Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Transcriptional विश्लेषण की नवजात आरएनए मछली द्वारा Published: August 31, 2016 doi: 10.3791/54386
Automatic Translation
1, 1
1Unité de Génétique et Biologie du Développement, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934

Abstract

अपरा एक अतिरिक्त भ्रूण वंश, ट्रोफेक्टोडर्म से निकला है। पेरी-आरोपण murine ब्लास्टोसिस्ट में, भित्ति ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं प्राथमिक trophoblast विशाल कोशिकाओं (TGCs) में अंतर है, जबकि ध्रुवीय ट्रोफेक्टोडर्म आंतरिक कोशिका द्रव्यमान overlying बाद में माध्यमिक TGCs में फर्क पैदा करने के लिए जारी है। TGCs विकासशील नाल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और एक सफल गर्भावस्था के लिए आवश्यक हैं। बाद आरोपण के विकास के दौरान विशिष्ट जीन के नियमन की जांच TGCs विकास में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं। हमल (E7-7.5) के 7-7.5 दिनों में भ्रूण से ectoplacental कोन (ईपीसी), ध्रुवीय ट्रोफेक्टोडर्म से प्राप्त कोशिकाओं, माध्यमिक TGCs 1 में अंतर है। TGCs बगल में अध्ययन किया जा सकता है, E7 में भ्रूण की cryostat वर्गों पर हालांकि TGCs की संख्या को इस स्तर पर बहुत कम है। माध्यमिक TGCs का विश्लेषण करने के वैकल्पिक साधन E7 भ्रूण से अलग-अलग निर्यात संवर्धन परिषदों के अल्पकालिक संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए हैएस। हम एक तकनीक का प्रस्ताव दोनों विवो में और सीटू संकरण (आरएनए मछली) में फ्लोरोसेंट का उपयोग कर नवजात टेप कल्पना करने के लिए एकल कोशिका के स्तर पर इन विट्रो में ब्याज की जीन के स्थिति की जांच करने के लिए। इस तकनीक जीन अभिव्यक्ति का एक सीधा readout प्रदान करता है और TGCs के गुणसूत्र स्थिति है, जो बड़ी endoreplicating कोशिकाओं रहे हैं के आकलन के लिए सक्षम बनाता है। दरअसल, TGCs के टर्मिनल भेदभाव की एक प्रमुख विशेषता यह है कि वे सेल चक्र से बाहर निकलें और endoreplication.This दृष्टिकोण के कई दौर से गुजरना autosomes और / या सेक्स क्रोमोसोम से व्यक्त किसी भी जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आवेदन किया जा सकता है और विकास में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है तंत्र के साथ ही अपरा रोगों।

Introduction

स्तनधारी trophoblast विशाल कोशिकाओं (TGCs) मातृ एवं भ्रूण के ऊतकों के बीच एक बाधा के रूप में। वे गर्भाशय में आरोपण और conceptus के आक्रमण मध्यस्थता और प्लेसेंटा के गठन के लिए विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे कई वृद्धि कारक (साइटोकिन्स) और प्रोलैक्टिन / अपरा Lactogen परिवार और स्टेरॉयड, भ्रूण के विकास और अस्तित्व के लिए आवश्यक के हार्मोन का उत्पादन। TGCs, बड़े mononucleated और polyploid एक कोशिका चक्र, endocycle, कि एस और जी के चरण बारी के होते हैं साथ कोशिकाओं रहे हैं। दरअसल, TGCs कोशिकाओं, किसी भी डिवीजन 2 के बिना डीएनए संश्लेषण के कई दौर से गुजरना करने में सक्षम endoreplicating रहे हैं। आदेश ट्रांसक्रिप्शनल अन्य भ्रूण और extraembryonic प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में vivo में जीन की स्थिति, TGCs में जांच करने के लिए, नवजात आरएनए मछली विशिष्ट बाद आरोपण चरणों में cryostat वर्गों 3 पर विवो में प्रदर्शन किया जा सकता है। TGCs उनके व्यापार के कारण वर्गों पर आसानी से पहचानने योग्य होते हैंआर बड़े आकार और उनकी transcriptional जीन गतिविधि दर्ज की जा सकती है, लेकिन जल्दी बाद आरोपण चरणों में उनकी संख्या कम है। E7 भ्रूण वर्गों पर TGCs की कमी, ट्रोफेक्टोडर्म विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन करने के क्रम में विभेदित TGCs प्राप्त करने के लिए भ्रूण trophectodermal ऊतकों की अल्पकालिक संस्कृतियों प्रदर्शन करने के लिए हमें का नेतृत्व किया। इसके अलावा, आदेश में संभव के रूप में शारीरिक रूप रहने के लिए, स्थापित सेल लाइनों यानी ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं (टीएस) स्टेम हमेशा विकास तंत्र पीढ़ी की जांच करने के माध्यमिक TGCs असामान्य जीन के कारण TGCs में दोष के साथ जुड़े रोग गर्भधारण अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान उपयुक्त नहीं हैं चूहों में विनियमन।

Ectoplacental कोन (ईपीसी) का ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं माध्यमिक TGCs 4 के पूर्ववर्ती हैं। माध्यमिक TGCs को सुसंस्कृत निर्यात संवर्धन परिषदों के सहज भेदभाव पहले से सूचित कर दिया गया है 5। हालांकि, प्राथमिक TGCs, माध्यमिक टी जी सी एडवेंचर्स पर अध्ययन करने के लिए इसके विपरीत मेंtiation presumablydue ईपीसी explants किसी भी मातृ या भ्रूण के ऊतकों का नि: शुल्क अलग-थलग करने की कठिनाइयों को सीमित बनी हुई है। हम इन तरीकों अनुकूलित, आदेश E7, एक विकासात्मक बाद आरोपण मंच है जहां TGCs बहुत कुछ कर रहे हैं, लेकिन ईपीसी व्यापारियों से उत्पन्न किया जा सकता है पर अलग-अलग भ्रूण से प्राप्त होता माध्यमिक TGCs पर आरएनए मछली प्रदर्शन करने में। परमाणु प्राथमिक टेप का विश्लेषण करने के लिए आरएनए मछली माध्यमिक TGCs पर एकल कोशिका के स्तर के स्तर पर कभी नहीं किया गया है। यह प्रतिलेखन के सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है और बाद आरोपण चरणों 3 पर TGCs के epigenetic अस्थिरता को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

स्तनधारियों में एपिजेनेटिक्स का एक क्लासिक उदाहरण, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (XCI) सुना प्रयोगशाला 6 में अध्ययन किया है। इस प्रक्रिया में महिला में 2 एक्स क्रोमोसोम के एक निष्क्रिय है। गैर-कोडिंग Xist प्रतिलेख कोट एक्स गुणसूत्र जिसमें से यह महिला कोशिकाओं में व्यक्त किया है और सबसे जीन का मुंह बंद करने से चलाता है। आरएनए मछली का उपयोग कर,एक्स से जुड़े जीन की नवजात टेप कर सकते हैं के रूप में जांच की जा सकता निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (ग्यारहवीं) पर Xist शाही सेना के संचय। हम यहाँ आरोपण के बाद भ्रूण की वर्गों पर और ईपीसी के अल्पकालिक संस्कृतियों पर आरएनए मछली प्रदर्शन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। इस प्रोटोकॉल उन है कि महिला भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और preimplantation भ्रूण 7-11 फर्क में XCI अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया से अनुकूलित। हम इन विट्रो TGCs के साथ ही इन विवो में महिला भ्रूण में XCI का उदाहरण देते हैं।

Protocol

पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी संस्थागत पशु की देखभाल के अनुसार में प्रदर्शन और Institut क्यूरी (CEEA-आईसी) प्रोटोकॉल (सी 75-05-18) का प्रयोग समिति थे। काम भी आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों (समझौता संख्या 5549CA-आई) के उपयोग के लिए उच्च शिक्षा और अनुसंधान के फ्रेंच मंत्रालय से मंजूरी के तहत आयोजित किया गया है।

1. Cryostat वर्गों की तैयारी

  1. स्वाभाविक रूप से एफ 1 C57BL / 6 एक्स डी बी / 2J चूहों ovulating शीया एट अल।, 12 में वर्णित के रूप से भ्रूण लीजिए। हमल (E7) के 7 दिन, ग्रीवा अव्यवस्था से 8-12 सप्ताह पुरानी माउस बलिदान। पूरे conceptus यानी पत्या 12 लीजिए।
  2. E7 conceptuses अलग, एक प्रकार का वृक्ष एट अल में वर्णित के रूप में।, 12। उन्हें पीबीएस युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश में रखें।
  3. cryostat वर्गों के लिए E7 माउस conceptus रुक।
    1. 1 सेमी ऊंचाई में रूपांतरित किया एल्यूमीनियम पन्नी कुओं तैयार ( 'घर में बने' एक गिलास पाश्चर रंज का उपयोग करईटी)। इस छोटे कंटेनर के तल पर ऊतक ठंड माध्यम की एक बूंद जमा। सही ओरिएंटेशन में conceptus जमा (यानी, अनुदैर्ध्य वर्गों के लिए conceptus अपने क्षैतिज अभिविन्यास में बनाए रखा जाना चाहिए)।
    2. अच्छी तरह से ऊतक ठंड मध्यम साथ conceptus युक्त भरें। फिर कुछ सेकंड के लिए तरल एन 2 में ब्लॉक विसर्जित जब तक यह सफेद बदल जाता है - ताकि इसे फ्रीज करने के लिए धीरे-धीरे अनुमति देने के लिए तरल एन 2 ऊपर वाष्प में संदंश के साथ यह निलंबित। इसके बाद डिग्री सेल्सियस -80 में एक ठंड की शीशी और दुकान में ब्लॉक हस्तांतरण (कई महीनों के लिए स्टोर कर सकते हैं)।
  4. इससे पहले क्रायो सेक्शनिंग, जमे हुए 30 मिनट के लिए cryostat में -20 डिग्री सेल्सियस पर conceptus युक्त ब्लॉक जगह है। 8 माइक्रोन मोटाई की cryosections प्रदर्शन करना। जमा 4 एक स्लाइड पर वर्गों कुशल लगाव सक्षम करने के लिए। प्लेस वर्गों एक 18 x 18 मिमी 2 coverslip के नीचे फिट करने के लिए पर्याप्त बंद करें।
  5. की गुणवत्ता की जाँचवर्गों (बरकरार है और खरोंच के बिना) और भ्रूण (अनुदैर्ध्य वर्गों) एक stereomicroscope साथ के उन्मुखीकरण और आगे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त वर्गों चुनें। जितनी जल्दी हो सके उन्हें एक Coplin जार में जमा और आरएनए मछली (3.3.2 देखें) प्रदर्शन करते हैं।

2. माध्यमिक TGCs की तैयारी

  1. Conceptus (1.1 और 1.2 देखें) अलग।
  2. काटना E7 Ectoplacental कोन (ईपीसी)
    1. एक stereomicroscope और पेट्री बाँझ पीबीएस युक्त व्यंजन का प्रयोग करें। संदंश के साथ पत्या काटना। पियर्स नमूना और खुले संदंश पत्या के दो पहलू फाड़ करने के लिए।
    2. भ्रूण बाहर खोल। एक कैंची की तरह कार्रवाई में बंद ठीक संदंश (Dumont नं 5) के सुझावों का उपयोग भ्रूण उचित से अलग करने के लिए ईपीसी। एक पूरी तरह से साफ नमूना प्राप्त करने के लिए विशेष देखभाल का प्रयोग करें, मातृ ऊतक से और साथ ही जरायु और जर्दी थैली से अलग। पीबीएस में ईपीसी explants बाहर धो लें।
    3. एक छोटे चम्मच के साथ, एक 4-wel के लिए अलग-अलग विच्छेदित ईपीसी का स्थानांतरणएल प्लेट माध्यम में एक बाँझ coverslip युक्त।
  3. निर्यात संवर्धन परिषदों अल्पकालिक संस्कृतियों से TGCs निकाले जाते हैं।
    1. coverslips युक्त 4 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें। इथेनॉल में डुबो, ज्योति सुखाने के बाद से 12 मिमी व्यास कांच coverslips दौर जीवाणुरहित।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर ईपीसी मध्यम जोड़ें (ईपीसी मध्यम: 1640 RPMI 15% एफसीएस, 0.1 मिमी 2-मर्केप्टोइथेनाल और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक)।
    3. जमा एकल, मध्यम संस्कृति के साथ साथ अच्छी तरह से में coverslip के केंद्र में विच्छेदित-निर्यात संवर्धन परिषदों। ठीक संदंश का प्रयोग गिलास coverslip पर ईपीसी लागू करने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 दिन Culturefor, 5% सीओ 2। व्यक्तिगत explant एक परिणाम है कि चपटा TGCs (2A चित्रा) की एक monolayer के रूप में फैलता रूपों।

3. आरएनए मछली

नोट:। प्रोटोकॉल Chaumeil एट अल, 8 और Pollex और हर्ड 13 में (ESCs) भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए वर्णित उन लोगों पर आधारित हैं।

  1. उन्नत Prepaशेयर समाधान के राशन
    1. एक 3M सोडियम एसीटेट बफर पीएच 5.2 से तैयार करें।
    2. 2x संकरण 40% से युक्त बफर तैयार (डब्ल्यू / वी) सोडियम सल्फेट dextran, 20x बीएसए, 4x खारा सोडियम साइट्रेट में 400 मिमी vanadyl Ribonucleoside कॉम्प्लेक्स (वीआरसी) (एसएससी)।
    3. बढ़ते मध्यम 90% (वी / वी) ग्लिसरॉल, 0.1% से युक्त तैयार (w / v) पी-PHENYLENEDIAMINE, पीबीएस में 9 पीएच।
  2. हौसले से तैयार समाधान
    1. लगानेवाला 3% हौसले से तैयार paraformaldehyde पीबीएस में (पीएफए) से मिलकर समाधान तैयार है। permeabilization पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 युक्त समाधान तैयार 2 मिमी वीर चक्र के साथ पूरक। और 50% formamide (एफए) और 2x एसएससी के मिश्रण से धो बफर तैयार 7.2-7.4 पीएच को समायोजित करें।
    2. डीएनए जवाबी धुंधला 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) 2x एसएससी में से मिलकर समाधान तैयार है।
  3. फिक्सेशन और Permeabilization मछली के लिए तैयारी में
    1. coverslips पर कोशिकाओं के लिए, 5 मीटर के लिए 1x पीबीएस में कोशिकाओं को धोनेमें।, स्लाइड पर coverslips, या भ्रूण वर्गों पर कोशिकाओं को ठीक लगानेवाला में 10 मिनट (3% पीएफए) आरटी पर समाधान के लिए।
    2. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं तीन बार कुल्ला। बर्फ पर ठंडा permeabilization समाधान में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize। कोशिकाओं को 70% इथेनॉल के साथ तीन बार धोएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 अच्छी तरह प्लेटों में स्टोर coverslips और 70% इथेनॉल में 4-स्लाइड परिवहन बॉक्स में स्लाइड।
      नोट: coverslips और स्लाइड -20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है। प्लेट्स और उन्हें युक्त बक्से इथेनॉल वाष्पीकरण से बचने के लिए parafilm के साथ सील किया जाना है।
  4. डीएनए जांच लेबलिंग
    1. फ्लोरोसेंट न्यूक्लियोटाइड का उपयोग कर निक अनुवाद के द्वारा डीएनए जांच के लेबल। निर्माता के निर्देशों (1 टेबल देखें) का पालन करें 8।
    2. एक 50 μl प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए, (डीएनए प्रवर्धन के लिए; 3.4.4 देखें) 1-2 प्लाज्मिड की माइक्रोग्राम, जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) या एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) जोड़ने के लिए, 17.5 μl पानी के लिए डीएनए 2.5 μl 0.2 मिमीSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 μl 10 मिमी प्रत्येक dNTP मिश्रण (dGTP, dATP, dCTP), 5 μl 10 मिमी dTTP, 5 μl 10x निक अनुवाद बफर और 8 μl निक अनुवाद एंजाइम।
    3. अंधेरे में 15 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए सेते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंड से प्रतिक्रिया निष्क्रिय। -20 डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए स्टोर जांच।
    4. एमडीए
      नोट: बीएसी डीएनए के लिए, शास्त्रीय तैयारी के बाद प्राप्त डीएनए की मात्रा कम है, इसलिए एक डीएनए प्रवर्धन की एक कदम लेबलिंग से पहले एमडीए का उपयोग करके उपयोग कर सकते हैं। एक वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों (1 टेबल देखें) का पालन करें।
    5. 9.5 μl नमूना बफर के साथ मिक्स 0.5 μl बीएसी डीएनए। 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट गरम करें। बर्फ पर तुरंत बुझा लेते हैं; बर्फ 10 मिनट के लिए छोड़ दें। प्रतिक्रिया बफर / एंजाइम मिश्रण तैयार करें: (9.5 μl + 0.5 μl एंजाइम मिश्रण) और बर्फ पर रख।
    6. 10 μl डीएनए मिश्रण + 10 μl प्रतिक्रिया बफर / एंजाइम मिश्रण मिलाएं। 30 डिग्री सेल्सियस कम से कम 20 घंटा पर सेते हैं। 65 & # पर 10 मिनट हीटिंग नमूना द्वारा एंजाइम निष्क्रिय176, सी। 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कूल नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले।
    7. पाचन द्वारा एमडीए की जाँच करें। 1 μl एमडीए, 2 μl 10x बफर, 2 μl हिंद तृतीय और 15 μl एच 2 ओ जोड़े 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं। सटीक डीएनए प्रवर्धन की पुष्टि के लिए एक 0.8-1% agarose जेल पर धीरे चलाने के लिए। उच्च आणविक भार के स्पष्ट डीएनए टुकड़े जेल पर मनाया जाना चाहिए।
  5. जांच तैयारी
    1. coverslip या स्लाइड प्रति 0.1 या 1 माइक्रोग्राम जांच का प्रयोग करें।
      नोट: खटिया -1 डीएनए के 2-5 माइक्रोग्राम जोड़े यदि प्रतियोगिता की आवश्यकता है जैसे, सबसे जांच के रूप में वे दोहराने दृश्यों जो अन्यथा पार संकरण होते हैं और पृष्ठभूमि में वृद्धि कर सकते हैं।
      1. वर्षा के लिए, 5 माइक्रोग्राम सामन शुक्राणु डीएनए, 1/10 मात्रा 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.2 और 3 मात्रा में इथेनॉल जोड़ें। 16,000 XG पर स्पिन और 25 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस। 70% इथेनॉल के साथ छर्रों धो और 5 मिनट के लिए फिर से नीचे स्पिन।
    2. एक concentrator / स्पीड VAC में 2 मिनट के लिए सूखी गोली। 100% रूप में Resuspendएमाइड आधी मात्रा संकरण के लिए आवश्यक में (जैसे, coverslip के लिए 2.5 μl या स्लाइड पर भ्रूण वर्गों के लिए 7 μl)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के एक thermomixer में झटकों के साथ रखें। 75 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए denature।
    3. बर्फ पर बुझा लेते हैं, या यदि प्रतियोगिता 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे डाल आवश्यक है। 2x संकरण समाधान के एक बराबर मात्रा के साथ जांच के समाधान मिश्रण।
  6. संकरण और Washes
    1. निर्जलीकरण; 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x 80%, 95% 1x और 2x 100% इथेनॉल में कुओं में coverslips और स्लाइड एक Coplin जार में, अनुक्रमिक धोने से। सूखी coverslips और स्लाइड पूरी तरह से।
    2. संकरण के लिए, संकरण मिश्रण में सामना करना पड़ रहा कोशिकाओं के साथ एक स्लाइड पर 5 μl जांच संकरण मिश्रण (3.5 देखें) लागू करते हैं और coverslip कम। स्लाइड पर वर्गों के लिए लागू होते हैं, 14 μl जांच संकरण मिश्रण (3.5 देखें) और एक 18 x 18 मिमी 2 coverslip के साथ कवर।
    3. एक नम कक्ष में जगह स्लाइड (टिशू पेपर में भिगो50% एफए / 2x एसएससी) और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, अंधेरे में।
    4. पोस्ट-संकरण Washes:
      1. स्लाइड यह ढीला करने पर coverslip पर 50% एफए / 2x एसएससी के 1 मिलीलीटर जोड़ें; स्लाइड से ध्यान हटाने और coverslip यह सेल साइड अप जगह एक 4 अच्छी तरह से थाली में 50% एफए / 2x एसएससी युक्त (कोशिकाओं परिमार्जन करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है)। स्लाइड पर वर्गों के लिए, एक समान तरीके से coverslip हटाने और 50% एफए / 2x एसएससी युक्त एक Coplin जार में स्लाइड जगह।
      2. 3 washes, प्रत्येक 7 मिनट के लिए पूर्व गर्म 50% एफए / 2x एसएससी के साथ 42 डिग्री सेल्सियस या 44 डिग्री सेल्सियस पर coverslip या स्लाइड के लिए क्रमश: प्रदर्शन करना।
      3. 3 washes पूर्व गर्म 2x एसएससी के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए 42 डिग्री सेल्सियस या 44 डिग्री सेल्सियस पर coverslip या स्लाइड के लिए क्रमश: प्रदर्शन करना।
    5. आरटी पर 3 मिनट के लिए 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI के साथ 2x एसएससी में धोने से नाभिक Counterstain। 2x एसएससी के साथ दो बार कुल्ला।
  7. Coverslips और स्लाइड के बढ़ते
    1. सुसंस्कृत TGCs से छोटे coverslip के लिए लागू होते हैं, 5 & #181, एल एक स्लाइड पर बढ़ते मध्यम। coverslip सेल साइड बूंद के शीर्ष पर नीचे रखें।
    2. वर्गों के साथ स्लाइड के लिए, बढ़ते स्लाइड पर मध्यम 15 μl लागू होते हैं। बूंद के शीर्ष पर एक 22 x 22 मिमी 2 coverslip रखें।
    3. बुलबुले से बचें। अतिरिक्त बढ़ते समाधान से साफ कर लें। नेल पॉलिश की एक छोटी राशि के साथ coverslip सील। यदि संभव हो तो, छवि -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत या दुकान के लिए स्लाइड कई महीनों के लिए।

4. माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण

  1. 0.3 माइक्रोन में 3 डी अनुक्रमिक z अक्ष छवियों का मोल एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (63X उद्देश्य) का उपयोग और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 14 3 डी छवि के ढेर का विश्लेषण करते हैं।

Representative Results

TGCs conceptus में अपने स्थानीयकरण और उनके बड़े आकार के कारण DAPI धुंधला पर E7 वर्गों पर पहचाना जा सकता है। यह एक अनुदैर्ध्य खंड पर चित्रा 1 ए में सचित्र है। आरएनए मछली इस अतिरिक्त भ्रूण वंश में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता का अध्ययन करने के क्रम में इस तरह के भ्रूण वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था।

कई स्लाइड या coverslips एक ही समय में कार्रवाई की जा सकती। विभिन्न जीनों की शाही सेना लेबल करने के लिए विभिन्न रंगों का उपयोग करके, एक ही नाभिक में विभिन्न प्राथमिक टेप पता लगा सकते हैं। कम से कम 2 जांच, एक साथ मिलाया जा सकता है के लिए उदाहरण Xist एसजी (हरी झंडी) और Atrx एसआर (रेड सिग्नल) के लिए मिलकर करने के लिए मिलकर। एक महिला टी जी सी का एक उदाहरण चित्रा 1 बी जहां 2 अन्य प्रजातियों प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, भ्रूण समुचित (ई) और आंत एण्डोडर्म (VE) में दिखाया गया है। एक टी जी सी नाभिक Xist आरएनए एक्स क्रोम कवर करने के साथ दिखाया गया हैosome जो निष्क्रिय है (ग्यारहवीं), जबकि अन्य एक्स गुणसूत्र जो सक्रिय है (XA) में कुछ pinpoints प्रदर्शित करता है। एक्स से जुड़े जीन Atrx प्राथमिक टेप सक्रिय एक्स गुणसूत्र (नहीं Xist से सजाया) endoreplication के कारण कई प्रतियों में से व्यक्त कर रहे हैं। इस monoallelic अभिव्यक्ति जैसे, एक एक्स गुणसूत्र पर Atrx की निष्क्रियता को दिखाता है।

के रूप में चित्रा 2 बी में सचित्र के बाद TGCs आकार में विषम हैं, केवल सबसे बड़े लोगों के दर्ज हैं। के रूप में माध्यमिक TGCs के लिए चित्रा -2 में सचित्र तीन जांच भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, Xist -SG (हरा), दो एक्स से जुड़े जीन: G6PD -SR (लाल) और Huwe1 -Cy (मैजंटा) एक ही नाभिक में एक ही समय में विश्लेषण किया गया। जबकि G6PD monoallelically रूप में यहाँ दिखाया व्यक्त (और पहले माध्यमिक TGCs में दिखाया गया है 3) है Huwe1 biallelically अपने जनसंपर्क का प्रदर्शन व्यक्त किया हैoperty XCI बचने के लिए। Endoreplication, कई pinpoints यानी, नवजात टेप प्रतियों के साथ, यह भी स्पष्ट है।

आकृति 1
E7 मादा भ्रूण अनुभाग से TGCs में चित्रा 1. प्राथमिक प्रतिलिपि अभिव्यक्ति। (ए) E7 conceptus DAPI के साथ दाग के अनुदैर्ध्य अनुभाग। भ्रूण और अतिरिक्त भ्रूण ऊतकों मां ऊतक, पत्या से घिरे हैं। विभिन्न प्रजातियों के स्थानीयकरण 5X उद्देश्य से DAPI धुंधला पर किया जाता है। TGCs अपने बड़े आकार के कारण पहचाने जाते हैं। चौधरी, जरायु, ई, भ्रूण, ईपीसी, ectoplacental शंकु, VE, आंत एण्डोडर्म, टी जी सी, trophoblast विशाल कोशिकाओं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। हरे रंग में (बी) ए (63X उद्देश्य) में बॉक्सिंग में क्षेत्र के उच्च बढ़ाई आरएनए मछली। Atrx प्राथमिक प्रतिलिपि लाल और Xist शाही सेना में 3 प्रजातियों = ई पर कल्पना कर रहे हैं, VE, टी जी सी। सुप्रीम कोर्टशराब बार 10 माइक्रोन =। एक विवो टी जी सी जहां Atrx monoallelically व्यक्त किया जाता है (Xa, नोक) और चुप Xist लेपित एक्स गुणसूत्र पर (ग्यारहवीं) का उदाहरण है; कई Atrx संकेतों Xa पर देखा endoreplication के कारण हैं। Atrx = बीएसी क्लोन RP23-260I15। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा ईपीसी से प्राप्त होता माध्यमिक TGCs में 2. प्राथमिक प्रतिलिपि अभिव्यक्ति। (ए) माध्यमिक TGCs (x5 उद्देश्य) बढ़ रही है की सामान्य दृश्य। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी) Asterisk उनके आकार (10X उद्देश्य) के अनुसार TGCs के उदाहरण का संकेत मिलता है। स्केल बार = 60 माइक्रोन। (सी) एक माध्यमिक महिला 3 जांच के उपयोग के साथ टी जी सी आरएनए मछली का उदाहरण (Xist Domaशी) G6PD और Huwe1 प्राथमिक टेप की endoreplication दिखा (कई pinpoints, लाल और मैजेंटा) में: हरे रंग में, निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र को कवर करने में। G6PD monoallelically व्यक्त किया है, वहीं Huwe1 अभिव्यक्ति इस नाभिक में biallelic है Huwe1 = बीएसी क्लोन RP24-157H12;। G6PD = बीएसी क्लोन RP23-13D21। शी = तीर; Xa = नोक (63X उद्देश्य)। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

नवजात आरएनए मछली विभिन्न विकासात्मक चरणों में भ्रूण के ऊतकों में transcriptional गतिविधि के एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एक आसान और संवेदनशील विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस दृष्टिकोण की शक्ति रूपात्मक मापदंड के अनुसार किसी विशेष स्तर पर अलग भ्रूण प्रजातियों की पहचान करने की क्षमता है। हालांकि यह भी जरूरी है कि कम से कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मौजूद है। इस तरह के किसी भी पृष्ठभूमि अलग भ्रूण क्षेत्रों और प्रकार की कोशिकाओं को चुनौती देने की पहचान प्रदान करता है। कम से कम पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए, वहाँ इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। पहले cryosection की गुणवत्ता है और दूसरी आरएनए मछली है, जो जीन अभिव्यक्ति के स्तर पर और जांच की गुणवत्ता पर निर्भर करता है की दक्षता (शोर अनुपात करने के लिए संकेत) है। बाद के लिए, जांच इसलिए हमेशा संवर्धित कोशिकाओं पर coverslips (भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं या दैहिक कोशिकाओं) वर्गों पर उपयोग करने से पहले पर परीक्षण कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम वें प्रदानई तकनीक नमूना तैयार करने के दो अलग अलग प्रकार (cryostat वर्गों और भ्रूण explants की प्राथमिक संस्कृतियों) से TGCs पर आरएनए मछली विश्लेषण करने की आवश्यकता है। इस तरह के एकल कक्ष विश्लेषण विभिन्न बाद आरोपण चरणों में जीन अभिव्यक्ति में गतिशील परिवर्तन का आकलन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है।

हम तरीकों माध्यमिक TGCs उत्पन्न करने के लिए (E7-7.5 बाद आरोपण चरणों में) का वर्णन हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया एक अतिरिक्त भ्रूण वंश जो बाद आरोपण चरणों में TGCs का गठन किया है एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता पैटर्न का अध्ययन करने के लिए। मूषक में अतिरिक्त भ्रूण विकास TGCs के भेदभाव पर निर्भर करता है। दरअसल, TGCs अपरा और इस प्रकार भ्रूण के विकास के लिए आवश्यक हैं। टी जी सी भेदभाव में दोष भ्रूण मारक (समीक्षा के लिए संदर्भ में 15 देखें) के कारण। TGCs के Transcriptional गतिविधि आरएनए मछली का उपयोग कर हमें माउस विकास 3 के दौरान इस तरह के सेल प्रकार के एक असामान्य एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता स्थिति प्रदर्शित करने के लिए अनुमति दी।

इन विवो TGCs में और इन विट्रो TGCs ईपीसी explant से निकाली गई विभिन्न जीन के गतिविधि का आकलन करने के लिए अनुमति जंगली प्रकार माउस भ्रूण का उपयोग शामिल किया गया। इस विधि ट्रांसजेनिक चूहों और / या संस्कृति के माध्यम में अवरोध अणुओं के अलावा द्वारा विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है। हम सफलतापूर्वक इस तरह के प्राथमिक TGCs जो माउस के विकास, E3.0 blastocyts के पहले चरण में दिखाई देते हैं, जो 4-5 दिन के दौरान जो परिणाम विकसित की है, के लिए व्यक्तिगत रूप से संवर्धित किया जा सकता है, TGCs का एक और प्रकार पर आरएनए मछली के इस विधि का इस्तेमाल किया है आईसीएम बड़े प्राथमिक TGCs 16,17 से घिरा रहा है। अलग करने के लिए नवजात टेपजीन के रूप में अच्छी तरह से Xist के रूप में कल्पना की और एक ही आरएनए मछली दृष्टिकोण 3 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस और आरएनए मछली भी इन विट्रो सुसंस्कृत TGCs 3 के रूप में रूप में अच्छी तरह cryostat वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। यह दर्शाता है कि विधि काफी मजबूत है, के रूप में प्राथमिक टेप अत्यधिक क्षरण करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और वहाँ RNase मुक्त यौगिकों के एक परम आवश्यकता है। यदि / आरएनए मछली प्रतिलेखन के स्तर, सेलुलर स्थानीयकरण और प्रोटीन अभिव्यक्ति, एक साथ एक दिया सेल में के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, आयल एम्बेडेड ऊतक के कुछ वर्गों में पहले मानव ट्यूमर में नवजात आरएनए का पता लगाने के लिए है जबकि, ऊतक आकृति विज्ञान 18 को बनाए रखने के लिए हमारे हाथ में इस्तेमाल किया गया है, cryostat वर्गों दोनों नवजात शाही सेना और epitopes immunofluorescence दौरान एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक संरक्षण के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।

आरएनए मछली के लिए इसके अलावा, निम्न immunofluorescence, गुणसूत्र डीएनए मछली भी fluorochromes, आरएनए मछली 3 के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए समान के साथ लेबल जांच का उपयोग माध्यमिक TGCs पर प्रदर्शन किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट जांच या तो plasmids / fosmids या बेक्स, के रूप में यहां इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट dUTPs के साथ लेबल, और Chaumeil एट अल।, 8 में वर्णित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, fluorescently लेबल ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स 19 का इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि डीएनए मछली कतरा-विशिष्टता की आवश्यकता नहीं है, oligonucleotide जांच लक्ष्य क्षेत्र में दो पूरक किस्में दोनों में से किसी को निशाना बनाया जा सकता है। शाखित डीएनए जांच, जहां संकेत प्रवर्धन विशिष्ट और एम्पलीफायर जांच के दो अनुक्रमिक दौर से हासिल की है भी मछली संकेतों 20 का संकेत करने वाली शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के riboprobes रूप में शाही सेना जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हमारे डीएनए आधारित जांच में संकेत गुणवत्ता, विशिष्टता और उपयोग में आसानी के बीच बेहतर तालमेल की गारंटी।

अंत में, 3 डी छवि अधिग्रहणपर इन बड़े कोशिकाओं में आवश्यक स्थानिक जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, और इस तरह के DeltaVision (GEH) के रूप में इस तरह के Apotome माइक्रोस्कोप के रूप में प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, या deconvolution साथ epifluorescence माइक्रोस्कोप की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, या अन्य उपयुक्त माइक्रोस्कोप इमेजिंग ऊतक वर्गों, और बड़े के लिए (> 20 माइक्रोन) TGCs। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक प्रति डीएनए लोकी के लिए, कबरा नवजात आरएनए मछली या डीएनए मछली द्वारा पता लगाया संकेत आसानी से confocal माइक्रोस्कोपी से नहीं पाया जा सकता है।

अंत में, तरीकों हम यहाँ वर्णन उपयोगी दोनों एक विकासात्मक संदर्भ में TGS का विस्तृत विश्लेषण के लिए, लेकिन यह भी अन्य बीमारी की स्थिति में होना चाहिए। कई जीनों कि कृन्तकों में टी जी सी के विकास और समारोह में शामिल कर रहे हैं इस तरह के प्रतिलेखन कारक, proteases और सेल आसंजन अणुओं के रूप में 21 मूषक और मनुष्यों के बीच संरक्षित कर रहे हैं। माउस TGCs का अध्ययन जीन है कि अपरा विकास एक को विनियमित करने के लिए एक सेल मॉडल हैंडी इसलिए मानव अपरा रोगों में अंतर्दृष्टि दे। इसके अलावा, इस तथ्य के कारण है कि इन कोशिकाओं endoreplicating कर रहे हैं और कुछ के बाद से कैंसर की कोशिकाओं को endocycle कार्यक्रमों संलग्न हैं, जीन प्रवर्धन प्रक्रियाओं के अलावा, विधियों का वर्णन हम भी एकल कोशिका कैंसर की कोशिकाओं में अस्थिरता जीनोम को अग्रणी तंत्र का पता लगाने के लिए आवश्यक जांच में मददगार होना चाहिए ।

Acknowledgments

हम चित्र के साथ मदद के लिए सोफी Gournet धन्यवाद, पांडुलिपि, पशु आवास सुविधा और यूनिट के इमेजिंग मंच पढ़ने के लिए जूली Chaumeil। इस काम के तहत कार्यक्रम «INVESTISSEMENTS डी Avenir» समर्थन प्राप्त संदर्भों ANR-10-LABX-0044 और ANR-10-IDEX-0001-02 पीएसएल, EpiGeneSys FP7 कोई साथ फ्रेंच सरकार द्वारा शुरू की और ANR द्वारा लागू किया गया है। एह करने के लिए उत्कृष्टता के 257,082 नेटवर्क, एक ईआरसी उन्नत अन्वेषक कोई पुरस्कार। 250367 और यूरोपीय संघ के FP7 SYBOSS कोई अनुदान। 242129 एह लेखकों प्रकाश के साथ मदद के लिए संस्थान क्यूरी, फ्रांस-Bioimaging (ANR-10-InSb-04) के सदस्य की आनुवंशिकी और विकास जीवविज्ञान विभाग (UMR3215 / U934) की सेल और ऊतक इमेजिंग मंच स्वीकार करना चाहते हैं माइक्रोस्कोपी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon SMZ 1500
Stereomicroscope Zeiss Stemi SV6
Scissors Pascheff-Wolff Moria MC19
Dumont #5 forceps Roth PK78.1
4-well tissue culture dishes  Nunc 176740
60 mm Petri dishes Falcon Dutsher, France 353004
100 mm Petri dishes Falcon Dutsher, France 353003
Coverslips 18 mm x 18 mm  VWR 631-1331
Coverslips 22 mm x 22 mm VWR 631-0125
12 mm glass round coverslips  Harvard apparatus 64-0712
Slides Superfrost plus VWR 631-9483
4-slide Transport  box  Lockmailer Dutsher, France 40684
Cryotubes 1.8 ml Corning  Fisher Science 10418571
Glass Coplin staining jars Fischer Scientific W1561L
TissueTek O.C.T compound VWR 4583
RPMI 1640 medium Invitrogen 61870
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D1408 10x  is used
Water  Sigma-Aldrich W3500
Paraformaldehyde  Panreac Quimica, Spain 141451 3% in PBS
Triton-X-100   Euromedex  2000-A 0.5% final
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)  New England Biolabs, USA S1402S
Sodium dextran sulfate  Sigma-Aldrich D8906
Bovine serum albumin  (BSA) New England Biolabs, USA B9001S
Formamide Sigma-Aldrich 47671-1L-F  aliquots kept at -20 °C
Illustra TempliPhi  Kit Construct (Kit MDA) Dutsher, France 25-6400-80
Nick translation kit Abbott, USA 07J00-001
20x SSC buffer concentrate Sigma-Aldrich  S6639
Spectrum green dUTP  Abbott, USA 02N32-050
Spectrum red dUTP  Abbott, USA 02N34-050
Cy-5 dUTP  Dutsher, France PA55022
Mouse Cot-1 DNA  Invitrogen 18440016
DNA, MB grade Invitrogen Roche DNA from fish sperm
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride  Sigma-Aldrich D9564 DAPI
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
p-phenylenediamine Sigma-Aldrich 695106
Centrifuge 5417R Eppendorf, Germany molecular biology grade
Eppendorf concentrator plus Eppendorf
Eppendorf Thermomixer comfort Eppendorf
Liquiport Liquid pump KNF Neuberger, Trenton, USA
Shake'N'Bake Hybridization oven Boekel Scientific, USA
Cryostat  Leica CM3050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
  2. Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
  3. Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
  4. Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
  5. El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
  6. Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
  7. Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
  8. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
  9. Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
  10. Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
  11. Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
  12. Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
  13. Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  15. Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, Suppl A. 4-9 (2008).
  16. Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
  17. Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
  18. Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
  19. Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
  20. Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
  21. Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 114 Ectoplacental कोन नवजात प्रतिलिपि आरएनए प्रतिदीप्ति माउस विकास ट्रोफोब्लास्ट विशाल कोशिकाओं भ्रूण cryostat अनुभाग
Transcriptional विश्लेषण की नवजात आरएनए मछली द्वारा<em&gt; Vivo</em&gt; ट्रोफोब्लास्ट विशाल कोशिकाओं या<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Ectoplacental कोन Explants के लघु अवधि के संस्कृति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corbel, C., Heard, E.… More

Corbel, C., Heard, E. Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants. J. Vis. Exp. (114), e54386, doi:10.3791/54386 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter