Abstract
Placenta stammer fra en ekstra-embryonale afstamning, den trophectoderm. I peri-implantation murine blastocyst, vægmaleri trophectoderm celler differentierer til primær trofoblast kæmpeceller (TGCs), mens den polære trophectoderm overlejrer den indre cellemasse vokser på senere differentiere til sekundære TGCs. TGCs spiller en central rolle i udviklingen af placenta og er afgørende for en vellykket graviditet. Undersøgelse af transkriptionel regulering af specifikke gener under post-implantation udvikling kan give indsigt i TGCs udvikling. Celler af ectoplacental kegle (EPC) fra embryoner på 7-7,5 dage i drægtigheden (E7-7.5), der stammer fra den polære trophectoderm, differentiere i sekundære TGCs 1. TGCs kan studeres in situ, på kryostatsnit embryoner på E7 selv om antallet af TGCs er meget lav på dette stadium. En alternativ metode til at analysere sekundær TGCs er at bruge kortsigtede kulturer af individuelle EPC'er fra E7 embryos. Vi foreslår en teknik til at undersøge den transkriptionelle status af gener af interesse både in vivo og in vitro på enkeltcelle-niveau ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering (FISH RNA) at visualisere nascente transkripter. Denne teknik giver en direkte udlæsning af genekspression og muliggør vurdering af det kromosomale status TGCs, som er store endoreplicating celler. Faktisk et centralt element i terminal differentiering af TGCs er, at de forlader cellecyklussen og med talrige runder af endoreplication.This metode kan anvendes til at detektere ekspression af ethvert gen udtrykt fra autosomer og / eller kønskromosomer og kan give vigtig information i udviklingsmæssige mekanismer samt placenta sygdomme.
Introduction
Pattedyr trofoblast kæmpeceller (TGCs) danner en barriere mellem mødres og embryonale væv. De mægle implantation og invasion af fosteret i livmoderen og spille kritiske roller i udvikling for dannelsen af moderkagen. De producerer flere vækstfaktorer (cytokiner) og hormoner af prolactin / placentalactogen familie og steroider, der er nødvendige for embryonisk vækst og overlevelse. TGCs er store, mononukleære og polyploide celler med en celle cyklus, endocycle, der består af skiftende S og G faser. Faktisk TGCs er endoreplicating celler, i stand til at gennemgå flere runder af DNA-syntese uden division 2. For at undersøge den transkriptionelle status af gener in vivo, in TGCs sammenlignet med andre embryonale og extraembryonic celletyper, kan spirende RNA FISH udføres in vivo på frysemikrotomsnit 3 ved specifikke efter implantation faser. TGCs er let genkendelige på strækninger på grund af their stor størrelse og deres transkriptionel gen aktivitet kan registreres, men deres antal på tidlige post-implantation faser er lav. Mangel på TGCs på E7 embryonale sektioner, førte os til at udføre kortvarige kulturer af embryonale trophectodermal væv for at opnå differentierede TGCs for at studere reguleringen af genekspression under trophectoderm udvikling. Desuden for at forblive som fysiologiske som muligt, etablerede cellelinjer dvs. trophectoderm stamceller (TS) er ikke altid egnet til at undersøge udviklingsmæssige mekanismer Generation af sekundære TGCs giver et værdifuldt værktøj til at studere patologiske graviditeter forbundet med defekter i TGCs grundet unormal gen regulering i mus.
Trophoblastceller af ectoplacental kegle (EPC) er forstadier for sekundære TGCs 4. Spontan differentiering af dyrkede EPC'er til sekundær TGCs er tidligere blevet rapporteret 5. Men i modsætning til de primære TGCs, undersøgelser af sekundær TGC differentiation har fortsat begrænset, presumablydue til vanskelighederne ved at isolere EPC eksplantater fri for enhver maternelle eller embryonale væv. Vi tilpasset disse metoder, for at udføre RNA FISH på sekundære TGCs afledt af individuelle embryo på E7, en udviklingsmæssig post-implantation fase, hvor TGCs er meget få, men kunne genereres fra EPC forstadier. RNA FISH at analysere nukleare primære udskrifter er aldrig blevet gjort på niveauet for den enkelt celle niveau på sekundære TGCs. Dette giver mulighed for præcis analyse af transskription og blev brugt til at vise på post-implantation trin 3 den epigenetiske ustabilitet TGCs.
Et klassisk eksempel på epigenetik i pattedyr, er X-kromosomet inaktivering (XCI) undersøgte i Heard lab 6. I denne proces en af de 2 X-kromosomer hos kvinder inaktiveres. Den ikke-kodende Xist transcript frakker X-kromosomet, hvorfra det udtrykkes hos kvindelige celler og udløser dæmpning af de fleste gener. Anvendelse af RNA FISH,spirende transkripter af X-bundne gener kan undersøges som kan akkumuleringen af Xist RNA på det inaktive X-kromosom (Xi). Vi beskriver her en procedure til at udføre RNA FISH på sektioner af post-implantation embryoner og på kortsigtede kulturer af EPC. Denne protokol tilpasset fra dem, der blev anvendt til at undersøge XCI ved differentiering kvindelige embryonale stamceller og præimplantations embryoner 7-11. Vi giver eksempler på XCI i kvindelige fostre in vivo, såvel som in vitro TGCs.
Protocol
procedurer Animal blev udført i overensstemmelse med den godkendte institutionelle Dyrepleje og brug udvalg af de protokoller Institut Curie (CEEA-IC) (C 75-05-18). Arbejdet er også blevet gennemført under godkendelsen fra det franske ministerium for videregående uddannelse og forskning for brug af genetisk modificerede organismer (aftalenummer 5549CA-I).
1. Fremstilling af kryostatsnit
- Saml embryoner fra naturligt ægløsning F1 C57BL / 6 x DBA / 2J-mus som beskrevet i Shea et al., 12. På dag 7 i drægtighedsperioden (E7), ofrer 8-12 uger gamle mus ved cervikal dislokation. Saml hele conceptus dvs decidua 12.
- Isoler E7 conceptuses, som beskrevet i Shea et al., 12. Anbring dem i en 60 mm petriskål indeholdende PBS.
- Frys E7 muse conceptus for cryostatsnit.
- Forbered tilpassede aluminiumsfolie brønde 1 cm i højden ( 'hjemmelavet' med et glas Pasteur pipET). Deponere en dråbe af væv frysemedium på bunden af denne lille beholder. Depositum conceptus i den rigtige retning (dvs. for længdesnit befrugtningsproduktet bør bevares i sin vandret retning).
- Fyld brønd indeholdende befrugtningsproduktet med vævet frysemedium. Suspendere den med pincet i dampen over flydende N2 for at tillade den at fryse langsomt - derefter nedsænkes blok i flydende N2 i et par sekunder, indtil den bliver hvid. Efterfølgende overføre blokken i en indefrysning hætteglas og opbevares ved -80 ° C (kan lagre i flere måneder).
- Før kryo-sektionering, placere den frosne blok indeholdende conceptus ved -20 ° C i kryostaten i 30 min. Udfør snit af frosset 8 um tykkelse. Depositum 4 sektioner på et dias for at muliggøre effektiv vedhæftning. Placer sektioner tæt nok til at passe under en 18 x 18 mm 2 dækglas.
- Kontroller kvaliteten af densektioner (intakte og uden ridser) og orientering af embryo (længdesnit) med et stereomikroskop og vælge de sektioner, der er egnede til yderligere analyse. Så hurtigt som muligt deponere dem i en Coplin-skål og udfører RNA FISH (Se 3.3.2).
2. Udarbejdelse af sekundær TGCs
- Isoler Conceptus (se 1.1 og 1.2).
- Dissekere E7 Ectoplacental Cone (EPC)
- Brug et stereomikroskop og petriskåle indeholdende sterilt PBS. Dissekere decidua med pincet. Pierce prøven og åbne pincet til at rive de to sider af decidua fra hinanden.
- Punger ud embryoet. Brug tips af lukkede fine pincet (Dumont # 5) i en sakselignende indsats for at adskille EPC fra embryonet korrekt. Brug særlig omhu for at opnå en helt ren prøve, adskilt fra moderens væv samt fra chorion og blommesækken. Skyl EPC eksplanteret i PBS.
- Med lidt spoon, overføre individuelle dissekeret EPC til en 4-welll plade indeholdende et sterilt dækglas i medium.
- Udlede TGCs fra EPC'er Kortsigtede Cultures.
- Forbered 4-brønds plader indeholdende dækglas. Sterilisere diameter 12 mm runde dækglas ved neddypning i ethanol, efterfulgt af flamme-tørring.
- Tilsæt 0,5 ml EPC medium til hver brønd (EPC medium: RPMI 1640 suppleret med 15% FCS, 0,1 mM 2-mercaptoethanol og antibiotika).
- Deposit enkelt, dissekeret-EPC'er i centrum af dækglasset i brønden sammen med dyrkningsmedium. Brug fine pincet til at anvende EPC på dækglas. Culturefor 3-5 dage ved 37 ° C, 5% CO2. Individuel eksplantat danner en udvækst, der spreder sig som et monolag af fladtrykt TGCs (figur 2A).
3. RNA FISH
BEMÆRK: protokoller er baseret på dem, der er beskrevet for embryonale stamceller (ESC) i Chaumeil et al, 8 og pollex og Heard 13..
- Avanceret Preparation af stamopløsninger
- Forbered en 3M natriumacetatpuffer pH 5,2.
- Forbered 2x hybridiseringspuffer indeholdende 40% (vægt / volumen) natrium dextransulfat, 20x BSA, 400 mM vanadyl ribonucleosid Complex (VRC) i 4x Saline natriumcitrat (SSC).
- Forbered montering medium indeholdende 90% (vol / vol) glycerol, 0,1% (vægt / volumen) p-phenylendiamin, pH 9 i PBS.
- Frisk fremstillede opløsninger
- Forbered fiksativ opløsning bestående af 3% frisk fremstillet paraformaldehyd (PFA) i PBS. Forbered permeabilisering opløsning indeholdende 0,5% Triton-X-100 i PBS suppleret med 2 mM VRC. Forbered vaskebuffer ved blanding 50% formamid (FA) og 2x SSC og justere pH til 7,2-7,4.
- Forbered DNA counter-farveopløsning bestående af 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid) i 2 x SSC.
- Fiksering og Permeabilisering i Forberedelse til FISH
- For celler på dækglas, vaske cellerne i 1 x PBS i 5 mi. Fix celler på dækglas eller embryonale sektioner på objektglas, i 10 minutter i fiksativ (3% PFA) opløsning ved stuetemperatur.
- Skyl celler tre gange med 1x PBS. Permeabilisere celler i 5 minutter i iskold permeabilisering opløsning på is. Vask cellerne tre gange med 70% ethanol. Store dækglas i 4-brønds plader og objektglassene i 4-slide transportkassen i 70% ethanol ved -20 ° C.
BEMÆRK: Dækglas og dias kan opbevares i flere måneder ved -20 ° C. Plader og kasser indeholder dem skal være forseglet med parafilm at undgå ethanol fordampning.
- DNA Probe Mærkning
- Label DNA-prober ved nick-translation under anvendelse af fluorescerende nukleotider. Følg producentens instruktioner (se tabel 1) 8.
- For en 50 pi reaktionsblanding, tilsættes 1-2 ug plasmid, bakterielle kunstige kromosomer (BAC) eller multiple Displacement Amplification (MDA) (til DNA-amplifikation, se 3.4.4) DNA til 17,5 pi vand, 2,5 pi 0,2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 pi 10 mM af hver dNTP-blanding (dGTP, dATP, dCTP), 5 pi 10 mM dTTP, 5 pi 10x nick translation buffer og 8 pi nick translation enzym.
- Der inkuberes i 16 timer ved 15 ° C i mørke. Inaktivere reaktionen ved nedfrysning ved -20 ° C. Opbevar prober til måneder ved -20 ° C.
- MDA
BEMÆRK: BAC DNA, mængde DNA opnået efter klassisk præparat er lav, derfor kan man anvende et trin til DNA-amplifikation før mærkning ved hjælp af MDA. Brug et kommercielt kit og følg producentens anvisninger (se tabel 1). - Bland 0,5 pi BAC DNA med 9,5 pi prøvepuffer. Opvarm 3 minutter ved 95 ° C. slukke straks på is; forlade på is 10 min. Forbered reaktion buffer / enzym-mix: (9,5 pi + 0,5 pi enzym mix) og holde på is.
- Bland 10 pi DNA mix + 10 pi reaktionsbuffer / enzymblanding. Inkuber ved 30 ° C i mindst 20 timer. Inaktivere enzymet ved opvarmning prøve 10 minutter ved 65 & #176; C. Cool prøve til 4 ° C før opbevaring ved -20 ° C.
- Check MDA ved fordøjelse. Tilsæt 1 pi MDA, 2 pi 10x buffer, 2 pi Hind III og 15 pi H 2 O. Der inkuberes ved 37 ° C natten over. Køre langsomt på en 0,8-1% agarosegel for at bekræfte korrekte DNA-forstærkning. Klare DNA-fragmenter af høj molekylvægt bør observeres på gelen.
- probe Fremstilling
- Brug 0,1 eller 1 pg probe pr dækglas eller dias.
BEMÆRK: Tilføj 2-5 ug Cot-1 DNA, hvis konkurrencen er påkrævet f.eks fleste sonder, da de kan indeholde gentagne sekvenser, som ellers krydshybridiseredes og øge baggrunden.- For udfældning, tilsættes 5 ug laksesperma-DNA, 1/10 volumen 3 M natriumacetat pH 5,2 og 3 volumener ethanol. Centrifugering ved 16.000 xg og 4 ° C i 25 min. Vask pellets med 70% ethanol og spin ned igen i 5 min.
- Tør pellet i 2 min i en koncentrator / hastighed vac. Resuspender i 100% formularamid i halvdelen af volumenet kræves til hybridisering (fx 2,5 pi til dækglas eller 7 pi for embryonale sektioner på slide). Anbringes 30 minutter ved 37 ° C under omrystning i en termomikser. Denaturer i 7 min ved 75 ° C.
- Quench på is, eller hvis konkurrencen kræves sat direkte ved 37 ° C i 30-60 min. Bland probeopløsningen med et tilsvarende volumen 2x hybridiseringsopløsning.
- Brug 0,1 eller 1 pg probe pr dækglas eller dias.
- Hybridisering og Vasker
- Dehydrer; dækglas i brønde, og dias i en Coplin-skål, ved sekventiel vask i 1x 80%, 1x 95% og 2x 100% ethanol i 5 minutter hver. Tørre dækglas og dias helt.
- Til hybridisering, anvende 5 pi probehybridisering mix (se 3.5) på et objektglas og sænke dækglasset, med celler vender ind hybridiseringsblandingen. For afsnittene om dias, gælder 14 pi probehybridisering mix (se 3.5) og tildækkes med en 18 x 18 mm 2 dækglas.
- Anbring objektglassene i et fugtigt kammer (silkepapir dyppet i50% FA / 2 x SSC) og inkuberes ved 37 ° C natten over i mørke.
- Post-hybridisering Vasker:
- Tilsæt 1 ml 50% FA / 2x SSC på dækglasset på dias for at løsne det; fjerne dækglasset forsigtigt fra slide (pas på ikke at skrabe cellerne) og placere den celle-side op i en 4-brønds plade, der indeholder 50% FA / 2x SSC. For afsnittene om dias, fjerne dækglasset på en lignende måde, og placere dias i en Coplin-skål, der indeholder 50% FA / 2x SSC.
- Udfør 3 gange, hver gang i 7 minutter med forvarmet 50% FA / 2x SSC ved 42 ° C eller 44 ° C i dækglas eller glide hhv.
- Udfør 3 vaske med forvarmet 2x SSC i 5 minutter hver ved 42 ° C eller 44 ° C i dækglas eller glide hhv.
- Kontrastfarve kerner ved vask i 2 x SSC med 1 ug / ml DAPI i 3 minutter ved stuetemperatur. Skyl to gange med 2 x SSC.
- Montering af Dækglas og Slides
- For små dækglas fra dyrkede TGCs, anvende 5 & #181; l montering medium på et dias. Placer dækglasset cellen nedad oven på dråben.
- For slide med sektioner, anvende 15 pi montering medium på diaset. Placer en 22 x 22 mm 2 dækglas på toppen af dråben.
- Undgå bobler. Tør overskydende montering løsning. Forsegl dækglasset med en lille mængde af neglelak. Hvis det er muligt, billede glider straks eller opbevares i op til flere måneder ved -20 ° C.
4. Mikroskopi og analyse
- Anskaf 3D sekventielle z akse billeder i 0,3 um ved hjælp af en fluorescens mikroskop (63X mål) og udfører analyse af 3D billedstakke hjælp af ImageJ software 14.
Representative Results
TGCs kan identificeres på E7 sektioner upon DAPI farvning på grund af deres lokalisering i conceptus og deres store størrelse. Dette er illustreret i figur 1A på et længdesnit. RNA FISH blev udført på sådanne embryonale sektioner for at studere X-kromosom inaktivering i denne ekstra-embryonale afstamning.
Flere sider eller dækglas kan behandles på samme tid. Ved at anvende forskellige farvestoffer til at mærke RNA af forskellige gener, kan man detektere forskellige primære transkripter i samme kerne. Mindst 2 prober kan blandes sammen, f.eks Xist koblet til SG (grønt signal) og Atrx koblet til SR (rødt signal). Et eksempel på en kvindelig TGC er vist i figur 1B, hvor 2 andre slægter er repræsenteret, embryonet korrekt (E) og den viscerale endoderm (VE). En TGC kerne er vist med Xist RNA dækker X kromosome som inaktiveres (Xi), mens den anden X-kromosom, som er aktiv (Xa) viser et par spidder. X-linked gen Atrx primære udskrifter udtrykkes fra den aktive X-kromosom (ikke dekoreret af Xist) i flere eksemplarer grundet endoreplication. Dette illustrerer monoallelisk ekspression fx inaktivering af Atrx på et X-kromosom.
Da TGCs er heterogene i størrelse som vist i figur 2B, er alene de største registreres. Tre prober kan også anvendes som vist i figur 2C for sekundære TGCs. I dette tilfælde Xist -SG (grøn), to X-bundne gener: G6PD -SR (rød) og Huwe1 -CY (magenta) analyseret på samme tid i samme kerne. Mens G6PD er monoallelically udtrykkes som vist her (og tidligere vist i sekundære TGCs 3) Huwe1 er biallelically udtryk demonstrere sin PRoperty at undslippe XCI. Endoreplication, med flere peger dvs, spirende udskrifter kopier, er også indlysende.
Figur 1. Primær transkript ekspression i TGCs fra E7 kvindelige embryonale sektion. (A) længdesnit af E7 befrugtningsproduktet farvet med DAPI. Den embryo og ekstra-embryonale væv er omgivet af moderen væv, decidua. Lokaliseringen af de forskellige afstamninger sker ved DAPI farvning med 5X objektiv. TGCs identificeres på grund af deres store størrelse. Ch, chorion, E, embryo, EPC, ectoplacental kegle, VE, visceral endoderm, TGC, trofoblast kæmpeceller. Scale bar = 100 um. (B) Højere forstørrelse af boxed-in området i A (63X objektiv) RNA FISH. Atrx primær udskrift i rødt og Xist RNA i grøn visualiseres på 3 slægter = E, VE, TGC. scale bar = 10 um. Eksempel på en in vivo TGC hvor Atrx er monoallelically udtrykkes (Xa, pilespids) og lydløs på Xist overtrukne X-kromosom (Xi); flere Atrx signaler ses på Xa skyldes endoreplication. Atrx = BAC klon RP23-260I15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Primær udskrift udtryk i sekundære TGCs afledt af EPC. (A) Overblik over voksende sekundær TGCs (x5 mål). Scale bar = 100 um. (B) Asterisk angiver eksempel på TGCs efter deres størrelse (10X objektiv). Scale bar = 60 um. (C) Eksempel på et sekundært kvindelig TGC RNA FISH under anvendelse af 3 prober (Xist domai grønt, der dækker den inaktiverede X-kromosom: Xi) viser endoreplication af G6PD og Huwe1 primære udskrifter (flere peger, i rød og magenta). Mens G6PD udtrykkes monoallelically, Huwe1 udtryk er biallele i denne kerne Huwe1 = BAC klon RP24-157H12;. G6PD = BAC klon RP23-13D21. Xi = pil; Xa = pilespids (63X objektiv). Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Nascent RNA FISH betegner en let og følsom fremgangsmåde til enkelt celle analyse af transkriptionsaktivitet i embryoniske væv på forskellige udviklingsstadier. Effekten af denne tilgang er evnen til at identificere forskellige embryonale afstamninger på et givent tidspunkt efter morfologiske kriterier. Dette kræver imidlertid også, at minimal baggrundsfluorescens er til stede. Enhver sådan baggrund gør identifikationen af forskellige embryonale regioner og celletyper udfordrende. For at sikre minimal baggrund, er der to kritiske skridt i denne protokol. Den første er kvaliteten af kryosektionen og det andet er effektiviteten (signal til støj-forhold) af RNA FISH, der afhænger af niveauet af genekspression og kvaliteten af sonden. For sidstnævnte er prober derfor altid testet på dyrkede celler på dækglas (embryonale stamceller eller somatiske celler) før anvendelse på sektioner.
I denne protokol, giver vi the teknikker forpligtet til at udføre RNA FISH analyse på TGCs fra to forskellige typer af prøveforberedelse (cryostatsektioner og primære kulturer af embryonale eksplantater). En sådan enkelt celle analyse giver mulighed for dynamiske ændringer i genekspression ved forskellige post-implantation trin der skal vurderes.
De metoder vi beskriver at generere sekundær TGCs (ved E7-7.5 post-implantation trin) blev anvendt i vores laboratorium for at studere de X-kromosominaktivering mønstre af en ekstra-embryonale afstamning som udgøres af TGCs på post-implantation faser. Ekstra fosterudviklingen hos gnavere afhænger af differentiering af TGCs. Faktisk TGCs er afgørende for placenta og dermed fosterudvikling. Fejl i TGC differentiering forårsage embryonale dødelighed (for review se reference 15). Transkriptionsaktivitet TGCs anvendelse af RNA FISH tilladt os at demonstrere en usædvanlig X-kromosom inaktivering status af en sådan celletype under museudvikling 3.
in vivo TGCs og i in vitro TGCs afledt af EPC eksplantat. Denne metode kunne udvides til analyse af transgene mus og / eller ved tilsætning af inhibitor-molekyler i dyrkningsmediet. Vi har med succes brugt denne metode af RNA FISH på en anden type TGCs, såsom primære TGCs som synes på et tidligere tidspunkt i mus udvikling, E3.0 blastocyts, hvilket kan være individuelt dyrket i 4-5 dage, hvor udviklede udvækst, de ICM er omgivet af store primære TGCs 16,17. Spirende udskrifter for forskelligegener såvel som Xist kunne visualiseres og kvantificeres ved hjælp af den samme RNA FISH metode 3.
Kombineret immunofluorescens og RNA FISH kan også udføres på cryostatsnit samt in vitro dyrkede TGCs 3. Dette viser, at metoden er ganske robust, som primære transkripter er meget modtagelige for nedbrydning, og der er et absolut krav af RNase frie forbindelser. HVIS / RNA FISH giver yderligere oplysninger om transskription niveauer, cellulære lokalisering og proteinekspression, samtidig i en given celle. Selv sektioner af paraffinindlejret væv, der tidligere er blevet anvendt til at påvise spirende RNA i humane tumorer samtidig opretholde vævsmorfologi 18, i vore hænder, cryostatsektioner er mere hensigtsmæssige for at bevare både det spirende RNA og epitoperne kræves til påvisning af antistoffer under immunofluorescens .
Foruden RNA FISH, efter immunofluorescence, kan kromosomalt DNA FISH også udføres på sekundære TGCs anvendelse af prober mærket med fluorochromer, der ligner dem, der anvendes til RNA FISH 3. Fluorescerende prober kan enten være plasmider / fosmids eller BAC'er, mærket med fluorescerende dUTPs som anvendt her, og beskrevet i Chaumeil et al., 8. Alternativt kan fluorescerende mærkede oligonukleotider anvendes 19. Da DNA FISH ikke kræver streng-specificitet, kan oligonukleotidprober konstrueres til at målrette en af de to komplementære strenge i målregionen. Forgrenede DNA-prober, hvor signalforstærkning opnås ved to sekventielle runder af specifikke og formeringsprober kan også anvendes til at forbedre signal-til-støj-forhold af fisk signaler 20. Alternativt kan RNA-prober såsom riboprober anvendes selv i vore DNA-baserede prober sikre et højere afvejning mellem signalkvalitet, specificitet og brugervenlighed.
Endelig 3D-billede køb af virksomer væsentlig for at opnå den ønskede geografisk information i disse store celler, og kan udføres ved anvendelse af forskellige fluorescens mikroskoper, såsom Apotome mikroskop eller epifluorescens mikroskoper med udfoldning såsom Deltavision (GEH), eller andre mikroskoper egnede til billeddannelse vævssnit, og store (> 20 um) TGCs. Det skal bemærkes, at for enkelt kopi DNA loci, den punktformet signal detekteres af spirende RNA FISH eller DNA FISH kan ikke let kan påvises ved konfokal mikroskopi.
Afslutningsvis bør de metoder, vi beskriver her være nyttigt både for detaljeret analyse af TGS i en udviklingsmæssig sammenhæng, men også i andre situationer sygdom. Mange gener, der er involveret i TGC udvikling og funktion i gnavere er bevaret mellem gnavere og mennesker, såsom transkriptionsfaktorer, proteaser og celleadhæsionsmolekyler 21. Mus TGCs er en celle model for studere gener, der regulerer placenta udvikling end derfor giver indsigt i menneskelige placenta sygdomme. På grund af det faktum, at disse celler endoreplicating og da nogle cancerceller indgreb endocycle programmer, foruden gen amplifikationsprocesser fremgangsmåderne vi beskriver bør også være nyttige i enkeltcelle-undersøgelser er nødvendige for at undersøge mekanismer, der fører til genome ustabilitet i cancerceller .
Acknowledgments
Vi takker Sophie gournet om hjælp med illustrationer, Julie Chaumeil til at læse manuskriptet, huset facilitet dyret og imaging platform af enheden. Dette arbejde har modtaget støtte under programmet «Investissements d'Avenir» lanceret af den franske regering og gennemført af ANR med referencerne ANR-10-LabX-0044 og ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, den EpiGeneSys FP7 no. 257.082 Network of Excellence til EH, et ERC Advanced Investigators tildele nej. 250.367 og EU FP7 SYBOSS giver ingen. 242.129 til EH Forfatterne vil gerne anerkende Cell og Tissue Imaging Platform for Genetik og Developmental Biology Department (UMR3215 / U934) af Institut Curie, medlem af Frankrig-Bioimaging (ANR-10-InSb-04), for at få hjælp med lys mikroskopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, Suppl A. 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
