Abstract
Moderkakan kommer från en extra embryonal härstamning, trophectoderm. I peri-implantation mus blastocyst, väggmålning trophectoderm celler differentierar till primär trofoblasten jätteceller (TGCs) medan den polära trophectoderm liggande inre cellmassan fortsätter att föröka sig senare differentiera till sekundära TGCs. TGCs spelar en viktig roll i utvecklingen av moderkakan och är avgörande för en lyckad graviditet. Undersökning av transkriptionell reglering av specifika gener under efter implantationen utveckling kan ge insikter TGCs utveckling. Celler av den ectoplacental konen (EPC) från embryon vid 7-7,5 dagars dräktighet (E7-7.5), som härrör från den polära trophectoderm, differentierar till sekundära TGCs 1. TGCs kan studeras in situ på kryostatsnitt av embryon vid E7 även om antalet TGCs är mycket låg i detta skede. Ett alternativt sätt att analysera sekundär TGCs är att använda kortsiktiga kulturer av enskilda EPC från E7 embryos. Vi föreslår en teknik för att undersöka den transkriptionella statusen av gener av intresse både in vivo och in vitro vid encelliga nivå med hjälp av fluorescerande in situ-hybridisering (RNA FISH) för att visualisera begynnande transkript. Denna teknik ger en direkt avläsning av genuttryck och möjliggör bedömning av den kromosomala status TGCs, som är stora endoreplicating celler. I själva verket är en viktig del av terminal differentiering av TGCs att de lämnar cellcykeln och genomgå flera omgångar av endoreplication.This tillvägagångssätt kan tillämpas för att detektera uttryck av varje gen uttrycks från autosomer och / eller könskromosomer och kan ge viktig information i utvecklings mekanismer samt moderkakan sjukdomar.
Introduction
Däggdjurs trofoblasten jätteceller (TGCs) bildar en barriär mellan moderns och embryonala vävnader. De medierar implantation och invasion av conceptus i livmodern och spela kritiska roller i utveckling för bildande av moderkakan. De producerar flera tillväxtfaktorer (cytokiner) och hormoner i Prolaktin / placentalaktogen familj och steroider, som är nödvändiga för embryonal tillväxt och överlevnad. TGCs är stora, mononukleära och polyploida celler med en cellcykeln, endocycle, som består av omväxlande S- och G faser. Faktum TGCs är endoreplicating celler, som kan genomgå flera omgångar av DNA-syntes utan division 2. För att undersöka den transkriptionella statusen av gener in vivo, i TGCs jämfört med andra embryonala och extraembryonic celltyper, kan nascent RNA FISH utföras in vivo på kryostatsnitt 3 vid specifika efter implantation etapper. TGCs är lätt att känna igen på sektioner på grund av their stora och deras transkriptions genaktivitet kan spelas in men deras antal i början efter implantation stegen är låg. Bristen på TGCs på E7 embryonala sektioner, ledde oss att utföra kortsiktiga kulturer av embryonala trophectodermal vävnader för att erhålla differentierade TGCs för att studera regleringen av genuttryck under trophectoderm utveckling. Dessutom, för att stanna kvar som fysiologisk som möjligt, etablerade cellinjer dvs trophectoderm stamceller (TS) är inte alltid lämpligt att undersöka utvecklingsmekanismer Generation av sekundära TGCs ett värdefullt verktyg för att studera patologiska graviditeter förknippade med defekter i TGCs på grund av onormala genen reglering i möss.
Trofoblastceller av ectoplacental könen (EPC) är prekursorer av sekundära TGCs 4. Spontan differentiering av odlade EPC till sekundär TGCs har tidigare rapporterats 5. Men i motsats till primära TGCs, studier av sekundär TGC annofinfördelning på djupet och har förblivit begränsad, presumablydue svårigheterna att isolera EPC explantat fria från alla moderns eller embryonala vävnader. Vi anpassade dessa metoder, i syfte att utföra RNA FISH på sekundära TGCs härrör från individ embryo på E7, en utvecklings efter implantation stadium där TGCs är mycket få, men kan genereras från EPC prekursorer. RNA FISH att analysera kärnprimärtranskript har aldrig gjorts på samma nivå som den enda cellnivå på sekundära TGCs. Detta möjliggör en exakt analys av transkription och användes för att visa den epigenetiska instabilitet TGCs vid efter implantation stegen 3.
Ett klassiskt exempel på epigenetik hos däggdjur, är X-kromosominaktivering (XCI) studerade i Heard lab 6. I denna process ett av de 2 X-kromosomer i kvinnliga inaktiveras. Den icke-kodande Xist avskrift rockar X-kromosomen som det uttrycks i kvinnliga celler och utlöser tysta flesta gener. Användning av RNA FISH,begynnande transkript av X-kopplade gener kan undersökas liksom ackumuleringen av Xist RNA på den inaktiva X-kromosomen (Xi). Vi beskriver här ett förfarande för att utföra RNA fisk på sektioner av efter implantation embryon och på kortsiktiga kulturer av EPC. Detta protokoll är anpassad från dem som användes för att studera XCI i differentiering kvinnliga embryonala stamceller och preimplantatorisk embryon 7-11. Vi ger exempel på XCI hos kvinnliga embryon in vivo, liksom in vitro TGCs.
Protocol
Djurförsök genomfördes i enlighet med den godkända stadgade djurvård och använda Kommittén Institut Curie (CEEA-IC) protokoll (C 75-05-18). Arbetet har också bedrivits inom ramen för godkännande från det franska ministeriet för högre utbildning och forskning för användningen av genetiskt modifierade organismer (avtalsnummer 5549CA-I).
1. Framställning av Kryostatsnitt
- Samla in embryon från naturligt ägglossning F1 C57BL / 6 x DBA / 2J-möss såsom beskrivits i Shea et al., 12. På dag 7 av dräktigheten (E7), offra 8-12 veckor gamla musen genom halsdislokation. Samla hela conceptus dvs decidua 12.
- Isolera E7 conceptuses, såsom beskrivs i Shea et al., 12. Placera dem i en 60 mm petriskål med PBS.
- Frysa E7 mus Conceptus för kryostatsnitt.
- Förbered anpassade aluminiumfolie brunnar 1cm i höjd ( "hemgjorda" med ett glas Pasteur pipet). Deponera en droppe av vävnadsfrysmedium på bottnen av denna lilla containern. Deponera Conceptus i rätt riktning (dvs för längdsnitt den befruktade bör bibehållas i dess horisontella orientering).
- Fyll brunnen innehåller Conceptus med vävnadsfrysmedium. Upphäva det med pincett i ånga ovanför vätske N 2 för att göra det möjligt att frysa långsamt - sedan doppa blocket i flytande N2 för några sekunder tills den blir vit. Därefter överför blocket i en frysflaska och förvara vid -80 ° C (kan lagra i flera månader).
- Innan Cryo-sektionering, placera frysta blocket innehåller Conceptus vid -20 ° C i kryostaten under 30 minuter. Utför kryosnitt av 8 um tjocklek. Insättning 4 sektioner på en bild för att möjliggöra effektiv fastsättning. Placera sektioner nära nog att passa under en 18 x 18 mm 2 täckglas.
- Kontrollera kvaliteten på densektioner (intakta och utan repor) och orienteringen av embryot (längsgående sektioner) med ett stereomikroskop och välja de avsnitt som är lämpliga för vidare analys. Så snabbt som möjligt sätta in dem i en coplinkärlet och utföra RNA FISK (se 3.3.2).
2. Beredning av sekundär TGCs
- Isolera Conceptus (se 1.1 och 1.2).
- Dissekera E7 Ectoplacental Cone (EPC)
- Använd en stereo och petriskålar innehållande steril PBS. Dissekera decidua med pincett. Pierce provet och öppna pincett för att riva de två sidorna av decidua isär.
- Punga ut embryot. Använd tips av slutna fin pincett (Dumont # 5) i en saxliknande åtgärder för att separera EPC från embryot korrekt. Var särskilt noga med att få en helt ren prov, skild från moderns vävnad samt från chorion och gulesäcken. Skölj EPC explants i PBS.
- Med en liten sked, överför individuell dissekerade EPC till en 4-well platta innehållande ett sterilt täckglas i medium.
- Härled TGCs från EPC Kortfristiga kulturer.
- Förbered fyra brunnar som innehåller täck. Sterilisera 12 mm diameter runda täckglas genom nedsänkning i etanol, följt av flam-torkning.
- Tillsätt 0,5 ml EPC medium till varje brunn (EPC medium: RPMI 1640 supplementerat med 15% FCS, 0,1 mM 2-merkaptoetanol och antibiotika).
- Insättning enda dissekeras-EPC i mitten av täckglaset i brunnen tillsammans med odlingsmedium. Använd fin pincett för att tillämpa EPC på glaset täckglas. Culturefor 3-5 dagar vid 37 ° C, 5% CO2. Individuella explantat bildar en utväxt som sprider sig som ett monoskikt av tillplattad TGCs (Figur 2A).
3. RNA FISH
OBS: De protokoll är baserade på de som beskrivits för embryonala stamceller (ESC) i Chaumeil et al, 8 och Pollex och Heard 13..
- advanced Preparanson av stamlösningar
- Förbereda en 3 M natriumacetatbuffert, pH 5,2.
- Förbereda 2x hybridiseringsbuffert innehållande 40% (vikt / volym) natrium-dextransulfat, 20x BSA, 400 mM Vanadyl ribonukleosid Complex (VRC) i 4x Saline Natriumcitrat (SSC).
- Förbereda monteringsmedium innehållande 90% (volym / volym) glycerol, 0,1% (vikt / volym) p-fenylendiamin, pH 9 i PBS.
- Nyberedda lösningar
- Förbereda fixativ lösning bestående av 3% nyberedd paraformaldehyd (PFA) i PBS. Förbereda permeabilization lösning innehållande 0,5% Triton-X-100 i PBS kompletterat med 2 mM VRC. Förbered tvättbuffert genom att blanda 50% formamid (FA) och 2 x SSC och justera pH till 7,2-7,4.
- Framställa DNA counter-färgningslösning bestående av 1 | ig / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid) i 2x SSC.
- Fixering och Permeabilization i Förberedelse för FISH
- För celler på täckglas, tvätta cellerna i 1x PBS i 5 mi. Fix celler på täckglas, eller embryonala sektioner på objektglas, i 10 min i fixativ (3% PFA) -lösning vid RT.
- Skölj cellerna tre gånger med 1 x PBS. Permeabilize celler för 5 min i iskall permeabilization lösningen på is. Tvätta cellerna tre gånger med 70% etanol. Förvara täck i 4-brunnsplattor och glider i fyra-slide transportlåda i 70% etanol vid -20 ° C.
OBS: Täck och diabilder kan lagras under flera månader vid -20 ° C. Plattor och lådor som innehåller dem måste tätas med parafilm för att undvika etanol avdunstning.
- DNA Probe Märkning
- Märka DNA-prober genom nick-translation med hjälp av fluorescerande nukleotider. Följ tillverkarens instruktioner (se tabell 1) 8.
- För en 50 pl reaktionsblandning, tillsätt 1-2 pg av plasmid, bakteriella artificiella kromosomer (BAC) eller flera förskjutningsförstärkning (MDA) (för DNA-förstärkning, se 3.4.4) DNA till 17,5 l vatten, 2,5 pl 0,2 mMSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 pl 10 mM vardera dNTP-blandning (dGTP, dATP, dCTP), 5 pl 10 mM dTTP, 5 pl 10x nick translationsbuffert och 8 pl nick translation enzym.
- Inkubera i 16 h vid 15 ° C i mörker. Inaktivera reaktionen genom frysning vid -20 ° C. Förvara prober för månader vid -20 ° C.
- MDA
OBS: För BAC-DNA, är låg kvantitet av DNA som erhållits efter klassisk beredning, därför kan man använda ett steg med DNA-amplifiering före märkning genom att använda MDA. Använd ett kommersiellt kit och följ tillverkarens instruktioner (se tabell 1). - Blanda 0,5 | j, l BAC-DNA med 9,5 ^ il provbuffert. Värm 3 min vid 95 ° C. Omedelbart släcka på is; lämna på is 10 min. Bered reaktionsbuffert / enzymblandning (9,5 l + 0,5 l enzymblandning) och hålla på is.
- Blanda 10 pl DNA-mix + 10 pl reaktionsbuffert / enzymblandning. Inkubera vid 30 ° C i minst 20 timmar. Inaktivera enzymet genom upphettning prov 10 minuter vid 65 & #176; C. Cool prov till 4 ° C före lagring vid -20 ° C.
- Ta MDA genom digerering. Lägg ett pl MDA, 2 | il 10 x buffert, 2 pl Hindlll och 15 | il H2O Inkubera vid 37 ° C över natten. Kör långsamt på en 0,8-1% agarosgel för att bekräfta exakt DNA-förstärkning. Tydliga DNA-fragment med hög molekylvikt bör observeras på gelén.
- sond Framställning
- Använd 0,1 eller 1 pg prob per täck eller bild.
OBS: Lägg 2-5 pg av Cot-1-DNA om konkurrensen krävs t.ex. flesta sonder eftersom de kan innehålla upprepade sekvenser som annars tvär hybridisera och öka bakgrunden.- För utfällning, tillsätt 5 ^ g DNA från laxsperma, 1/10 volym 3 M natriumacetat pH 5,2 och 3 volymer etanol. Centrifugering vid 16000 x g och 4 ° C under 25 min. Tvätta pellets med 70% etanol och snurra ner igen i 5 min.
- Torr pellet under 2 min i en koncentrator / speed vac. Återsuspendera i 100% formenamid i halva volymen som krävs för hybridisering (t.ex. 2,5 l för täck eller 7 l för embryonala sektioner på bild). Placera 30 min vid 37 ° C med skakning i en Thermomixer. Denaturera för 7 min vid 75 ° C.
- Släck på is, eller om konkurrensen krävs sätta direkt vid 37 ° C under 30-60 min. Blanda sondlösningen med en lika stor volym av 2x hybridiseringslösning.
- Använd 0,1 eller 1 pg prob per täck eller bild.
- Hybridisering och Tvättar
- Torka; täckglas i brunnar, och objektglasen i ett Coplin-kärl, genom sekventiell tvättning i 1x 80%, 1 x 95% och 2x 100% etanol för 5 min vardera. Torra täck och glider helt.
- För hybridisering tillämpa 5 il sond hybridiseringsblandning (se 3.5) på en bild och sänka täck, med celler som vetter in i hybridiseringsblandning. För avsnitten om bild, gäller 14 l sond hybridiseringsblandning (se 3.5) och täck med en 18 x 18 mm 2 täckglas.
- Placera objektglasen i en fuktkammare (mjukpapper indränkt i50% FA / 2x SSC) och inkubera vid 37 ° C över natten, i mörker.
- Post-hybridiserings-tvättar:
- Tillsätt 1 ml 50% FA / 2x SSC på täck på bilden för att lossa det; ta bort täck försiktigt från bilden (se till att inte skrapa cellerna) och placera den cellsidan uppåt i en 4-brunnar innehåller 50% FA / 2x SSC. För avsnitten på objektglaset, ta bort täckglas på ett liknande sätt och placera objektglaset i ett Coplin-kärl innehållande 50% FA / 2x SSC.
- Utför 3 tvättar, var och en för 7 minuter med förvärmda 50% FA / 2x SSC vid 42 ° C eller 44 ° C för täck eller glida, respektive.
- Utföra 3 tvättar med förvärmd 2 x SSC under 5 min vardera vid 42 ° C eller 44 ° C under täckglas eller glida, respektive.
- Motfärga kärnor genom tvättning i 2 x SSC med 1 | ig / ml DAPI i 3 min vid RT. Skölj två gånger med 2 x SSC.
- Montering av Täck och Slides
- För små täck från odlade TGCs tillämpa 5 & #181; l monteringsmedium på en bild. Placera täckcell nedåt på toppen av droppen.
- För bild med sektioner, applicera 15 ul monteringsmedium på bilden. Placera en 22 x 22 mm 2 täck ovanpå droppen.
- Undvika bubblor. Torka bort överflödigt monteringslösning. Täta täck med en liten mängd av nagellack. Om möjligt, glider bilden omedelbart eller lagra upp till flera månader vid -20 ° C.
4. mikroskopi och analys
- Förvärva 3D sekventiella z axel bilder i 0,3 pm med användning av ett fluorescensmikroskop (63x mål) och utföra analysen av 3D bildstaplar med hjälp av ImageJ programvara 14.
Representative Results
TGCs kan identifieras på E7 sektioner vid DAPI färgning på grund av sin lokalisering i Conceptus och deras storlek. Detta illustreras i Figur 1A på en längsgående sektion. RNA FISH utfördes på sådana embryonala sektioner för att studera X-kromosom inaktivering i detta extra embryonala härstamning.
Flera diabilder eller täck kan behandlas samtidigt. Genom att använda olika färgämnen för att märka RNA av olika gener, kan man detektera olika primära transkript i samma kärna. Minst 2 prober kan blandas ihop, exempelvis Xist kopplad till SG (grön signal) och Atrx kopplad till SR (röd signal). Ett exempel på en kvinnlig TGC visas i figur 1B, där 2 andra härstamningar är representerade, embryot korrekt (E) och den viscerala endoderm (VE). En TGC kärna visas med Xist RNA täcker X kromosome som inaktiveras (Xi) medan den andra X-kromosomen som är aktiv (Xa) visar några prickar. X-kopplad gen Atrx primära transkript uttrycks från den aktiva X-kromosomen (inte dekorerad med Xist) i flera exemplar på grund av endoreplication. Detta illustrerar monoallel uttryck t.ex. inaktivering av Atrx på en X-kromosom.
Eftersom TGCs är heterogena i storlek som visas i figur 2B, är bara de största registreras. Tre prober kan också användas såsom visas i fig 2C för sekundära TGCs. I det här fallet, Xist -SG (grön), två X-kopplade gener: G6PD -SR (röd) och Huwe1 -CY (magenta) analyserades samtidigt i samma kärna. Medan G6PD är monoallelically uttryckt som visas här (och tidigare visats i sekundära TGC enheterna 3) Huwe1 är biallelically uttrycks visar dess property fly XCI. Endoreplication, med flera prickar dvs begynnande avskrifter kopior, är också uppenbar.
Figur 1. Primär transkriptet expression i TGCs från E7 kvinnliga embryonal sektion. (A) Längdsnitt av E7 conceptus färgas med DAPI. Embryot och extra embryonala vävnader är omgivna av modern vävnad, decidua. Lokaliseringen av de olika härstamningarna görs vid DAPI-färgning med 5X objektiv. TGCs identifieras på grund av sin storlek. Ch, chorion, E, embryo, EPC, ectoplacental kon, VE, visceral endoderm, TGC, trofoblasten jätteceller. Skalstreck = 100 | j, m. (B) Högre förstoring av boxed-in-området i A (63x mål) RNA FISH. Atrx primärt transkript i rött och Xist RNA i grönt visualiseras på 3 linjer = E, VE, TGC. scale bar = 10 | im. Exempel på en in vivo TGC där Atrx är monoallelically uttrycks (Xa, pilspets) och tyst på Xist -belagda X-kromosomen (Xi); flera Atrx signaler sett på Xa beror på endoreplication. Atrx = BAC-klon RP23-260I15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. primärt transkript uttryck i sekundär TGCs härrör från EPC. (A) Översikt av växande sekundär TGCs (x5 mål). Skalstreck = 100 | j, m. (B) Asterisk anger exempel på TGCs enligt deras storlek (10X objektiv). Skalstreck = 60 | im. (C) Exempel på en sekundär kvinnlig TGC RNA FISH med användning av 3 prober (Xist domai grönt, som omfattar det inaktiverade X-kromosomen: Xi) visar endoreplication av G6PD och Huwe1 primära transkript (flera prickar, i rött och magenta). Medan G6PD uttrycks monoallelically är Huwe1 uttryck bialleliska i denna kärna Huwe1 = BAC-klon RP24-157H12;. G6PD = BAC-klon RP23-13D21. Xi = pil; Xa = pilspets (63x mål). Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Nascent RNA FISH representerar en enkel och känslig metod för enskild cell analys av transkriptionsaktivitet i embryonala vävnader vid olika utvecklingsstadier. Kraften i denna strategi är förmågan att identifiera olika embryonala linjer vid en viss skede enligt morfologiska kriterier. Men detta kräver också att minimal bakgrundsfluorescens är närvarande. Varje sådan bakgrund gör identifiering av olika embryonala regioner och celltyper utmanande. För att säkerställa minimal bakgrund, det finns två viktiga steg i detta protokoll. Den första är kvaliteten på den kryosektion och den andra är effektiviteten (signal-brusförhållandet) av RNA-FISH, som beror på nivån av genuttryck och kvaliteten på sonden. I det senare fallet är sonder därför alltid testat på odlade celler på täck (embryonala stamceller eller somatiska celler) före användning på sektioner.
I detta protokoll, vi ge the tekniker som krävs för att utföra RNA FISH analys TGCs från två olika typer av provberedning (kryostatsnitt och primära kulturer av embryonala explants). Sådan enda cell analys gör det möjligt dynamiska förändringar i genexpression vid olika efter implantation etapper som skall bedömas.
De metoder vi beskriver att generera sekundär TGCs (vid E7-7.5 efter implantation steg) användes i vårt labb för att studera X-kromosominaktivemönster en extra embryonal härstamning som utgörs av TGCs vid efter implantation steg. Extra-embryonal utveckling hos gnagare beror på differentieringen av TGCs. I själva verket TGCs är viktiga för placenta och därmed embryots utveckling. Defekter i TGC differentiering orsakar embryonal dödlighet (för granskning se referens 15). Transkriptionsaktivitet av TGCs användning av RNA FISH tillät oss att visa en ovanlig X-kromosom inaktive status av sådan celltyp under mus utveckling 3.
in vivo TGCs och i in vitro TGCs härrör från EPC explantat. Denna metod skulle kunna utvidgas till analys av transgena möss och / eller genom tillsats av hämmarmolekyler i odlingsmediet. Vi har framgångsrikt använt denna metod för RNA FISH på en annan typ av TGCs, såsom primära TGCs som uppträder i ett tidigare skede av mus utveckling, E3.0 blastocyts, som kan vara individuellt odlades under 4-5 dagar under vilka utvecklade utväxt, de ICM är omgiven av stora primära TGCs 16,17. Begynnande transkript för olikagener samt som Xist kan visualiseras och kvantifieras med användning av samma RNA FISH strategi 3.
Kombinerat immunofluorescens och RNA FISH kan också utföras på kryostatsnitt samt in vitro odlade TGCs 3. Detta visar att metoden är ganska robust, som primära transkript är mycket mottagliga för nedbrytning och det finns ett absolut krav på RNas fria föreningar. IF / RNA FISH ger ytterligare information om transkriptionsnivåer, cellulär lokalisering och proteinuttryck, samtidigt i en given cell. Även delar av paraffin-inbäddad vävnad har tidigare använts för att detektera begynnande RNA i humana tumörer med bibehållen vävnadsmorfologin 18, i våra händer, kryostatsnitt är mer lämpade för att bevara både den begynnande RNA och epitoperna som krävs för detektering av antikroppar under immunofluorescens .
Förutom RNA-FISH, efter immunofluorescence kan kromosomalt DNA FISH också utföras på sekundära TGCs med användning av sönder märkta med fluorokromer, liknande dem som används för RNA-FISH 3. Fluorescerande prober kan vara antingen plasmider / fosmids eller BAC: ar, märkta med fluorescerande dUTPs såsom det används här, och som beskrivs i Chaumeil et al., 8. Alternativt kan fluorescensmärkta oligonukleotider användas 19. Eftersom DNA-FISH kräver inte strängspecificitet, kan oligonukleotidprober utformas för att rikta in endera av de två komplementära strängarna i målregionen. Grenade DNA-sonder, där signalförstärkning uppnås genom två sekventiella rundor av specifika och amplifierarsökfragment kan också användas för att förbättra förhållandet signal-brus av fisk signaler 20. Alternativt kan RNA-sonder såsom riboprober användas även i våra DNA-baserade prober garantera en bättre avvägning mellan signalkvalitet, specificitet och användarvänlighet.
Slutligen, 3D-bild acquisitipå är viktigt för att uppnå önskad geografisk information i dessa stora celler, och kan utföras med hjälp av olika fluorescensmikroskop, såsom Apotome mikroskop, eller epifluorescence mikroskop med avfaltning såsom Deltavision (GEH), eller andra mikroskop lämplig för avbildning vävnadssnitt, och stora (> 20 um) TGCs. Det bör noteras att för enkelkopie-DNA-loci, de punktat signalen som detekteras av nascent RNA FISH eller DNA FISH kan inte lätt detekteras genom konfokal mikroskopi.
Sammanfattningsvis bör de metoder vi beskriver här vara till nytta både för en detaljerad analys av TGS i en utvecklings sammanhang, men även i andra situationer sjukdoms. Många gener som är involverade i TGC utveckling och funktion hos gnagare är konserverade mellan gnagare och människa, såsom transkriptionsfaktorer, proteaser och celladhesionsmolekyler 21. Mus TGCs är en cellmodell för att studera gener som reglerar placental utveckling end ger därför insikter i mänsklig placenta sjukdomar. Vidare, beroende på det faktum att dessa celler är endoreplicating och eftersom vissa cancerceller i ingrepp endocycle program, förutom att genen amplifieringsförfaranden, de metoder vi beskriver bör också vara till hjälp för en enda cell undersökningar som behövs för att undersöka mekanismer som leder till genom instabilitet i cancerceller .
Acknowledgments
Vi tackar Sophie gournet för hjälp med illustrationer, Julie Chaumeil för att läsa manuskriptet, djurstallar anläggningen och avbildning plattform för enheten. Detta arbete har fått stöd inom ramen för programmet «Investissements d'Avenir» lanserades av den franska regeringen och genomförs av ANR med referenserna ANR-10-LABX-0044 och ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, den EpiGeneSys FP7 nr. 257082 Network of Excellence till EH, en ERC Advanced Investigator Award nr. 250.367 och EU FP7 SYBOSS bevilja någon. 242.129 till EH Författarna vill tacka för cell- och vävnads Imaging plattformen för Genetics och utvecklingsbiologi Institutionen (UMR3215 / U934) av Institut Curie, medlem av Frankrike-Bioimaging (ANR-10-InSb-04), för att få hjälp med ljus mikroskopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, Suppl A. 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
