Abstract
Morkaken stammer fra en ekstra-embryonale avstamning, den trophectoderm. I peri-implantasjon murine blastocyst, veggmaleri trophectoderm cellene differensieres til primær trophoblast kjempeceller (grønne sertifikater), mens den polare trophectoderm liggende den indre cellemassen fortsetter å spre seg senere å differensiere til videregående grønne sertifikater. Grønne sertifikater spiller en sentral rolle i utviklingen av placenta og er avgjørende for en vellykket graviditet. Undersøkelse av transkripsjonsregulering av spesifikke gener i perioden etter implantasjon utvikling kan gi innsikt i grønne sertifikater utvikling. Cellene i ectoplacental kjegle (EPC) fra embryoer på 7-7,5 dagers drektighet (E7-7.5), avledet fra polar trophectoderm, differensieres til videregående grønne sertifikater 1. Grønne sertifikater kan studeres in situ, på kryostatsnitt av embryoer på E7 selv om antallet grønne sertifikater er svært lav på dette stadiet. En alternativ metode for å analysere sekundær grønne sertifikater er å bruke kortsiktige kulturer av individuelle EPCs fra E7 embryos. Vi foreslår en teknikk for å undersøke den transkripsjonelle status av gener som er av interesse både in vivo og in vitro på enkelt-celle-nivå ved å benytte fluorescens in situ hybridisering (FISH RNA) for å visualisere begynnende transkripter. Denne teknikken gir en direkte avlesning av genekspresjon og muliggjør vurdering av det kromosomale status av grønne sertifikater, som er store endoreplicating celler. Faktisk, en viktig funksjon i terminal differensiering av grønne sertifikater er at de går ut av cellesyklus og gjennomgå flere runder med endoreplication.This tilnærming kan brukes til å påvise uttrykk av noe genet uttrykkes fra autosomer og / eller kjønnskromosomer og kan gi viktig informasjon i utviklings mekanismer samt placenta sykdommer.
Introduction
Pattedyr trophoblast kjempeceller (grønne sertifikater) danner en barriere mellom mors og embryonale vev. De formidler implantasjon og invasjon av abortmaterialet inn i livmoren og spiller avgjørende roller i utvikling for dannelsen av placenta. De produserer flere vekstfaktorer (cytokiner) og hormoner i Prolactin / placental laktogen familie og steroider, som er nødvendig for embryonisk vekst og overlevelse. Sertifikater vil være stor, og mononukleærerte polyploid celler med en cellesyklus, den endocycle, som består av vekslende S og G-faser. Faktisk grønne sertifikater er endoreplicating celler, i stand til å gjennomgå flere runder med DNA-syntese uten divisjon 2. For å undersøke den transkripsjonelle status av gener in vivo, i grønne sertifikater i forhold til andre embryonale og extraembryonic celletyper, kan begynnende RNA FISH bli utført in vivo på kryostatsnitt 3 på bestemte etter implantasjon trinn. Grønne sertifikater er lett gjenkjennelig på strekninger grunnet their stor størrelse og deres transkripsjonen genaktivitet kan tas opp, men antallet på tidlig etter implantasjon etapper er lav. Mangelen på grønne sertifikater på E7 embryonale seksjoner, ledet oss til å utføre kortsiktige kulturer av embryonale trophectodermal vev for å få differensierte grønne sertifikater for å studere regulering av genuttrykk under trophectoderm utvikling. Videre, for å forbli som fysiologisk mulig, etablerte cellelinjer dvs. trophectoderm stamceller (TS) er ikke alltid egnet til å undersøke utviklingsmekanismer Generering av sekundære grønne sertifikater gir et verdifullt verktøy for å studere patologiske svangerskap forbundet med feil i grønne sertifikater på grunn av unormale genet regulering i mus.
Trophoblast cellene i ectoplacental kjegle (EPC) er forløpere for sekundær grønne sertifikater 4. Spontan differensiering av kultur EPCs til videregående grønne sertifikater har tidligere blitt rapportert fem. Men i motsetning til primær grønne sertifikater, studier på videregående TGC differenfor handling har vært begrenset, presumablydue til vanskelighetene med å isolere EPC explants fri for enhver mors eller embryonale vev. Vi tilpasset disse metodene, for å utføre RNA FISH på sekundære grønne sertifikater fra individuelle embryo på E7, en utviklings etter implantasjon stadiet der grønne sertifikater er svært få, men kan bli generert fra EPC forløpere. RNA FISH å analysere kjerne primære transkripter har aldri vært gjort på nivået av den enkelte celle-nivå på sekundære grønne sertifikater. Dette tillater presis analyse av transkripsjon og ble brukt til å vise epigenetisk ustabilitet av grønne sertifikater på etter implantasjon etapper 3.
Et klassisk eksempel på epigenetikk i pattedyr, er X-kromosom inaktivering (XCI) studert i Heard lab 6. I denne prosessen en av de 2 X-kromosomer i kvinne inaktiveres. Den ikke-kodende Xist transkripsjons strøk X-kromosom fra hvilken den kommer til uttrykk i hunnceller og utløser stanse av de fleste genene. Ved hjelp av RNA FISH,gryende transkripsjoner av X-linked gener kan bli etterforsket som kan akkumulering av Xist RNA på inaktive X-kromosomet (Xi). Vi beskriver her en prosedyre for å utføre RNA FISH på deler av etter implantasjon embryoer og på kortsiktige kulturer av EPC. Denne protokollen tilpasset fra de som ble brukt til å studere XCI i differensierende hunn embryonale stamceller og preimplantation embryoer 7-11. Vi gir eksempler på XCI i hunn embryoer in vivo så vel som in vitro grønne sertifikater.
Protocol
Animal prosedyrer ble utført i samsvar med godkjent institusjonelle dyr omsorg og bruk komité av Institut Curie (CEEA-IC) protokoller (C 75-05-18). Arbeidet har også blitt gjennomført under godkjenning fra det franske departementet for høyere utdanning og forskning for bruk av genmodifiserte organismer (avtalenummer 5549CA-I).
1. Utarbeidelse av kryostatsnitt
- Samle embryoer fra naturlig eggløsning F1 C57BL / 6 x DBA / 2J-mus som beskrevet i Shea et al., 12. På dag 7 av svangerskapet (E7), ofre 8-12 uker gamle mus ved halshugging. Samle hele Conceptus dvs. decidua 12.
- Isolere E7 embryo, som beskrevet i Shea et al., 12. Plassere dem i en 60 mm petriskål inneholdende PBS.
- Frys E7 musen Conceptus for kryostatsnitt.
- Forbered folie brønner tilpasset aluminiums 1 cm i høyde ( 'hjemmelaget' med et glass Pasteur pipet). Deponere en dråpe av vev frysemedium på undersiden av denne lille beholder. Deponere Conceptus i riktig retning (dvs. for lengdesnitt av abortmaterialet bør opprettholdes i sin horisontal orientering).
- Fyll godt som inneholder Conceptus med vev frysemedium. Suspendere det med pinsett i dampen over flytende N2 for å tillate det å fryse langsomt - deretter senke blokken i den flytende N2 i noen få sekunder før den blir hvit. Deretter overfører blokken i en frysehetteglass og oppbevar ved -80 ° C (kan lagre i flere måneder).
- Før cryo-seksjonering, plasserer den frosne blokken som inneholder Conceptus ved -20 ° C i kryostaten for 30 min. Utfør frysesnitt av 8 mikrometer tykkelse. Innskudds 4 seksjoner på et lysbilde for å muliggjøre effektiv vedlegg. Plasser seksjoner nær nok til å passe under en 18 x 18 mm 2 dekkglass.
- Kontrollere kvaliteten avseksjoner (intakte og uten riper) og orienteringen av embryo (lengdesnitt) med en stereo og velge de delene som er egnet for videre analyse. Så raskt som mulig sette dem i en Coplin krukke og utføre RNA FISH (se 3.3.2).
2. Utarbeidelse av Sekundær grønne sertifikater
- Isoler Conceptus (se 1.1 og 1.2).
- Dissekere E7 Ectoplacental Cone (EPC)
- Bruk en stereomikroskop og petriskåler som inneholder sterilt PBS. Dissekere decidua med pinsett. Pierce prøven og åpen tang for å rive de to sidene av decidua fra hverandre.
- Shell ut fosteret. Bruk tips av lukkede fine tang (Dumont # 5) i en sakselignende tiltak for å skille EPC fra embryo riktig. Bruk spesiell omsorg for å få en helt ren prøve, atskilt fra mors vev samt fra chorion og plommesekken. Vask ut EPC explants i PBS.
- Med litt skje, overføre enkelte preparat EPC til en 4-well plate som inneholder en steril dekkglass i medium.
- Utlede grønne sertifikater fra EPCs Kortsiktige kulturer.
- Forbered 4-brønners plater som inneholder Dekk. Steril 12 mm diameter stanse med rund dekkglass ved neddykking i etanol, etterfulgt av flamme-tørking.
- Tilsett 0,5 ml EPC medium til hver brønn (EPC medium: RPMI 1640 supplementert med 15% FCS, 0,1 mM 2-merkaptoetanol og antibiotika).
- Innskudd enkelt, dissekert-EPCs i sentrum av dekkglass i brønnen sammen med kulturmedium. Bruk fin pinsett til å bruke EPC på dekkglass. Culturefor 3-5 dager ved 37 ° C, 5% CO2. Individuell explant danner en utvekst som sprer seg som et monolag av flatet grønne sertifikater (figur 2A).
3. RNA FISH
MERK: Protokollene er basert på de som er beskrevet for embryonale stamceller (ESCs) i Chaumeil et al, 8 og Pollex og Heard 13..
- Avansert behandling anleggrasjon av Stock Solutions
- Forbered en 3M natriumacetat pH 5,2.
- Forbered 2x hybridiseringsbuffer inneholdende 40% (vekt / volum) natrium dekstransulfat, 20x BSA, 400 mM Vanadyl ribonukleosid-komplekset (VRC) i 4x Saline natriumcitrat (SSC).
- Fremstille monterings medium inneholdende 90% (v / v) glyserol, 0,1% (w / v) p-fenylendiamin, pH 9 i PBS.
- Nylaget Solutions
- Forbered fiksativ løsning bestående av 3% nylaget Paraformaldehyde (PFA) i PBS. Fremstille permeabiliseringen oppløsning inneholdende 0,5% Triton-X-100 i PBS supplert med 2 mM VRC. Tilberede vaskebuffer ved blanding av 50% formamid (FA) og 2 x SSC og justere pH til 7,2-7,4.
- Fremstille DNA kontrafarging oppløsning bestående av 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid) i 2x SSC.
- Fiksering og Permeabilization i forberedelse til FISH
- For celler på dekkglass, vaske cellene i 1x PBS i 5 mi. Fix celler på dekkglass, eller embryonale seksjoner på lysbilder, i 10 minutter i fiksativ (3% PFA) løsning ved romtemperatur.
- Skyll-celler tre ganger med 1 x PBS. Permeabilisere cellene i 5 min i iskald permeabiliseringen løsning på is. Vask cellene tre ganger med 70% etanol. Oppbevar Dekk i 4-brønners plater og lysbilder i fire-lysbilde transportkassen i 70% etanol ved -20 ° C.
MERK: Dekk og lysbilder kan lagres i flere måneder ved -20 ° C. Plater og bokser som inneholder dem må forsegles med parafilm for å unngå etanol fordampning.
- DNA Probe Merking
- Merk DNA-prober ved nick oversettelse hjelp fluorescerende nukleotider. Følg produsentens anvisninger (se tabell 1) 8.
- For en 50 pl reaksjonsblandingen, tilsett 1-2 mikrogram av plasmid, bakterielle kunstige kromosomer (BAC) eller flere forskyvning forsterkning (MDA) (for DNA forsterkning, se 3.4.4) DNA til 17,5 mL vann, 2,5 mL 0,2 mMSR, SG, Cy5-dUTP, 10 mL 10 mM hver dNTP mix (dGTP, dATP, dCTP), 5 mL 10 mM dTTP, 5 pl 10x nick oversettelse buffer og 8 pl nick oversettelse enzym.
- Inkuber i 16 timer ved 15 ° C i mørket. Inaktivere reaksjonen ved frysing ved -20 ° C. Lagre prober for måneder ved -20 ° C.
- MDA
MERK: For BAC DNA, mengden av DNA oppnådd etter klassisk forberedelse er lav, derfor kan man bruke et trinn av DNA forsterkning før merking ved hjelp av MDA. Bruk en kommersielt sett, og følg produsentens anvisninger (se tabell 1). - Bland 0,5 mL BAC DNA med 9,5 mL prøve buffer. Varm 3 min ved 95 ° C. Umiddelbart slukke på is; la på is 10 min. Forbered reaksjon buffer / enzymblanding: (9,5 mL + 0,5 mL enzym mix) og holde på is.
- Bland 10 mL DNA mix + 10 mL reaksjon buffer / enzymblanding. Inkuber ved 30 ° C i minst 20 timer. Inaktivere enzymet ved oppvarming prøven 10 min ved 65 & #176, C. Cool prøven til 4 ° C før lagring ved -20 ° C.
- Sjekk MDA av fordøyelsen. Tilsett 1 mL MDA, 2 ul 10x buffer, 2 mL Hind III og 15 mL H 2 O. Inkuber ved 37 ° C over natten. Kjør sakte på en 0,8-1% agarosegel for å bekrefte nøyaktig DNA forsterkning. Klare DNA-fragmenter med høy molekylvekt må overholdes på gelen.
- probe Forberedelse
- Bruk 0,1 eller 1 mikrogram sonde per dekkglass eller lysbilde.
MERK: Legg 2-5 mikrogram av Cot-1 DNA hvis det blir nødvendig konkurranse for eksempel de fleste sonder som de kan inneholde gjentatte sekvenser som ellers kryss hybridiserer og øke bakgrunn.- For nedbør, tilsett 5 mikrogram laks sperm DNA, 1/10 volum 3 M natriumacetat pH 5,2 og 3 volumer etanol. Sentrifugering ved 16 000 xg og 4 ° C i 25 min. Vask pellets med 70% etanol og spinne ned igjen i 5 min.
- Tørr pellet i 2 min i en konsentrator / speed vac. Resuspender i 100% skjemaamid i halvparten av volumet som kreves for hybridisering (f.eks 2,5 mL for dekkglass eller 7 ul i embryonale seksjoner på lysbilde). Plasser 30 minutter ved 37 ° C med risting i et termomikser. Denatureres i 7 minutter ved 75 ° C.
- Slukke på is, eller hvis konkurranse ønskes satt direkte på 37 ° C i 30-60 min. Bland sonden løsningen med et like stort volum av 2 x hybridiseringsoppløsning.
- Bruk 0,1 eller 1 mikrogram sonde per dekkglass eller lysbilde.
- Hybridisering og Vasker
- dehydrere; Dekk i brønner og lysbilder i en Coplin krukke, ved sekvensiell vasking i 1x 80%, 1x 95% og 2 x 100% etanol for 5 min hver. Tørre Dekk og lysbilder helt.
- For hybridisering, bruke 5 ul probe hybridisering blanding (se 3.5) på et lysbilde og senke dekkglass, med celler som vender inn hybridisering mix. For seksjoner på lysbilde, gjelder 14 mL probe hybridisering blanding (se 3.5) og dekk med en 18 x 18 mm 2 dekkglass.
- Plasser lysbilder i en fuktig kammer (silkepapir dynket i50% FA / 2x SSC) og inkuberes ved 37 ° C over natten i mørke.
- Post-hybridisering Vasker:
- Tilsett 1 ml 50% FA / 2x SSC på dekkglass på lysbildet for å løsne den, fjerne dekkglass forsiktig fra raset (tar seg ikke å skrape cellene) og plassere den celle-siden opp i en 4-brønn plate inneholder 50% FA / 2x SSC. For seksjoner på lysbilde, fjerne dekkglass på en lignende måte, og plasser raset i en Coplin krukke inneholder 50% FA / 2x SSC.
- Utføre 3 vaskinger, hver på 7 min med forvarmet 50% FA / 2 x SSC ved 42 ° C eller 44 ° C for dekkglass eller slide, respektivt.
- Utføre 3 vaskinger med forvarmet 2x SSC i 5 minutter hver ved 42 ° C eller 44 ° C for dekkglass eller slide, respektivt.
- Counterstain kjerner etter vask i 2 x SSC med 1 ug / ml DAPI i 3 minutter ved RT. Skyll to ganger med 2x SSC.
- Montering av Dekk og lysbilder
- For lite dekkglass fra dyrket grønne sertifikater, gjelder 5 & #181; l montering medium på et lysbilde. Plasser dekkcellesiden ned på toppen av fallet.
- For lysbilde med seksjoner, bruke 15 ul montering medium på lysbildet. Plasser en 22 x 22 mm 2 dekkglass på toppen av fallet.
- Unngå bobler. Tørk av overflødig montering løsning. Tett dekkglass med en liten mengde av neglelakk. Hvis det er mulig, glir bilde umiddelbart eller butikken for opptil flere måneder ved -20 ° C.
4. mikroskopi og analyse
- Anskaffe 3D sekvensielle z aksen bilder i 0,3 mikrometer ved hjelp av en fluorescens mikroskop (63X objektiv) og utføre analysen av 3D bildestakker bruker ImageJ programvare 14.
Representative Results
Grønne sertifikater kan identifiseres på E7 seksjoner ved DAPI flekker på grunn av sin lokalisering i abort og sin store størrelse. Dette er illustrert i figur 1A på en langsgående seksjon. RNA FISH ble utført på slike embryonale seksjoner for å studere X-kromosom inaktivering i denne ekstra-embryonale avstamning.
Flere sider eller dekk kan behandles samtidig. Ved å bruke ulike fargestoffer å merke RNA av forskjellige gener, kan man oppdage ulike primær transkripsjoner i samme kjernen. Minst 2 prober kan bli blandet sammen, for eksempel Xist koplet til SG (grønt signal) og Atrx koplet til SR (rødt signal). Et eksempel på en kvinnelig TGC er vist i Figur 1B hvor 2 andre cellelinjer er representert, embryoet passende (E) og visceral endoderm (VE). En TGC kjerne er vist med Xist RNA dekker X kromOsome som er inaktivert (Xi), mens den andre X-kromosomet som er aktiv (Xa) viser noen peikt. X-bundet gen Atrx primære transkripsjoner er uttrykt fra den aktive X-kromosom (ikke dekorert av Xist) i flere eksemplarer på grunn endoreplication. Dette illustrerer monoallelic uttrykk f.eks inaktivering av Atrx på ett X-kromosom.
Siden grønne sertifikater er heterogene i størrelse som illustrert i figur 2B, er det bare de største som er registrert. Tre prober kan også anvendes som illustrert i figur 2C for sekundær grønne sertifikater. I dette tilfelle Xist -SG (grønn), to X-bundne gener: G6PD -SR (rød) og Huwe1 -C ^ (magenta) ble analysert på samme tid på den samme kjernen. Mens G6PD er monoallelically uttrykkes som vist her (og tidligere vist i videregående grønne sertifikater 3) Huwe1 er biallelically uttrykt demonstrere sin property å unnslippe XCI. Endoreplication, med flere peikt dvs. begynnende transkripsjoner kopier, er også tydelig.
Figur 1. Primær transkripsjon uttrykk i grønne sertifikater fra E7 kvinnelige embryonale delen. (A) Lengdesnitt av E7 abort farget med DAPI. Embryoet og ekstra-embryonale vev er omgitt av moren vev, decidua. Lokaliseringen av de ulike linjene er gjort ved DAPI farging med 5X objektiv. Grønne sertifikater er identifisert på grunn av sin store størrelse. Ch, chorion, E, embryo, EPC, ectoplacental kjegle, VE, visceral endoderm, TGC, trophoblast kjempeceller. Scale bar = 100 mikrometer. (B) Høyere forstørrelse av eske-in område A (63X objektiv) RNA FISH. Atrx primære avskrift i rødt og Xist RNA i grønt er visualisert på 3 slektsnavn = E, VE, TGC. Scale bar = 10 mikrometer. Eksempel på en in vivo TGC hvor Atrx er monoallelically uttrykt (Xa, pilspiss) og stille på Xist belagte X-kromosomet (Xi); flere Atrx signaler sett på Xa skyldes endoreplication. Atrx = BAC klone RP23-260I15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Primær transkripsjon uttrykk i videregående grønne sertifikater avledet fra EPC. (A) General view of økende sekundær grønne sertifikater (x5 objektiv). Scale bar = 100 mikrometer. (B) Asterisk viser eksempel på grønne sertifikater i henhold til deres størrelse (10X objektiv). Scale bar = 60 mikrometer. (C) Eksempel på en sekundær hunn TGC RNA FISH med bruk av 3 prober (Xist domai grønt, som dekker inaktivert X-kromosomet: Xi) viser endoreplication av G6PD og Huwe1 primære transkripsjoner (flere peikt, i rød og magenta). Mens G6PD er uttrykt monoallelically, er Huwe1 uttrykk biallelic i denne kjernen Huwe1 = BAC klone RP24-157H12;. G6PD = BAC klone RP23-13D21. Xi = pil; Xa = pilspiss (63X objektiv). Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Begynnende RNA fisk representerer en lett og følsom metode for enkelt celle analyse av transkripsjonen aktivitet i embryoniske vev på forskjellige utviklingsstadier. Kraften av denne fremgangsmåten er evnen til å identifisere forskjellige embryoniske slektsnavn på et bestemt stadium i henhold til morfologiske kriterier. Men dette krever også at minimalt bakgrunnsfluorescens er til stede. Enhver slik bakgrunn gjør identifisering av ulike embryonale regioner og celletyper utfordrende. For å sikre minimal bakgrunn, er det to viktige trinn i denne protokollen. Den første er kvaliteten på cryosection og den andre er den effektivitet (signal til støyforhold) av RNA fisk, som avhenger av nivået av genekspresjon og kvaliteten av sonden. For sistnevnte er prober derfor alltid testet på dyrkede celler på dekkglass (embryonale stamceller eller somatiske celler) før bruk på deler.
I denne protokollen, gir vi the teknikker som kreves for å utføre RNA FISH analyse på grønne sertifikater fra to forskjellige typer prøveopparbeidelse (kryostatsnitt og primærkulturer av embryonale explants). Slike enkelt celle analyse gir rom for dynamiske endringer i genuttrykk på ulike etter implantasjon etapper for å bli vurdert.
Metodene vi beskriver å generere sekundær grønne sertifikater (på E7-7.5 etter implantasjon etapper) ble brukt i vårt laboratorium for å studere X-kromosom inaktive mønstre av en ekstra-embryonale avstamning som utgjøres av grønne sertifikater på etter implantasjon etapper. Extra-embryoutvikling hos gnagere avhenger av differensiering av grønne sertifikater. Faktisk, grønne sertifikater er avgjørende for placenta og dermed embryoutvikling. Defekter i TGC differensiering forårsake embryonale dødelighet (for gjennomgang se referanse 15). Transkripsjonen aktivitet av grønne sertifikater ved hjelp av RNA FISH tillatt oss å demonstrere en uvanlig X-kromosom inaktive status av en slik celletype under musen utvikling 3.
in vivo grønne sertifikater og i in vitro-grønne sertifikater som stammer fra EPC eksplantering. Denne metoden kan utvides til analyse av transgene mus og / eller ved tilsetning av inhibitor molekyler i kulturmediet. Vi har med hell brukt denne metoden for RNA FISH på en annen type grønne sertifikater, slik som primære grønne sertifikater som vises på et tidligere stadium av mus utvikling, E3.0 blastocyts, som kan være individuelt dyrket i 4-5 dager som utviklet utvekst, de ICM å være omgitt av store primær grønne sertifikater 16,17. Begynnende transkripsjoner for forskjelliggener samt Xist kan bli visualisert og kvantifisert ved hjelp av samme RNA FISH tilnærming tre.
Kombinert immunfluorescens og RNA FISH kan også utføres på kryostatsnitt samt in vitro dyrkede grønne sertifikater 3. Dette viser at fremgangsmåten er ganske robust, som primære transkripsjoner er svært utsatt for degradering, og det er et absolutt krav for RNase fri forbindelser. IF / RNA FISH gir ytterligere informasjon om transkripsjonsnivåer, cellulær lokalisering og protein uttrykk, samtidig i en gitt celle. Selv om deler av parafin-embedded tissue har tidligere blitt brukt til å oppdage begynnende RNA i humane svulster og samtidig opprettholde vev morfologi 18, i våre hender, kryostatsnitt er mer hensiktsmessig for å bevare både begynnende RNA og epitoper som kreves for påvisning av antistoffer i løpet av immunfluorescens .
I tillegg til RNA FISH, etter imimmunofluorescens-, kan kromosomalt DNA FISH også utføres på videregående grønne sertifikater ved hjelp av prober merket med fluorokromer, lik de som brukes for RNA FISH tre. Fluorescerende prober kan enten være plasmider / fosmids eller BACS, merket med fluorescerende dUTPs som anvendt her, og som er beskrevet i Chaumeil et al., 8. Alternativt kan fluorescerende merkede oligonukleotider benyttes 19. Siden DNA FISH ikke krever tråd-spesifisitet, kan oligonukleotidprober være utformet for å målrette en av de to komplementære tråder i målområdet. Forgrenede DNA-prober, hvor signalforsterkning oppnås ved to påfølgende runder av spesifikke og forsterker sonder kan også brukes til å forbedre signal-til-støy-forholdet for FISH-signaler 20. Alternativt kan RNA-prober som riboprober anvendes selv om det i våre DNA-baserte prober garantere en bedre kompromiss mellom signalkvalitet, spesifisitet og brukervennlighet.
Til slutt, 3D-bilde acquisitipå er avgjørende for å oppnå den nødvendige romlige informasjonen i disse store celler, og kan utføres ved hjelp av en rekke fluorescensmikroskoper, slik som Apotome mikroskop, eller epifluorescens mikroskop med dekonvolvering som Deltavision (GEH), eller andre mikroskoper passende for bildebehandling vevssnitt, og store (> 20 mikrometer) grønne sertifikater. Det skal bemerkes at for enkeltkopi-DNA loci, den punktformet signal som detekteres av begynnende RNA eller DNA FISH FISH kan ikke lett oppdages ved konfokal mikroskopi.
Som konklusjon bør metodene vi beskriver her være nyttig både for detaljert analyse av TGS i en utviklingsmessig sammenheng, men også i andre sykdomssituasjoner. Mange gener som er involvert i TGC utvikling og funksjon hos gnagere er konservert mellom gnagere og mennesker, slik som transkripsjonsfaktorer, proteaser og celleadhesjonsmolekyler 21. Mus grønne sertifikater er en celle modell for å studere gener som regulerer morkake utvikling end gi derfor innsikt i menneskelige placenta sykdommer. Videre, på grunn av det faktum at disse cellene er endoreplicating og siden noen kreftceller engasjere endocycle programmer, i tillegg til genet forsterkningsprosesser, metodene vi beskriver bør også være nyttig i én celle undersøkelser som kreves for å utforske mekanismene som fører til genom ustabilitet i kreftcellene .
Acknowledgments
Vi takker Sophie Gournet for hjelp med illustrasjoner, Julie Chaumeil for å lese manuskriptet, dyrehuset anlegget og bildebehandling plattform av enheten. Dette arbeidet har fått støtte under programmet «Investissements d'Avenir» lansert av den franske regjeringen og implementert av ANR med referanser ANR-10-LabX-0044 og ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, den EpiGeneSys FP7 no. 257082 Network of Excellence til EH, en ERC Advanced Investigator tildele nei. 250367 og EU FP7 SYBOSS gi no. 242 129 til EH Forfatterne ønsker å erkjenne Cell og Tissue Imaging Platform av genetikk og utviklingsbiologi Institutt (UMR3215 / U934) av Institut Curie, medlem av Frankrike-Bioimaging (ANR-10-InSb-04), for å få hjelp med lys mikroskopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, Suppl A. 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
