Z-empilement 50 images à travers longueur de 100 um du cathéter.
  7. Analyser les images en utilisant suitabLe logiciel d'analyse: aplatir les images en Z empilée dans le plan Z, en utilisant la fonction pour étendre la profondeur de champ, pour créer une seule image d'une pièce de cathéter.
    NOTE: Cette image doit ensuite être analysé pour obtenir la zone du cathéter couverte par des bactéries, après correction d'arrière-plan en utilisant la fonction 'aplatir background'.

10. L'analyse de la fixation des bactéries sur les cathéters par SEM

  1. Préparer une solution à 10% de polymère (p / v) dans de l'acétone.
  2. Appuyez sur une pointe de pipette (pour 200 ul micropipette) dans la partie médiane de la pièce du cathéter de coupe pour le maintenir et tremper la pièce dans la solution de polymère pendant environ 30 secondes. Sécher la pièce revêtue dans des conditions ambiantes pendant 30 min. Appliquer un second revêtement par immersion à nouveau dans la solution de polymère et sécher pendant la nuit dans des conditions ambiantes.
  3. Après le traitement UV et une incubation avec des bactéries se laver les morceaux (n = 3) avec du PBS (2x 1 ml) et de les transférer dans des plaques à 48 puits contenant 10% de formaldehyde dans du PBS pendant 30 min. Après la fixation, se laver les morceaux avec du PBS (1 ml), sécher pendant la nuit à la température ambiante, monter sur les talons avec des disques de carbone conducteur, et le manteau d'or en utilisant une coucheuse de pulvérisation (voir l'étape 7.5).
  4. Obtenir des images en utilisant un microscope électronique à balayage 6.

Representative Results

La figure 2 montre la fixation des bactéries (intensité de fluorescence normalisée) à un certain nombre de polymères tels que déterminés par analyse par microréseau. Spots imprimés sans polymère (NMP seulement) sont le contrôle négatif, que l' agarose résiste fortement la liaison 6 bactérienne - fluorescence enregistrée est très faible. Les polymères affichés sont tous à faible liaison, bien que dans la plupart des cas, les propriétés répulsives d'un polymère varie considérablement entre les espèces bactériennes testées. Cela reflète les grandes différences entre les mécanismes de fixation à travers les différentes espèces. La sélection d'un polymère approprié est donc fonction de l'application, mais les polymères de faible liaison sont facilement identifiés par comparaison avec d'agarose. polymères de haute liaison sont susceptibles d'être identifiés dans un tableau, et peuvent être utilisés comme témoins positifs pour les expériences ultérieures. Pour les polymères qui ne présentent pas d'auto-fluorescence dans le canal DAPI, co qualitativemparison des images spot peut être fait visuellement (comme le montre la figure 3, mettant en évidence un polymère de haute liaison représentant et trois par exemple des polymères à faible liaison). Une telle comparaison, tout en fournissant moins d'informations que l'analyse statistique peut être une validation visuelle utile des valeurs d'intensité calculées.

Avec 22 polymères appropriés identifiés par micropuce, expériences à l'échelle-up sont effectuées pour confirmer leur propriété bactéries repoussant lorsqu'il est utilisé pour le revêtement de surfaces plus grandes. Montré sont les exemples les plus performants, utilisés pour des lamelles de verre de revêtement (analysées par SEM (figures 4 et 5)) et les tranches de cathéter (analysées par microscopie confocale (figure 6) et SEM (figure 7)). Les deux méthodes microscopiques ont l'avantage de permettre la numération des cellules directes sur la surface, fournissant des données sans ambiguïté; réduction de la fixation des cellules est facilement visible. Ces revêtements qui conservaient le mieux à leurs propriétés répulsives sur l'échelle, tout en étant prête à des techniques de revêtement à grande échelle, ont été étudiées plus loin. Les résultats présentés illustrent les polymères les plus performants de chaque étape.

Figure 1
Figure 1: ETM = microscopie électronique Les étapes impliquées dans l'identification de bactéries polymères hydrophobes par des microréseaux de polymères pour des applications biomédicales de numérisation..

Figure 2
Figure 2:. Liaison bactérienne sur une série de polymères, déterminée par l' analyse des microréseaux faible liaison bactérienne est vu sur un certain nombre de polyacrylates / acrylamides (PA) et polyuréthanes (PU). Les résultats des microréseaux polymères sondées avec plusieurs s bactériens Les espèces (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, et deux consortiums; BacMix-1 et BacMix-2) sont présentés. Bactérienne liaison exprimée en fond corrigée moyenne DAPI intensité de fluorescence (normalisée). Les barres d'erreur représentent l'écart type. Adapté de la référence 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Images Exemples de spots polymères Fluorescence (DAPI) et microscopie en fond clair images de BacMix-2 montrant la fixation des bactéries sur des polymères représentatifs. Un polymère fortement contraignant est inclus à titre de comparaison à plusieurs polymères non contraignants (PU-20, PA-336 et PU-179). Barre d'échelle = 100 um. Adapté de la référence 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: expériences d'échelle-up avec des lamelles de verre images MEB montrant la fixation des bactéries sur le verre non couché et le verre revêtu de polymères «hit» (exemples choisis dans le tableau 1).. Les barres d'échelle = 20 pm.

Figure 5
Figure 5:. Liaison bactérienne quantifiée par le nombre de cellules à partir d' images MEB Comparaison des cellules fixées par unité de surface des surfaces revêtues avec les meilleurs polymères «hit». Agarose a été utilisé comme «non contraignant» surface d'un contrôle, avec le verre comme surface de liaison de contrôle. Les barres d'erreur représententécart-type.

Figure 6
Figure 6: Comparaison de la fixation des bactéries sur des tranches de cathéters revêtus et non revêtus de comparaison d' images confocales cathéter non traité (Cath-1) (A) et le cathéter revêtu de PA13 (B) après incubation avec BacMix-2.. Les images prises avec un objectif 40X (barre d'échelle = 20 pm). Adapté de la référence 6.

Figure 7
Figure 7:. La comparaison de la liaison bactérienne sur des tranches de cathéter revêtues et non revêtues images MEB montrent la comparaison d' un cathéter non traité (Cath-1) (A) et le cathéter revêtu de PA13 (B) après incubation avec un cocktail de bactéries consistant en BacMix-2 Scale. barres = 101; m. Adapté de la référence 6.

Polymère monomère 1 monomère 2 monomère 3 Ratio de Monomères
PA465 MEMA DEAEMA IL A 8 1 1
PA475 MEMA DEAEA HEMA 6 1 3
PA513 MEMA DEAEMA MMA 8 1 1
PA515 MEMA DEAEA MMA 6 1 3
PA13 DMAA - 9 1 -
PU1 PEG2000 HDI - 4.9 5.2 -
PU16 PEG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU161 PEG2000 MDI BD 2.5 5.2 2.3
PU7 PEG900 BICH - 4.9 5.2 -
PU83 PEG900 HMDI BD 2.5 5.2 2.3
PU227 PPG-PEG-1900 HDI - 4.9 5.2 -
PU129 PPG425 BICH DMAPD 2.5 5.2 2.3
PU10 PTMG2000 BICH - 4.9 5.2 -
PU179 PTMG2000 HDI NMAPD 2.5 5.2 2.3
PU20 PTMG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU5 PTMG2000 HDI - 4.9 5.2 -

Tableau 1: Composition des bactéries non-binding "frappé" polymères à la figure 2.

Discussion

Fixation des bactéries à une surface est un processus complexe déterminé par un large éventail de facteurs dépendants de l'espèce bactérienne, les propriétés de la surface, le milieu environnant et l'environnement physique. Bien que certains groupes chimiques sont connus pour affecter la liaison des bactéries (polyglycols, par exemple, typiquement résister fixation 11), en corrélation l'impact biologique des polymères avec leurs structures chimiques , il est difficile, ce qui rend la conception rationnelle de polymères pour des fonctions spécifiques complexes. En l'absence de mécanismes de fixation détaillés, d' autres études ont tenté d'imiter naturels répulsifs surfaces, avec une longue et vaste optimisation traite 21. La méthode à haut débit miniaturisé présenté ici surmonte ces défis en facilitant le dépistage parallèle des centaines de polymères pour identifier des pistes pour une étude plus approfondie.

Les résultats de la méthode des microréseaux servent principalement à identifier probables candidats de plomb. La figure 2 illustre 22 candidats ayant une faible liaison d'au moins une espèce, tandis que la figure 3 montre la nette diminution de la capacité de liaison. Les 22 polymères de faible liaison représentés sur la figure 2 ont été prises avant dans des expériences de l' échelle, au cours de laquelle le meilleur (en termes de répulsion et de revêtement des propriétés) ont été jugées PU83, PA13 et PA515 (figures 4 et 5). Polyacrylates offrent une plus grande flexibilité en termes de procédés de polymérisation et donc le polyacrylate le plus bas de liaison, PA13, a été choisi pour les études de revêtement de cathéter (figures 6 et 7). De plus amples travaux supplémentaires sur d' autres candidats a été effectuée et a été rapporté ailleurs 6.

Grâce à un certain nombre d'itérations expérimentales nous avons trouvé un certain nombre d'étapes mineures ont été la clé de la réussite et de la reproductibilité. En plus de faciliter l'adhésion dudes polymères sur les lames de verre, en utilisant un agarose sous-revêtement présente un fond propre, que l'agarose est très résistant à la colonisation bactérienne. De même la cohérence dans le polymère se voit, à la fois dans le même tableau et entre les tableaux, est vital et donc l'impression des tableaux doit être soigneusement contrôlée. Le réglage précis des broches dans la tête d'impression et le remplissage aussi uniforme de la plaque 384 puits sont nécessaires pour assurer spotting uniforme. Comme certains des polymères, nous avons utilisé présentait un degré de autofluorescence, en prenant les données de fond de fluorescence pour chaque diapositive avant incubation avec des bactéries était vitale. Pour tenir compte des variations et obtenir de solides répétitions de données de microarrays sont conseillés.

La tache employée ici (DAPI) n'a pas la sélectivité pour les espèces bactériennes, la liaison non spécifique à l'ADN. Par conséquent, une bonne technique aseptique est essentiel une fois les cultures bactériennes sont introduites en tant que contaminants peuvent passer inaperçus, confondant l'interprétatation des résultats. La même chose est vraie des expériences ultérieures en utilisant la microscopie électronique à balayage, où il est possible de distinguer les tiges et les cocci mais pas du genre ou espèce.

Après le criblage de microréseau, polymères prometteurs devraient être choisis pour une validation supplémentaire. Dans l'exemple présenté ici, sept polymères d'intérêt ont été identifiés par leur nette diminution de la fluorescence sur la puce à ADN , et leur inhibition de la fixation a été confirmée par enrobage sur des surfaces plus grandes. Les figures 4 et 5 montrent la réduction de la liaison réalisée sur des lamelles de verre, d' un des moyens pratiques pour tester le comportement des polymères en tant que revêtements en vrac plutôt que comme des taches de microréseaux. Par la suite, ces polymères ont été revêtus sur les dispositifs médicaux pour quantifier entièrement la réduction de la fixation des bactéries. Il est important que le solvant choisi (voir la section de protocole 8) pour ces études de revêtement est bénigne au substrat souhaité (ici, le cathéter) en conservement la capacité de dissoudre le polymère d'intérêt, afin de permettre le revêtement. Ici, nous avons utilisé de l'acétone qui, ainsi que les propriétés mentionnées ci, a un point d'ébullition bas et évapore rapidement pour laisser un revêtement uniforme.

Les moyens de validation choisie dépendra de l'application spécifique en cours d'étude. L'observation des cellules par microscopie électronique et par fluorescence permet une quantification directe de l'attachement des cellules individuelles, on a choisi ces techniques comme complément à l'essai de coloration de puces à ADN en vrac. Les résultats sont présentés dans les figures 6 et 7, qui démontrent l'importance des méthodes de validation gratuits. Les images confocales sur la figure 6 , d' obtenir des images très nettes des cellules individuelles, tandis que le SEM a l'avantage supplémentaire de permettre une évaluation de la surface du polymère, qui est ici lisse et uniforme. Ces méthodes sont limitées par le champ de vision des microscopes utilisés, et il est donc important de prendre une série de clichés d'avoir confiance dans les résultats. Le procédé décrit ci-dessus ne peut quantifier l'adhérence des bactéries sur toute la surface, seulement en déduire la couverture à partir d'un certain nombre de petites régions. Nous pensons que cela est suffisant pour l'application décrite. Réduction de la liaison bactérienne pouvait être évalué en dénombrant les bactéries adhérant à la surface sur l'ensemble de morceaux de cathéters enduits et non enduits en utilisant des procédés tels que décrits ailleurs 22. Cependant, ces procédés exigent des surfaces biomatériau criblés pour avoir une surface uniforme, ce qui est difficile à maintenir lorsque les essais sont effectués avec des dispositifs médicaux, qui ont souvent une géométrie complexe.

De toute évidence, tout dispositif destiné à un usage clinique doit passer par des tests supplémentaires importants pour assurer la sécurité et l'efficacité chez les humains. La méthode présentée ici représente le début de ce processus et d' autres travaux doivent inclure la confirmation de l' activité in vivo. Dans ce cas, l'étude c veineuseatheters, travail initial pourrait enquêter sur la liaison des composants sanguins et des cellules entières au polymère. L'effet des composants sanguins sur la liaison bactérienne devrait également être envisagée, éventuellement en répétant les essais de liaison en présence de sérum inactivé ou de sang de-fibrinated 23. Le test définitif de la technologie sera dans un modèle in vivo, comme un modèle d'infection de l' implant sous - cutané 24.

Nous démontrons le potentiel de la méthode des microréseaux de polymère pour le criblage de polymères surface altérant. De tels polymères (à la fois résistant et la promotion de la liaison bactérienne) ont un grand nombre d'applications dans la médecine, l'industrie alimentaire et de la biotechnologie, ce qui signifie que cette méthode peut être utile dans de nombreux domaines de recherche. Bien que le travail ici utilise des bactéries, la méthode pourrait être adaptée à d'autres types de cellules et même d'autres microarrays chimiques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma 05066 
Silane-prep slides Sigma S4651
Polymers Synthesised in-house Not applicable
NMP Sigma 494496
LB Broth Oxoid CM1018
DAPI Thermo Fisher D1306
Tetrahydrofuran Sigma 401757
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides Sigma Silane-prep
Cacodylate buffer Sigma 97068
Catheter 1 Arrow International CS12123E
Catheter 2 Baxter Healthcare ECS1320
Osmium tetroxide Sigma 201030
Equipment
Contact printer Genetix Qarraymini
Microarray microscope IMSTAR Pathfinder
Spin Coater Speedline Technologies 6708D
Confocal microscope Leica SP5
Image analysis software Media Cybernetics Image-Pro Plus
Scanning electron microscope Philips XL30CP
Sputter coater Bal-Tec SCD050

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References

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Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux
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Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).More

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