Abstract
Plasenta bir ekstra-embriyonik soyundan, ilkel trofoblast türemiştir. iç hücre kütlesi örten kutup trofoektoderm sonra ikincil TGCs içine farklılaşma çoğalmaya devam ederken peri-implantasyon fare blastosist olarak, duvar trofoektoderm hücreleri birincil trofoblast dev hücreler (TGCs) içine ayırt. TGCs olan plasentadan önemli bir rol oynayabilir ve başarılı bir gebelik için gereklidir. implantasyon sonrası gelişimi sırasında spesifik genlerin transkripsiyonel regülasyonu İncelenmesi TGCs gelişimi anlayışlar verebilir. Kutup ilkel trofoblast türetilen gebelik (E7-7.5) arasında 7-7.5 gün embriyolardan ectoplacental koni (EPC), hücreleri, ikincil TGCs 1 içine ayırt. TGCs sayısı, bu aşamada çok düşük olmasına rağmen TGCs E7 embriyo kriyostat kesitleri üzerinde in situ olarak incelenebilir. İkincil TGCs analiz için alternatif bir yöntem E7 embriyo bireysel EPC kısa dönem kültürleri kullanmaktırs. Biz in vivo ve doğmakta olan transkript görselleştirmek için in situ hibridizasyon (RNA FISH) floresan kullanılarak tek hücre düzeyinde in vitro hem de ilgi genlerin transkripsiyonel durumunu araştırmak için bir teknik önermek. Bu teknik, gen ekspresyonunun doğrudan okunmasını sağlar ve büyük endoreplicating hücreleridir TGCs kromozomal durumu değerlendirilmesini sağlar. Gerçekten de, TGCs farklılaşması önemli bir özelliği, hücre döngüsü çıkıp endoreplication.This yaklaşım birden fazla tur tabi otozomal ve / veya cinsiyet kromozomları ifade edilen herhangi bir genin ekspresyonunu tespit etmek için uygulanabilir ve gelişim ilgili önemli bilgiler sağlar olmasıdır mekanizmaları olarak plasental hastalıklar.
Introduction
Memeli trofoblast dev hücreler (TGCs) anne ve embriyonik dokular arasında bir bariyer oluşturur. Onlar rahim içine implantasyonu ve gebeliğin işgali aracılık ve plasenta oluşumu için gelişiminde kritik rol oynamaktadır. Onlar birkaç büyüme faktörleri (sitokinler) ve embriyonik büyüme ve hayatta kalmak için gerekli Prolaktin / plasenta laktojeni ailesi ve steroidler, hormonları üretir. TGCs ve G, değişken fazlarda ardışık oluşan bir hücre döngüsü, endocycle olan hücreleri, büyük tek çekirdekli ve poliploid bulunmaktadır. Gerçekten de, TGCs bir bölme 2 DNA sentez birden fazla tur geçmesi mümkün hücreleri endoreplicating edilir. Diğer embriyonik ve extraembryonic hücre tipleri ile karşılaştırıldığında TGCs in vivo genlerin transkripsiyonel durumunu incelemek için, Yeni oluşan RNA FISH implantasyon sonrası aşamalarında kriyostat kesitleri 3, in vivo olarak gerçekleştirilebilir. TGCs nedeniyle thei için bölümlerinde kolayca tanınabilirr büyük boyutlu ve transkripsiyonel gen aktivitesi kaydedildi ancak erken post-implantasyon aşamalarında onların sayısı düşüktür edilebilir. E7 embriyonik bölümlerde TGCs azlığı, trofoektoderm gelişimi sırasında gen ifadesinin düzenlenmesi incelemek için farklılaştırılmış TGCs elde etmek embriyonik trophectodermal dokuların kısa vadeli kültürleri gerçekleştirmek için götürdü. yani trofoektoderm hücreleri (TS) kök Ayrıca, sırayla mümkün olduğunca fizyolojik olarak kalması, kurulan hücre hatları ikincil TGCs nedeniyle anormal gene TGCs hatalarına ile ilişkili patolojik gebelik incelemek için değerli bir araç sağlamak gelişim mekanizmaları Nesil araştırmak için her zaman uygun değildir farelerde düzenleme.
Ectoplacental koni (EPC) trofoblast hücrelerin ikincil TGCs 4 öncüleridir. İkincil TGCs için kültür EPC spontan farklılaşma daha önce 5 bildirilmiştir. Ancak, birincil TGCs, ikincil TGC Farkli çalışmalarının aksinesokan presumablydue maternal veya embriyonik dokularda serbest EPC eksplantlar izole zorluklara, sınırlı kalmıştır. Biz E7, TGCs çok az, ancak EPC öncüleri elde edilebilir gelişimsel implantasyon sonrası aşamasında tek tek embriyodan türetilen ikincil TGCs ilgili RNA FISH gerçekleştirmek için, bu yöntemler adapte. Nükleer birincil transkript analiz RNA BALIK ikincil TGCs üzerinde tek hücre düzeyinde seviyesinde hiç yapılmamıştı. Bu transkripsiyon hassas analiz izin verir ve implantasyon sonrası aşamada 3'te TGCs epigenetik instabilite göstermek için kullanılmıştır.
Memelilerde epigenetik klasik bir örneği, X kromozomu inaktivasyonu (XCI) Heard laboratuarında 6 incelenmiştir. Bu işlemde dişi 2 X kromozomu bir inaktive edilir. Xist transkript kat bunun bir kadın hücrelerinde ifade edilir ve en çok genin susturulması tetikler edildiği X kromozomu kodlayıcı olmayan. RNA, FISH kullanılarak,X'e bağlı genlerin olgunlaşmamış transkript olabildiğince incelenebilir inaktif X kromozomu (Xi) üzerine Xist RNA birikimi. Biz burada post-implantasyon embriyoların bölümlerinde ve EPC kısa vadeli kültürleri üzerinde RNA FISH gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Kadın embriyonik kök hücreleri ve preimplantasyon embriyolar 7-11 ayırıcı XCI incelemek için kullanılan edilenler uyarlanan Bu protokol. In vitro TGCs, hem de in vivo olarak bir kadın embriyolar XCI örnekler verilmektedir.
Protocol
Hayvan prosedürleri onaylı kurumsal hayvan bakımı göre yapılan ve Institut Curie (CEEA-IC) protokolleri (C 75-05-18) komitesini kullanmak bulundu. çalışmaları da Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar (anlaşma numarası 5549CA-I) kullanımı için Yükseköğretim ve Araştırma Fransız Bakanlığı onayı altında yapılmıştır.
Kriyostat Bölüm 1. hazırlanması
- Shea ve arkadaşları., 12 de tarif edildiği gibi, doğal olarak F1 C57BL / 6 x DBA / 2J fareler yumurtlama embriyolar toplayın. gebelik (E7) 7. gününde, servikal dislokasyon ile 8-12 haftalık fare kurban. Tüm konseptus yani desidua 12 toplayın.
- Shea ve arkadaşları de tarif edildiği gibi, E7 conceptuses izole edin. 12. PBS içeren bir 60 mm Petri kabı koyun.
- kriyostat bölümleri için E7, fare konseptus dondurun.
- 1cm yüksekliğinde uyarlanmış alüminyum folyo kuyuları hazırlayın ( 'ev yapımı' bir cam Pasteur pip kullanarakEt). bu küçük kabın altındaki doku dondurma orta bir damla bırakın. Doğru yönde konseptus birikintisi (örn, boyuna kesitler için konseptus yatay oryantasyonda muhafaza edilmelidir).
- Doku ortamı dondurma iyi içeren konseptus doldurun. Daha sonra, beyaz olana kadar bir kaç saniye için sıvı N2 içinde blok daldırın - yavaş yavaş dondurma izin vermek için sıvı N2 üzerindeki buhar forseps ile askıya alınması. Daha sonra, (bir kaç ay için depolayabilir) -80 ° C'de bir dondurucu şişe ve deposuna blok aktarın.
- kriyo-ayırma önce, 30 dakika süre ile kriyostat -20 ° C'de konseptus içeren dondurulmuş blok yerleştirin. 8 mikron kalınlığında cryosections gerçekleştirin. bir slayt Mevduat 4 bölümler verimli eki sağlamaktır. Yeri bölümleri 18 x 18 mm 2 lamel altına sığacak kadar kapatın.
- kalitesini kontrol edinBölümler (sağlam ve çizilmelere olmaksızın) ve bir stereomikroskop ile embriyo (boyuna kesit) yönlendirilmesi ve daha fazla analiz için müsait bölümler seçin. Mümkün olduğu kadar çabuk bir coplin kavanoza onları yatırmak ve RNA FISH (3.3.2 bakınız) gerçekleştirin.
İkincil TGCs 2. hazırlanması
- Conceptus (1.1 ve 1.2) izole eder.
- E7 Ectoplacental Cone (EPC) teşrih
- Stereomikroskopta ve steril PBS içeren Petri kapları kullanın. forseps ile desidua teşrih. Pierce örnek ve açık forseps ayrı desidua iki yakasını gözyaşı.
- embriyo dışarı kabuk. Bir makas benzeri eylem kapalı ince forseps (Dumont No. 5) kullanılması uçları uygun embriyo EPC ayırmak için. Anne dokusundan yanı sıra koryon ve yolk kesesi ayrı, mükemmel temiz numune elde etmek için özel dikkat gösterin. PBS EPC eksplantlar yıkayın.
- Biraz kaşıkla, bir 4-wel bireysel Diseke EPC transferiorta steril lamel içeren l plaka.
- EPC Kısa vadeli Kültürler gelen TGCs türevi.
- lamelleri içeren 4-oyuklu plakalar hazırlamak. alev sonra kurutma, etanol içinde daldırarak cam lameller hafta 12 mm çaplı sterilize edin.
- Her bir oyuğa 0.5 ml EPC orta ekleyin (EPC ortamı: RPMI 1640,% 15 FCS, 0.1 mM 2-mersaptoetanol ve antibiyotik ile takviye edilmiştir).
- Deposit, tek bir kültür ortamı ile birlikte iyi olarak lamel merkezinde kesilerek-EPC. cam lamel üzerinde EPC uygulamak için ince forseps kullanın. 37 ° C'de 3-5 gün Culturefor,% 5 CO2. Bağımsız eksplant düzleştirilmiş TGCs (Şekil 2A) bir tek tabaka olarak yayılan bir gelişimini oluşturur.
3. RNA BALIK
Not:. Protokolleri Chaumeil ve arkadaşları, 8 ve baş ve duyulan 13 (ESCs) embriyonik kök hücreleri için tarif edilen dayanmaktadır.
- Gelişmiş PrepaStok Çözümleri rasyon
- 3M sodyum asetat tamponu pH 5.2 hazırlanır.
- % 40 ihtiva eden 2 x hibridizasyon tamponu hazırlayın sodyum dekstran sülfat, 20x BSA (w / v) 4x Tuzlu sodyum sitrat, 400 mM Vanadil ribonükleosit Kompleksi (VRC) (SSC) sistemleridir.
- % 90 (h / h) gliserol,% 0.1 ihtiva eden montaj orta hazırlanması p-fenilendiamin (w / v) PBS pH 9'dur.
- Taze hazırlanmış Çözümler
- % 3 taze hazırlanmış paraformaldehid PBS (PFA) oluşan sabitleyici çözeltisi hazırlayın. PBS içinde% 0.5 Triton-X-100 ihtiva eden besleyici çözeltiyi hazırlayın 2 mM VRC ile takviye edilmiştir. % 50 formamid (FA) ve 2x SSC karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın ve 7.2-7.4 pH ayarlamak.
- 2X SSC 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)' den oluşan bir DNA karşı boyama çözeltisi hazırlayın.
- FISH için Hazırlama Fiksasyon ve Permeabilization
- lamelleri hücreler için, 5 m 1x PBS içinde hücreleri yıkayıniçinde. sabitleştirici 10 dakika oda sıcaklığında (% 3 PFA) çözümü için, slaytlar üzerinde lamelleri, ya da embriyonik bölümlerinde hücreleri saptamak.
- 1x PBS ile hücreler üç kez durulayın. Buz üzerinde buz soğukluğunda permeabilizasyon çözeltisi içinde 5 dakika için hücreler geçirgenliği. hücreler% 70 etanol ile üç kez yıkayın. -20 ° C'de% 70 etanol içerisinde 4-kayar bir taşıma kutusu içinde deposu 4 oyuklu plakalarda lamelleri ve slaytlar.
NOT: Lameller ve slaytlar -20 ° C'de birkaç ay boyunca saklanabilir. Plakalar ve bunları ihtiva eden kutu etanol buharlaşmayı önlemek için parafilm ile kapatıldı gerekir.
- DNA probu Etiketleme
- floresan nükleotidler kullanılarak nick çeviri tarafından DNA probları etiketleyin. Üreticinin talimatlarına (Tablo 1) takip 8..
- (DNA amplifikasyonu için, 3.4.4 bakınız) 50 ul reaksiyon karışımı için, 1-2 plazmidi ug, bakteriyel suni kromozom (BAC) ya da birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) ekleyin, 17.5 ul su DNA 2.5 ul 0.2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 ul 10 mM her dNTP karışımı (dGTP, dATP, dCTP), 5 ul 10 mM dTTP, 5 ul 10x nick çeviri tampon ve 8 ul nick çeviri enzim.
- karanlıkta 15 ° C 'de 16 saat süreyle inkübe edilir. -20 ° C'de dondurma ile reaksiyona etkisiz hale getirirler. -20 ° C'de ay depolanabilir Probes.
- MDA
Not: BAC DNA için klasik hazırlandıktan sonra elde edilen DNA miktarı düşüktür, bu nedenle bir MDA ile tanımlamadan önce, DNA amplifikasyon adımı kullanılabilir. Ticari kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına (Tablo 1) izleyin. - 9.5 ul numune tamponu ile 0.5 ul BAC DNA karıştırın. 95 ° C'de 3 dakika ısıtın. Hemen buz üzerinde gidermek; Buz 10 dakika bekletin. Reaksiyon tamponu / enzim karışımı hazırlayın: (9.5 ul + 0.5 ul enzim karışımı) ve buz üzerinde tutmak.
- 10 ul DNA karışımı + 10 ul reaksiyon tampon / enzim karışımı karıştırın. 30 ° C'de en az 20 saat inkübe edilir. 10 dakika 65 ° # ısıtma numunesi enzimi176 ° C. -20 ° C'de depolamadan önce, 4 ° C'ye soğutun örneği.
- sindirimi ile MDA edin. 1 ul MDA 2 ul 10x tampon, 2 ul Hind III ve 15 ul H2O ekleme gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Doğru DNA amplifikasyon onaylamak için 0,8-1% agaroz jel üzerinde yavaş çalışmasına. Yüksek molekül ağırlıklı açık DNA fragmanları jel üzerinde gözlenmelidir.
- Probe Hazırlık
- lamel veya slayt başına 0,1 ya da 1 mcg prob kullanın.
NOT: Yarışma, örneğin, çoğu sondalar gerekiyorsa, aksi takdirde çapraz olarak melezleşen tekrar dizileri içeren ve arka plan artırabilir olarak Cot-1 DNA 2-5 mikrogram ekleyin.- çökelme için, 5 mg somon spermi DNA'sı, 1/10 hacim 5.2 ve 3 hacim etanol 3 M sodyum asetat pH ekleyin. 16.000 x g'de santrifüj ile 25 dakika boyunca 4 ° C. % 70 etanol ile pelet yıkayın ve 5 dakika boyunca tekrar aşağı doğru döndürün.
- Bir yoğunlaştırıcı / hızlı vakumda 2 dakika için kuru pelet. % 100 şeklinde süspanseamid hibridizasyon için gerekli yarım hacminde (örneğin, lamel için 2.5 ul veya slayt embriyonik bölümler için 7 ul). Bir Thermomixer çalkalanarak 37 ° C'de 30 dakika yerleştirin. 75 ° C'de 7 dakika boyunca denatüre.
- Yarışma, 30-60 dakika boyunca 37 ° C'de doğrudan koymak gerekirse, buz üzerinde söndürülmüş, veya. 2x melezleştirme çözeltisi eşit hacimde prob çözeltisi karıştırın.
- lamel veya slayt başına 0,1 ya da 1 mcg prob kullanın.
- Hibridizasyon ve yıkama
- kurutmak; Her biri 5 dakika için 1 x% 80, 1 x% 95 ve 2 x% 100 etanol içinde sıralı yıkama ile Coplin kavanoza kuyularda lamelleri, ve slaytlar. tamamen kuru lamelleri ve slaytlar.
- melezleme için, melezleme karışımı içine bakacak hücreleri ile, bir slayt üzerine 5 ul prob hibridizasyon karışımı (3.5 bakınız) uygulamak ve lamel indirin. Slayt bölümler için, (3.5 bakınız) 14 ul prob hibridizasyon karışımı uygulayın ve 18 x 18 mm 2 lamel ile kaplayın.
- nemli bir oda içinde yer slaytlar (doku kağıt ıslatılır50% F / 2X SSC) ve karanlıkta, gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hibridizasyon sonrası yıkamaların:
- gevşetmek için slayt lamel üzerine% 50 FA / 2x SSC 1 ml ekleyin; slayt dikkatlice lamel çıkarın ve% 50 FA / 2x SSC içeren bir 4-plaka içine o hücre tarafı yerleştirin (hücreleri kazımak için özen). slayt bölümlere için, benzer bir şekilde lamel çıkarın ve 50% F / 2X SSC içeren bir Coplin kavanoz slayt yerleştirin.
- sırasıyla lamel veya slayt 42 ° C ya da 44 ° C'de önceden ısıtılmış 50% F / 2x SSC ile 7 dakika boyunca 3 yıkama, her gerçekleştirin.
- sırasıyla lamel veya slayt 42 ° C ya da 44 ° C 'de 5 dakika her biri için önceden ısıtılmış 2x SSC ile 3 yıkama yapın.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI ile 2x SSC içinde yıkanarak çekirdek karşıt. 2X SSC ile iki kere yıkayın.
- Lameller ve Slaytlar montajı
- kültürlü TGCs küçük lamel için, 5 & # uygulamak181; bir slayt montaj orta l. damla üstünde aşağı lamel hücre tarafı yerleştirin.
- bölümleri ile slayt için, slayt montaj orta 15 ul uygulayın. Damla üstünde bir 22 x 22 mm2 lamel yerleştirin.
- kabarcıkları kaçının. Fazla montaj çözümü siliniz. oje küçük bir miktar ile lamel mühür. Mümkünse, görüntü -20 ° C'de birkaç ay hemen veya mağaza kadar için kayar.
4. Mikroskopi ve Analiz
- Bir floresan mikroskop (63X objektif) kullanılarak 0.3 mikron 3D sıralı z ekseni görüntüler elde ve ImageJ yazılımı 14 kullanarak 3D görüntü yığınlarının analizi gerçekleştirmek.
Representative Results
TGCs sebebi, hamile lokalizasyonlarında ve büyük bir boyuta DAPI boyama ile E7 bölümleri tespit edilebilir. Bu, uzunlamasına bir bölümü Şekil 1A'da gösterilmiştir. RNA BALIK bu ekstra embriyonik soy X kromozomunun inaktivasyon incelemek için bu tür embriyonik bölümlerinde gerçekleştirilmiştir.
Çeşitli slayt veya lamelleri aynı anda işlenebilir. farklı genlerin RNA etiket farklı boya kullanılarak, tek bir aynı çekirdek içinde farklı bir birincil transkript tespit edebilir. Örnek Xist SG (yeşil sinyali) ve SR (kırmızı sinyal) bağlanmış Ldşftkrd bağlanmış olan en az 2 Probes, birbirine karıştırılabilmektedir. Bir dişi TGC bir örneği, 2 diğer soylar almaktadır Şekil 1B, uygun bir embriyo (E) ve iç organ endoderm (VE) 'de gösterilmiştir. Bir TGC çekirdeği Xist RNA X chrom kaplama ile gösteriliraktif diğer X kromozomu (Xa) birkaç saptar görüntüler ise (Xi) inaktive olan osome. X-bağlantılı gen XÍmkdmchq primer transkript endoreplication nedeniyle birkaç kopya halinde (değil Xist ile dekore edilmiş) aktif X kromozomdan ifade edilmiştir. Bu monoallelik ifade örneğin, bir X kromozomu üzerinde Ldşftkrd inaktivasyonunu gösterir.
Şekil 2B'de gösterildiği gibi, TGCs boyutu heterojen olduğundan, sadece en büyük olanlar kaydedilir. İkincil TGCs Şekil 2C'de gösterildiği gibi, üç problar da kullanılabilir. Bu durumda, Xist -SG (yeşil), iki X-bağlantılı genler G6PD -SR (kırmızı) ve Huwe1 Cy (kırmızı) aynı çekirdek içinde aynı anda analiz edildi. G6PD monoallelically burada gösterildiği gibi ifade edilen (ve daha önce sekonder TGCs gösterilen 3) iken Huwe1 biallelically onun PR gösteren ifade ediliroperty XCI kaçmak için. Birkaç saptar, doğmakta olan transkript kopyaları yani ile Endoreplication, aynı zamanda açıktır.
E7 kadın embriyonik bölümünden TGCs Şekil 1. İlköğretim transkript ifadesi. (A) DAPI ile boyandı E7 gebeliğin Boyuna kesit. Embriyo ve ekstra-embriyonik dokular anne dokusu, desidua ile çevrilidir. farklı soy lokalizasyonu 5X amacı ile DAPI boyama üzerine yapılır. TGCs büyük boyutları nedeniyle tanımlanır. Ch, koryon, E, embriyo, EPC, ectoplacental koni, VE, visseral endoderm, TGC, trofoblast dev hücreler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (B) (63X objektif) olarak kutulu-in alanının yüksek büyütme RNA BALIK. XÍmkdmchq birincil transkript kırmızı ve Xist RNA yeşil 3 soy = E görselleştirilebilir, TGC TİC. scale bar 10 mikron =. Xist -kaplı X kromozomunda bir in vivo XÍmkdmchq monoallelically ifade edilir TGC (Xa, ok başı) ve sessiz (XI) Örnek; Xa görülen birkaç XÍmkdmchq sinyalleri endoreplication kaynaklanmaktadır. XÍmkdmchq = BAC klonu RP23-260I15. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
EPC türetilmiş ikincil TGCs Şekil 2. Primer transkript ifadesi. (A) İkincil TGCs (x5 objektif) büyüyen genel görünümü. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (B) Asterisk boyutları (10X objektif) göre TGCs örneğini göstermektedir. Ölçek çubuğu 60 mikron =. 3 probları kullanılarak ikinci bir kadın TGC RNA balık (C), Örnek (Xist domaXi) () kırmızı ve kırmızı birkaç saptar, G6PD ve Huwe1 birincil transkript endoreplication gösterilen: yeşil, inaktive X kromozomunu kapsayan. G6PD monoallelically ifade edilirken, Huwe1 sentezleme Bu çekirdeğinde bialelik olan Huwe1 = BAC klonu RP24-157H12;. G6PD = BAC klonu RP23-13D21. Xi = ok; Xa = ok (63X objektif). Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Yeni oluşan RNA BALIK farklı gelişim aşamalarında embriyonik dokuda transkripsiyonel aktivitenin tek bir hücre analizi için kolay ve hassas bir yöntemi temsil eder. Bu yaklaşımın gücü morfolojik kriterlere göre herhangi bir aşamada farklı embriyo soy tespit kapasitesidir. Bununla birlikte bu aynı zamanda minimum eşiğe mevcut olmasını gerektirir. Herhangi bir arka plan farklı embriyonik bölgeleri ve zorlu hücre tiplerinin belirlenmesi vermektedir. Minimal bir arka plan sağlamak için, bu protokolde iki kritik adımlar vardır. İlk cryosection kalitesi ve ikinci gen ekspresyon seviyesi ve prob kalitesine bağlıdır RNA FISH, verimi (sinyal gürültü oranı) 'dir. İkincisi için, sondalar bu nedenle her zaman bölümlerinde kullanımdan önce lamelleri (embriyonik kök hücreler veya somatik hücre) ile kültürlenmiş hücreler üzerinde test edilmiştir.
Bu protokol, biz th sağlamakE teknikleri iki farklı numune hazırlama türleri (kriyostat kesitleri ve embriyonik eksplant primer kültürlerinde) den TGCs üzerinde RNA BALIK analizi gerçekleştirmek için gerekli. Bu tür tek hücre analizi değerlendirilmesi gereken farklı post-implantasyon aşamalarında gen ifadesinde dinamik değişiklikleri sağlar.
Biz (E7-7.5 implantasyon sonrası aşamalarında) orta TGCs oluşturmak için tarif yöntemleri implantasyon sonrası aşamalarında TGCs oluşmaktadır ekstra embriyonik soy X kromozomu inaktivasyonu kalıplarını incelemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. kemirgenlerde Ekstra embriyonik gelişim TGCs ayrımında bağlıdır. Nitekim, TGCs plasental ve böylece embriyonik gelişimi için gereklidir. TGC farklılaşmasında Kusurları embriyonik ölümcül (inceleme için başvuru 15) neden olur. RNA FISH kullanarak TGCs transkripsiyonel aktivite bize fare gelişimi 3 sırasında bu tür hücre tipinin alışılmadık bir X kromozomu inaktivasyonu durumunu göstermek için izin verdi.
in vivo TGCs ve EPC eksplant elde edilen in vitro TGCs çeşitli genlerin transkripsiyonel aktivitesini değerlendirmek için izin vahşi tip fare embriyoları kullanımını içeriyordu. Bu yöntem, ve / veya kültür ortamı içinde, inhibitör moleküllerinin eklenmesi ile transgenik farelerin analizine genişletilebilir. Biz başarıyla gibi akıbet geliştirdi sırasında 4-5 gün boyunca ayrı ayrı kültüre olabilir fare geliştirme, E3.0 blastosist önceki bir aşamada görünen birincil TGCs gibi, TGCs Başka tip RNA FISH bu yöntemi kullandık ICM büyük birincil TGCs 16,17 tarafından çevrili olmak. Farklı için olgunlaşmamış transkripthem Xist genler görüntülenmiştir, aynı RNA FISH yaklaşımı 3 ile niceliksel olarak belirtilmiştir.
Kombine immünofloresan ve RNA balık da, in vitro kültürlenmiş TGCs 3 gibi kriyostat kesitleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu, birincil transkript bozunmaya çok hassastırlar ve RNaz içermeyen bileşiklerin mutlak bir gereklilik değildir yöntem olup özelliği, çok sağlam olduğunu gösterir. / RNA BALIK aynı anda belirli bir hücrede transkripsiyon seviyeleri, hücresel lokalizasyonu ve protein ifadesi, hakkında ek bilgi sağlar IF. Parafine gömülü doku kesitleri, daha önce elimizde, doku morfolojisi 18 muhafaza ederken, insan tümörlerinde Yeni oluşan RNA tespit etmek için kullanılmıştır rağmen, kriyostat kesitleri immünofloresan sırasında antikorların tespiti için gerekli oluşmakta olan RNA ve her iki epitopu da korumak için daha uygun olan .
RNA, FISH ek olarak, im şumunofluorescence, kromozomal DNA, balık da RNA balık 3 için kullanılanlara benzer florokromlar ile işaretlenmiş problar kullanılarak sekonder TGCs gerçekleştirilebilir. Floresan probları ya da plazmidler / fosmids veya BAC'ler, burada kullanılan floresan dUTPs ile etiketlenmiş ve Chaumeil ve diğ., 8'de tarif olabilir. Seçenek olarak ise, floresan markajlı oligonükleotidlerin 19 kullanılabilir. DNA, FISH şerit spesifikliğini gerektirmediği için, oligonükleotid probları hedef bölgede iki tamamlayıcı şeritlerin hedeflemek üzere dizayn edilebilir. Sinyal amplifikasyon spesifik ve amplifikatör probların iki ardışık mermi elde dallı DNA probları, aynı zamanda FISH sinyallerini 20 bir sinyal-gürültü oranı arttırmak için kullanılabilir. Bizim DNA bazlı prob sinyal kalitesi, özgüllük ve kullanım kolaylığı arasında daha iyi bir dengeyi sağlamak, ancak alternatif olarak, örneğin riboprobes gibi RNA probları kullanılabilir.
Son olarak, 3D görüntü acquisitibu büyük hücreler gerekli mekansal bilgi elde etmek için gereklidir ve böyle DeltaVision (GEH) olarak Dekonvolüsyonun böyle Apotome mikroskop olarak floresan mikroskop, ya da Epifloresans mikroskop kullanarak çeşitli yapılabilir, ya da diğer mikroskoplar uygun görüntüleme doku bölümleri, ve büyük için (> 20 mikron) TGCs. Tek kopya DNA loci için, doğmakta olan RNA FISH veya DNA FISH ile tespit noktalı sinyal kolayca konfokal mikroskobu ile tespit edilemeyebilir dikkat edilmelidir.
Sonuç olarak, burada açıklamak yöntemleri yararlı hem gelişimsel bir bağlamda TGS'nin detaylı analiz için değil, aynı zamanda diğer hastalık durumlarında olmalıdır. Kemirgenlerde TGC gelişimi ve fonksiyonu katılan bir çok gen, kopyalama faktörleri, proteaz ve hücre adhezyon moleküllerinin 21 gibi kemirgenler ve insanlarda arasında muhafaza edilir. Fare TGCs plasenta gelişme, düzenleyen okuyan genler için bir hücre modeli vardırd nedenle insan plasental hastalıklar içgörüler verir. Dahası, bu hücreler endoreplicating ve bazı kanser hücreleri endocycle programları meşgul olduğundan, gen amplifikasyonu işlemlere ek olarak, tarif yöntemler de kanser hücrelerinin istikrarsızlığı genom neden mekanizmaları keşfetmek için gerekli olan tek bir hücre araştırmalarda yardımcı olması gerektiği gerçeğine .
Acknowledgments
Biz resimli yardım için Sophie gournet teşekkür Julie Chaumeil el yazması, hayvan barınma tesisi ve Birim görüntüleme platformu okumak için. Bu çalışma programı «Investissements d'Avenir» altında destek alan referanslar ANR-10-LABX-0044 ve ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, EpiGeneSys 7.ÇP hayır ile Fransız Hükümeti tarafından başlatılan ve ANR tarafından uygulamaya koymuştur. EH mükemmellik 257.082 Ağ, bir ERC Advanced Araştırmacı hayır ödül. 250.367 ve AB 7.ÇP SYBOSS hiçbir hibe. 242.129 EH yazarlar ışık yardım için Institut Curie, Fransa-Biyogörüntüleme (ANR-10-InSb-04) üyesi, ve Genetik ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü (UMR3215 / U934) Hücre ve Doku Görüntüleme Platformu kabul etmek istiyorum mikroskopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, Suppl A. 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
