Abstract
Die Plazenta leitet sich von einer extraembryonalen Linie, die Trophektoderm. In der peri-Implantation murine Blastozysten, unterscheiden Wand Trophektoderm Zellen in primäre trophoblast Riesenzellen (TGCs), während die polare Trophektoderm der inneren Zellmasse liegt, später zu wuchern weiter in sekundäre TGCs unterscheiden. TGCs spielen eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der Plazenta und sind essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft. Untersuchung der Transkriptionsregulation bestimmter Gene während nach der Implantation Entwicklung kann Einblicke in TGCs geben Entwicklung. Zellen des ectoplacental Kegels (EPC) von Embryonen bei 7-7,5 Tagen der Trächtigkeit (E7-7.5), von dem polaren Trophektoderm abgeleitet, differenzieren sich in Sekundär TGCs 1. TGCs kann in situ auf Kryostatschnitten von Embryonen bei E7 untersucht werden , obwohl die Anzahl von TGCs in diesem Stadium sehr niedrig ist. Ein alternatives Mittel sekundären TGCs der Analyse ist kurzfristige Kulturen einzelner EPCs von E7 Embryo zu verwenden,s. Wir schlagen vor , eine Technik , die Transkriptionsstatus von Genen von Interesse in vivo sowohl und auf der Ebene einzelner Zellen in vitro zu untersuchen , unter Verwendung von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (RNA FISH) im Entstehen begriffenen Transkripte zu visualisieren. Diese Technik liefert eine direkte Auslesung der Genexpression und erlaubt die Beurteilung der chromosomalen Status TGCs, die große endoreplicating Zellen sind. Tatsächlich ist ein wesentliches Merkmal der terminalen Differenzierung von TGCs, dass sie den Zellzyklus zu verlassen und durchlaufen mehrere Runden von endoreplication.This Ansatz kann angewendet werden, um Expression eines beliebigen Gens von Autosomen und / oder Geschlechtschromosomen exprimiert zu erkennen und wichtige Informationen in Entwicklungs liefern Mechanismen sowie Plazentakrankheiten.
Introduction
Mammalian trophoblast Riesenzellen (TGCs) eine Barriere zwischen mütterlichen und embryonalen Geweben bilden. Sie vermitteln die Implantation und die Invasion des conceptus in die Gebärmutter und spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung für die Bildung der Plazenta. Sie produzieren verschiedene Wachstumsfaktoren (Zytokine) und Hormone der Prolactin / Placentalactogen Familie und Steroide, die für embryonale Wachstum und Überleben. TGCs sind groß, einkernigen und polyploiden Zellen mit einem Zellzyklus, der endocycle, dass S und G Phasen im Wechsel besteht. Tatsächlich TGCs sind endoreplicating Zellen, in der Lage 2 ohne Teilung mehrere Runden der DNA - Synthese zu unterziehen. Um die Transkriptionsstatus von Genen in vivo, in TGCs Vergleich zu anderen embryonalen und extraembryonale Zelltypen, naszierende RNA FISH zu untersuchen , können in vivo auf Kryostatschnitten 3 an bestimmten Postimplantationsschritte durchgeführt werden. TGCs sind leicht erkennbar auf Abschnitte aufgrund their Größe und ihre Transkriptions Genaktivität kann aufgezeichnet werden, aber ihre Zahl in frühen Stadien nach der Implantation ist gering. Mangel an TGCs auf E7 embryonalen Abschnitte, führte uns kurzfristige Kulturen von embryonalen trophectodermal Gewebe auszuführen differenzierte TGCs zu erhalten, um die Regulation der Genexpression während der Trophektoderm Entwicklung zu studieren. Darüber hinaus, um möglichst physiologischen bleiben, etablierte Zelllinien, dh Trophektoderm Stammzellen (TS) sind nicht immer geeignet Entwicklungsmechanismen Generation zu untersuchen sekundärer TGCs ein wertvolles Hilfsmittel für pathologische Schwangerschaften mit Defekten in TGCs durch abnorme Gen assoziiert zu studieren Regulierung bei Mäusen.
Trophoblastzellen des ectoplacental Kegel (EPC) sind Vorläufer von sekundären TGCs 4. Spontane Differenzierung von kultivierten EPCs zur sekundären TGCs zuvor 5 berichtet. Jedoch im Gegensatz zu primären TGCs, Studien über Sekundär TGC differenhandlungen haben begrenzt geblieben, presumablydue auf die Schwierigkeiten der frei von mütterlichen oder embryonalem Gewebe EPC Explantate zu isolieren. Wir passten diese Methoden, um RNA-FISH auf Sekundär TGCs aus einzelnen Embryo in E7, eine Entwicklungs nach der Implantation Stadium, in dem TGCs sind nur sehr wenige abgeleitet ausführen konnte aber von EPC-Vorstufen erzeugt werden. RNA-FISH Kern Primärtranskripte zu analysieren hat nie auf der Ebene der Einzelzellebene auf Sekundär TGCs geschehen. Dies ermöglicht eine genaue Analyse der Transkription und wurde 3 verwendet die epigenetische Instabilität von TGCs bei Postimplantationsstadien zu zeigen.
Ein klassisches Beispiel für die Epigenetik bei Säugetieren, das X-Chromosom - Inaktivierung (XCI) im Heard Labor 6 untersucht. Bei diesem Verfahren eine der zwei X-Chromosomen in weiblichen inaktiviert. Die nicht codierende Transkript Xist beschichtet das X - Chromosom , von dem sie in weiblichen Zellen exprimiert und löst silencing der meisten Gene. Mit RNA-FISH,Entstehen begriffenen Transkripte von X-chromosomale Gene können wie auch die Anhäufung von Xist - RNA auf dem inaktiven X - Chromosom (Xi) untersucht werden. Wir beschreiben hier ein Verfahren zur RNA-FISH auf Abschnitten nach der Implantation Embryonen und auf Kurzzeitkulturen von EPC durchführen. Dieses Protokoll von denjenigen , die angepasst XCI verwendet wurden 7-11 in differenzierenden weiblichen embryonalen Stammzellen und Präimplantationsembryonen zu studieren. Wir stellen Beispiele von XCI in weiblichen Embryonen in vivo sowie in vitro TGCs.
Protocol
Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem genehmigten institutionellen Tierpflege und verwenden Ausschusses des Instituts Curie (CEEA-IC) Protokolle (C 75-05-18) durchgeführt. Die Arbeit wurde auch im Rahmen der Genehmigung aus dem Französisch Ministerium für Höhere Bildung und Forschung für die Nutzung von gentechnisch veränderten Organismen (Vertragsnummer 5549CA-I) durchgeführt worden.
1. Herstellung von Kryostasisschnitte
- Sammeln Embryonen aus natürlich F1 C57BL / 6 x DBA / 2J - Mäuse ovulating wie in Shea et al., 12. Am 7. Tag der Trächtigkeit (E7), opfern 8-12 Wochen alten Maus durch Genickbruch. Sammeln Sie die gesamte conceptus dh decidua 12.
- Isolieren E7 Konzepti, wie in Shea et al., 12. Legen Sie sie in einer 60 mm Petrischale mit PBS.
- Frieren Sie das E7 Maus conceptus für Cryostatschnitten.
- Bereiten angepasst Aluminiumfolie Brunnen 1cm in der Höhe ( 'hausgemachten' mit einem Glas Pasteur pipet). Abzuscheiden einen Tropfen Gewebe Einfriermedium auf dem Boden des kleinen Behälters. Hinterlegung der conceptus in der richtigen Ausrichtung (dh für Längsschnitte der conceptus sollte in seiner horizontalen Ausrichtung gehalten).
- Füllen Sie das gut mit dem conceptus mit Gewebe Einfriermedium. Suspend es mit einer Pinzette in Dampf über flüssigem N 2, um es zu ermöglichen , langsam zu frieren - dann den Block in der flüssigen N 2 für ein paar Sekunden tauchen , bis es weiß wird. Anschließend übertragen Sie den Block in ein Einfrieren Fläschchen und bei -80 ° C (für mehrere Monate zu speichern).
- Vor dem Kryo-Schnitte, legen Sie den gefrorenen Block die conceptus bei -20 ° C in den Kryostaten 30 min enthält. Führen Sie Kryoabschnitte von 8 & mgr; m Dicke. Kaution 4 Abschnitte auf einer Folie effiziente Befestigung zu ermöglichen. Platz Abschnitte schließen genug , um unter einem 18 x 18 mm 2 Deckglas zu passen.
- Prüfen Sie die Qualität derAbschnitte (intakt und ohne Kratzer) und die Orientierung des Embryos (Längsschnitt) mit einem Stereomikroskop und die Sektionen für eine weitere Analyse auszuwählen. So schnell wie möglich, sie in einer Glasküvette ablagern und RNA FISH (siehe 3.3.2) durchführen.
2. Herstellung von Secondary TGCs
- Isolieren Sie die Conceptus (siehe 1.1 und 1.2).
- Präparieren Sie die E7 Ectoplacental Cone (EPC)
- Verwenden Sie ein Stereomikroskop und Petrischalen mit sterilem PBS. Präparieren Sie die Decidua mit einer Pinzette. Pierce die Probe und offene Zange die beiden Seiten der Decidua auseinander zu reißen.
- Shell den Embryo. Verwenden Spitzen geschlossenen feinen Pinzette (Dumont No. 5) in einer scherenartigen eigentliche Handlung des EPC aus dem Embryo zu trennen. Verwenden Sie spezielle Pflege eine perfekt saubere Probe zu erhalten, aus dem mütterlichen Gewebe trennen sowie von Chorion und Dottersack. Waschen Sie den EPC Explantate in PBS.
- Mit ein wenig Löffel, übertragen einzelnen seziert EPC auf eine 4-well Platte ein steriles Deckglas in Medium enthält.
- Man leite TGCs von EPCs Kurzfristige Kulturen.
- Bereiten Sie 4-Well-Platten, die Deckgläser. Sterilisieren 12 mm Durchmesser runden Glasplättchen durch in Ethanol eingetaucht, gefolgt von flamm Trocknen.
- 0,5 ml EPC Medium zu jeder Vertiefung (EPC-Medium: RPMI 1640 mit 15% FCS ergänzt, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol und Antibiotika).
- Kaution Einzel-, seziert-EPCs in der Mitte des Deckglases in den Brunnen zusammen mit Kulturmedium. Verwenden feinen Pinzette den EPC auf dem Deckglas anzuwenden. Culturefor 3-5 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2. Einzelnen Explantat bildet einen Auswuchs , die als eine Monoschicht von abgeflachten TGCs (2A) erstreckt.
3. RNA-FISH
HINWEIS: Die Protokolle werden auf solche auf Basis für embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) in Chaumeil et al, 8 und Pollex und Heard 13..
- Erweiterte PrepaRation von Stammlösungen
- Bereiten Sie eine 3 M Natriumacetat-Puffer pH 5.2.
- Bereiten 2x Hybridisierungspuffer, enthaltend 40% (w / v) Natrium-Dextransulfat, 20x BSA, 400 mM Vanadyl Ribonukleosid Komplex (VRC) in 4x Saline Sodium Citrate (SSC).
- Bereiten Befestigungsmedium, enthaltend 90% (v / v) Glycerol, 0,1% (w / v) p-Phenylendiamin, pH 9 in PBS.
- Frisch zubereitete Lösungen
- Bereiten Sie Fixierungslösung, bestehend aus 3% frisch zubereitet Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Bereiten Permeabilisierung Lösung 0,5% Triton-X-100 in PBS, ergänzt mit 2 mM VRC enthält. Bereiten Waschpuffer durch Mischen von 50% Formamid (FA) und 2x SSC und den pH-Wert auf 7,2 bis 7,4.
- Bereiten DNA Gegenfärbungslösung, bestehend aus 1 & mgr; g / ml DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid) in 2x SSC.
- Die Fixierung und Permeabilisierung in Vorbereitung für die FISH
- Für Zellen auf Deckgläsern, waschen Sie die Zellen in 1x PBS für 5 min. Fix-Zellen auf Deckgläsern oder embryonalen Abschnitte auf Objektträger für 10 min in Fixierungsmittel (3% PFA) Lösung bei RT.
- Spülen Zellen dreimal mit 1x PBS. Permeabilisierung Zellen für 5 min in eiskaltem Permeabilisierung Lösung auf Eis. Wasche die Zellen dreimal mit 70% Ethanol. Shop Deckgläser in 4-Well-Platten und Folien in 4-Dia-Transportbox in 70% Ethanol bei -20 ° C.
HINWEIS: Die Deckgläser und Folien können mehrere Monate bei -20 ° C gelagert werden. Platten und Kartons mit ihnen mit Parafilm abgedichtet werden müssen, um Ethanol Verdampfung zu vermeiden.
- DNA-Sondenmarkierung
- Beschriften DNA-Sonden durch Nick-Translation unter Verwendung von fluoreszierenden Nukleotiden. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle 1) 8.
- Für eine 50 ul-Reaktionsgemisch, fügen Sie 1-2 ug Plasmid, bakterielle künstliche Chromosomen (BAC) oder mehrere Displacement Amplification (MDA) (für die DNA-Amplifikation, siehe 3.4.4) DNA zu 17,5 ul Wasser, 2,5 ul 0,2 mMSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 & mgr; l 10 mM jedes dNTP-Mix (dGTP, dATP, dCTP), 5 ul 10 mM dTTP, 5 ul 10x Nick-Translation-Puffer und 8 ul Nick-Translation-Enzym.
- im Dunkeln bei 15 ° C für 16 Stunden inkubieren. Inaktivieren die Reaktion bei -20 ° C gefroren. Store Sonden für Monate bei -20 ° C.
- MDA
HINWEIS: Für BAC-DNA, die Menge der nach der klassischen Zubereitung erhaltene DNA ist gering, deshalb kann man vor der Markierung einen Schritt der DNA-Amplifikation verwenden, indem MDA. Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Kits und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle 1). - Mischen Sie 0,5 ul BAC-DNA mit 9,5 & mgr; l Probenpuffer. Erhitzen Sie 3 min bei 95 ° C. Quench sofort auf Eis; lassen auf Eis 10 min. Bereiten Sie Reaktionspuffer / Enzymmischung: (9,5 & mgr; l + 0,5 ul Enzym-Mix) und halten Sie auf dem Eis.
- Mischen Sie 10 ul DNA-Gemisch + 10 & mgr; l Reaktionspuffer / Enzymmischung. Inkubieren bei 30 ° C mindestens 20 Std. Inaktivieren Enzym durch Erhitzen Probe 10 min bei 65 & #176; C. Kühlen Probe auf 4 ° C, bevor auf -20 ° C lagern.
- Prüfen MDA durch die Verdauung. 1 ul MDA, 2 ul 10x - Puffer, 2 ul Hind III und 15 & mgr; l H 2 O. über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Führen Sie langsam auf einem 0,8-1% Agarose-Gel, um eine genaue DNA-Amplifikation zu bestätigen. Klare DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht sollte auf dem Gel beobachtet werden.
- Probe Vorbereitung
- Verwenden Sie 0,1 oder 1 ug Sonde pro Deckglas oder Folie.
HINWEIS: In 2-5 ug Cot-1 - DNA , wenn der Wettbewerb erforderlich ist , zum Beispiel die meisten Sonden , wie sie Wiederholungssequenzen , die sonst Quer hybridisieren und erhöhen Hintergrund enthalten.- Zur Fällung, fügen 5 ug Lachssperma-DNA, 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 3 Volumina Ethanol. Spin bei 16.000 xg und 4 ° C für 25 min. Waschen Sie Pellets mit 70% Ethanol und Spin-down erneut für 5 min.
- Trockene Pellet für 2 Minuten in einem Konzentrator / Geschwindigkeit vac. Resuspendieren in 100% iger FormAmid in der Hälfte des Volumens für die Hybridisierung erforderlich (zB 2,5 ul für Deckglas oder 7 ul für die embryonale Abschnitte auf Folie). Legen Sie 30 min bei 37 ° C mit in einem Thermomixer schütteln. Denaturieren für 7 min bei 75 ° C.
- Quench auf Eis, oder wenn der Wettbewerb für 30-60 min direkt bei 37 ° C setzen erforderlich ist. Mischen Sie die Sondenlösung mit einem gleichen Volumen von 2x Hybridisierungslösung.
- Verwenden Sie 0,1 oder 1 ug Sonde pro Deckglas oder Folie.
- Die Hybridisierung und Wäscht
- Entwässern; Deckgläser in Brunnen, und gleitet in einer Glasküvette, durch aufeinanderfolgende Waschen in 1x 80%, 1x 95% und 2 x 100% Ethanol für jeweils 5 Minuten. Dry Deck und Dias vollständig.
- Für die Hybridisierung, gelten die 5 ul Sonde Hybridisierungsmischung (siehe 3.5) auf einen Objektträger und das Deckglas senken, mit Zellen in die Hybridisierungsmischung gegenüber. Für Abschnitte auf dem Objektträger gelten 14 ul Sonde Hybridisierungsmischung (siehe 3.5) und Deckel mit einem 18 x 18 mm 2 Deckglas.
- Die Objektträger in einer feuchten Kammer (Seidenpapier getränkt50% FA / 2 × SSC) und über Nacht bei 37 ° C inkubieren, im Dunkeln.
- Post-Hybridisierung Wäscht:
- 1 ml 50% FA / 2 × SSC auf das Deckglas auf der Folie um sie zu lösen; das Deckglas vorsichtig von der Folie entfernen (dabei nicht um die Zellen zu kratzen) und legen es die Zellseite nach oben in ein 4-Well-Platte 50% FA / 2 × SSC enthält. Für Abschnitte auf dem Objektträger, das Deckglas in ähnlicher Weise zu entfernen und die Folie in einer Glasküvette legen 50% FA / 2 × SSC enthält.
- Führen 3 Waschungen, jeweils für 7 min mit vorgewärmtem 50% FA / 2 × SSC bei 42 ° C oder 44 ° C für Deckglas bzw. Objektträger, respectively.
- Führen 3 Waschungen mit vorgewärmten 2x SSC für jeweils 5 Minuten bei 42 ° C oder 44 ° C für Deckglas bzw. Objektträger, respectively.
- Gegenfärbung Kerne durch Waschen in 2x SSC mit 1 & mgr; g / ml DAPI für 3 min bei RT. Spülen Sie zweimal mit 2 × SSC.
- Montage von Deckgläser und Slides
- Für kleine Deckglas aus kultivierten TGCs gelten 5 & #181; l Eindeckmedium auf einer Folie. Legen Sie die Deckzellseite nach unten auf der Oberseite des Tropfens.
- Für Dia mit Abschnitten gelten 15 ul Montagemedium auf dem Objektträger. Legen Sie ein 22 x 22 mm 2 Deckglas auf der Oberseite des Tropfens.
- Vermeiden Sie Blasen. Wischen Sie überschüssiges Montagelösung. Deckglasränder mit einer kleinen Menge von Nagellack. Wenn möglich, Bild gleitet sofort oder Speicher für bis zu mehrere Monate bei -20 ° C.
4. Mikroskopie und Analyse
- Erwerben 3D sequentielle z - Achse Bilder in 0,3 um einem Fluoreszenzmikroskop (63X - Objektiv) mit und führen Sie 14 , um die Analyse von 3D - Bildstapel die imagej Software.
Representative Results
TGCs in der conceptus und ihre Größe, ihre Lokalisation durch auf E7 Abschnitte auf DAPI-Färbung identifiziert werden. Dies ist in Figur 1A auf einem Längsschnitt veranschaulicht. RNA-FISH wurde auf solche embryonalen Abschnitte durchgeführt, um X-Chromosom-Inaktivierung in dieser extra embryonale Linie studieren.
Mehrere Folien oder Deckgläser können gleichzeitig verarbeitet werden. Durch die Verwendung von verschiedenen Farbstoffen RNA unterschiedlicher Gene zu kennzeichnen, kann man verschiedene primäre Transkripte in demselben Kern detektieren. Mindestens zwei Sonden können miteinander vermischt werden, zum Beispiel Xist gekoppelt SG (grünes Signal) und ATRX gekoppelt SR (rotes Signal). Ein Beispiel eines weiblichen TGC ist in 1B gezeigt , wo zwei anderen Linien dargestellt sind, den Embryo richtige (E) und dem viszeralen Endoderm (VE). Ein TGC Kern ist mit Xist - RNA für den X chrom gezeigtOsome, die inaktiviert (Xi), während das andere X-Chromosom, die aktiv (Xa), ist ein paar Pünktchen zeigt. X-chromosomal - Gen ATRX primäre Transkripte aus dem aktiven X - Chromosom exprimiert (nicht von Xist dekoriert) in mehreren Kopien aufgrund Endoreplikation. Dies zeigt monoallelic Ausdruck zB Inaktivierung von ATRX auf ein X - Chromosom.
Da TGCs in Größe heterogen sind , wie in 2B dargestellt, werden nur die größten aufgezeichnet. Drei Sonden kann auch , wie dargestellt in 2C für die Sekundär TGCs verwendet. In diesem Fall Xist -SG (grün), zwei X-chromosomale Gene: G6PD -SR (rot) und Huwe1 -Cy (Magenta) wurden in der gleichen Zeit in dem gleichen Kern analysiert. Während G6PD monoallelically wie hier gezeigt ausgedrückt wird (und zuvor in sekundären TGCs 3 dargestellt) Huwe1 ist biallelically ausgedrückt seine pr demonstrierenoperty zu entkommen XCI. Endoreplikation, mit mehreren pinpoints dh, im Entstehen begriffenen Transkripte Kopien, ist auch offensichtlich.
Abbildung 1. Primäre Transkriptexpression in TGCs von E7 weibliche embryonale Abschnitt. (A) Längsschnitt des conceptus E7 mit DAPI gefärbt. Der Embryo und extraembryonale Gewebe werden durch die Mutter Gewebe, die Decidua umgeben. Die Lokalisierung der verschiedenen Linien wird auf DAPI-Färbung mit 5X Ziel gemacht. TGCs sind aufgrund ihrer Größe identifiziert. Ch, Chorion, E, Embryo, EPC, ectoplacental Kegel, VE, viszeralen Endoderm, TGC, trophoblast Riesenzellen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B) Eine stärkere Vergrößerung der boxed-in - Bereich in A (63X - Objektiv) RNA FISH. ATRX primären Transkripts in rot und Xist - RNA in grün auf der 3 Abstammungslinien = E sichtbar gemacht werden, VE, TGC. scale bar = 10 & mgr; m. Beispiel für eine in vivo TGC wo ATRX wird monoallelically ausgedrückt (Xa, Pfeilspitze) und leise auf der Xist -beschichteten X - Chromosom (Xi); mehrere ATRX Signale auf dem Xa gesehen sind aufgrund Endoreplikation. ATRX = BAC - Klon RP23-260I15. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Primäre Transkriptexpression in sekundären TGCs von EPC abgeleitet. (A) Gesamtansicht der wachsenden Sekundär TGCs (x5 Ziel). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B) Asterisk zeigen Beispiel von TGCs nach ihrer Größe (10X - Objektiv). Maßstabsbalken = 60 & mgr; m. (C) Beispiel eines sekundären weiblichen TGC RNA FISH mit der Verwendung von drei Sonden (Xist domain in grün, das inaktivierte X - Chromosom abdeckt: Xi) Endoreplikation von G6PD und Huwe1 Primärtranskripte (mehrere pinpoints, in Rot und Magenta zeigt). Während G6PD monoallelically ausgedrückt wird, ist Huwe1 Ausdruck biallelic in diesem Kern Huwe1 = BAC - Klon RP24-157H12;. G6PD = BAC - Klon RP23-13D21. Xi = Pfeil; Xa = Pfeilspitze (63X-Objektiv). Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Nascent RNA FISH stellt eine einfache und empfindliche Methode zur Einzelzellanalyse von Transkriptionsaktivität in embryonalem Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die Kraft dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, unterschiedliche embryonale Linien zu einem bestimmten Stadium zu identifizieren nach morphologischen Kriterien. Allerdings erfordert dies auch, dass minimale Hintergrundfluoreszenz vorhanden ist. Ein solcher Hintergrund macht die Identifizierung verschiedener embryonaler Regionen und Zelltypen herausfordernd. Um sicherzustellen, minimal Hintergrund gibt es zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste ist die Qualität der Kryoschnitt und die zweite ist die Effizienz (Signal-Rausch-Verhältnis) des RNA FISH, die auf der Ebene der Genexpression und der Qualität der Sonde abhängt. Für letztere sind Sonden daher immer auf kultivierten Zellen auf Deckgläsern getestet (embryonale Stammzellen oder somatischen Zellen), bevor auf Abschnitten zu verwenden.
In diesem Protokoll stellen wir the Techniken erforderlich, um RNA FISH-Analyse auf TGCs aus zwei unterschiedlichen Typen von Probenvorbereitung (Kryostatschnitten und Primärkulturen von embryonalen Explantate) durchführen. Solche Einzelzellanalyse ermöglicht die dynamische Veränderungen in der Genexpression bei verschiedenen Postimplantationsstufen bewertet werden.
Die Methoden, die wir beschreiben sekundäre TGCs zu erzeugen (bei E7-7.5 nach der Implantation Stufen) wurden in unserem Labor zur Untersuchung der X-Chromosom Inaktivierung Muster einer extra embryonale Linie verwendet, die von TGCs bei Postimplantationsstufen gebildet ist. Extra-Embryonalentwicklung in Nagetieren, hängt von der Differenzierung von TGCs. Tatsächlich sind TGCs essentiell für Plazenta und damit die embryonale Entwicklung. Defekte in TGC Differenzierung führen embryonale Letalität (zur Übersicht siehe Referenz 15). Transkriptions - Aktivität von TGCs RNA FISH erlaubt uns eine ungewöhnliche X - Chromosom Inaktivierung Status dieser Zelltyp während der Mausentwicklung 3 zu demonstrieren.
vivo in TGCs und in in vitro TGCs von EPC Explantation abgeleitet zu beurteilen. Dieses Verfahren könnte zur Analyse von transgenen Mäusen verlängert werden und / oder durch die Zugabe von Inhibitor-Moleküle in das Kulturmedium. Wir haben erfolgreich diese Methode der RNA FISH auf einer anderen Art von TGCs, wie primäre TGCs, die in einem früheren Stadium der Entwicklung der Maus, E3.0 blastocyts, die sein können einzeln kultiviert für 4-5 Tage, in denen entwickelte Auswuchs erscheinen verwendet, die ICM werden 16,17 von großen primären TGCs umgeben. Nascent Transkripte für verschiedeneGene sowie Xist visualisiert und quantifiziert werden konnte 3 die gleiche RNA - FISH - Ansatz.
Kombinierte Immunofluoreszenz und RNA FISH können auch als auch in vitro kultiviert TGCs 3 auf Kryostatschnitten durchgeführt werden. Dies zeigt, daß das Verfahren ziemlich robust ist, als primäre Transkripte sehr anfällig gegenüber Abbau sind, und es ist eine absolute Voraussetzung für RNase freien Verbindungen. IF / RNA-FISH bietet weitere Informationen zur Transkription Ebenen, zelluläre Lokalisation und Proteinexpression, gleichzeitig in einer bestimmten Zelle. Obwohl die Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden bisher verwendet worden , im Entstehen begriffenen RNA in menschlichen Tumoren zu erfassen , während Gewebemorphologie Aufrechterhaltung 18, in unseren Händen, sind Cryostatschnitten besser geeignet für die Erhaltung sowohl der im Entstehen begriffenen RNA und die für den Nachweis erforderlich Epitope , die durch Antikörper bei Immun .
Zusätzlich zu den RNA-FISH, folgende imFluoreszenz, chromosomale DNA FISH kann auch auf TGCs sekundären Sonden durchgeführt werden mit Fluorochromen markiert verwenden, ähnlich denen für die RNA - FISH 3 verwendet. Fluoreszenzsonden können entweder Plasmide / Fosmide oder BACs sein, mit fluoreszierend markiertem dUTPs wie hier verwendet und beschrieben in Chaumeil et al., 8. Alternativ können fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide 19 verwendet werden. Da FISH DNA Oligonukleotidsonden einem der beiden komplementären Stränge in der Zielregion zum Ziel können nicht strang Spezifität erfordern ausgebildet sein. Verzweigte DNA - Sonden, wobei die Signalverstärkung durch zwei sequenzielle Runden von spezifischen und Verstärkersonden erreicht wird , kann auch das Signal-Rausch - Verhältnis von FISH - Signale 20 verstärkt werden. Alternativ können RNA-Sonden wie Ribosonden verwendet werden, obwohl in unserer DNA-basierten Sonden ein besseres Kompromiss zwischen Signalqualität garantieren, Spezifität und Einfachheit der Verwendung.
Schließlich 3D-Bild acquisition ist wesentlich, um die gewünschte räumliche Information in diesen großen Zellen zu erhalten, und kann unter Verwendung einer Vielzahl von Fluoreszenzmikroskopen, wie dem Apotome Mikroskop oder Epifluoreszenz-Mikroskop mit Dekonvolution durchgeführt werden, wie der Deltavision (GEH) oder andere Mikroskope geeignet zur Bebilderung Gewebeschnitte und große (> 20 um) TGCs. Es sollte für einzelne Kopie DNA-Loci, erfasst das punktierte Signal von im Entstehen begriffenen RNA FISH oder DNA-FISH kann nicht ohne weiteres durch konfokale Mikroskopie festgestellt werden, dass nachgewiesen werden.
Abschließend sollten die Methoden, die wir hier beschreiben, nützlich sowohl für die detaillierte Analyse von TGS in einem Entwicklungskontext, sondern auch in anderen Krankheitssituationen. Viele Gene , die in TGC Entwicklung und Funktion in Nagetieren beteiligt sind , zwischen Nagern und Menschen konserviert, wie Transkriptionsfaktoren, Proteasen und Zelladhäsionsmoleküle 21. Maus TGCs sind ein Zellmodell zur Untersuchung von Genen, die Entwicklung der Plazenta eine regulierend deshalb geben Einblicke in die menschliche Plazenta-Erkrankungen. Außerdem ist es aufgrund der Tatsache, dass diese Zellen endoreplicating und da einige Krebszellen endocycle Programme greifen, zusätzlich zur Genamplifikation Verfahren werden die Methoden, die wir beschreiben, sollten auch in Einzelzell Untersuchungen hilfreich sein erforderlich Mechanismen zu erforschen führende Instabilität in Krebszellen zu genom .
Acknowledgments
Wir danken Sophie Gournet um Hilfe mit Abbildungen, Julie Chaumeil für das Manuskript zu lesen, um das Tier Gehäuse Anlage und die Imaging-Plattform des Gerätes. Diese Arbeit hat die Unterstützung im Rahmen des Programms «Investissements d'Avenir» erhielt von der Französisch Regierung ins Leben gerufen und umgesetzt von ANR mit den Referenzen ANR-10-LABX-0044 und ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, die EpiGeneSys FP7-Nr. 257082 Network of Excellence zu EH ein ERC Advanced Investigator Award Nr. 250367 und EU FP7 SYBOSS gewähren Nr. 242.129 EH Die Autoren möchten die Zell- und Gewebe Imaging Platform der Genetik und Entwicklungsbiologie Abteilung (UMR3215 / U934) des Institut Curie, Mitglied des Frankreich-Bioimaging (ANR-10-InSb-04) zu erkennen, für die Hilfe bei Licht Mikroskopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
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