Abstract
La placenta deriva da una stirpe extra-embrionali, il trophectoderm. Nel peri-impianto blastocisti murine, le cellule trophectoderm murali si differenziano in cellule giganti trofoblasto primaria (TGC), mentre il trophectoderm polare sovrastante massa cellulare interna continua a proliferare poi differenziarsi in TGC secondari. TGC svolgono un ruolo chiave nello sviluppo e nella placenta sono essenziali per una gravidanza. Indagine di regolazione trascrizionale di geni specifici durante lo sviluppo post-impianto può dare intuizioni sviluppo TGC. Le cellule del cono ectoplacental (EPC) da embrioni a 7-7,5 giorni di gestazione (E7-7.5), derivato dal trophectoderm polare, si differenziano in TGC secondarie 1. TGC può essere studiato in situ, su sezioni al criostato di embrioni a E7 sebbene il numero di TGC è molto basso in questa fase. Un mezzo alternativo di analisi secondaria TGC è quello di utilizzare le culture a breve termine dei singoli EPC da E7 embrioneS. Si propone una tecnica per analizzare lo stato trascrizionale di geni di interesse sia in vivo che in vitro, a livello di singola cellula mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH RNA) per visualizzare trascritti nascenti. Questa tecnica fornisce una lettura diretta di espressione genica e permette la valutazione dello stato cromosomico di TGC, che sono grandi cellule endoreplicating. In effetti, una caratteristica chiave di differenziazione terminale di TGC è che escono il ciclo cellulare e sottoposti a vari cicli di approccio endoreplication.This possono essere applicati per rilevare l'espressione di un gene espresso da autosomi e / o cromosomi sessuali e può fornire informazioni importanti in sviluppo meccanismi così come le malattie della placenta.
Introduction
Mammiferi trofoblasto cellule giganti (TGC) formano una barriera tra tessuti materni ed embrionali. Essi mediano l'impianto e l'invasione del concepito nell'utero e giocano ruoli critici in sviluppo per la formazione della placenta. Essi producono diversi fattori di crescita (citochine) e ormoni della famiglia e gli steroidi prolattina / placentare Lactogen, necessari per la crescita embrionale e la sopravvivenza. TGC sono grandi, mononucleate e poliploide celle con un ciclo cellulare, la endocycle, che consiste nell'alternare fasi S e G. Infatti, TGC sono endoreplicating cellule, in grado di sottoporsi a vari cicli di sintesi del DNA, senza alcuna divisione 2. Al fine di indagare lo stato trascrizionale dei geni in vivo, in TGC rispetto ad altri tipi di cellule embrionali e fetali, nascente RNA FISH può essere eseguita in vivo su sezioni al criostato 3 a specifiche fasi di post-impianto. TGC sono facilmente riconoscibili sulle sezioni a causa di theiR grandi dimensioni e la loro attività trascrizionale del gene possono essere registrati, ma il loro numero nelle fasi iniziali post-impianto è basso. Scarsità di TGC su E7 sezioni embrionali, ci ha portato a realizzare le culture a breve termine dei tessuti trophectodermal embrionali per ottenere TGC differenziate al fine di studiare la regolazione dell'espressione genica durante lo sviluppo trophectoderm. Inoltre, al fine di rimanere il più fisiologico possibile, linee cellulari stabilizzate cioè trophectoderm cellule staminali (TS) non sempre sono adatti per studiare i meccanismi di sviluppo Generazione di TGC secondarie forniscono un valido strumento per studiare le gravidanze patologiche associate a difetti di certificati verdi negoziabili a causa di gene anomalo regolamentazione nei topi.
Cellule del trofoblasto del cono ectoplacental (EPC) sono precursori di TGC secondarie 4. Differenziazione spontanea di EPC in coltura per TGC secondario è stato riportato in precedenza 5. Tuttavia, a differenza TGC primari, studi su differen TGC secondariaziazione sono rimasti limitati, presumablydue alle difficoltà di isolare espianti EPC, libero da qualsiasi tessuti materni o embrionali. Abbiamo adattato questi metodi, per eseguire RNA FISH su TGC secondarie derivate da embrione a E7, una fase di sviluppo post-impianto dove TGC sono molto pochi ma potrebbero essere generati da precursori EPC. RNA FISH analizzare trascritti primari nucleari è mai stato fatto a livello del livello di singola cellula su TGC secondarie. Questo permette l'analisi precisa di trascrizione ed è stato utilizzato per mostrare l'instabilità epigenetica di TGC nelle fasi post-impianto 3.
Un classico esempio di epigenetica nei mammiferi, l'inattivazione del cromosoma X (XCI) è studiato in laboratorio Heard 6. In questo processo uno dei 2 cromosomi X nella femmina è inattivato. La non-codificante Xist trascritto ricopre il cromosoma X da cui viene espresso in cellule femminili e innesca silenziamento maggior parte dei geni. Utilizzando RNA FISH,trascritti nascenti di geni X-linked possono essere studiati come può l'accumulo di RNA Xist sul cromosoma X inattivo (Xi). Descriviamo qui di una procedura per eseguire l'RNA FISH su sezioni di embrioni post-impianto e sulle culture a breve termine di EPC. Questo protocollo adattato da quelli che sono stati utilizzati per studiare XCI nel differenziare le cellule staminali embrionali femminili ed embrioni preimpianto 7-11. Forniamo esempi di XCI in embrioni di sesso femminile in vivo, così come in vitro TGC.
Protocol
procedure di animali sono state eseguite in conformità con la cura degli animali istituzionale approvato e utilizzano Comitato delle Institut Curie (CEEA-IC) protocolli (C 75-05-18). Il lavoro è stato inoltre condotto sotto l'approvazione da parte del Ministero dell'Istruzione superiore e della ricerca francese per l'uso di organismi geneticamente modificati (numero di contratto 5549CA-I).
1. Preparazione del criostato sezioni
- Raccogliere gli embrioni da ovulazione naturalmente F1 C57BL / 6 x DBA topi / 2J come descritto in Shea et al., 12. Il giorno 7 di gestazione (E7), sacrificare 8-12 settimane vecchio mouse dislocazione cervicale. Raccogliere l'intera concepito cioè decidua 12.
- Isolare conceptuses E7, come descritto in Shea et al., 12. Metterli in un piatto di 60 millimetri di Petri contenente PBS.
- Congelare l'E7 del mouse concepito per sezioni al criostato.
- Preparare pozzi foglio di alluminio adattati 1 cm di altezza ( 'fatta in casa' con una lente di Pasteur pipet). Depositare una goccia di mezzo di tessuto congelamento sulla parte inferiore di questo piccolo contenitore. Depositare il concepito con l'orientamento corretto (ad esempio, per le sezioni longitudinali il concepito dovrebbe mantenuto nel suo orientamento orizzontale).
- Riempire il pozzetto contenente il concepito con il tessuto congelamento media. Sospendere con pinze a vapore superiore liquido N 2 per permettere di congelare lentamente - poi immergere il blocco nel liquido N 2 per pochi secondi fino a quando non diventa bianco. Successivamente, trasferire il blocco in una fiala di congelamento e conservare a -80 ° C (può memorizzare per diversi mesi).
- Prima di crio-sezionamento, posizionare il blocco congelato contenente il concepito a -20 ° C nel criostato per 30 min. Eseguire criosezioni di spessore 8 micron. Deposito 4 sezioni su uno scivolo per consentire l'attaccamento efficiente. Sezioni posto vicino abbastanza da stare sotto un coprioggetto 18 x 18 mm 2.
- Controllare la qualità delsezioni (intatte e senza graffi) e l'orientamento dell'embrione (sezioni longitudinali) con uno stereomicroscopio e scegliere le sezioni adatte per ulteriori analisi. Nel più breve tempo possibile depositarli in una vaschetta Coplin ed eseguire RNA FISH (vedere 3.3.2).
2. Preparazione di TGC secondaria
- Isolare il concepito (vedi 1.1 e 1.2).
- Sezionare il E7 Ectoplacental Cone (EPC)
- Utilizzare uno stereomicroscopio e piastre di Petri contenenti PBS sterile. Sezionare il decidua con una pinza. Pierce il campione e pinze aperte per strappare i due lati della decidua parte.
- Sborsare l'embrione. Utilizzare punte della pinza sottile chiusi (Dumont No. 5) in una azione di forbice per separare l'EPC dall'embrione corretta. Usare particolare cura per ottenere un campione perfettamente pulito, separato dal tessuto materno come pure da corion e sacco vitellino. Lavare espianti EPC in PBS.
- Con un cucchiaino, trasferire EPC Dissected individuale ad una 4-well piatto contenente un vetrino sterile in mezzo.
- Derive TGC da EPC Culture a breve termine.
- Preparare 4-pozzetti contenenti lamelle. Sterilizzare 12 millimetri di diametro rotonda vetrini immergendo in etanolo, seguito da fiamma essiccazione.
- Aggiungere 0,5 ml di mezzo EPC in ogni pozzetto (media EPC: RPMI 1640 integrato con il 15% di FCS, 0,1 mM 2-mercaptoetanolo e antibiotici).
- Deposito singolo, sezionati-EPC al centro del vetrino nel pozzo con terreno di coltura. Utilizzare una pinza sottile per applicare l'EPC sul vetrino di vetro. Culturefor 3-5 giorni a 37 ° C, 5% CO 2. Espianto forme individuali una conseguenza che si diffonde come un monostrato di appiattito TGC (Figura 2A).
3. RNA FISH
NOTA: I protocolli sono basate su quelle descritte per le cellule staminali embrionali (CSE) a Chaumeil et al, 8 e Pollex e Heard 13..
- Prepa avanzatarazione di soluzioni madre
- Preparare un tampone 3M sodio acetato pH 5.2.
- Preparare tampone di ibridazione 2x contenente il 40% (w / v) destrano solfato di sodio, 20x BSA, 400 mm Vanadyl ribonucleosidi Complex (VRC) a 4x Saline citrato di sodio (SSC).
- Preparare mezzo di montaggio contenente il 90% (v / v) glicerolo, 0,1% (w / v) p-fenilendiammina, pH 9 in PBS.
- Soluzioni appena preparate
- Preparare la soluzione fissativa al 3% paraformaldeide preparata al momento (PFA) in PBS. Preparare la soluzione permeabilizzazione contenente 0,5% Triton-X-100 in PBS integrato con 2 mM VRC. Preparare tampone di lavaggio mescolando 50% formammide (FA) e 2x SSC e regolare il pH a 7,2-7,4.
- Preparare la soluzione contro-colorazione DNA composto da 1 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato) in 2x SSC.
- Fissazione e permeabilizzazione in preparazione FISH
- Per le cellule su vetrini, lavare le cellule in 1x PBS per 5 min. Fix cellule su vetrini, o sezioni embrionali su vetrini per 10 min in fissativo soluzione (3% PFA) a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule tre volte con PBS 1x. Permeabilize cellule per 5 min in soluzione di permeabilizzazione ghiacciata sul ghiaccio. Lavare le cellule tre volte con il 70% di etanolo. coprioggetto Conservare in piastre 4 pozzetti e in cassette di trasporto 4-scivolo nel 70% di etanolo a -20 ° C.
NOTA: Coprioggetto e diapositive possono essere conservati per diversi mesi a -20 ° C. Piastre e scatole che li contengono devono essere sigillati con parafilm per evitare l'evaporazione di etanolo.
- DNA Probe Etichettatura
- Etichetta sonde di DNA da traduzione nick utilizzando nucleotidi fluorescenti. Seguire le istruzioni del produttore (vedi tabella 1) 8.
- Per una miscela di reazione di 50 ml, aggiungere 1-2 mg di plasmide, cromosomi batterici artificiali (BAC) o di amplificazione spostamento multipla (MDA) (per l'amplificazione del DNA; vedi 3.4.4) DNA a 17,5 ml di acqua, 2,5 ml 0,2 mMSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 microlitri 10 mm Ogni miscela dNTP (dGTP, dATP, dCTP), 5 ml 10 mM dTTP, 5 ml di buffer 10x traduzione nick e 8 ml nick enzima traduzione.
- Incubare per 16 ore a 15 ° C al buio. Inattivare la reazione mediante congelamento a -20 ° C. sonde Conservare per mesi a -20 ° C.
- MDA
NOTA: per il DNA BAC, la quantità di DNA ottenuto dopo la preparazione classica è bassa, quindi si può usare una fase di amplificazione del DNA prima di etichettatura utilizzando MDA. Utilizzare un kit commerciale e seguire le istruzioni del produttore (vedi tabella 1). - Mescolare 0,5 ml di DNA BAC con 9,5 microlitri tampone campione. Scaldare 3 min a 95 ° C. estinguere immediatamente in ghiaccio; lasciare in ghiaccio 10 min. Preparare mix tampone di reazione / enzimatica: (9,5 ml + 0,5 microlitri miscela di enzimi) e tenere in ghiaccio.
- Mescolare 10 ml mix di DNA + 10 ml mix di reazione tampone / enzima. Incubare a 30 ° C per almeno 20 ore. Inattivare enzimi per esempio riscaldamento di 10 min a 65 & #176; C. Raffreddare campione a 4 ° C prima della conservazione a -20 ° C.
- Controllare MDA dalla digestione. Aggiungere 1 ml MDA, 2 microlitri di buffer 10x, 2 microlitri Hind III e 15 ml H 2 O. Incubare a 37 ° C durante la notte. Eseguire lentamente su un gel di agarosio 0,8-1% per confermare accurata amplificazione del DNA. Cancella frammenti di DNA ad alto peso molecolare devono essere osservati sul gel.
- Preparazione della sonda
- Utilizzare 0,1 o 1 mg sonda per vetrino o scivolare.
NOTA: Aggiungere 2-5 mg di Cot-1 DNA se la concorrenza è necessaria per esempio, la maggior parte delle sonde in quanto possono contenere ripetere sequenze che Ibridare altrimenti croce e aumentare sfondo.- Per la precipitazione, aggiungere 5 mg salmone DNA spermatico, 1/10 del volume 3 M acetato di sodio a pH 5.2 e 3 volumi di etanolo. Spin a 16.000 xg e 4 ° C per 25 min. Lavare pellet con il 70% di etanolo e spin giù di nuovo per 5 min.
- pellet secco per 2 minuti in una vac concentratore / velocità. Risospendere in forma al 100%ammide in metà del volume richiesto per l'ibridazione (per esempio, 2,5 microlitri per coprioggetto o 7 microlitri per sezioni embrionali sul vetrino). Posizionare 30 min a 37 ° C con agitazione in una thermomixer. Denaturare per 7 minuti a 75 ° C.
- Quench su ghiaccio, o se la concorrenza è richiesto messo direttamente a 37 ° C per 30-60 min. Mescolare la soluzione della sonda con un volume uguale di soluzione di ibridazione 2x.
- Utilizzare 0,1 o 1 mg sonda per vetrino o scivolare.
- Ibridazione e lavaggi
- Disidratare; coprioggetto in pozzi, e diapositive in una vaschetta Coplin, di lavaggio sequenziale a 1x 80%, 95% e 1x 2x 100% di etanolo per 5 minuti ciascuno. coprioggetto secco e diapositive completamente.
- Per l'ibridazione, applicare la sonda di ibridazione mix 5 ml (vedi 3.5) su un vetrino e abbassare il vetrino, con le cellule si affacciano nel mix di ibridazione. Per le sezioni su vetrino, applicare 14 ml mix di sonde di ibridazione (vedi 3.5) e coprire con un coprioggetto 18 x 18 mm 2.
- Posizionare i vetrini in una camera umida (carta velina immersi in50% FA / 2x SSC) e incubare a 37 ° C per una notte, al buio.
- Lava Post-ibridazione:
- Aggiungere 1 ml di 50% FA / 2x SSC sul vetrino sul vetrino per allentarla; rimuovere il vetrino con attenzione di diapositiva (facendo attenzione a non raschiare le cellule) e posizionarlo cellulare rivolta verso l'alto in un piatto 4-pozzetti contenenti il 50% FA / 2x SSC. Per le sezioni sulla diapositiva, rimuovere il vetrino in un modo simile e posizionare il vetrino in una vaschetta Coplin contenente il 50% FA / 2x SSC.
- Effettuare 3 lavaggi, ciascuno per 7 min con pre-riscaldato 50% FA / 2x SSC a 42 ° C o 44 ° C per vetrino o scorrere rispettivamente.
- Effettuare 3 lavaggi con pre-riscaldato 2x SSC per 5 minuti ciascuno a 42 ° C o 44 ° C per vetrino o scorrere rispettivamente.
- nuclei di lavaggio Controcolorare in 2x SSC con 1 mg / ml DAPI per 3 minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte con 2x SSC.
- Montaggio di vetrini e diapositive
- Per le piccole vetrino da colta TGC, applicare 5 & #181; mezzo di montaggio su un vetrino l. Posizionare la cella lato coprioggetto giù in cima della goccia.
- Per slide con le sezioni, applicare 15 microlitri di media sulla slitta di montaggio. Inserire un mm 2 coprioggetto 22 x 22 sulla parte superiore della goccia.
- Evitare le bolle. Pulire soluzione di montaggio in eccesso. Sigillare il vetrino con una piccola quantità di smalto. Se possibile, l'immagine scorre immediatamente o conservare fino a diversi mesi a -20 ° C.
4. Microscopia e analisi
- Acquisire immagini z assi sequenziali 3D in 0,3 micron utilizzando un microscopio a fluorescenza (obiettivo 63X) ed eseguire l'analisi di pile di immagini 3D utilizzando il software ImageJ 14.
Representative Results
TGC può essere identificato su sezioni E7 su colorazione DAPI a causa della loro localizzazione nel concepimento e le loro grandi dimensioni. Questo è illustrato in Figura 1A su una sezione longitudinale. RNA FISH è stata eseguita su tali sezioni embrionali per studiare inattivazione del cromosoma X in questo lignaggio extra-embrionali.
Diversi diapositive o coprioggetto possono essere trattati contemporaneamente. Utilizzando diversi coloranti per etichettare RNA di geni diversi, si può rilevare diversi trascritti primari nello stesso nucleo. Almeno 2 sonde possono essere mescolati tra loro, per esempio Xist accoppiato ad SG (segnale verde) e ATRX accoppiato a SR (segnale rosso). Un esempio di una femmina TGC è mostrato in Figura 1B in cui sono rappresentate 2 altre linee, l'embrione corretta (E) e l'endoderma viscerale (VE). Un nucleo TGC è mostrata con Xist RNA che copre il X Chromosome che viene inattivato (Xi), mentre l'altro cromosoma X che è attivo (Xa) mostra un paio di puntini. Gene ATRX trascrizioni primarie X-linked sono espressi dal cromosoma X attivo (non decorata da Xist) in diverse copie a causa di endoreplication. Questo illustra monoallelic ad esempio l'espressione, l'inattivazione di ATRX su un cromosoma X.
Poiché TGC sono eterogenei dimensioni come illustrato in figura 2B, solo quelli più grandi vengono registrate. Tre sonde possono anche essere usati come illustrato in Figura 2C per TGC secondarie. In questo caso, Xist -sg (verde), due geni X-linked: G6PD -SR (rosso) e Huwe1 -cy (magenta) sono stati analizzati allo stesso tempo nello stesso nucleo. Mentre G6PD è monoallelically espresso come mostrato qui (e in precedenza mostrato in TGC secondari 3) Huwe1 è biallelically espresso dimostrando la sua property per sfuggire XCI. Endoreplication, con diversi puntini IE, trascritti nascenti copie, è anche evidente.
Figura 1. espressione trascritto primario in TGC da E7 sezione embrionali femminile. (A) Sezione longitudinale del concepito E7 macchiato con DAPI. L'embrione e tessuti extra-embrionali sono circondate dal tessuto madre, la decidua. La localizzazione dei differenti linee avviene sulla colorazione DAPI con obiettivo 5X. TGC vengono identificati a causa delle loro grandi dimensioni. Ch, corion, E, embrione, EPC, cono ectoplacental, VE, endoderma viscerale, TGC, trofoblasto cellule giganti. Barra di scala = 100 micron. (B) maggiore ingrandimento della zona in scatola nella A (obiettivo 63X) RNA FISH. ATRX trascritto primario in rosso e Xist RNA in verde sono visualizzate sul 3 linee = E, VE, TGC. Scale barra = 10 micron. Esempio di TGC in vivo in cui si ATRX monoallelically espresso (Xa, punta di freccia) e silenzio sulla Xist Rivestiti cromosoma X (Xi); diversi segnali ATRX visto sul Xa sono dovuti a endoreplication. ATRX = BAC clone RP23-260I15. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. espressione trascritto primario in TGC secondarie derivate da EPC. (A) Vista generale di crescente TGC secondaria (obiettivo x5). Barra di scala = 100 micron. (B) asterisco indicano esempio di TGC base alle loro dimensioni (obiettivo 10X). Barra di scala = 60 micron. (C) Esempio di una femmina secondaria TGC RNA FISH con l'uso di 3 sonde (Xist domain verde, che copre il cromosoma X inattivato: Xi) che mostra endoreplication di G6PD e Huwe1 trascritti primari (diverse puntini, in rosso e magenta). Mentre G6PD è espressa monoallelically, espressione Huwe1 è biallelica in questo nucleo Huwe1 = BAC clone RP24-157H12;. G6PD = BAC clone RP23-13D21. Xi = freccia; Xa = punta di freccia (obiettivo 63X). Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Nascente RNA FISH rappresenta un metodo semplice e sensibile per la singola analisi delle cellule di attività trascrizionale in tessuti embrionali a diversi stadi di sviluppo. La potenza di questo approccio è la capacità di individuare diverse linee embrionali in qualsiasi fase particolare secondo i criteri morfologici. Tuttavia, questo richiede anche che sfondo minima fluorescenza è presente. Tale fondo rende l'identificazione delle diverse regioni embrionali e tipi di cellule di sfida. Per garantire sfondo minima, ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo è la qualità del cryosection e il secondo è l'efficienza (rapporto segnale rumore) del RNA FISH, che dipende dal livello di espressione genica e la qualità della sonda. Per questi ultimi, le sonde sono quindi sempre testati su cellule coltivate su vetrini (cellule staminali embrionali o cellule somatiche) prima dell'uso su sezioni.
In questo protocollo, forniamo °tecniche e necessari per eseguire RNA analisi FISH su TGC da due diversi tipi di preparazione del campione (sezioni al criostato e colture primarie di espianti embrionali). Tale analisi singola cella consente cambiamenti dinamici di espressione genica nelle diverse fasi post-impianto da valutare.
I metodi che descriviamo di generare secondaria TGC (a E7-7.5 fasi post-impianto) sono stati utilizzati nel nostro laboratorio per studiare i modelli X-inattivazione del cromosoma di un lignaggio extra-embrionali che è costituito di TGC nelle fasi post-impianto. sviluppo extra-embrionali nei roditori dipende dalla differenziazione dei TGC. Infatti, TGC sono essenziali per lo sviluppo della placenta e quindi embrionale. Difetti di differenziazione TGC causa letalità embrionale (per la revisione vedi riferimento 15). Attività trascrizionale di TGC utilizzando RNA FISH ci ha permesso di dimostrare un cromosoma X stato di inattivazione inusuale di questo tipo di cellule durante lo sviluppo del mouse 3.
in vivo TGC e in TGC in vitro derivate da EPC espianto. Questo metodo può essere esteso all'analisi di topi transgenici e / o con l'aggiunta di molecole di inibitore nel mezzo di coltura. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo di RNA FISH su un altro tipo di TGC, come ad esempio TGC primarie che appaiono in una fase iniziale di sviluppo del mouse, blastocyts E3.0, che può essere personalizzato in coltura per 4-5 giorni durante i quali hanno sviluppato conseguenza, i ICM di essere circondata da grandi TGC primarie 16,17. trascrizioni nascenti per diversigeni così come Xist potrebbero essere visualizzati e quantificati utilizzando lo stesso approccio RNA FISH 3.
Immunofluorescenza combinato e RNA FISH possono essere eseguite anche su sezioni al criostato e in vitro TGC coltivate 3. Ciò dimostra che il metodo è abbastanza robusto, come trascritti primari sono altamente suscettibili di degradazione e vi è un requisito assoluto di composti liberi RNasi. IF / RNA FISH fornisce ulteriori informazioni sui livelli di trascrizione, localizzazione cellulare e l'espressione della proteina, allo stesso tempo in una determinata cella. Anche se, le sezioni di tessuto incluso in paraffina sono stati precedentemente utilizzato per rilevare l'RNA nascente nei tumori umani, pur mantenendo la morfologia del tessuto 18, nelle nostre mani, sezioni al criostato sono più appropriati per preservare l'RNA nascente e gli epitopi necessarie per il rilevamento da parte di anticorpi durante immunofluorescenza .
Oltre a RNA FISH, seguendo immunofluorescence, cromosomico DNA pesce può anche essere eseguita su TGC secondari utilizzando sonde marcate con fluorocromi, simili a quelli utilizzati per l'RNA FISH 3. Sonde fluorescenti possono essere sia plasmidi / fosmidi o BAC, etichettati con dUTPs fluorescenti ed usati qui, e descritti in Chaumeil et al., 8. In alternativa, oligonucleotidi fluorescente possono essere utilizzati 19. Poiché DNA FISH non richiede strand-specificità, sonde oligonucleotidiche possono essere progettati per indirizzare uno dei due filamenti complementari nella regione bersaglio. Sonde di DNA ramificato, in cui l'amplificazione del segnale è ottenuto attraverso due cicli sequenziali di sonde specifiche e amplificazione possono anche essere utilizzati per migliorare il rapporto segnale-rumore dei segnali FISH 20. In alternativa, le sonde di RNA come riboprobes possono essere utilizzati anche nelle nostre sonde di DNA basata garantire una migliore compromesso tra la qualità del segnale, specificità e facilità d'uso.
Infine, l'immagine 3D acquisition è essenziale per ottenere le informazioni spaziali richieste in questi grandi cellule, e può essere eseguita utilizzando una varietà di microscopi a fluorescenza, come il microscopio apotome o microscopi a epifluorescenza dotato di deconvoluzione come il Deltavision (GEH), o altri microscopi adatto per sezioni di tessuto per immagini, e di grandi dimensioni (> 20 micron) TGC. Va notato che un singolo loci copia di DNA, il segnale rilevato dal puntata nascente FISH RNA o DNA FISH non può essere facilmente rilevata mediante microscopia confocale.
In conclusione, i metodi che descriviamo qui dovrebbero essere utili sia per l'analisi dettagliata di TGS in un contesto di sviluppo, ma anche in altre situazioni di malattia. Molti geni che sono coinvolti nello sviluppo e nella funzione di TGC nei roditori sono conservati tra i roditori e gli esseri umani, come i fattori di trascrizione, proteasi e molecole di adesione cellulare 21. Topo TGC sono un modello cellulare per i geni che regolano studiano placenta uno sviluppod quindi dare intuizioni patologie placentari umane. Inoltre, a causa del fatto che queste cellule sono endoreplicating e poiché alcune cellule tumorali impegnarsi programmi endocycle, oltre ai processi di amplificazione genica, i metodi che descriviamo dovrebbero anche essere utile in indagini monocellulari necessari per esplorare meccanismi che portano alla genoma instabilità nelle cellule tumorali .
Acknowledgments
Ringraziamo Sophie Gournet per un aiuto con le illustrazioni, Julie Chaumeil per aver letto il manoscritto, l'impianto di stabulazione degli animali e la piattaforma di imaging dell'Unità. Questo lavoro ha ricevuto sostegno nell'ambito del programma «Investissements d'Avenir» lanciato dal governo francese e attuato da ANR con i riferimenti ANR-10-LabX-0044 e PSL ANR-10-IDEX-0001-02, il 7 ° PQ EpiGeneSys no. 257.082 rete di eccellenza a EH, un ERC Advanced Investigator Award no. 250367 e 7 ° PQ SYBOSS UE concessione n. 242129 a EH Gli autori vorrebbero riconoscere il cellulare e tissutale Imaging Piattaforma della genetica e dello sviluppo Dipartimento di Biologia (UMR3215 / U934) del Institut Curie, membro del France-Bioimmagini (ANR-10-InSb-04), per un aiuto con la luce microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
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