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Bioengineering

医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

doi: 10.3791/54382 Published: November 5, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

ポリマーマイクロアレイは、最大7,000のポリマー1は、原核細胞または真核細胞2との平行分析のためにガラススライド上に印刷されたハイスループットプラットフォームを小型化しています。ここで紹介する方法は、我々が最初に2010年3で説明したものに基づいています。このスクリーニング系は、ヒト肝細胞4、幹細胞5、尿細管上皮細胞2、細菌3,6および原虫病原体7を含む多数の細胞型に適用されています。それぞれの場合において、促進または研究中の細胞の結合レジストポリマーは、8を同定しました。合成ポリカチオン性ポリマーとDNAの複合体はまた、遺伝子トランスフェクション候補9のハイスループットスクリーニングのためのマイクロアレイフォーマットで使用されてきました。同様に、細胞-基質相互作用のスクリーニングとして、ポリマーマイクロアレイはまた、材料特性10を評価するために使用されてきました。

">表面への細菌の付着を調節する合成ポリマーの能力は十分3,6,11に確立されている。ポリマー表面の電荷、疎水性及び表面粗さを含む多数の因子が、細菌の結合に影響を与えることが知られている。生体材料を発見する従来のアプローチそれは順番に細菌の結合または経験的に設計し、一度に一つの材料をテストレジスト労働集約、コストと時間のかかるプロセスである。高分子マイクロアレイはそのような制限を回避するための魅力的な代替を提供しています。

表面に関連する細菌は、複雑な集団として成長するバイオフィルムと呼ばれる - このようなバイオフィルムは、多くの環境ストレスと抗生物質に耐性が高いです。これは、バイオフィルム13で堅牢な「persistor」細胞の存在の増加に起因する(タンパク質、多糖類および核酸から成る)、それらの密な細胞外マトリックス12に部分的には一部です。 Altho16 -うわ表面会合およびその後のバイオフィルム形成の正確な機構を特徴づけることが困難である、一般的に表面成長14の三つの異なる段階があると考えられています。最初、可逆付着、細胞の強い接着が続き、細胞外タンパク質の産生および多糖マトリックス及び細胞増殖によるバイオフィルムの確立。最後に、成熟したバイオフィルムのリリースでは、他の場所で新たな感染を開始することができる浮遊細胞を、自由生活します。細菌の初期付着を防止し、ひいてはバイオフィルム形成の初期段階を防ぐ細菌忌避ポリマー、潜在的に感染を最小限に抑えるための優れたソリューションを表します。抗生物質耐性の上昇(および表面結合細菌12の本質的に高い抵抗)が与えられると、感染を減少させる抗生物質を含まない手段は特に重要です。病院において、細菌撥ポリマーコーティングは、一般的に植え込まれたデバイス17の周囲に形成院内感染の低減に直接的な医療用途を持つことができます。

ここでは、ヒット確認およびその後のコーティングおよび中心静脈カテーテルの材料の分析、続い院内感染に関連する病原性細菌の範囲に対する忌避活性についての381のポリマーのスクリーニングのためのハイスループット法は、( 図1)に記載されています。簡潔には、ポリマーは、乾燥及び滅菌後、小型化アレイは、臨床的に重要な細菌培養物と共にインキュベートした、接触印刷により、アガロースでコーティングされたガラススライド上にスポットしました。インキュベーションの後、マイクロアレイを穏やかに洗浄し、付着した細菌細胞を染色し、蛍光により可視化しました。その後、結合細菌阻害ポリマーは、ガラスカバースリップ上に塗布することにより大規模に調査し、電子顕微鏡で可視化しました。選択した反発貸与ポリマーは、その後の商業カテーテル上にコーティングし、約100倍の細菌の付着を低減することが示されました。

Protocol

アガロースコーティングしたスライドの調製

注:ポリマーマイクロアレイを作製する前に、アミノアルキルシラン被覆ガラススライドを、非特異的バックグラウンド結合を最小化し、細菌6に結合するか、反発するポリマーの評価を可能にするためにアガロースIBで被覆されています。シランコーティングは、スライドにアガロースの結合を促進します。

  1. 2%を構成している250mlのボトルで蒸留水にアガロースIBの(w / v)溶液。
  2. 溶解するまで緩やかに瓶をキャップした後、30秒周期で、マイクロ波オーブン中で懸濁液を加熱します。キャップがしっかりと任意の潜在的な圧力ビルドアップを避けるために閉じられていないことを確認してください。定期的にボトルを外し、静かに渦巻きます。
  3. 固体が溶解し、溶液が透明であることを確認してください。溶液を維持するために65℃の水浴中でこのアガロースを100mLのビーカーに溶液、及び場所を注ぎます。
  4. 、アガロース溶液にシラン被覆スライドを浸し均一なコーティングを確実にする、とのwiティッシュペーパーとスライドの裏側をPE。
  5. 24時間の最小値のためにコーティングされた側を上にして、ほこりのない環境で( 例えば 、食器棚やヒュームフード内部の)スライドを、乾燥させます。
  6. 目視で均一なコーティングを確認してください。コーティングは、簡単にスライド上に呼吸することによって評価することができる - 結露がコーティングされていない領域上に形成することになります。完全に均一にコーティングされたスライドだけは、マイクロアレイ印刷に使用する必要があります。

印刷用ポリマー溶液の調製

  1. ガラスバイアル中のN -methylpyrrolidone(NMP)にポリアクリレート、ポリアクリルアミドおよびポリウレタンからなる予備成形されたポリマーの選択の溶液(w / vの1%)を準備します。 (各ポリマーを1ml調製)。ポリマーが完全に溶解するまでボルテックス。ポリマーの合成は、他の場所6に記載されています。
  2. マイクロピペットを用い、25μlのポリマー溶液を384マイクロウェルプレートの各ウェルに充填する、交差するコンタが存在しないことを保証mination、各ウェルは、独特のポリマーが含まれています。少なくとも2つのウェルで陰性コントロールとしてNMPを使用してください。ウェルプレートテンプレートやスプレッドシートファイル上の各ウェル中のポリマー溶液のアイデンティティを記録します。

3.印刷ポリマーマイクロアレイ連絡先のプリンタを使用して

注:マイクロアレイの印刷は、コンタクトプリンタを用いて行きました。高分子マイクロアレイ印刷に関する具体的な手順を以下に示します。プリンタや安全上の推奨事項を使用して、上の一般的なガイドラインについては、製造元からのマニュアルに従ってください。我々は、コンタクトプリンタを使用しているが、適切な手動スタンピング装置を使用することもできます。

  1. プリンタのマニュアルに助言したように、(8行4列として配置された)32ピンmicroarrayingヘッドを使用して、四連で384液体(ポリマー溶液またはNMP)の印刷を可能にするルーチンを(ステップ3.3を参照)を作成します。
  2. 48行と32列として配置された1536スポットを印刷します。プログラム12のセクションに印刷するルーチン秒、 すなわち 、一度に32のソリューション、プリンタはピンの洗浄を可能にするために、各セクションを印刷した後に停止することができるように。
  3. 印刷ルーチンを作成するには:
    1. ソフトウェアを開き、利用可能なオプションから「新規のルーチンを作成]を選択します。実験の入力内容に「説明」タブを選択します。 「ヘッド」タブを選択し、'32 -pin microarrayingヘッド 'を選択します。
    2. [ソース]タブを選択し、プレートホルダー(ソースプレートホルダー(1×5))、プレートタイプ(プレート384のx 6000)を選択し、総プレート(1)とソース順(列ごと)。
    3. タブ「スライドのデザイン」で、「3×1 ''のスライドを選択します 'とによって並べ選ぶ「フィールド数」。そして、「整列パターン」を選択します。入力「レイアウト」と「行数」として「パターン寸法 'と'スポットビュー」(6)、「列数」(8)、「行ピッチ」(750)と「列ピッチ」(560)。モミを印刷する1セクションを選択します。トン。
    4. 「スライドのレイアウト]タブ入力での印刷に使用するスライドの数。入力に[印刷]タブを選択して印刷パラメータ(インキングあたりスタンプの数:1、スポット当たりスタンプの数:5、タイムスタンプ:200ミリ秒、時間をインキング:100ミリ秒)。
      注:ルーチンは、現在(8行4列として配置)32ピンmicroarrayingヘッドを用いて、四重で384液体(ポリマー溶液またはNMP)を印刷するために作成されます。合計では、ルーチンは750ミクロンと560ミクロンの列ピッチの行ピッチで48行と32列として配置された1536スポットを印刷する必要があります。
  4. プラットフォーム上でのアガロース被覆スライドを配置した位置にスライドを保持するために良好な真空シールを確保します。
  5. すべてのピンが同じ高さになるようにプリントヘッドを調整します。手動でスライドガラス上に頭を下げ、ピンが同時に上がることを確認することにより、これを確認してください。高さと矛盾がある場合は、sleevを使用して調整します上下にピン上の電子。
  6. すなわち 、正しい方向にプレートホルダーにウェルプレートを置き、よくA1は、ホルダーの右上にあるとウェルプレートがしっかりと固定されていることを確認します。
  7. 高さ調整を使用して、プレートホルダーの高さは、ポリマー溶液を選ぶとき、ピンがウェルの底に触れていないようなものであることを確認してください。
    注:これは、均一なポリマースポッティングのために重要であり、またそれによって交差汚染を引き起こし、隣接するウェルにポリマー溶液のこぼれを回避します。
  8. [スタート]タブを選択し、「標準」としての「ファイル名を指定して実行タイプ]を選択します。プロンプトが表示されたら、「ファイル名を指定して実行」をクリックし、そのスライド、ウェルプレートなどを確認し、位置にあります。
  9. 一度に1セクションを印刷(一度に32溶液; 12セクション)、セクション間のピンの洗浄を可能にします。ピンが完全に乾燥していることを確認するために乾いたティッシュペーパーに続いてアセトンに浸したペーパータオル、で十分にピンを清掃してください。
  10. マイクロアレイの印刷が完了すると、スライドホルダーに置き、オーブンポリマースポットにNMPを除去するために45℃に設定し、真空中で一晩、それらを乾燥させます。 30分間のUV光で滅菌後、マイクロアレイは、細菌の接種の準備ができています。
  11. (セクション5で説明したように)細菌にスライドを接種する前に、バックグラウンド蛍光の測定を行います。この測定は、細菌結合の計算に使用します。

細菌を有するポリマーマイクロアレイの4接種

注:良い無菌法を確認してください。文化のすべての取扱いは、無菌環境で実行する必要があります。ブンゼンバーナーを使用して、または流フードのいずれかで。培養物は、それぞれの種の要件に適合酸素利用、増殖培地、および温度で成長されるべきです。

  1. 5ミリリットルルリア-ベルターニブロス(LB接種して一晩培養を準備します:10グラムL -1バクト-トリプトン、5グラムのL -1のNaCl、および10グラムのLを<SUP> -1プレートからコロニーと酵母エキス)。 200 rpmで振とうしながら、37℃で一晩インキュベートします。
  2. グリセロール(10%濃度の全体的な)の添加により一晩培養のフリーザーストックを調製し、-80℃での在庫を保管してください。
  3. 解凍した細菌株のサンプルから細胞数を決定するために、各ストックの連続希釈を行い、固体培地上で一晩細菌を成長させます。株の細胞数の正確な決意は、それぞれの種6の適切な接種を保証します。
  4. マイクロアレイのための接種物を準備します。単一の種培養物を、上記のように増殖させ、マイクロアレイに直接適用されます。 BacMix-1は、 肺炎桿菌肺炎桿菌 )、 スタフィロコッカス・サプロフィチカス (S.の腐性 )、および黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌 )の細菌混合物である。BacMix-2は、 ストレプトコッカス・ミュータンス(S.ミュータンス)からなる細菌の混合物でありますS.球菌 M>、K.肺炎連鎖球菌および腸球菌 (E.フェカリス )。
  5. いずれかの混合培養物を生成するために、等容量(3ミリリットルずつ)でovernightsをミックスし、新鮮なLBで(約50 mlの最終体積に)4倍に希釈。
  6. 長方形の4ウェルプレートにUV殺菌高分子マイクロアレイを置き、5日間穏やかに撹拌(30 rpm)しながら37℃で混合細菌培養液の6ミリリットルでそれらをインキュベートします。
  7. インキュベーション後、穏やかにリン酸緩衝食塩水で二回マイクロアレイを洗浄(PBS:137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4)及び1μgのmlの溶液-1 4とインキュベート30分間PBSで '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色。
  8. PBSで1回を変え、PBSで覆い、穏やかに旋回することにより、新鮮なウェルプレートに染色されたマイクロアレイスライドを洗浄します。空気の流れの下で乾燥しました。接着剤で所定の位置にマイクロアレイスライドとシールにガラスカバースリップを適用します。 DいったんRY、70%(v / v)エタノールで外面を滅菌します。
  9. 安全に封じ込めレベルに応じた培養物を処分。

5.マイクロアレイイメージングおよび分析

  1. 各ポリマー明視野でのスポットとDAPI(例/エム= 358 nmの/ 361 nm)のチャネルのための単一の画像をキャプチャします。 20Xの対物レンズを装着した蛍光顕微鏡または(画像取得ソフトウェアによって制御XYZステージ付き)自動化された蛍光顕微鏡を使用して手動でこれを実行します。
    注:ソフトウェアを動作させると、明視野およびDAPIチャネルを使用して画像を取得するために顕微鏡を調整するための取扱説明書18を参照してください。すべてのマイクロアレイのための画像キャプチャ用のゲインおよび露光時間が同じであることを確認してください。
  2. スポット領域を選択し、画像処理ソフトウェアを用いて蛍光を定量することによってDAPIチャネルにおける各スポットの平均蛍光強度を得ます。
  3. 各スポットのバックグラウンド蛍光のため、obta複製マイクロアレイ上のポリマースポットの画像にのみ細菌なしでメディアとインキュベートしました。細菌からの蛍光を得るために、スポットの強度からバックグラウンド蛍光を差し引きます。
  4. 種々のポリマー6の結合細菌を比較するために使用される各ポリマーを表す、4つのスポットからの平均正規化した値を計算します。
  5. 「ヒット」ポリマー6として少なくとも細菌の結合(最低蛍光)を示すポリマーを特定します。

「ヒット」の検証のためのカバースリップの6コーティング

  1. ポリマーでコートカバースリップへ:
    1. 「ヒット」ポリマーの溶液を調製する(〜2%w / v)のテトラヒドロフラン(THF)、または他の適切な溶媒。
    2. 10秒間2000rpmでスピンコーターを用いてポリマー溶液との適切なサイズのスピンコート円形ガラスカバースリップ。
      注:スピンコーターの非存在下では、カバーガラスまたは他の材料をディップコーティングすることができる、スピンもののコーティングは、より均一な表面を生成します。
    3. 一晩40℃の対流式オーブンでコーティングされたカバースリップを乾燥前の細菌を接種し、30分間UV光を用いて滅菌します。
  2. 陰性対照のためのアガロースでコートカバースリップへ:
    1. きれいなカバーガラス10分間のプラズマ処理によって、又は4時間、1MのNaOH中に浸漬どちら。
    2. 一晩1%(3-アミノプロピル)トリエトキシシランを含むアセトニトリルでカバースリップを浸します。アセトンで3回カバースリップをきれいにし、1時間オーブン(100℃)に入れました。
    3. ディップコート、60℃の水浴中で維持し、1%アガロース水溶液で乾燥したカバースリップ。 24時間無塵環境条件に平らな表面上のアガロースコーティングしたカバースリップを置き、前に細菌を接種し、30分間UV光を用いて滅菌します。

7.添付ファイルおよび走査型電子顕微鏡を使用したカバースリップの分析(SEM)

  1. 後の30分間UV光で滅菌、標準的な12ウェルプレート又は(カバーガラスの大きさに応じて)24ウェルプレート中のカバースリップ(ポリマー/アガロース被覆または非被覆ガラス)を配置し、セクションに記載のように細菌とインキュベート4。
  2. 細菌と共にインキュベートした後、2時間、0.1 Mカコジル酸緩衝液(pH7.4)中の2.5%(w / v)のグルタルアルデヒドで固定し、次いで0.1 Mカコジル酸緩衝液(pH7.4)で2回コーティングされていないおよびコーティングされたカバースリップを洗浄し。
  3. 1%の接尾サンプルを室温で1時間(w / v)の四酸化オスミウム及び30分ごとに(v / v)の50、70、90および100%シーケンシャルエタノール洗浄と脱水。
  4. 標準プロトコル19に係るCO 2でドライサンプル。乾燥時間は、試料の性質に依存します。
  5. 0.75トルで30 mAから真空に電流がスパッターコーターを用い、金/パラジウム合金で被覆サンプル(60/40%)。標準的なプロトコル20に従って電子顕微鏡で調べます。
    注:ENSそれは非常に有毒であるとして、四酸化オスミウムの貯蔵、取扱い及び処分から生じるリスクを管理するURE十分な安全上の注意事項。
  6. 視覚的にコーティングされていないカバースリップの画像を比較し、アガロースまたは「ヒット」ポリマーでコーティングされたものは、ポリマーの細菌の結合/反発する能力を確認します。
    注:添付ファイルの抵抗が存在する細胞の減少として容易に識別できるものとします。
  7. 最も有望な医療デバイス( 例えば 、中心静脈カテーテル)6を有するコーティング研究のための非結合ポリマーを「ヒット」を選択します。

カテーテルを被覆するための溶媒の選択8.

  1. カテーテルの留置部分との互換性だけでなく、「ヒット」ポリマーを溶解する能力について、様々な溶媒を評価します。キャスキッドソン-1の部分をカットし、円筒形の片に長さ5mm、およびデジタルノギスで測定します。
  2. このようなアセトアミドなどの種々の溶媒を評価しますIC酸、アンモニア、アセトン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)、エタノール、メタノール、エチレングリコール、トルエン、キシレン。 12時間溶媒中でのカテーテル片を浸し、カテーテルおよび溶剤の明確化の整合性を視覚的に評価します。
    注:カテーテルは膨潤または崩壊または濁った溶剤に繋がりない溶媒を選択してください。溶剤は、「ヒット」のポリマーを溶解しなければなりません。

共焦点顕微鏡によるカテーテル上の細菌付着の9分析

  1. 2.5%調製(w / v)のアセトン、又は他の適切な溶媒中のポリマー溶液を小さなガラスバイアル(5ml)中にセクション8に置き、5mmのカテーテルの部分を決定し、2分間ポリマー溶液1mlでそれらを浸すように。過剰のポリマー溶液を除去し、40℃の真空オーブンで一晩カテーテル片を乾燥させます。
  2. 解凍した細菌の目を混合して接種材料を準備しますocksを50ml LB 6にそれぞれの種の約10 6細胞を得ました。
  3. 30分間UV光でコーティングし、コーティングされていないカテーテルの部分を殺菌し、穏やかに撹拌6で、3日間37℃で、24ウェルプレート中のLBを接種1mlでインキュベートします。
  4. インキュベーション後、PBS(2×2 ml)でカテーテルを洗浄し、30分間PBS中の10%のパラホルムアルデヒドで細菌を固定し、そしてPBS(1ml)で洗浄します。 (1μgのmlの- 1)DAPIを有するカテーテルピース上の細菌を染色20分間、および(1ミリリットル)PBSで洗浄します。
  5. - Airy1、画像サイズ - 1024×1024ピクセル、ボクセル幅 - 105.2 nmで、0.5μmの間隔Z-スタック405nmの青色ダイオードレーザー、検出範囲414 nmの502に、ピンホール:次の設定を使用して、カテーテル片の共焦点画像を取得、倍率 - 40X 1.25。
  6. カテーテルの100ミクロンの長さにわたってZ-スタッキング50画像によって共焦点イメージングを完了します。
  7. SUITABを使用して画像を分析ル解析ソフトウェア:カテーテル片の単一のイメージを作成するために、被写界深度を拡張する機能を使用して、Z平面内でZ積層画像を平ら。
    注:この画像はその後、「バックグラウンドを平ら」機能を使用してバックグラウンド補正した後、細菌によってカバーされるカテーテルの面積を得るために分析されるべきです。

SEMによるカテーテル上の細菌付着の10解析

  1. アセトン(w / v)の10%のポリマー溶液を調製します。
  2. それを保持し、約30秒間ポリマー溶液中にピースを浸漬するために、カテーテルの切断片の中央部に(200μlのマイクロピペット用)ピペットチップを押します。 30分間周囲条件でコーティングされた部分を乾燥させます。周囲条件でのポリマー溶液と一晩乾燥に再び浸漬することにより、第2のコーティングを適用します。
  3. 細菌によるUV処理及びインキュベーション後(n = 3)をPBS(2×1 ml)及び1を含む48ウェルプレートに移すピースを洗浄します30分間、PBS中の0%ホルムアルデヒド。 PBS(1ミリリットル)、室温で一晩乾燥して作品を洗って、固定した後、スパッタコーターを使用して、導電性カーボンディスクとスタブ、および金コートにマウント(ステップ7.5を参照してください)。
  4. 走査型電子顕微鏡6を用いて画像を取得します。

Representative Results

図2は、マイクロアレイ解析によって決定されるポリマーの数に対する細菌付着(正規化された蛍光強度)を示しています。アガロースが強く6を結合細菌をレジストとしてポリマー(のみNMP)なしで印刷されたスポットは、陰性対照である-記録された蛍光は非常に低いです。ほとんどの場合、ポリマーの撥水特性を試験細菌種間で大きく異なるが表示されたポリマーは、すべての低結合されています。これは、異なる種間の取付機構との間に広いの違いを反映しています。適切なポリマーの選択は、したがって、用途に依存するが、低結合性ポリマーは、容易にアガロースと比較することによって同定されます。高結合性ポリマーは、配列中で同定される可能性があり、その後の実験のためのポジティブコントロールとして使用することができます。 DAPIチャネルにおける自己蛍光を示さないポリマーについては、定性的な共同( 図3に示すように、1つの代表的な高結合性ポリマー三実施例の低結合性ポリマーをハイライト)スポット像のmparisonを目視することができます。このような比較は、統計的分析よりも少ない情報を提供しながら、計算された強度値の有用な視覚的検証することができます。

22適切なポリマーは、マイクロアレイを用いて同定して、スケールアップ実験を、より大きい表面を被覆するために使用される場合、それらの細菌撥性を確認するために行われます。 (SEMによって分析した( 図4、図 5))コートガラスカバースリップとカテーテルスライス(共焦点顕微鏡( 図6)とSEMによって分析した( 図7))に使用される最高の実行例は、示されています。両方の顕微鏡法は、明確なデータを提供し、表面に直接細胞計数を可能にするという利点を有します。細胞付着の減少はvisibl簡単です電子。これらの最高のスケールアップに自分の忌避特性を保持し、コーティング、ならびに大規模コーティング技術に適しているが、さらに調査しました。示された結果は、各段から最高の実行ポリマーを示しています。

図1
図1: 生物医学的用途のためのポリマーマイクロアレイを介して細菌忌避剤ポリマーの識別に必要な手順 SEM =走査電子顕微鏡

図2
2: マイクロアレイ解析によって決定一連のポリマーに結合細菌は、低細菌の結合はポリアクリレート/アクリルアミド(PA)及びポリウレタン(PU)の数に見られています。いくつかの細菌のでプローブした高分子マイクロアレイからの結果 pecies(C。ジェジュニ 、C。ディフィシルウェルシュ菌ストレプトコッカス・ミュータンス 、および2つのコンソーシアム; BacMix-1およびBacMix-2)が示されています。背景は、平均DAPI蛍光強度(正規化)を補正し、細菌が発現バインディング。エラーバーは標準偏差を表します。参照6から適応。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3:代表的なポリマー上の細菌の付着を示すBacMix-2のポリマースポットの例の画像蛍光(DAPI)および明視野顕微鏡画像。強く結合ポリマーは、いくつかの非結合ポリマー(PU-20、PA-336及びPU-179)と比較するために含まれています。スケールバー=100μmです。参照6から適応。://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4: ガラスカバースリップとスケールアップ実験 「ヒット」ポリマー( 表1から選択された例)でコーティングされたコーティングされていないガラスとガラス上の細菌の付着を示すSEM画像スケールバー=20μmです。

図5
5:SEM 画像から細胞数によって定量化した結合細菌最高の「ヒット」ポリマーで被覆された表面の単位面積あたりに付着した細胞との比較アガロースは対照結合表面としてのガラスで、コントロールの非結合」面として使用しました。エラーバーは、表現します標準偏差。

図6
図6: 被覆及び非被覆カテーテルスライス上の細菌結合の比較 BacMix-2でインキュベーションした後のPA13(B)でコーティングされた未処理のカテーテル(カテーテル検査-1)(A)およびカテーテルを比較する共焦点像対物レンズ40倍(スケールバー=20μm)を用いて撮影した画像。参照6から適応。

図7
図7: 被覆及び非被覆カテーテルスライス上の細菌結合の比較 SEM像はBacMix-2からなる細菌カクテルとのインキュベーション後にPA13(B)でコーティングされた未処理のカテーテル(カテーテル検査-1)(A)とカテーテルの比較を示す尺度バー= 101;メートル。参照6から適応。

ポリマー モノマー1 モノマー2 モノマー3 モノマーの比率
PA465 MEMA DEAEMA HEA 8 1 1
PA475 MEMA DEAEA HEMA 6 1 3
PA513 MEMA DEAEMA MMA 8 1 1
PA515 MEMA DEAEA MMA 6 1 3
PA13 DMAA - 9 1 -
PU1 PEG2000 HDI - 4.9 5.2 -
PU16 PEG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU161 PEG2000 MDI BD 2.5 5.2 2.3
PU7 PEG900 ビック - 4.9 5.2 -
PU83 PEG900 HMDI BD 2.5 5.2 2.3
PU227 PPG-PEG-1900 HDI - 4.9 5.2 -
PU129 PPG425 ビック DMAPD 2.5 5.2 2.3
PU10 PTMG2000 ビック - 4.9 5.2 -
PU179 PTMG2000 HDI NMAPD 2.5 5.2 2.3
PU20 PTMG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU5 PTMG2000 HDI - 4.9 5.2 -

表1: 細菌の組成非結合図2の「ヒット」ポリマー。

Discussion

表面への細菌の付着は細菌種、表面の特性、周囲の媒体と物理的環境に依存する要因の広い範囲によって決定される複雑なプロセスです。ある種の化学基は、細菌の結合に影響することが知られているが(ポリグリコールを、例えば、典型的にはアタッチメント11をレジスト)、それらの化学構造を有するポリマーの生物学的影響を関連付けることは困難な特定の機能のためのポリマーの合理的な設計を行うことは困難です。詳細な取り付け機構の非存在下では、他の研究は長く豊富な最適化は、21を処理て、天然に存在する撥水表面を模倣することを試みてきました。ここで提示小型化ハイスループット法は、さらなる研究のためのリード線を識別するために重合体の数百のパラレルスクリーニングを容易にすることによって、これらの課題を克服します。

マイクロアレイ法からの結果は、主にIDEに役立ちますntify可能性の高いリード候補図3は、結合能力の明らかな低下を示していた。 図2は 、少なくとも1種の低い結合を持つ22の候補を示しています。 図2に示すすべての22の低結合性ポリマーは、スケールアップ実験に進められた、その間(撥水性とコーティング特性の面で)最高のPU83、PA13、及びPA515( 図4、図 5)であると決定されました。ポリアクリレートは、重合方法の点でより大きな柔軟性を提供するので、最も低い結合ポリアクリレート、PA13は、カテーテルのコーティング試験のために選択した( 図6および7)。他の候補者に関するより詳細なさらなる作業が行われた他の場所6報告されています。

実験反復回数を通して、私たちはマイナーなステップ数は成功と再現性への鍵だったが見つかりました。だけでなく、の付着を促進しますアガロースは、細菌のコロニー形成に対して非常に抵抗性であるように、クリーンな背景を提供するアンダーコーティングアガロースを用いてガラススライドにポリマー。同様に、ポリマー中の一貫性は、同じアレイ内およびアレイ間の両方、自分自身をスポット不可欠なため、アレイの印刷が慎重に制御されなければならないです。プリントヘッドのピンと384ウェルプレートのさらに均一な充填の注意深い調整が均一なスポットを確保するために必要とされます。我々が使用されるポリマーの一部として、細菌とのインキュベーションは不可欠だった前に、各スライドの背景蛍光データを取って、自家蛍光の程度を示しました。変動を考慮して、マイクロアレイの堅牢なデータ複製を取得することをお勧めします。

ここで用いた染色(DAPI)は、DNAに非特異的に結合し、細菌種のための選択性を有していません。汚染物質が見過ごさ得るような細菌培養物はinterpreを混乱、導入されたらそのため、良好な無菌技術が不可欠です結果のテーション。同じことは、ロッドと球菌を区別なく、属または種ではないことだけが可能である走査電子顕微鏡を使用して、後の実験の真のです。

マイクロアレイスクリーニングした後、有望なポリマーは、さらなる検証のために選択されるべきです。ここに示す例では、関心の7ポリマーは、マイクロアレイ上の蛍光におけるそれらの明確な減少によって同定し、付着の阻害は、より大きな表面上に塗布することにより確認した。4および 5は、カバーガラス上で達成結合の減少を示しますバルクコーティングとしてではなく、マイクロアレイスポットとしてポリマーの動作をテストするための実用的な手段。続いて、これらのポリマーは完全に細菌付着の減少を定量するために、医療デバイス上にコーティングしました。保持しながら、これらのコーティング研究のための溶媒として選択したが(プロトコルセクション8を参照)(ここでは、カテーテル)所望の基板に良性であることが重要ですコーティングを可能にするために、目的のポリマーを溶解する能力がる。ここでは、低沸点を有し、均一なコーティングを残すために迅速に蒸発し、ならびに記載の特性、アセトンを使用しました。

選択された検証手段が検討されている特定の用途に依存します。電子および蛍光顕微鏡による細胞の観察は、個々の細胞付着の直接の定量化を可能にするように、我々はバルク染色マイクロアレイアッセイを補完するものとして、これらの技術を選択しました。結果は、無料の検証方法の重要性を実証する図6及び図7に示されています。 SEMは、ここに滑らかで均一であるポリマーの表面の評価を可能にする追加の利点を有している図6の共焦点画像は、個々の細胞の非常に鮮明な画像を提供します。これらの方法を使用する顕微鏡の視野によって制限され、従ってそれはimportaあるれていますNTは、結果の信頼性を持っている一連のスナップショットを取ります。上述の方法は、小領域の数からカバレッジを推論する、全面細菌の付着を定量することができません。我々は、これが記述されたアプリケーションのために十分であると考えています。細菌の結合の減少は、他の場所22に記載の方法を用いて、全体の被覆及び非被覆カテーテル片の表面付着した細菌を列挙することによって評価することができました。しかし、そのような方法は、アッセイは、多くの場合、複雑な形状を有する医療機器で実行されるときに維持することが困難であり、均一な表面積を有するようにスクリーニングされ、生体材料の表面を必要とします。

明らかに、臨床使用のために意図された任意のデバイスは、ヒトにおける安全性と有効性を確保するために、かなりのさらなるテストを通過する必要があります。ここで紹介する方法は、このプロセスの開始を表し、更なる作業は、 インビボ活性の確認を含める必要があります。この場合、静脈Cを勉強atheters、最初の作業は、血液成分およびポリマーへの全細胞の結合を調べることができます。細菌の結合の血液成分の効果は、おそらく不活性化血清または脱fibrinated血液23の存在下での結合アッセイを繰り返すことにより、考慮されるべきです。技術の決定的なテストは、皮下インプラント感染モデル24としてin vivoモデルになります。

我々は、表面改変ポリマーのスクリーニングのための高分子マイクロアレイ法の可能性を示します。このようなポリマーは、(両方の抵抗と結合細菌を促進する)この方法を意味する研究の多くの分野で有用である可能性がある、医学、食品産業とバイオテクノロジーのアプリケーションを多数持っています。仕事はここに細菌を使用するが、この方法は、他の細胞型と同様に、他の化学マイクロアレイに適合させることができます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma 05066 
Silane-prep slides Sigma S4651
Polymers Synthesised in-house Not applicable
NMP Sigma 494496
LB Broth Oxoid CM1018
DAPI Thermo Fisher D1306
Tetrahydrofuran Sigma 401757
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides Sigma Silane-prep
Cacodylate buffer Sigma 97068
Catheter 1 Arrow International CS12123E
Catheter 2 Baxter Healthcare ECS1320
Osmium tetroxide Sigma 201030
Equipment
Contact printer Genetix Qarraymini
Microarray microscope IMSTAR Pathfinder
Spin Coater Speedline Technologies 6708D
Confocal microscope Leica SP5
Image analysis software Media Cybernetics Image-Pro Plus
Scanning electron microscope Philips XL30CP
Sputter coater Bal-Tec SCD050

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References

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医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定
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Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).More

Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).

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