Abstract
태반은 한 여분의 배아 혈통의 trophectoderm에서 유래. 내부 세포 덩어리 위에 놓인 극 trophectoderm 나중에 차 TGCS로 분화 증식을 계속하는 동안 요정 주입 쥐의 배반포에서, 벽화 trophectoderm 세포는 차 영양막 세포 거대 세포 (TGCS)로 분화. TGCS 개발 태반에서 핵심적인 역할을하고 성공적인 임신을 위해 필수적이다. 착상 후 개발하는 동안 특정 유전자의 전사 조절의 조사는 TGCS 개발에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 북극 trophectoderm에서 파생 된 임신 (E7-7.5)의 7-7.5 일에서 배아에서 ectoplacental 콘 (EPC)의 세포, 보조 TGCS 1로 분화. TGCS 수가이 단계에서 매우 낮지 만 TGCS은 E7에서 배아의 저온 유지 부에 동일계에서 연구 될 수있다. 이차 TGCS을 분석하는 또 다른 수단은 E7 배아 개별 내피 전구 세포의 단기 배양 물을 사용하는 것에스. 우리는 생체 내 및 초기 전 사체를 시각화 계내 혼성화 (FISH RNA)에 형광체를 사용하여 단일 세포 수준에서의 시험 관내 모두에서 관심 유전자의 전사 상태를 조사하는 방법을 제안한다. 이 방법은 유전자 발현의 직접적인 판독을 제공하며, 대형 endoreplicating 셀인 TGCS 염색체 상태의 평가를 가능하게한다. 실제로 TGCS 말단 분화의 중요한 특징은 세포주기를 종료하고 endoreplication.This 방법의 여러 발사를 거쳐 염색체 및 / 또는 성 염색체로부터 발현하는 유전자의 발현을 검출하는 데 적용 할 수 있고, 개발에 중요한 정보를 제공 할 수있다 메커니즘뿐만 아니라 태반 질환.
Introduction
포유 동물 영양막 세포 거대 세포 (TGCS)은 산모와 태아 조직 사이에 장벽을 형성한다. 그들은 자궁에 주입하고, 수태의 침공을 중재하고 태반의 형성을위한 발달에 중요한 역할을한다. 그들은 여러 성장 인자 (사이토 카인)와 배아의 성장과 생존에 필요한 프로락틴 / 태반 락토 겐의 가족과 스테로이드의 호르몬을 생산하고 있습니다. TGCS는 S와 G 위상을 교대로 구성된 세포주기의 endocycle와 세포, 큰 단핵 및 배수체이다. 사실, TGCS 모든 부문이없이 DNA 합성의 여러 라운드를받을 수 세포를 endoreplicating있다. 다른 배아 배외 (extraembryonic)과 세포 유형에 비해 TGCS 생체 내에서 유전자의 전사 상태를 조사하기 위하여, 초기 RNA의 FISH 특정 착상 후 단계에서 저온 유지 부 (3)의 생체 내에서 수행 될 수있다. TGCS 인해 파묻혀에 섹션에 쉽게 알아볼 수 있습니다R 큰 크기 및 전사 유전자의 활동을 기록하지만 초기 착상 후 단계에서 자신의 번호가 낮을 수있다. E7 배아 부분에 TGCS의 소수는 trophectoderm 개발 과정에서 유전자 발현의 조절을 연구하기 위해 차별화 된 TGCS를 얻기 위해 배아 trophectodermal 조직의 단기 문화를 수행하기 위해 우리를 이끌었다. 즉 trophectoderm 세포 (TS)를 줄기 또한, 위해 가능한 생리 학적으로 남아 설립 세포주 보조 TGCS 인해 비정상적인 유전자에 TGCS의 결함과 관련된 병리학 적 임신을 연구하는 유용한 도구를 제공의 발달 메커니즘의 생성을 조사하기 위해 항상 적합하지 않다 마우스의 규제.
ectoplacental 콘 (EPC)의 영양막 세포는 보조 TGCS 4의 전구체이다. 보조 TGCS에 배양 내피 전구 세포의 자발적 분화 이전에 5를보고되었다. 그러나 차 TGCS, 보조 TGC의 differen에 대한 연구는 대조적으로tiation는 presumablydue 어떤 산모 나 태아 조직의 무료 EPC 외식 분리의 어려움, 제한된 남아있다. 우리는 E7, TGCS이 매우 적은 있지만 EPC 전구체로부터 생성 될 수있는 개발 후 주입 단계에서 개별 배아에서 파생 된 보조 TGCS에 RNA의 FISH를 수행하기 위해 이러한 방법을 적용. 핵 차 성적표를 분석하는 RNA의 물고기는 보조 TGCS의 단일 세포 수준의 수준에서 수행 된 적이있다. 이 전사의 정확한 분석이 가능하고 이식 후 3 단계에서 TGCS의 후생 유전 학적 불안을 표시하기 위해 사용되었다.
포유 동물에서 후성 유전학의 고전적인 예는 X 염색체 비활성화 (XCI)는 허드 연구소 6 연구되고있다. 이 과정에서 여성에서 2 X 염색체 중 하나는 비활성화된다. XIST 성적 증명서 코트는 여성 세포에서 발현 대부분의 유전자의 침묵을 트리거되는 X 염색체 비 코딩. RNA의 물고기를 사용하여,X 연결된 유전자의 초기 성적은 가능한 한 조사 할 수있는 비활성 X 염색체 (사이)에 XIST RNA의 축적. 우리는 여기에서 착상 후 배아의 섹션과 EPC의 단기 문화에 RNA FISH을 수행하는 절차를 설명합니다. 여성 배아 줄기 세포와 착상 전 배아 7-11 차별화에 XCI을 연구하기 위해 사용 된 것과 적응이 프로토콜. 우리는 시험 관내 TGCS뿐만 아니라, 생체 내에서 여성의 배아에서 XCI의 예를 제공합니다.
Protocol
동물 절차는 승인 기관 동물 보호에 따라 수행하고 연구소 퀴리 (CEEA-IC) 프로토콜 (C 75-05-18)의위원회를 사용했다. 이 연구는 유전자 변형 생물체 (계약 번호 5549CA-I)의 사용에 대한 고등 교육과 연구의 프랑스 교육부의 승인 아래 진행되고있다.
의 저온 섹션 1. 제조
- 시어 등., (12)에 설명 된대로 자연스럽게 F1 C57BL / 6 ×의 DBA / 2J 마우스를 배란로부터 배아를 수집합니다. 임신 (E7)의 7 일에, 자궁 전위에 의해 8~12주 된 마우스를 희생. 전체 수태의 즉 탈락 (12)를 수집합니다.
- 시어 등의 알에 기술 된 바와 같이, E7의 수태를 분리합니다., 12. PBS를 포함하는 60mm 페트리 접시에 배치합니다.
- 저온 유지 장치 섹션에 대한 E7 마우스 수태를 고정.
- 1cm 높이에 적응 알루미늄 호일 우물을 준비합니다 ( '집에서 만든'유리 파스퇴르 핍을 사용하여등). 이 작은 용기의 바닥에서 동결 조직 배지 한 방울을 증착. 올바른 방향으로 수태를 입금 (즉, 길이 섹션의 수태는 수평 방향으로 유지한다).
- 조직이 매체 동결과 잘 들어있는 수태를 입력합니다. 다음은 흰색으로 바뀔 때까지 몇 초 동안 액체 N 2 블록을 담그지 - 천천히 정지 할 수 있도록하기 위해 액체 N 2 위의 증기에 집게로를 일시 중단합니다. 그 후, (몇 달 동안 저장할 수) -80 ° C에서 냉동 유리 병 및 저장소로 블록을 전송할 수 있습니다.
- 극저온 단면 처리하기 전에 30 분 동안 저온 유지 장치에서 -20 ° C에서 수태 함유 동결 블록을 배치했다. 8 μm의 두께의 저온부를 수행합니다. 슬라이드에 입금 4 절 효율적인 첨부 파일을 활성화합니다. 장소 섹션은 18 X 18mm 2 coverslip에 아래에 들어갈 정도로 닫습니다.
- 의 품질을 확인섹션 (손상 및 긁힘없이) 실체 현미경으로 배아 (세로 섹션)의 방향 및 추가 분석에 적합한 섹션을 선택합니다. 가능한 빨리 코 플린 항아리를 입금 및 RNA FISH를 (3.3.2 참조) 수행합니다.
보조 TGCS 2. 준비
- 수태를 (1.1 및 1.2 참조)를 분리합니다.
- E7 Ectoplacental 콘 (EPC)를 해부하다
- 실체 현미경 및 멸균 PBS를 포함하는 배양 접시를 사용합니다. 집게와 함께 탈락을 해부하다. 피어스 샘플 및 오픈 집게가 떨어져 탈락의 양면을 찢어합니다.
- 배아를 밖으로 껍질. 가위 같은 행동에 폐쇄 미세 포셉 (뒤몽 제 5 호)의 사용 팁 적절한 배아에서 EPC를 분리합니다. 산모의 조직에서뿐만 아니라 융모막과 난황 주머니에서 분리, 완벽하게 깨끗한 샘플을 얻기 위해 특별한주의를 사용합니다. PBS에서 EPC 외식을 씻으십시오.
- 작은 숟가락으로 4 아 개별 해부 EPC를 전송매체에서 멸균 커버 슬립을 포함 리터 판.
- 내피 전구 세포 단기 문화에서 TGCS를 파생.
- 커버 슬립을 포함하는 4 잘 접시를 준비합니다. 화염 건조하여 에탄올에 침지시켜 커버 글라스 원형 12mm 직경 소독.
- 각 웰에 0.5 ml의 EPC 매체 추가 (EPC 배지 : RPMI 1640 15 % FCS, 위하여 0.1mM 2- 머 캅토 에탄올 및 항생제가 보충).
- 예금 하나의 배지와 함께 잘 커버 슬립의 중심에 해부 - 내피 전구 세포. 유리 커버 슬립의 EPC를 적용하는 미세 집게를 사용합니다. 37 ° C에서 3-5일 Culturefor, 5 % CO 2. 개인 이식편은 평평 TGCS (그림 2A)의 단일 층으로 확산 부산물을 형성한다.
3. RNA FISH
주 :. 프로토콜이 Chaumeil 등, 8 Pollex 들었 13 (는 ESC) 배아 줄기 세포에 대해 기술 된 것들에 기초한다.
- 고급 용 준비증권 솔루션의 배급
- 3M의 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.2을 준비합니다.
- 40 %를 함유하는 2 × 혼성화 완충액을 준비 나트륨 덱스 트란 설페이트, 20 배 BSA (/ V w) 4X 염 구연산 나트륨 400 mM의 리보 바나 딜 착체 (VRC) (SSC).
- 90 % (v / v)의 글리세롤, 0.1 %를 함유하는 배지를 준비 장착 -p- 페닐 렌 디아민 (/ V w), PBS (9)에서의 pH.
- 갓 준비된 솔루션
- 3 % 갓 준비 파라 포름 알데히드 PBS에서 (PFA)로 구성된 정착 솔루션을 준비합니다. PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100을 포함 permeabilization 솔루션을 준비하는 2 mM의 VRC 보충. 50 % 포름 아미드 (FA)와 2 배 SSC를 혼합하여 세척 버퍼를 준비하고 7.2-7.4로 pH를 조정합니다.
- 배 SSC 1 μg의 / ㎖의 DAPI (4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 디 히드로 클로라이드)로 이루어진 DNA 반대 염색 액을 준비합니다.
- FISH를위한 준비에 고정 및 Permeabilization
- 커버 슬립에 세포를 들어, 5m를 위해 1X PBS로 세포를 씻어에. 고정액에 10 분 실온에서 (3 % PFA) 솔루션을 슬라이드에 커버 슬립, 또는 배아 부분에 세포를 수정.
- 1X PBS로 세포를 세 번 씻어. 얼음에 얼음처럼 차가운 permeabilization 용액에 5 분 동안 세포를 Permeabilize 하시려면. 세포를 70 % 에탄올로 3 회 씻는다. -20 ° C에서 70 % 에탄올에 4 슬라이드 운송 상자에 보관 4 웰 플레이트에서 커버 슬립 및 슬라이드.
참고 : Coverslips는 슬라이드는 -20 ° C에서 몇 달 동안 저장 될 수있다. 플레이트 및이를 함유하는 박스 에탄올의 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 할 수있다.
- DNA 프로브 라벨링
- 형광 뉴클레오티드를 사용하여 닉 번역에 의해 DNA 프로브 레이블. 제조업체의 지침 (표 1 참조)에 따라 8.
- (DNA 증폭을 위해, 3.4.4 참조) 50 μl의 반응 믹스를 들어, 1-2 플라스미드의 μg의 세균 인공 염색체 (BAC) 또는 다중 변위 증폭 (MDA)를 추가, 17.5 μL 물에 DNA를 2.5 ㎕를 0.2 밀리미터SR-, SG-, Cy5에-dUTP를, 10 μl의 10 mM의 각각의 dNTP 믹스 (dGTP의, dATP를,의 dCTP), 5 ㎕의 10 mM의 dTTP를, 5 ㎕의 10 배 닉 번역 버퍼 8 μl의 닉 변환 효소.
- 어둠 속에서 15 ° C에서 16 시간 동안 품어. -20 ℃에서 동결 반응을 비활성화한다. -20 ° C에서 개월 스토어 프로브.
- MDA
주 : BAC DNA를 들어, 전통적인 제조 후의 DNA의 양이 낮고, 따라서 하나의 MDA를 이용하여 표시하기 전에 DNA 증폭하는 단계를 사용할 수있다. 상용 키트를 사용하여 제조업체의 지침 (표 1 참조)에 따라. - 9.5 μL 샘플 버퍼 0.5 μL의 BAC DNA를 섞는다. 95 ° C에서 3 분 가열한다. 즉시 얼음에 해소; 얼음 10 분에 출발. 반응 버퍼 / 효소 믹스를 준비합니다 (9.5 μL + 0.5 ㎕의 효소 믹스)와 얼음에 보관하십시오.
- 10 ㎕의 DNA 믹스 + 10 μL 반응 완충액 / 효소 조합을 섞는다. 30 ° C에서 최소 20 시간에서 품어. 10 분 65 & # 가열 샘플로 효소를 비활성화176; C. -20 ° C에서 저장하기 전에 4 ° C로 냉각 샘플.
- 소화에 의해 MDA를 확인합니다. 1 μL MDA, 2 μL 10 배 버퍼, 2 μL의 뒷다리 III 15 μL의 H 2 O를 추가 하룻밤 37 ° C에서 품어. 정확한 DNA 증폭을 확인하기 위해 0.8-1 % 아가 로스 겔상에서 느리게 실행. 고 분자량의 클리어 DNA 단편을 겔에서 관찰한다.
- 프로브 준비
- 커버 슬립 또는 슬라이드 당 0.1 1 μg의 프로브를 사용합니다.
참고 : 경쟁이 예를 들어, 대부분의 프로브를해야하는 경우가 그렇지 않은 경우 교차 교배를 반복 서열을 포함하고 배경을 증가시킬 수있는 침대-1 DNA의 2-5 μg의 추가.- 강수량를 들어, 5 μg의 연어 정자 DNA, 1/10 볼륨 5.2, 3 권 에탄올 3 M 아세트산 나트륨의 산도를 추가합니다. 16,000 XG에 스핀, 25 분 동안 4 ° C. 70 % 에탄올로 알약을 세척하고 5 분간 다시 스핀 다운.
- 농축기 / 속도 진공 청소기 2 분 동안 건조 펠렛. 100 % 형태로 재현 탁아미드 하이브리드에 필요한 절반 볼륨에서 (예를 들어, coverslip에 2.5 μL 또는 슬라이드에서 배아 섹션 7 μL). 써모에서 진탕 37 ° C에서 30 분을 놓습니다. 75 ° C에서 7 분 동안 변성.
- 경쟁이 30-60 분 동안 37 ° C에서 직접 넣어 필요한 경우 얼음에 담금질하거나. 배 혼성화 용액의 동량 프로브 용액을 혼합한다.
- 커버 슬립 또는 슬라이드 당 0.1 1 μg의 프로브를 사용합니다.
- 하이브리드 및 세척
- 탈수; 5 분마다 1 배 80 %, 1 배 95 %와 배 100 % 에탄올에 순차적으로 세척하여 코 플린 항아리에 우물 된 커버, 슬라이드,. 완전히 건조 된 커버 및 슬라이드.
- 혼성화, 혼성화 믹스 대향 세포 슬라이드 상에 5 ㎕의 프로브 혼성화 믹스 (3.5 참조)를 적용하고, 커버 슬립을 낮출. 슬라이드 섹션의 경우, (3.5 참조) 14 μl의 프로브 하이브리드 믹스를 적용하고 18 X 18mm 2 coverslip에 함께 다룹니다.
- 습기 챔버에 넣어 슬라이드 (조직 종이에 배어50 % FA / 2 × SSC)와 어둠 속에서, 밤새 37 ° C에서 품어.
- 포스트 하이브리드 세척 :
- 를 느슨하게 할 수있는 슬라이드에 커버 슬립에 50 % FA / 2 × SSC의 1 ML을 추가; 슬라이드에서 조심스럽게 커버 슬립을 제거하고 50 % FA / 2 × SSC를 포함하는 4 웰 플레이트에 최대 그것 세포 측을 배치 (세포를 긁어 않도록주의하면서). 슬라이드 섹션에 대한 유사한 방식으로, 커버 슬립을 제거하고 50 % FA / 2 × SSC를 함유하는 코 플린 항아리에서 슬라이드를 배치했다.
- 각각 커버 슬립 또는 슬라이드 42 ° C 또는 44 ° C에서 미리 예열 50 % FA / 2 × SSC로 7 분 동안 3 세척, 각각을 수행합니다.
- 각각 커버 슬립 또는 슬라이드 42 ° C 또는 44 ° C에서 5 분마다 미리 예열 배 SSC로 3 세척을 수행합니다.
- RT에서 3 분 동안 1 μg의 / ㎖ DAPI로 2 배 SSC에 세척하여 핵을 Counterstain과. 배 SSC로 두 번 씻어.
- Coverslips는 프레젠테이션의 설치
- 배양 TGCS에서 작은 coverslip에 들어 오 & # 적용(181), 슬라이드에 미디어를 장착 리터. 드롭의 상단에 아래 coverslip에 세포 측을 놓습니다.
- 섹션 슬라이드, 슬라이드에 미디어를 장착 15 μl를 적용합니다. 드롭의 상단에 22 X 22mm 2 coverslip에 배치합니다.
- 거품을 피하십시오. 초과 장착 솔루션을 닦아냅니다. 매니큐어 소량 커버 슬립을 밀봉. 가능하면, 이미지는 -20 ° C에서 몇 개월에 즉시 또는 저장 업에 대한 슬라이드.
4. 현미경 및 분석
- 형광 현미경 (63X 대물 렌즈)를 사용하여 0.3 ㎛의 차원 순차 Z 축 이미지를 획득하고 ImageJ에 소프트웨어 (14)를 사용하여 3 차원 화상 스택의 분석을 수행한다.
Representative Results
TGCS 인해 수태에서의 현지화 및 큰 크기로 DAPI 염색시 E7 섹션에서 확인할 수 있습니다. 이것은 종단면도 1a에 도시된다. RNA FISH이 여분의 배아 계보에 X 염색체 불 활성화를 연구하기 위해 배아 섹션에서 수행되었다.
몇몇 슬라이드 나 커버 슬립이 동시에 처리 될 수있다. 다른 유전자의 RNA 라벨을 다른 염료를 사용함으로써, 하나의 동일한 핵 상이한 차 전 사체를 검출 할 수있다. 예를 XIST는 SG (녹색 신호) 및 SR (적색 신호)에 결합 Atrx 결합을 위해 적어도 2 프로브는, 혼합 할 수 있습니다. 여성 TGC의 예는 다른 두 계통이 표현도 1b 적절한 배아 (E) 및 내장 내배엽 (VE)에 도시된다. TGC 핵는 XIST RNA는 X의 CHROM을 덮고 함께 표시됩니다활성화 된 다른 X 염색체 (들 Xa)은 몇 표적을 표시하면서 화학식 XI 비활성화되는 osome. X 연결된 유전자 Atrx 주 성적은 endoreplication으로 인해 여러 사본 (안 XIST 장식) 활성 X 염색체에서 표현된다. 이 monoallelic 식 예를 들어, 하나의 X 염색체에 Atrx의 불 활성화를 나타낸다.
도 2b에 도시 된 바와 같이 TGCS 크기가 불균일하기 때문에, 단지 큰 것들 기록된다. 이차 TGCS 위해도 2c에 도시 된 바와 같이 세 개의 프로브를 사용할 수도있다. 이 경우, XIST -SG (녹색)은 두 개의 X-연결된 유전자 : G6PD -SR (적색)과 Huwe1 -cy (마젠타)은 동일한 핵을 동시에 분석 하였다. G6PD가 monoallelically 다음과 같이 표현 (이전 보조 TGCS에 표시 3) 동안 Huwe1는 biallelically의 홍보를 보여주는 표현된다operty는 XCI 탈출합니다. 여러 표적이 초기 성적 복사본으로 즉 Endoreplication이 또한 명백하다.
E7 여성 배아 섹션에서 TGCS 그림 1. 기본 증명서 식입니다. (A) DAPI로 염색 E7의 수태의 종단면. 배아와 여분의 배아 조직은 어머니 조직의 탈락에 둘러싸여 있습니다. 다른 계통의 현지화는 5 배 목표와 DAPI 염색에 이루어집니다. TGCS는 그들의 큰 크기로 인해 식별됩니다. 장, 융모막, E, 배아, EPC, ectoplacental 콘, VE, 내장 내배엽, TGC, 영양막 세포 거대 세포. 스케일 바 = 100 μm의. (B) A (63X 목적)에서 박스 인 영역의 높은 배율 RNA의 물고기. Atrx 차 성적 증명서 빨간색과 XIST RNA에 녹색이 3 계통 = E에 시각화, TGC를 VE. 사우스 캐롤라이나맥주 바는 10 μm의 =. XIST 코팅 된 X 염색체에 생체 Atrx이 monoallelically 표현된다 TGC (들 Xa, 화살촉) 및 자동 (사이)의 예; 들 Xa에서 본 여러 Atrx 신호는 endoreplication에 기인한다. Atrx = BAC 클론 RP23-260I15가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
EPC에서 파생 된 보조 TGCS 그림 2. 기본 증명서 식입니다. (A) 차 TGCS (X5 목표를) 성장의 일반보기. 스케일 바 = 100 μm의. (B) 별표 크기 (10X 목적)에 따라 TGCS의 예를 나타냅니다. 스케일 바는 60 μm의 =. 3 프로브의 사용과 보조 여성 TGC RNA FISH의 (C) 예 (XIST의 도마사이) () 빨간색과 마젠타 여러 표적을, G6PD 및 Huwe1 차 성적 증명서의 endoreplication을 보여주는 : 녹색의 불 활성화 된 X 염색체을 포함한다. G6PD가 monoallelically 표현되는 동안, Huwe1 발현이 핵 biallelic입니다 Huwe1 = BAC 클론 RP24-157H12;. G6PD = BAC 클론 RP23-13D21. 사이 = 화살표; XA = 화살표 (63X 목적). 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
초기 RNA FISH는 서로 다른 발달 단계에서 배아 조직에서 전사 활동의 단일 세포 분석을위한 쉽고 민감한 방법을 나타냅니다. 이 방법의 파워 학적 기준에 따라 임의의 특정 단계에서 상이한 계통의 배아를 식별 할 수있는 능력이다. 그러나이 또한 최소한의 배경 형광이 존재해야합니다. 그러한 배경이 다른 배아 지역과 도전 세포 유형의 식별을 렌더링합니다. 최소한의 배경을 보장하기 위해,이 프로토콜에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫번째는 동결 절단 (Cryosections)의 품질이며, 둘째는 유전자 발현 수준과 프로브의 품질에 의존 RNA FISH의 효율 (신호 대 잡음 비)이다. 후자의 경우, 프로브 그러므로 항상 섹션을 사용하기 전에 커버 슬립 (배아 줄기 세포 또는 체세포)에 배양 된 세포에 시험한다.
이 프로토콜에서는, 우리는 일 제공전자 기술은 두 개의 서로 다른 시료 제제의 종류 (저온 유지 부 및 배아 이식편의 차 배양)에서 TGCS에서 RNA의 FISH 분석을 수행하는 데 필요한. 이러한 단일 세포 분석 평가하는 다양한 착상 후 단계에서 유전자 발현의 동적 변화를 가능하게한다.
우리가 (E7-7.5 후 주입 단계에서) 보조 TGCS를 생성하기 위해 설명하는 방법은 사후 주입 단계에서 TGCS 구성되어 여분의 배아 계보의 X 염색체 비활성화 패턴을 연구하기 위해 실험실에서 사용되었다. 설치류에서 엑스트라 배아 개발 TGCS의 분화에 따라 달라집니다. 사실, TGCS는 태반 따라서 배아 발달에 필수적이다. TGC 분화의 결함은 배아 치사를 (검토 기준 15 참조) 발생합니다. RNA FISH를 사용 TGCS의 전사 활동은 우리가 마우스 개발 3 중에 이러한 세포 유형의 비정상적인 X 염색체 불 활성화 상태를 입증 할 수 있었다.
생체 TGCS 및 EPC 이식편 유래의 체외 TGCS 다양한 유전자의 전사 활성을 평가할 수 있도록 야생형 마우스 배아의 사용을 포함했다. 이 방법 및 / 또는 배지에서 분자 억제제의 첨가에 의해 트랜스 제닉 마우스의 분석으로 확장 될 수있다. 우리는 성공적 가지를 개발하는 동안 4-5일의에 대한 개별적으로 배양 할 수 있습니다 마우스 개발, E3.0의 blastocyts의 초기 단계에 나타나는 주요 TGCS로, TGCS의 다른 유형에 RNA FISH이 방법을 사용했다 ICM은 큰 차 TGCS (16, 17)에 의해 포위된다. 다른에 대한 초기 성적 증명서뿐만 아니라 XIST 같은 유전자는 시각화와 같은 RNA의 FISH 방법 3을 사용하여 정량화 할 수있다.
결합 된 면역 및 RNA FISH는 체외 배양 TGCS 3뿐만 아니라 저온 유지 부에서 수행 될 수있다. 이것은 기본 증명서는 분해에 매우 취약하고 된 RNase 유리 화합물의 절대 조건이있는 한 방법은 매우 견고한 것을 보여준다. / RNA FISH 동시에 주어진 셀의 전사 수준, 세포 현지화 및 단백질 발현에 대한 추가 정보를 제공합니다. 파라핀 포매 조직 섹션 이전 우리 손에, 조직의 형태 (18)을 유지하면서 인간 종양에서 초기 RNA를 검출하기 위해 사용 된,하지만, 저온 유지 섹션 면역 동안 항체의 탐지에 필요한 초기 RNA 및 에피토프를 모두 보존 더 적합 .
RNA 물고기뿐만 아니라, 메신저 다음munofluorescence는 염색체 DNA FISH는 RNA의 FISH 3에 사용 된 것과 유사한 형광 색소로 표지 된 프로브를 사용하여 이차 TGCS에서 수행 될 수있다. 형광 프로브는 어느 플라스미드 / fosmids 또는 BAC에, 여기에서 사용 된 형광 표지 dUTPs 및 Chaumeil 외., (8)에 기술 될 수있다. 대안 적으로, 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 (19)를 사용할 수있다. FISH는 DNA 가닥 특이성을 필요로하지 않기 때문에, 올리고 뉴클레오티드 프로브는 표적 부위에 상보적인 두 가닥 중 하나를 목표로 설계 될 수있다. 신호 증폭 특정 증폭기 프로브 개의 순차 발사함으로써 달성된다 분지 DNA 프로브는도 FISH 신호 (20)의 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 우리의 DNA 프로브에 기반 신호 품질 특성 및 사용의 용이성 간의 더 나은 균형을 보장하지만 대안 적으로, 리보 프로브와 같은 RNA 프로브가 사용될 수있다.
마지막으로, 3D 이미지 acquisiti에이 큰 셀에서 필요한 공간 정보를 얻기 위하여 필수적이며, 예 Deltavision (GEH)로서 컨벌루션와 같은 Apotome 현미경과 같은 형광 현미경, 또는 표면 형광 현미경의 다양한 사용하여 수행 될 수 있고, 또는 다른 현미경 적합 이미징 조직 섹션, 대형 용 (> 20 μm의) TGCS. 단일 복사본 DNA 궤적위한 초기 RNA 또는 DNA의 FISH의 FISH에 의해 검출 된 신호 점상 용이 초점 현미경에 의해 검출하지 않을 수도 있다는 것을 유의한다.
결론적으로, 우리가 여기서 설명하는 방법이 유용 모두 발달 맥락에서 TGS의 상세한 분석을 위해,뿐만 아니라 다른 질병 상황에 있어야합니다. 설치류 TGC 개발 및 기능에 관여하는 많은 유전자는 전사 인자, 단백질 분해 효소 및 세포 부착 분자 (21)와 같은 설치류와 인간 사이에서 보존된다. 마우스 TGCS는 태반 개발을 조절 공부 유전자 세포 모델입니다D 따라서 인간의 태반 질환에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 인해 이들 세포 endoreplicating이고 일부 암세포 endocycle 프로그램과 결합하기 때문에, 유전자 증폭 방법 외에도,이 서술 된 방법은 또한 암세포 불안정 게놈 주요 메커니즘을 탐구하는 데 필요한 단일 세포 연구에 도움이되어야한다는 사실 .
Acknowledgments
우리는 그림에 대한 도움말은 소피 Gournet 감사, 줄리 Chaumeil 원고, 동물 주택 설비 및 장치의 영상 플랫폼을 읽어. 이 작품은 프로그램«INVESTISSEMENTS 드 아브 니르»에서 지원을받은 참조 ANR-10 LabX에-0044 및 ANR-10 IDEX-0001-02 PSL의 EpiGeneSys FP7 없음으로 프랑스 정부에 의해 출시 ANR에 의해 구현했다. EH에 우수 257082 네트워크, ERC 고급 수사관이없는 수여. 250,367 및 EU FP7 SYBOSS은 부여하지 않습니다. 242129 EH에 저자는 빛에 대한 도움 연구소 퀴리, 프랑스 Bioimaging (ANR-10 InSb를-04) 회원의 유전학과 발달 생물학 교실 (UMR3215 / U934)의 세포 및 조직 이미징 플랫폼을 인정하고 싶습니다 현미경 사용.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
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