Abstract
Affinity rensning tilgange har kunnet isolere indfødte komplekser for proteomisk karakterisering. Strukturel heterogenitet og en grad af kompositorisk heterogenitet en kompleks normalt ikke hindrer fremskridt i at gennemføre sådanne undersøgelser. Derimod bør et kompleks bestemt til strukturel karakterisering oprenses i en tilstand, der er både deres sammensætning og strukturelt homogen samt ved en højere koncentration end nødvendigt for proteomics. For nylig har der været betydelige fremskridt i anvendelsen af elektronmikroskopi for struktur bestemmelse af store makromolekylære komplekser. Dette har øget interessen for tilgange til at rense indfødte komplekser af tilstrækkelig kvalitet og mængde for strukturel bestemmelse ved elektronmikroskopi. Den (TAP) metode Tandem Affinity Purification er optimeret til at udtrække og rense en 18-underenhed, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein samling fra spirende gær (Saccharomyces cerevisiae)
Introduction
Mange store cellulære processer udføres af store protein og protein-RNA-komplekser 1. En betydelig flaskehals for udførelse biofysiske og strukturelle studier af sådanne komplekser er at opnå dem af en sådan kvalitet (dvs. homogenitet), og i en passende koncentration. Isolering af et kompleks fra en nativ kilde har mange fordele, herunder fastholdelse relevante post-transkriptionelle og / eller translationelle modifikationer af underenheder og forsikring ordentlig kompleks samling. Men store cellulære komplekser er ofte til stede i en celle ved et lavt kopiantal og oprensningen skal være højeffektive og forekommer under tæt fysiologiske betingelser for at sikre kompleks integritet bevares. Oprensning af et kompleks fra en eukaryot kilde er særligt udfordrende og kan være økonomisk prohibitiv. Således er strategier eller metoder, der er effektive og giver en homogen kompleks meget ønsket.
En strategi, der har væretsucces med oprensning native komplekser fra eukaryote celler for deres første karakterisering er Tandem Affinity Purification (TAP) metode 2,3. TAP metode blev oprindeligt udviklet til at oprense et nativt protein fra knopskydende gær (S. cerevisiae) i kompleks med interagerende faktor (er) 2. TAP metode anvendes to tags, hvert mærke fusioneret i tandem til det samme protein-kodende gensekvens. Mærkerne blev valgt således, at afbalancere et behov for stram og selektiv binding til en affinitet harpiks med et ønske om at opretholde nær fysiologisk opløsning betingelser. Denne balance tjener til at bevare en stabil interaktion (er) af det mærkede protein med interagerende faktor (er) for post-rensning karakterisering. Den genomisk inkorporeret TAP tag blev placeret for enden (C-terminal) af et protein-kodende gen og bestod af en sekvens, der koder for et calmodulinbindende peptid (CBP) efterfulgt af protein A - en tilsætning af lidt over 20 kDa til den mærkede protein. CBP er kort, 26 aminosyrer, og anerkendt af ~ 17 kDa protein calmodulin (CAM) i tilstedeværelse af calcium med en K D på i størrelsesordenen 10 -9 M 4. Protein A tag er større, bestående af to gentagelser af 58 rester med en kort linker mellem gentagelserne. Hver 58 aminosyrer gentagelse er anerkendt af immunglobulin G (IgG) med et K D ~ 10 -8 M 5. Mellem disse to tags blev indarbejdet en anerkendelse site for TEV protease, en endopeptidase fra Tobacco Etch Virus 6,7. Som illustreret i figur 1, i den første affinitet trin i fremgangsmåden TAP mærkede protein er bundet til en IgG harpiks via protein A. Det mærkede protein elueres ved på søjle spaltning ved tilsætning af TEV-protease, stedspecifikt spaltning mellem de to mærker. Dette er et nødvendigt skridt som interaktionen af IgG og protein A er meget stærk og kan kun være tilstrækkeligt forstyrret under denaturerende opløsning betingelser. Mangler en Protein Et tag proteinet bundet til CaM harpiks i nærvær af calcium og elueres fra denne harpiks med tilsætning af metalionen chelatoren EGTA (ethylenglycol tetraeddikesyre) (figur 1).
Snart efter indførelsen af den TAP-metoden, blev det brugt i en omfattende undersøgelse for at generere et "kort" af komplekse interaktioner i S. cerevisiae 8. Vigtigere er det, som en konsekvens af denne indsats en hel gær-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF) bibliotek samt individuel TAP mærkede ORF 9 er tilgængelige fra en kommerciel kilde. Således kan man opnå nogen gærstamme med et mærket protein til enhver gær kompleks. Den TAP-metoden ansporede også modifikationer eller variationer af TAP-tag, herunder: dets anvendelse til rensning af komplekser fra andre eukaryote samt bakterieceller 10,11; udformningen af en "split tag", hvor protein A og CBP er placeret på forskellige proteiner 12; og tags ændret, således at imødekomme behovet for investigator, såsom følsomhed af komplekset til Ca2 + eller EGTA 13.
Nylige fremskridt i både instrumentering og metode har ført til betydelige fremskridt i anvendelsen af elektronmikroskopi (EM) for struktur bestemmelse, der har ført til høj, tæt atomare opløsning billeder af makromolekylære komplekser 14. Resolutionen opnåelig af et kompleks af EM forbliver dog betinget af kvaliteten af komplekset, der undersøges. Denne undersøgelse har udnyttet TAP tag tilgang til oprensning fra S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-underenhed (~ 0,8 MDA) lavkopiantals ribonukleoproteinkompleks der er en del af spliceosome 15,16. Der er taget en række skridt til at rense denne komplekse sådan, at det er homogent og af en passende koncentration. Potentielle problemer på forskellige stadier af oprensningen er beskrevet og taget strategier til at overvinde challEnges fremhævet. Ved omhyggeligt at vurdere og optimere trin i oprensningen, U1 snRNP renset, er af en kvalitet og til en mængde egnet til negativ plet og elektron cryo mikroskopi (cryo-EM) undersøgelser. En optimeret TAP metodeprotokollen til oprensning af indfødte komplekser til strukturelle studier er beskrevet heri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Den følgende protokol blev udtænkt til oprensning af et kompleks fra 4 l cellekultur, ca. 40 g våd vægt af celler. Når forberedt, bør alle buffere opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for en måned af deres forberedelse. Reduktion hæmmere agent og protease er kun tilføjes buffere lige før brug.
1. Fremstilling af helcelleekstrakt for Tandem Affinitetsrensning
- Vækst af S. cerevisiae-celler
- Streak den ønskede TAP mærkede S. cerevisiae stamme fra lager (-80 ° C) på en gær pepton dextrose (YPD) plade. Der inkuberes i 3 - 5 dage (30 ° C), indtil gærceller synes hvidt og luftigt.
- Inokulere en stribe af ca. 2 mm 2 af de friske celler fra pladen i 10 ml YPD medium i et 50 ml konisk polypropylencentrifugerør. Ryst røret ved 180 omdrejninger pr minut (RPM) natten over (30m ° C).
- Pode 2 ml af løbetnat kultur per liter YPD medium i en 2 L Erlenmeyer eller konisk kolbe. Ryst ved 180 rpm (30 ° C). Overvåg cellevækst ved en optisk densitet på 600 nm (OD 600) indtil sent logaritmisk fase, OD600 på 1,8 til 2, typisk 20 - 24 timer.
- Høst S. cerevisiae-celler
- Harvest celler ved centrifugering ved 5.400 x g i 15 min (4 ° C).
- Hurtigt dekanter supernatanten og holde celler ved 4 ° C eller på is.
- Suspendere hver liter cellepellet med 2 ml kølet Lysis Buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 300 mM NaCI; 10 mM KCI; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazol, pH 8,0; 10% glycerol; 0,1% v / v NP-40). Hæng celler ved hvirvlende og / eller gentagen pipettering ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette.
Bemærk: Betydningen af NP-40 som den vedrører komplekse kvalitet og post-rensning analyse diskuteres nedenfor. - Overfør cellesuspensionen i en tom 50 ml konisk polypropylen centrifugerør kEPT på is. Vask hver centrifuge-flaske med yderligere 2 ml afkølet Lysis Buffer og tilføje til cellesuspensionen i 50 ml rør.
- Bestemme den våde vægt af cellepellet ved at veje røret og fratrækning af vægten af de tomme rør samt den tilsatte Lysis Buffer.
Bemærk: En liter cellekultur med en OD 600 på 1,8 er ca. 10 g. - Skabe et flydende nitrogen-bad i et 50 ml konisk polypropylencentrifugerør. Tegn suspenderede celler ind i en 5 ml sprøjte. Tilslut en 16 G kanyle på sprøjten. Frys cellesuspensionen ved passage gennem sprøjten / nål til at generere celle "smådråber". Rate for frost skal være ca. 1 min / ml.
- Opbevar frosne celle dråber (-80 ° C) eller gå videre til lyse.
- Lysere celler og lysatklaring
- Lyse gærcellerne ved hjælp af en kaffemølle. Lyserer celler otte til ni gange med 25 sek slibning brister, mens ryste cOffee kværn. Før anvendelse præ-chill kaffemølle med flydende nitrogen. Hvert andet runder af formaling, tilføje en lavvandet lag af flydende nitrogen til vinkelsliberen og lade det fordampe.
- Der omrøres med en flydende nitrogen afkølet spatel efter behov for at holde celler fra sammenklumpning. Tage forsigtighed for at forhindre optøning af celler, hvilket kan resultere i celle sammenklumpning. Cellerne skal fremstå som et fint hvidt pulver efter lysis. En maksimal cellepellet fra 4 l gærkultur (~ 40 g) kan være formalet ad gangen.
Bemærk: Bemærkninger om metode lyse diskuteres nedenfor. - Vurdere graden af cellelyse under anvendelse af et hæmocytometer eller alternativ celletælling metode. At give en fyldestgørende analyse, tage følgende prøver: (1) før lysis; (2) efter fire runder af lysis; og (3) efter lysis. At kontrollere disse prøver, tage en lille mængde af celler med en flydende nitrogen afkølet spatel og sted i et 1,5 ml rør.
- Når cellerne optøs, anbringes med pipette 5 pi cellerog blandes med 495 pi vand. Hvis 40 - der observeres 60% lyse af celler, gå videre til næste trin i protokollen.
Bemærk: Bemærkninger om effekt af lange perioder med lysis er beskrevet nedenfor. - Når tilstrækkelig lysis observeres, lagre lyserede celler (-80 ° C) eller gå videre til næste trin.
- Forbered to 50 ml koniske polypropylen centrifugerør med hver 15 ml Lysis Buffer, herunder 1 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT), og et kommercielt tilgængeligt cocktail af proteaseinhibitorer.
Bemærk: Hvis der observeres betydelige proteolyse, overveje brugen af en protease mangelfuld stamme. - Brug en flydende nitrogen afkølet spatel at score frosne lyserede celle pulver i den forberedte 50 ml rør. Tilsæt celle pulver / faststof trinvist til Lysis Buffer indeholdende både et reduktionsmiddel og protease-inhibitor (er).
- Rotere de 50 ml rør forsigtigt ved stuetemperatur for at optø / opløse cellerne, men også for at forhindre bobler fra formning. ENs cellen pulver / faste opløses, tilsætte yderligere celle faststof / pulver.
- Fyld hver af de to 50 ml rør, indtil hver har ca. 20 g celler eller alle celler tilsat. Fortsæt optøning / opløsning indtil der ikke er frosne celleklumper observeret i 50 ml rør. Dette bør tage omkring 50 min.
- Centrifugeres suspenderede cellelysatet i 20 minutter ved 25.000 xg (4 ° C). Well-lyserede celler kan udvise en lille mængde sort bundfald.
- Overfør 50 ml af supernatanten til polycarbonat ultra-centrifugerør (26,3 ml rør, der anvendes), og der tilsættes 10 ul 200 mM PMSF til hver fulde rør.
- Centrifuge i 1 time ved 100.000 xg (4 ° C). Fire lag skal være synlige, fra bund til top: (1) en hård klar pellet, som indeholder ribosomale komplekser; (2) en blød lipid-rige pellet; (3) en stor klar gullig lag, der indeholder de fleste af cellens opløselige proteiner og komplekser; og (4) en "skællet" øverste lag består af lipider.
- Udfør alle subsequent trin i et koldt rum (4 ° C). Fjern så meget af toppen 'skællet' lipid lag som muligt ved hjælp af en 1 ml pipette og kassér. Brug en 10 ml serologisk pipette at genvinde det meste af den gule, klare lag.
- Gendan de sidste par ml dette lag ved hjælp af en 1 ml pipette for at undgå at forstyrre de to nederste lag. Fra 40 g våd cellepellet, er ca. 48 ml af det midterste lag udvindes typisk og 8 ml lipidlag fjernet / kasseres.
Bemærk: Søjleoprensning flow reduceres ganske betydeligt ved tilstedeværelsen af lipider, som også kan reducere kvaliteten af komplekset, diskuteret nedenfor.
2. Kolonne Oprensning trin 1: IgG Kromatografi
- Resin Ligevægtsindstilling og Binding
- Forbered en 300 pi IgG Sepharose gylle til 40 g cellepellet. Skær enden af en 1 ml pipettespids at lette pipettering opslæmningen. Vask / ligevægt IgG harpiks tre gange, hver gang med 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 150 mM NaCI; 150 mM KCI; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 0,1% v / v NP-40; 1 mM DTT; en proteaseinhibitor tablet pr 50 ml volumen).
- Spin at pelletere ved 160 xg (4 ° C) mellem hver vask og fjern supernatanten.
- Drej IgG harpiksen med den midterste fase supernatanten og to mini proteasehæmmere tabletter pr 40 g celler under anvendelse af en passende rotator, i 2 timer (4 ° C). Dette er IgG batch opløsning.
- Forbered to 10 ml poly-prep kolonner til brug ved skæring i slutningen af søjlen til frembringelse af en flad snit. For at fremskynde pakning og vaskning af søjlen ved tyngdekraftens strøm, maksimalt lægges 200 pi pakkede IgG harpiks eller ~ 25 ml af IgG batch opløsning pr 10 ml søjle.
- Hæld IgG batch opløsningen i søjlen og tillade at sedimentere ved hjælp af tyngdekraften. Hvis sedimentering tager længere tid end 30 minutter, er der højst sandsynligt var lipid forurening når inddrive den midterste fase fra centrifugen tUBE'er.
- Vask den pakkede kolonne med fire 10 ml volumener af IgGD150 Buffer.
- Forbered en 300 pi IgG Sepharose gylle til 40 g cellepellet. Skær enden af en 1 ml pipettespids at lette pipettering opslæmningen. Vask / ligevægt IgG harpiks tre gange, hver gang med 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 150 mM NaCI; 150 mM KCI; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 0,1% v / v NP-40; 1 mM DTT; en proteaseinhibitor tablet pr 50 ml volumen).
- På Column TEV Cleavage
- Forsegl bunden af kolonnen, og der tilsættes 1 ml IgGD150 puffer og 100 pi TEV protease (0,6 mg / ml stamopløsning, mutant variant S219V af TEV fremstillet internt). Forsegl toppen af kolonnen og blandes i 20 min (18 ° C) under anvendelse af en termisk mixer, rystning ved 750 rpm. Resuspender harpiks og bland igen i 20 minutter, gentag en gang mere for i alt 1 times inkubation.
Bemærk: Det er vigtigt at holde inkubationstid på et minimum. - Retur kolonnen til 4 ° C og eluering af protein / komplekset ved hjælp af tyngdekraften. Elueres rest-volumen med yderligere 200 gi IgGD150 Buffer.
- Forsegl bunden af kolonnen, og der tilsættes 1 ml IgGD150 puffer og 100 pi TEV protease (0,6 mg / ml stamopløsning, mutant variant S219V af TEV fremstillet internt). Forsegl toppen af kolonnen og blandes i 20 min (18 ° C) under anvendelse af en termisk mixer, rystning ved 750 rpm. Resuspender harpiks og bland igen i 20 minutter, gentag en gang mere for i alt 1 times inkubation.
3. Kolonne Oprensning Trin 2: Calmodulin Affinity Chromatography
- Resin Ligevægtsindstilling og Binding
- Forbered 200 pi Calmodulin affinitetsharpiks pr 40 g cellepellet. Resinen vaskes tre gange, hver gang med 5 ml calmodulin bindingspuffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 150 mM NaCI; 10 mM KCI; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 2 mM CaCl2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoethanol), centrifugering ved 160 xg (4 ° C) for at pelletere for hver vask.
- Til hver 1 ml IgG eluat, tilsættes 3 volumener calmodulinbindende Buffer. For at holde calcium konstant, tilsættes CaCl2 og β-mercaptoethanol at tage højde for manglen på sådanne bestanddele i IgG eluering. Slutkoncentrationer skal være 2 mM CaCl2 og 10 mM β-mercaptoethanol.
- Tilsæt prøve til kalmodulin harpiksen og binde i 1 time (4 ° C) under anvendelse af et rør rotator.
- Pakning og Eluering fra Calmodulin Resin
- En 2 ml poly-prep søjle pr 100 pi Calmodulin opslæmning ved at skære enden af kolonnen til at oprette en flad åbning. Læg ikke mere end 100 pi Calmodulin gylle pr column at minimere mængden af harpiks prøven kommer i kontakt med under eluering.
- Pak kolonnen ved tyngdekraften og vaske harpiksen i søjlen tre gange med 5 ml calmodulinbindende Buffer.
- Eluere protein med tilsætning af 200 pi Calmodulin Elution Buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 150 mM NaCI; 10 mM KCI; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% volumen / v NP-40; 10 mM β-mercaptoethanol). Gentag seks gange tilsætning af 200 pi Calmodulin Elution Buffer.
- For elueringer 1 til 3, gælder lydstyrken til kolonnen, og eluatet opsamles straks. Til eluering 4, forsegle bunden af søjlen og inkuberes med elueringspuffer i 2,5 minutter og derefter bryde forseglingen, og der elueres ved hjælp af tyngdekraften. Til eluering 5, inkuberes i 5 minutter og derefter bryde forseglingen og eluere. Til eluering 6, inkuberes i 10 minutter og derefter bryde forseglingen og eluere.
Bemærk: Integriteten af komplekset kan variere fra elueringer / fraktioner (se repræsentative resultater afsnit) <./ Li> - Dialysere elueringer 2 til 6 individuelt natten over under anvendelse af en passende micro dialysemetode. Dialyse fraktionerne mod dialysebuffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 150 mM NaCI; 10 mM KCI; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 10 mM β-mercaptoethanol).
Bemærk: NP-40 ikke passerer mærkbart, hvis overhovedet, gennem dialysemembranen.
4. Post-Rensning Analyser at vurdere Complex Kvalitet
- Native Gel og sølvfarvning
- Forbered en 4-16% præfabrikerede indfødte gel til analyse af komplekset som pr instruktionerne fra producenten. Bruge en passende molekylvægt proteinstandard og belastning 15 pi af hver af de dialyserede Calmodulin eluerings- / fraktioner på gelen.
- Elektroforese gelen ved 150 V i ca. 3 timer (4 ° C).
- Sølv plet gelen til at vurdere kvaliteten af hver af de seks elueringer. Alternativt kan du bruge lige så følsomme kommerciellefluorescerende farvning (s). På dette stadium er koncentrationen af komplekset er mest sandsynligt under niveauet for påvisning for Coomassie blue-farvning.
- Yderligere gelanalyse Metoder
- For at påvise protein ved Western blotting, løse komplekse ved SDS eller indfødte PAGE og derefter sonde gelen for calmodulinbindende peptid (CBP) epitop ved hjælp af en TAP-tag antistof som pr instruktionerne fra producenten.
- Ved hjælp af en specifik fluorescerende farve (r), bekræfte tilstedeværelsen og integritet af protein og / eller nukleinsyre i en TAP oprenset kompleks. Pas på, at der ikke registreres spektral overlapning mellem disse pletter.
- Negativ Stain Electron Microscopy Visualisering
- Brug kontinuerlig kulstof gitre glød-afladet ved -15 mA i 30 sek, inden for 30 min af komplekse ansøgning.
- Påfør 3 ul TAP renset kompleks (typisk i en koncentration på 1 nM) til nettet. Inkuberes i et minut. Blot from den side af nettet for at fjerne overskydende buffer.
- Vask to gange med 20 pi dråber deioniseret vand. Side skamplet mellem vaske.
- Påfør gitter til en 50 pi negativ plet drop og inkuberes i en min. Farvning med uranylacetat (2%) eller uranyl formiat (0,75%) anbefales.
Forsigtig: uranyl salte og løsninger er svagt radioaktivt og indeholder tungmetaller. Disse skal behandles med omhu og alt materiale, der kommer i kontakt med disse løsninger bør bortskaffes efter institutionelle anbefalede retningslinjer affald. - Påfør gitter til en frisk 50 pi negativ plet dråbe, uden blotting. Inkuber i en min, derefter side-blot, og endelig lufttørres, og visualisere.
- Cryo Electron Microscopy (cryo-EM) Visualisering
- Udfør cryo-EM med TAP oprenset kompleks, selv om optimering kan være nødvendig, ifølge producentens protokol.
Bemærk: Tilstedeværelse af vaskemiddel ved høje koncentrationer may hindre fremskridt og diskuteres nedenfor.
- Udfør cryo-EM med TAP oprenset kompleks, selv om optimering kan være nødvendig, ifølge producentens protokol.
5. Kompleks opbevaring
- Forberedelse Complex for opbevaring
- Koncentrer komplekset, hvis det er nødvendigt, ved hjælp af en centrifugal filter med en passende molekylvægt afskæring for komplekset. Spin ved 14.000 x g i trin på 1 min, indtil den ønskede koncentration er nået.
Bemærk: NP-40 koncentration vil stige i koncentration under koncentrering, da den ikke passere gennem filteret eller dialysemembran. - Flash fryse komplekset i 30 pi alikvoter i flydende nitrogen eller tøris afkølet ethanol-bad og derefter opbevares ved -80 ° C.
- Koncentrer komplekset, hvis det er nødvendigt, ved hjælp af en centrifugal filter med en passende molekylvægt afskæring for komplekset. Spin ved 14.000 x g i trin på 1 min, indtil den ønskede koncentration er nået.
- Valgfri Post-rensning Fjernelse af Vaskemiddel
Bemærk: Tilstedeværelsen af et detergent, såsom NP-40 og i en koncentration, der ligger over dets kritiske micellekoncentration kan hindre eller hæmme fremskridt til nogle anvendelser. Konsekvenserne af dets fjernelse fra protocol samt udskiftning med andre additiver eller co-opløsningsmidler er beskrevet nedenfor. Hvis der ønskes ikke NP-40, en mulighed er at bruge en kommerciel anvendelse til fjernelse, f.eks Bio-perler.
- Pre-ligevægt kommercielt tilgængelige rengøringsmidler absorberende perler i dialyse Buffer. Bland fem perler pr 30 pi kompleks (sædvanligvis ved 10 nM koncentration).
- Inkuber ækvilibrerede perler fra trin 5.2.1 med TAP renset kompleks i 15 min på is. Brug kompleks i løbet af få timer efter fjernelse af detergent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En modificeret TAP metode blev anvendt til at oprense fra S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-underenhed ribonukleoproteinkompleks. En indledende TAP oprensning af komplekset efter den publicerede protokol 2,3 gav et kompleks, der optrådte heterogene, migrerer som tre bånd på en sølvfarvet nativ polyacrylamidgel (figur 2A). Multiple runder af optimering af TAP metode, gav en kompleks, der vandrede som primært et enkelt bånd på en nativ gel indikerer en mere homogen samling (figur 2A). Brug fluorescerende farvestoffer til farvning for både protein og nukleinsyre, blev det fastslået, at det rensede kompleks havde både biopolymerer til stede (figur 2B).
Det oprensede kompleks blev også analyseret ved SDS PAGE og Western blotting under anvendelse af et TAP-tag-antistof (figur 3A). I overensstemmelse med native gel resultat, komplekset oprenset overensstemmelse med den publicerede protokol udviste proteolyse af TAP mærkede protein (Snu71). Mængden af proteolyse blev imidlertid signifikant reduceret med modifikationer af TAP-metoden. Næsten alle de sytten proteiner i U1 snRNP komplekset blev opløst ved SDS-PAGE og positivt identificeret ved MALDI-massespektrometri (figur 3B). Samt indfødte og SDS PAGE, var komplekse kvalitet vurderes på forskellige stadier af rensning ved negative plet elektronmikroskopi (figur 4). De monodisperse partikler observeret i figur 4A og B, men fraværende fra 4C er eksempler på god prøve for strukturel undersøgelse. Denne analyse metoden kritisk indsigt i konsekvenserne af ændringer i TAP-metoden.
TAP metodekald om optagelse af det ikke-ioniske detergent NP-40 og ved en koncentration over det for dets kritiske micellekoncentration (CMC). Robustheden af metoder til vurdering af kvaliteten af komplekset beskrevet i protokollen er godt demonstreret ved et eksperiment, hvor den zwitterioniske tensid CHAPS, glycerol eller ingen co-solvent blev erstattet af NP-40 i alle buffere (figur 5). Ved indfødte PAGE og negativ plet EM, U1 snRNP forekommer mest homogene og stabile i NP-40 med faldende stabilitet fra CHAPS til glycerol til ingen co-solvent tilsættes. Det kan være, at gæren U1 snRNP har en hydrofobe forside og tilstedeværelsen af NP-40 forhindrer aggregering ved at overtrække denne overflade. Desværre kan NP-40 ikke fjernes ved dialyse og koncentrering af komplekset vil derefter koncentrere NP-40. Mens den højere NP-40 ikke syntes at forurolige komplekset, gjorde det negativ indflydelse indefrysning af partiklen i glasagtig is til cryo-EM og store micelle-lignende aggregater blev observeret. Detergent absorberende perler blev anvendt med succes til reFlyt størstedelen af NP-40 fra U1 snRNP prøven uden at virke at påvirke komplekset strukturelt.
Blev opnået efter oprensning af komplekset med modifikationerne beskrevet i protokollen, en kompleks egnet til både negative pletten og cryo-EM, som det fremgår af billeder af plænen af partikler og karakteristiske repræsentativ klasse gennemsnit (figur 6).
Figur 1. Oversigt over Tandem Affinity Purification (TAP) Metode. (A) Skematisk af totrins TAP metode. Kompleks af interesse (grå) indbefatter en TAP mærkede subunit (sort; U1 snRNP subunit Snu71) genomisk fusioneret med en sekvens bestående af en calmodulinbindende peptid (CBP, grøn), et genkendelsessted for den stedspecifikke protease TEV (blå), og to IgG bindende regioner af protein A (Pr A , Red). I 1. trin cellelysat inkuberes med en IgG-harpiks og komplekset fastholdes via dens interaktion med protein A-sekvensen. Komplekset er frigivet fra harpiksen ved TEV spaltning. I 2. trin komplekset inkuberes med en kalmodulin harpiks, en Ca2 + afhængige reaktion. Komplekset frigives via tilsætning af Ca2 + chelator EGTA. (B) Western blot efter en TAP mærket protein gennem oprensningstrin illustreret i (A). Prøver blev taget af cellelysat, efter 1. trin, og efter 2. trin af TAP-metoden. Den reaktive protein observeret i cellelysatet vandrer hurtigere efter 1. trin, efter TEV protease spaltning og dermed tab af protein A sekvens. Klik her for at se en større version af dette tal.
ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 54.389 / 54389fig2.jpg "/>
Figur 2. Optimering af TAP Method. (A) Silver farvet indfødte gel af TAP renset komplekser. Native PAGE af: protein standard (bane 1); komplekse oprenset ifølge original TAP metode 3 (bane 2), tre bånd observeret (pilespidser); tre på hinanden følgende elueringer fra samme TAP rensning følgende ændringer til buffer, to bånd observeret (pilespidser) (bane 3 - 5); yderligere ændringer af TAP-metoden, hvilket giver primært et enkelt komplekst bånd migrerer ved ~ 800 kDa (bane 6). (B) Analyse af sammensætningen af et oprenset kompleks ved farvning en enkelt gel lane med både protein og RNA-reaktive pletter. Native PAGE af: protein standard (bane 1) farvet med et protein fluorescerende plet; kompleks afbildes med protein fluorescerende farvning (bane 2), to bånd observeret; samme bane i bane 2, nu afbildet med en nukleinsyre fluorescerende farvning (bane 3), to bånd observeret; og fluorescerende signal overlå af farvet kompleks i bane 2 og 3 (bane 4). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Optimering af TAP Method. (A) Western blot-analyse af forbedring i komplekse kvalitet, efter TAP mærkede subunit Snu71 probet med α-TAP-antistof. Adskillige proteolyserede bånd er synlige i første omgang (bane 1), men forbedringer reducere mængden af lavere bånd betydeligt (bane 2 og 3). (B) en repræsentativ SDS gel farvet med et fluorescerende protein gel pletten. Gel løser 12 af de 17 protein-subunits af komplekset. Identitet af protein i båndene blev oprettet ved massespektrometri. Klik her for at se et largis version af dette tal.
Figur 4. Eksempel på kvalitet på Faser i TAP Metode Vurderet af negative Stain Electron Microscopy vurdering negativ plet elektronmikroskopi af komplekse efter:. (A) den 1. trin i TAP, (B) den 2. trin i TAP (C ) kompleks destabiliseres. Scale bar, 125 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Virkningerne på Sample kvalitet tilsætningsstoffer i TAP Metode Buffere Lanes 1 -. 4 er de første fire elueringer af den endelige eller 2. trin af TAP rensning af complex oprenset i nærvær af: (A) den nonioniske detergent nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analyseret ved nativ PAGE (øverst) og negativ farvning EM (bund), (B) den zwitterioniske detergent 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), analyseret ved nativ PAGE (øverst) og negativ farvning EM (bund), (C) glycerol, analyseret ved nativ PAGE (øverst) og negativ farvning EM (nederst); og (D) noget additiv, analyseret ved nativ PAGE (øverst) og negativ farvning EM (nederst). Scale bar, 50 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Visualisering af TAP Metode Oprenset Complex. (A) Top, et repræsentativt billede af en negativ plet elektron microscopy (EM) mikrograf. Observeret er en græsplæne af tilsvarende formede partikler, er to boxed, renset ved den optimerede TAP-metoden. Bund, et udvalg af klasse gennemsnit taget af partiklerne, der fremhæver partikel kendetegn. Scale bar, 50 nm. (B) Top, et repræsentativt billede af en cryo-EM mikrograf. Observeret er regioner i højere kontrast repræsentativ for partikler, se to sådanne områder boxed. Bottom, klasse gennemsnit af udvalgte partikler frosset i glasagtige is. Scale bar, 50 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TAP fremgangsmåde anvender to koder, som afbalancerer et behov for stram og selektiv binding til en affinitet harpiks med et ønske om at opretholde nær fysiologisk opløsning betingelser. Denne balance tjener til at bevare en stabil interaktion (er) af det mærkede protein med interagerende faktor (er) for post-rensning karakterisering. Desuden individuel TAP mærkede ORF'er er tilgængelige fra en kommerciel kilde, så man kan opnå nogen gærstamme med et mærket protein til enhver gær kompleks. Bevare integriteten af en kompleks og tilgængeligheden af en ressource til at teste anvendelsen af forskellige mærkede proteinunderenheder i et kompleks til oprensning er to fordele for anvendelse af TAP fremgangsmåde til oprensning af et nativt kompleks. Imidlertid blev den oprindelige TAP metodeprotokollen ikke udformet for at sikre, at komplekset oprensede er deres sammensætning og strukturelt homogen. Den TAP-metoden er derfor blevet ændret, som beskrevet ovenfor, for at opnå dette mål.
Forskelligetrin i TAP metode blev vurderet til at etablere den optimale tilgang og betingelser for at rense et kompositorisk og strukturel homogen kompleks. En tidlig kritisk trin er cellelyse. Dette trin kræver en balance mellem en ønske om et højt udbytte og dermed maksimal lysis, mens hvilket sikrer, at det opnåede kompleks er af høj kvalitet, dvs. homogen. Forskellige tilgange til lyserende gærceller blev undersøgt, herunder ved anvendelse af en perle-beater, høj forskydning fluid processor, og kuglemølle. Anvendelse af mindre dyre kaffemølle var mindre effektiv end de alternative metoder (40 - 60% lysis), men den komplekse isolerede og oprensede optrådte monodisperse mens flere af disse fremgangsmåder syntes at enten forstyrrer partikel integritet eller forårsage en vis aggregering. I sidste ende blev et betydeligt antal celler ikke lyseret for at sikre høj kvalitet kompleks blev opnået. Mens i 40 - 60% lysis er ideel til gær U1 snRNP, er optimering foreslås ved anvendelsen af denne protokol til en nyt biologisk kompleks.
Det var vigtigt at identificere de trin i fremgangsmåden, der kunne fremskynde rensning for at sikre, at komplekse integritet ikke blev kompromitteret af cellulære proteaser, underenhedsdissociation som følge af fortynding og forlænget inkubering ved 18 ° C i løbet af TEV-protease-spaltning. En simpel trin for at opnå tid effektiv rensning var at sikre, at lipider ikke bære over fra det tidlige lysatet afklaring, da lipider hindrer flow under tyngdekraften rensning. Andre trin omfattede identificere en optimal balance af de beløb harpiks og kolonne størrelse / dimensioner for at opnå en effektiv rensning og en maksimal flowhastighed. Et særligt kritiske skridt var at reducere tid på kolonne spaltning af TEV protease. TEV protease anvendt blev oprenset i huset for at sikre, at det var protease / nuklease frit og i en høj koncentration 17. Betydelige mængder af TEV protease blev brugt til at opnå fuldstændig spaltning på under en time.
Indholdsproduktion "> I indledende TAP oprensninger proteolyse blev observeret. Proteolyse under rensningen kan begrænses ved at arbejde effektivt, tilføjer et batteri af inhibitorer, og med i rensning høje salt vaske. En bred vifte af proteasehæmmere leveres i løbet af første halvdel af oprensningen stærkt forbedret stabilitet TAP mærkede protein og kompleks. Desuden blev proteolyse minimeres ved at forøge den monovalente koncentration på 300 til 500 mM i løbet af cellelyse og IgG oprensningstrin. Selv med de ovennævnte modifikationer af TAP-metoden, successiv eluerede fraktioner off af CBP affinitet harpiks varierede i deres grad af kompositorisk homogenitet. således selektiv samling af fraktioner fra den anden, CBP kromatografitrin, er berettiget.Et aspekt af TAP metode, der modtog særlig fokus var betydningen af det ikke-ioniske detergent NP-40 til kompleks oprensning og ved en koncentration over dens CMC. Tilstedeværelsen af NP-40 i en koncentration på 0,08% eller højere havde en samlet gavnlig virkning på komplekse integritet og det endelige udbytte. Den tilsyneladende gavnlige virkning (er) af NP-40 kan skyldes til dels, at reducere de ikke-specifikke interaktioner mellem harpiks og komplekset. Mens NP-40 synes at have en gunstig virkning under oprensningen, kan det fjernes efter oprensning uden at forårsage kompleks aggregering.
Endelig kritisk at optimere TAP metode til strukturel undersøgelse var flere komplementære assays anvendes til at vurdere integriteten og homogenitet af komplekset. Disse omfattede lysspredning, SDS og nativ PAGE probet under anvendelse af TAP antistof ved Western blot og / eller farvet med fluorescerende farvestoffer, samt negativ plet elektronmikroskopi. De ændringer af TAP-metoden beskrevet heri, gav en homogen kompleks på tilstrækkelige mængder til elektronmikroskopi. kan have behov for yderligere ændringer, der skal foretages i TAP-metoden til andre komplekser, især en afskrækkemelse af betydningen af NP-40.
Sammenfattende kan TAP oprensning fremgangsmåden anvendes med succes oprense makromolekylære komplekser fra en eukaryot kilde af egnet kvalitet til strukturel undersøgelse. Vi har etableret en egnet metode til rensning af S. cerevisiae U1 snRNP og detaljer de skridt, samt rationalet for mange af disse ændringer. For andre komplekser, foreslår vi, at investigator tilsvarende udforske trinene i protokollen, som kan give tilstrækkelige mængder og kvalitet af komplekse. De skridt, der bør undersøges inkluderer cellelysis, salt og tilsætningsstof type og koncentrationer, herunder vaskemiddel, og følsomheden af komplekset til calcium og metalchelator EGTA. Endvidere er det afgørende for langtidsstudier, at komplekset kan nedfryses og optøs uden forstyrrende struktur. Vigtigt er, bør man have adskillige alternative måder til analyse af strukturen af komplekset under og efter oprensning. Native ennd SDS PAGE, negativ plet EM, og lysspredning har tjent os godt i vores undersøgelse af, hvordan man bedst at rense et homogent kompleks ved hjælp af TAP-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 ml Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 ml poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
