Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Abstract

Affinitätsreinigung Ansätze wurden erfolgreich für Proteomik Charakterisierung zu isolieren nativen Komplexe. Strukturelle Heterogenität und ein gewisses Maß an Heterogenität der Zusammensetzung eines Komplexes nicht behindern in der Regel Fortschritte in solchen Studien durch. Im Gegensatz dazu ist ein Komplex für die strukturelle Charakterisierung bestimmt sind, sollten in einem Zustand gereinigt werden, die sowohl kompositionell und strukturell homogener als auch in einer höheren Konzentration als für die Proteomik erforderlich ist. Seit kurzem gibt es für die Strukturbestimmung großer makromolekularer Komplexe in der Anwendung von Elektronenmikroskopie signifikante Fortschritte. Dies hat das Interesse an Ansätzen erhöhte auf native Komplexe von ausreichender Qualität und Quantität für die Strukturbestimmung mittels Elektronenmikroskopie zu reinigen. Die Tandem Affinity Purification (TAP) Verfahren optimiert wurde , um eine 18-Untereinheit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein Montage von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) zu extrahieren und zu reinigen

Introduction

Viele wichtige zelluläre Prozesse werden ¹ von großen Protein- und Protein-RNA - Komplexen durchgeführt. Ein wesentlicher Engpass biophysikalische und strukturelle Untersuchungen solcher Komplexe zur Durchführung wird sie in geeigneter Qualität (dh Homogenität) und in einer geeigneten Konzentration zu erhalten. Isolieren eines Komplexes aus einer natürlichen Quelle hat viele Vorteile, einschließlich der Beibehaltung relevanten posttranskriptionales und / oder translationale Modifikationen von Untereinheiten und die richtige komplexe Montage sicherstellt. Jedoch sind große Zellkomplexe oft in einer Zelle bei einer niedrigen Kopienzahl und die Reinigung müssen unter nahezu physiologischen Bedingungen sehr leistungsfähig und treten komplex Integrität sicherzustellen aufrechterhalten wird. Reinigung eines Komplexes aus einer eukaryotischen Quelle ist eine besondere Herausforderung und kann finanziell untragbar sein. So Strategien oder Methoden, die eine homogene komplexe effiziente und ergeben sind sehr erwünscht.

Eine Strategie, die warerfolgreiche einheimische Komplexe aus eukaryotischen Zellen für ihre anfängliche Charakterisierung bei der Reinigung ist die Tandem Affinity Purification (TAP) Methode ^2,3. Die TAP - Methode wurde zunächst mit zusammenwirkenden Faktor (en) ² ein natives Protein aus der Bäckerhefe (S. cerevisiae) in Komplex zu reinigen , erdacht. Die TAP-Methode zwei Tags verwendet, jedes Tag in tandem mit dem gleichen Protein-kodierenden Gensequenz fusioniert. Die Tags wurden so ausgewählt, dass eine Notwendigkeit für enge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten auszubalancieren. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Die genomisch integriert TAP-Tag am Ende (C-terminal) einer Protein-kodierenden Gens plaziert wurde, und bestand aus einer Sequenz, codierend für ein Calmodulin bindendes Peptid (CBP), gefolgt von einer Protein - ein Zusatz von etwas mehr als 20 kDa zu dem markierten Eiweiß. CBP ist kurz, 26 Aminosäuren und durch die ~ 17 kDa Protein Calmodulin (CaM) in Gegenwart von Calcium mit einem K _D in der Größenordnung von 10 ^-9 M ⁴ erfasst. Das Protein A-Tag größer ist, bestehend aus zwei Wiederholungen von 58 Resten mit einer kurzen Linker zwischen den Wiederholungen. Jeweils 58 Aminosäure repeat wird durch Immunglobulin G (IgG) mit einer K _D ~ 10 ^-8 M ⁵ erfasst. Zwischen diesen beiden Tags wurde eine Erkennungsstelle für TEV - Protease eingebaut, eine Endopeptidase aus dem Tabakätzvirus ^6,7. Wie in Figur 1 dargestellt ist , in der ersten Affinitätsschritt des Verfahrens wird die TAP - Protein markiert ist mit einem IgG - Harz über das Protein A gebunden Das markierte Protein , das durch Spaltung an der Säule bei der Zugabe von TEV - Protease eluiert, ortsspezifisch zu spalten zwischen die beiden Tags. Dies ist ein notwendiger Schritt, da die Interaktion von IgG und Protein A ist sehr stark und nur hinreichend unter denaturierenden Lösungsbedingungen gestört werden kann. In Ermangelung eines Protein : Tag wird das Protein zu CaM Harz in Gegenwart von Calcium gebunden und aus diesem Harz unter Zugabe des Metallionenchelator EGTA (Ethylenglykoltetrasäure) (Abbildung 1) eluiert.

Bald nach der Einführung des TAP - Methode, es in einer groß angelegten Studie verwendet wurde , eine "Karte" der komplexen Wechselwirkungen in S. zu erzeugen cerevisiae ^8. Wichtig ist markiert, als Folge dieser Bemühungen eine ganze Hefe-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF) Bibliothek sowie einzelne TAP ORFs ⁹ von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind. Somit kann man jede Hefestamm mit einem markierten Proteins für jede Hefe-Komplex erhalten. Die TAP - Verfahren angetrieben auch Modifikationen oder Variationen des TAP - Tag, einschließlich: seine Verwendung zur Reinigung von Komplexen aus anderen eukaryotischen als auch Bakterienzellen ^10,11; der Entwurf eines "Split - Tag", bei dem das Protein A und CBP auf verschiedene Proteine ^​​12 platziert sind; und tags verändert, um so die Notwendigkeit des Prüfers, wie Empfindlichkeit des Komplexes zu Ca ²⁺ oder EGTA ¹³ aufzunehmen.

Jüngste Fortschritte in sowohl Instrumentierung und Methodik haben zu erheblichen Fortschritten bei der Anwendung der Elektronenmikroskopie (EM) führte zur Strukturbestimmung, die zu hohen, in der Nähe von atomarer Auflösung Bilder von makromolekularen Komplexen ¹⁴ geführt. Die erreichbare Auflösung eines Komplexes von EM bleibt jedoch, die von der Qualität des Komplexes untersucht. Diese Studie hat die TAP - Tag Ansatz genutzt von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, ein 18-Untereinheit (~ 0,8 MDA) geringer Kopienzahl Ribonukleoproteinkomplex , die Teil des Spliceosoms ^15,16 ist. Eine Reihe von Schritten wurden unternommen, um diesen Komplex zu reinigen, so daß sie homogen und einer ausreichenden Konzentration vorliegt. Potenzielle Probleme in verschiedenen Stadien der Reinigung begegnet werden beschrieben und Strategien chall zu überwinden ergriffenEnges hervorgehoben. Durch die sorgfältige Bewertung und Schritte bei der Reinigung zu optimieren, gereinigt das U1 snRNP ist von einer Qualität und einer Menge geeignet für negative Färbung und Elektronen Kryo (Kryo-EM) Studien. Eine optimierte TAP Methode Protokoll für die Reinigung von nativen Komplexe für Strukturuntersuchungen wird hier beschrieben.

Protocol

Hinweis: Das folgende Protokoll zur Reinigung eines Komplexes von 4 l Zellkultur entwickelt wurde, etwa 40 g Nassgewicht der Zellen. Nach der Vorbereitung sollten alle Puffer bei 4 ° C gelagert und innerhalb eines Monats nach ihrer Herstellung verwendet. Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren werden nur Puffer zugesetzt unmittelbar vor der Verwendung.

1. Herstellung von Gesamtzellextrakt für Tandem Affinity Purification

1. Das Wachstum von S. cerevisiae - Zellen
   1. Streak die gewünschte TAP markiert S. cerevisiae - Stamm aus dem Speicher (-80 ° C) auf eine Hefe - Pepton Dextrose (YPD) Platte. Inkubieren für 3 - 5 Tage (30 ° C), bis Hefezellen weiß und flauschig erscheinen.
   2. Beimpfen einen Streifen von etwa 2 mm ² der frische Zellen von der Platte in 10 ml YPD - Medium in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Das Röhrchen wird bei 180 Umdrehungen pro min (UpM) über Nacht (30 m ° C).
   3. Impfen 2 ml der überNachtkultur pro Liter YPD Medium in einem 2-L Erlenmeyer oder Erlenmeyerkolben. Schütteln bei 180 rpm (30 ° C). Überwachen Zellwachstum bei einer optischen Dichte von 600 nm (OD ₆₀₀₎ bis zum späten logarithmischen Phase, OD ₆₀₀ von 1,8 bis 2, typischerweise von 20 bis 24 Stunden.
2. Ernten S. cerevisiae - Zellen
   1. Ernte die Zellen durch Zentrifugation bei 5.400 xg für 15 Minuten (4 ° C).
   2. Schnell den Überstand dekantieren und halten Zellen bei 4 ° C oder auf Eis.
   3. Suspend jeden Liter Zellpellet mit 2 ml gekühlt Lysis-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM Imidazol, pH 8,0; 10% Glycerin; 0,1% v / v NP-40). Suspend-Zellen durch Verwirbelung und / oder Wiederholungs Pipettieren 10 ml serologische Pipette.
      Hinweis: Die Bedeutung von NP-40, wie es komplexe Qualität und Nachreinigung Analyse bezieht sich auf unten diskutiert wird.
   4. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine leere 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen kept auf Eis. Waschen Sie jeden Zentrifugenflasche mit weiteren 2 ml gekühlt Lysepuffer und fügen Sie in der 50-ml-Röhrchen zur Zellsuspension.
   5. Bestimmen das Naßgewicht Zellpellet durch das Rohr mit einem Gewicht und das Gewicht des leeren Rohrs sowie die hinzugefügte Lysis Buffer subtrahieren.
      Hinweis: Ein Liter Zellkultur eine OD ₆₀₀ von 1,8 mit ca. 10 g.
   6. Erstellen eines Bad aus flüssigem Stickstoff in einem 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zeichne suspendierten Zellen in eine 5 ml Spritze. Schließen Sie eine 16 G-Nadel an der Spritze. Einfrieren der Zellsuspension, indem sie durch die Spritze / Nadel vorbei Zelle zu erzeugen, "Tröpfchen". Gefriergeschwindigkeit sollte etwa 1 min / ml betragen.
   7. Lagerung tiefgefroren Zell Tröpfchen (-80 ° C) oder zur Lyse stattfindet.
3. Lyse von Zellen und Lysate Klärung
   1. Lyse der Hefezellen mit einer Kaffeemühle. Lyse Zellen acht bis neun Mal mit 25 sec platzt Schleifen, während die C Schüttelnoffee Mahlwerk. Vor der Verwendung vorge kühlen Sie die Kaffeemühle mit flüssigem Stickstoff. Alle zwei Runden von Schleifen, eine flache Schicht aus flüssigem Stickstoff zu der Mühle hinzufügen und verdampfen lassen.
   2. Rühren Sie mit einem flüssigen Stickstoff gekühlt Spatel nach Bedarf Zellen von Verklumpung zu halten. Vorsicht geboten Auftauen von Zellen zu verhindern, die in Zell Verklumpung führen kann. Die Zellen sollten als feines weißes Pulver nach Lyse erscheinen. Eine maximale Zellpellet von 4 l Hefekultur (~ 40 g) geschliffen zu einer Zeit sein.
      Hinweis: Beobachtungen in Bezug auf Verfahren der Lyse werden im Folgenden erörtert.
   3. Beurteilen Sie den Grad der Zell-Lyse einer Zählkammer oder alternative Zelle Zählmethode verwendet. Um eine angemessene Analyse liefern, nehmen Sie die folgenden Beispiele: (1) vor der Lyse; (2) nach vier Runden der Lyse; und (3) nach Lyse. Um diese Proben zu überprüfen, nehmen Sie eine kleine Menge an Zellen mit einem flüssigen Stickstoff gekühlt Spachtel und in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   4. Sobald Zellen aufgetaut werden, Pipette 5 ul Zellenund mit 495 & mgr; l Wasser mischen. Wenn 40-60% Lyse von Zellen beobachtet wird, mit dem nächsten Schritt im Protokoll verfahren.
      Hinweis: Anmerkungen hinsichtlich Wirkung von langen Perioden der Lyse werden im Folgenden erörtert.
   5. Sobald eine angemessene Lyse beobachtet wird, zu speichern lysierten Zellen (-80 ° C) oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   6. Bereiten zwei 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit jeweils 15 ml Lysis-Puffer, bestehend aus 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Dithiothreitol (DTT) und eines handelsüblichen Cocktail von Proteaseinhibitoren.
      Hinweis: Wenn signifikante Proteolyse beobachtet wird, die Verwendung eines Protease-defiziente Stamm betrachten.
   7. Verwenden Sie ein mit flüssigem Stickstoff gekühlt Spachtel das gefrorene lysierte Zell Pulver in die vorbereiteten 50-ml-Röhrchen zu schöpfen. Fügen Sie die Zelle Pulver / Feststoff schrittweise zu dem Lysepuffer, sowohl ein Reduktionsmittel und Protease-Inhibitor (en) enthält.
   8. Drehen Sie die 50-ml-Röhrchen vorsichtig bei RT, um aufzutauen / die Zellen aufzulösen, sondern auch Blasen Bildung zu verhindern. EINs die Zelle Pulver / Feststoff löst, zusätzliche Zelle fest / Pulver hinzufügen.
   9. Füllen Sie jede der beiden 50-ml-Röhrchen, bis jeweils etwa 20 g Zellen hat oder alle hinzugefügten Zellen. Weiter Auftauen / Auflösung, bis es keine gefrorenen Zellklumpen in den 50-ml-Röhrchen beobachtet werden. Dies sollte etwa 50 Minuten dauern.
   10. Zentrifugieren des suspendierten Zelllysat für 20 Minuten bei 25.000 × g (4 ° C). Gut lysierten Zellen kann eine kleine Menge von schwarzem Niederschlag aufweisen.
   11. Übertragen Sie die 50 ml Überstand Ultrazentrifugenröhrchen auf Polycarbonat (26,3 ml-Röhrchen verwendet wird) und dann werden 10 & mgr; l 200 mM PMSF zu jeder vollen Rohr.
   12. Zentrifuge für 1 Stunde bei 100.000 × g (4 ° C). Vier Schichten sollte sichtbar sein, von unten nach oben: (1) eine harte klare Pellet, ribosomale Komplexe enthält; (2) eine weiche lipidreichen Pellet; (3) eine große, klare gelb-gefärbten Schicht die meisten der Zelle lösliche Proteine ​​und Komplexe enthalten; und (4) eine "schuppig" Deckschicht, bestehend aus Lipiden.
   13. Führen Sie alle subsequent Schritte in einem kalten Raum (4 ° C). Entfernen Sie so viel von der Spitze "schuppig" Lipidschicht wie möglich eine 1 ml-Pipette und entsorgen. Verwenden Sie eine 10 ml serologische Pipette die meisten der gelbe, klare Schicht zu erholen.
   14. Recover die letzten paar ml dieser Schicht mit einer 1 ml Pipette stören die beiden unteren Schichten zu vermeiden. 40 g Nasszellpellet wird in etwa 48 ml der mittleren Schicht typischerweise gewonnen und 8 ml der Lipidschicht entfernt / verworfen.
       Hinweis: Säulenreinigung Fluss stark durch die Anwesenheit von Lipiden behindert wird, die auch die Qualität des Komplexes verringern kann, wie unten diskutiert.

2. Spalte Reinigungsschritt 1: IgG-Chromatographie

1. Resin Equilibrierung und Bindung
   1. Bereiten Sie eine 300 ul IgG Sepharose Aufschlämmung 40 g Zellpellet. Schneiden Sie das Ende einer 1 ml Pipettenspitze Pipettieren der Aufschlämmung zu erleichtern. Wash / äquilibrieren die IgG-Harz drei Mal, jedes Mal mit 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl; 1 mM MgCl _2; 5 mM Imidazol, pH 8, 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, ein Protease - Inhibitor - Tablette pro 50 ml Volumen).
      1. Spin bei 160 xg (4 ° C) zwischen den Wäschen zu pelletieren und zu entfernen Überstand.
   2. Drehen, um die IgG-Harz mit der mittleren Phasenüberstand und zwei Mini Protease-Inhibitor Tabletten pro 40 g der Zellen, einen entsprechenden Rotator, 2 Stunden (4 ° C) verwendet wird. Dies ist die IgG-Batch-Lösung.
   3. Bereiten Sie zwei 10 ml Poly-Prep-Säulen für die Verwendung durch das Ende der Säule Schneiden eines flachen Schnitt zu erzeugen. Um die Verpackung und Waschen der Säule durch Schwerkraftfluss zu beschleunigen, laden ein Maximum von 200 ul gepackten IgG-Harz oder ~ 25 ml der IgG-Batch-Lösung pro 10 ml-Säule.
   4. Gießen Sie die IgG batch-Lösung in die Säule gegeben und durch die Schwerkraft zu sedimentieren. Wenn Sedimentation länger dauert als 30 min, da die meisten wahrscheinlich Lipid Kontamination, wenn die mittlere Phase aus der Zentrifuge t erholtUBEs.
   5. Waschen Sie die gepackten Säule mit vier aufeinanderfolgenden 10 ml-Volumina von IgGD150 Buffer.
2. Auf Spalte TEV - Spaltung
   1. Verschließen Sie den Boden der Säule und 1 ml IgGD150 Puffer und 100 ul TEV-Protease (0,6 mg / ml Lager, mutierten Variante S219V von TEV produziert in-house). Verschließen Sie den Kopf der Kolonne und mischen für 20 min (18 ° C) mit einem Thermomischer bei 750 Umdrehungen pro Minute schütteln. Resuspendieren Harz und 20 min wieder mischen, noch einmal wiederholen für insgesamt 1 Stunde Inkubation.
      Hinweis: Es ist wichtig, auf ein Minimum Zeit der Inkubation zu halten.
   2. Liefert die Säule auf 4 ° C und Eluieren des Protein / Komplex durch die Schwerkraft. Eluieren der Totraumvorrichtung mit zusätzlichen 200 ul IgGD150 Buffer.

3. Spalte Reinigung Schritt 2: Calmodulin-Affinitätschromatographie

1. Resin Equilibrierung und Bindung
   1. Bereiten 200 ul Calmodulin-Affinitätsharz pro 40 g Zellpelletieren. Das Harz wird dreimal, jedes Mal mit 5 ml Calmodulin Bindungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl _2; 5 mM Imidazol, pH 8; 2 mM CaCl _2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-Mercaptoethanol) bei 160 xg (4ºC) zentrifugiert für jede Wäsche zu pelletieren.
   2. Zu je 1 ml IgG-Eluat, fügen Sie 3 Volumen Calmodulin Bindungspuffer. Um die Calciumspiegel konstant zu halten, fügen CaCl ₂ und β-Mercaptoethanol für das Fehlen dieser Bestandteile in der IgG - Elution zu berücksichtigen. Endkonzentrationen sollte 2 mM CaCl ₂ und 10 mM β-Mercaptoethanol sein.
   3. Fügen Sie die Probe auf das Harz und Calmodulin binden, für 1 Stunde (4 ° C) unter Verwendung eines Rohr-Rotator.
2. Verpackung und Eluieren von Calmodulin Harz
   1. Bereiten Sie eine 2 ml Poly-Prep-Säule pro 100 ul Calmodulin Aufschlämmung durch das Ende der Säule Schneiden einer flachen Öffnung zu schaffen. Legen Sie nicht mehr als 100 & mgr; l Calmodulin Slurry pro column die Menge des Harzes, die Probe in Kontakt mit während der Elution kommt, zu minimieren.
   2. Packen Sie die Spalte durch die Schwerkraft und waschen das Harz in der Säule dreimal mit 5 ml Calmodulin Bindungspuffer.
   3. Eluieren Protein unter Zugabe von 200 ul Calmodulin Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl _2; 5 mM Imidazol, pH 8,0, 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-Mercaptoethanol). Wiederholen sechsmal die Zugabe von 200 ul Calmodulin Elutionspuffer.
   4. Für Elutionen 1 bis 3, um das Volumen auf die Säule übernehmen und das Eluat sofort sammeln. Zur Elution 4 dichten den Boden der Säule und Inkubation mit Elutionspuffer für 2,5 min und dann entsiegeln und ermöglichen es durch die Schwerkraft zu eluieren. Zur Elution 5, 5 min inkubieren und dann entsiegeln und ausströmen. Zur Elution 6, 10 min inkubieren und dann entsiegeln und ausströmen.
      Hinweis: Die Integrität des Komplexes kann variieren zwischen Eluierungen / Fraktionen (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt) <./ Li>
   5. Dialysiere Eluierungen 2 bis 6 einzeln über Nacht eine geeignete Mikrodialyseverfahren. Dialysieren um die Fraktionen gegen Dialysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl _2; 5 mM Imidazol, pH 8; 10 mM β-Mercaptoethanol).
      Hinweis: NP-40 nicht nennenswert weitergeben, wenn überhaupt, durch die Dialysemembran.

4. Nachreinigung Analysen Komplexe Qualität beurteilen

1. Nativen Gel und Silberfärbung
   1. Bereiten Sie ein 4 - 16% Fertig nativen Gel zur Analyse des Komplexes gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden eines geeigneten Molekulargewicht-Proteinstandards und Last 15 ul von jedem der dialysierten Calmodulin Elution / Fraktionen auf das Gel.
   2. Elektrophorese, das Gel bei 150 V für etwa 3 Stunden (4 ° C).
   3. Silberfärbung des Gels, die Qualität von jedem der sechs Elutionen zu beurteilen. Alternativ dazu können Sie ebenso sensible GeschäftsFluoreszenzfarbstoff (en). In diesem Stadium ist die Konzentration des Komplexes wahrscheinlich unterhalb der Nachweisgrenze für die Coomassie-Blau-Färbung.
2. Zusätzliche Gel - Analyse - Methoden
   1. Um Protein durch Western Blot erkennen, zu lösen des Komplexes durch SDS oder native PAGE und die Sonde dann das Gel für die Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) Epitop ein TAP-Tag Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
   2. Verwendung eines spezifischen Fluoreszenzfarbstoff (e), bestätigen das Vorhandensein und die Integrität des Proteins und / oder Nukleinsäure in einer TAP gereinigten Komplexes. Achten Sie darauf, dass keine spektrale Überlappung zwischen diesen Flecken festgestellt wird.
3. Negative Stain Elektronenmikroskopie Visualisierung
   1. Verwenden Sie kontinuierliche Kohlenstoff Gitter glow-entladen bei -15 mA für 30 Sekunden, innerhalb von 30 Minuten von komplexen Anwendung.
   2. Bewerben 3 ul TAP gereinigt Komplex (typischerweise bei einer Konzentration von 1 nM) auf Gitter. Inkubieren für eine Minute. Blot fROM mit der Seite des Gitters überschüssigen Puffer zu entfernen.
   3. Wasche zweimal mit 20 & mgr; l Tropfen entionisiertes Wasser. Side-Blot zwischen Wäschen.
   4. Bewerben Gitter auf eine 50 & mgr; l Negativfärbung Tropfen und Inkubation für eine min. Färbung mit Uranylacetat (2%) oder Uranyl-formiat (0,75%) empfohlen.
      Achtung: Uranylsalzen und Lösungen sind schwach radioaktiv und enthalten Schwermetall. Diese sollten mit Sorgfalt und alle Materialien bearbeitet werden, die mit diesen Lösungen in Kontakt kommt, sollte der folgenden institutionellen empfohlen Abfallrichtlinien entsorgt werden.
   5. Wenden Sie Gitter in ein frisches 50 ul negativen Fleck Tropfen, ohne Blotting. Inkubieren für eine min, dann Seite Blot, und schließlich an der Luft trocknen und zu visualisieren.
4. Cryo - Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Visualisierung
   1. Führen Kryo-EM mit TAP gereinigten Komplex, obwohl Optimierung erforderlich sein kann, gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      Hinweis: Das Vorhandensein von Reinigungsmittel in hohen Konzentrationen may behindern Fortschritt und wird unten diskutiert.

5. Komplexe Speicher

1. Vorbereiten Complex für Storage
   1. Konzentriere das komplexe, falls erforderlich, unter Verwendung eines zentrifugalen Filters ein geeignetes Molekulargewicht cut-off für den Komplex ist. Spin bei 14.000 × g für 1 min-Schritten, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.
      Hinweis: NP-40-Konzentration wird in Konzentration erhöhen während die Konzentration, da es nicht durch den Filter noch Dialysemembran nicht passieren.
   2. Blitzeis der Komplex in 30 ul Aliquots in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis gekühlt Ethanol-Bad und dann bei -80 ° C.
2. Optional Nachreinigung Entfernung von Waschmittel

Hinweis: Die Anwesenheit eines Detergens, wie NP-40 und in einer Konzentration über der von seiner kritischen Mizellenkonzentration behindern oder inhibieren Fortschritt für einige Anwendungen. Die Folgen der Entnahme aus dem Protocol sowie Austausch mit anderen Additiven oder Cosolventien werden im Folgenden erörtert. Wenn kein NP-40 erwünscht ist, ist eine Option für die Entfernung einer kommerziellen Anwendung zu verwenden, beispielsweise Bio-beads.

1. Pre-Equilibrat im Handel erhältlichen Waschmittel absorbierenden Perlen in Dialysepuffer. Mischen Sie fünf Perlen pro 30 ul-Komplex (in der Regel bei 10 nM Konzentration).
2. Inkubieren ins Gleichgewicht gebracht Perlen aus Schritt 5.2.1 mit TAP gereinigt Komplex für 15 Minuten auf Eis. Verwenden Komplex innerhalb weniger Stunden nach dem Entfernen des Waschmittels.

Representative Results

Eine modifizierte TAP Methode wurde verwendet , von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, einen 18-Untereinheit Ribonukleoproteinkomplex. Eine anfängliche TAP Reinigung des Komplexes nach dem veröffentlichten Protokoll ^2,3 ergab einen Komplex, der heterogene erschienen, die Migration als drei Bänder auf einem silbergefärbten nativen Polyacrylamidgel (2A). Mehrere Runden der Optimierung des TAP - Methode ergab einen Komplex, der in erster Linie als eine einzelne Bande auf einem nativen Gel , welches eine homogenere Anordnung (2A) migriert. Fluoreszenzfarbstoffe Verwendung sowohl für Protein und Nukleinsäure zu färben, wurde festgestellt , dass das gereinigte Komplex beide Biopolymere hatte vorhanden (2B).

Der gereinigte Komplex wurde auch durch SDS PAGE und Western - Blotting unter Verwendung eines TAP - Tag - Antikörper (3A) analysiert. In Übereinstimmung mit den native Gel Ergebnis zeigte der Komplex gereinigt gemäß dem veröffentlichten Protokoll markiert Proteolyse des TAP-Protein (Snu71). Die Menge der Proteolyse wurde jedoch signifikant mit Änderungen des TAP-Methode reduziert. Fast alle der siebzehn Proteine ​​in der U1 snRNP - Komplexes wurden durch SDS - PAGE aufgelöst und positiv durch MALDI - Massenspektrometrie (3B) identifiziert. Sowie nativen und SDS PAGE, wurden komplexe Qualität in verschiedenen Stadien der Reinigung durch Negativfärbung - Elektronenmikroskopie (Abbildung 4) bewertet. Die monodispersen Teilchen beobachtet in 4A und B , aber abwesend von 4C sind Beispiele für eine gute Probe für strukturelle Studie. Diese Analysemethode kritische Meinung über die Auswirkungen von Änderungen an den TAP-Methode.

Die TAP-Methode fordert die Einbeziehung des nicht-ionischen Detergens NP-40 und bei einer concentration über dem von seiner kritischen Mizellenkonzentration (CMC). Die Robustheit der Verfahren zur Beurteilung der Qualität des Komplexes in dem Protokoll beschrieben sind , auch durch ein Experiment gezeigt , in dem das zwitterionische Tensid CHAPS, Glycerin oder kein Cosolvens für NP-40 ersetzt wurden in allen Puffern (Abbildung 5). Durch die native PAGE und negative Fleck EM, wird die U1 snRNP meisten homogen und stabil in NP-40 mit abnehmenden Stabilität von Chaps kein Co-Lösungsmittel zugegeben zu Glycerin. Es könnte sein, dass die Hefe U1 snRNP eine hydrophobe Fläche aufweist, und das Vorhandensein von NP-40 verhindert die Aggregation durch diese Oberflächenbeschichtung. Leider NP-40 nicht durch Dialyse und Konzentrierung des Komplexes entfernt werden, wird dann die NP-40 konzentrieren. Während die höhere NP-40 nicht um den Komplex zu stören schienen, hat es sich negativ auf das Einfrieren des Partikels in glasartigem Eis für Kryo-EM und großen Mizellen-ähnliche Aggregate auswirken beobachtet wurden. Waschmittel absorbierenden Kügelchen wurden erfolgreich r verwendetemove die Mehrheit der NP-40 von der U1 snRNP Probe ohne auftretende den Komplex strukturell auswirken.

Nach der Reinigung des Komplexes mit den Detailmodifikationen in dem Protokoll, ein Komplex geeignet für sowohl negative stain und Kryo-EM wurde erhalten, wie von Bildern des Rasens von Partikeln und Unterscheidungs ​​repräsentative Klasse Mittelwerte (Abbildung 6) belegt.

Abbildung 1. Übersicht über Tandem Affinity Purification (TAP) Methode. (A) Schematische Darstellung des Zwei - Schritt - TAP - Methode. Komplexe von Interesse (grau) eine TAP markierte Untereinheit (schwarz; U1 snRNP Untereinheit Snu71) genomisch mit einer Sequenz eines Calmodulin-Bindungspeptid (CBP, grün), eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Protease TEV (blau) umfasste verschmolzen, und zwei IgG-Bindungsregionen von Protein A (Pr A , Rot). Im ersten Schritt wird Zelllysat mit einem IgG-Harz inkubiert, und der Komplex wird durch seine Wechselwirkung mit dem Protein A-Sequenz beibehalten. Der Komplex wird aus dem Harz durch TEV vermittelte Spaltung freigesetzt. Im 2. Schritt wird der Komplex mit einem Harz Calmodulin inkubiert, einem Ca ²⁺ abhängigen Reaktion. Der Komplex wird durch Zugabe des Chelators EGTA Ca ²⁺ freigelassen. (B) Western - Blot nach einem TAP markierte Protein durch die Reinigungsschritte in (A) dargestellt ist . Proben wurden von Zelllysat genommen, nach dem ersten Schritt, und nach dem zweiten Schritt des TAP-Methode. Das reaktive Protein in Zellysat beobachtet wandert schneller nach dem ersten Schritt, Spaltung folgende TEV - Protease und damit Verlust der Protein - A - Sequenz. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Optimierung der TAP - Methode. (A) Silber gefärbten nativen Gel von TAP - Komplexe gereinigt. Native PAGE: Proteinstandard (Spur 1); Komplex gereinigt nach original TAP Methode ³ (Spur 2), drei Banden beobachtet (Pfeile); drei aufeinanderfolgenden Elutionen aus demselben TAP Reinigung folgende Änderungen zu puffern, zwei Banden beobachtet (Pfeile) (Bahnen 3 bis 5); weitere Änderungen an der TAP - Methode, die Migration bei ~ 800 kDa in erster Linie eine einzige komplexe Bande ergibt (Spur 6). (B) Analyse der Zusammensetzung eines gereinigten Komplex , der durch einen einzelnen Gelspur mit sowohl Protein- und RNA reaktiven Flecken Anfärbung. Native PAGE: Proteinstandard (Spur 1) mit einem Protein fluoreszierenden Farbstoff gefärbt; Komplex abzubildenden mit Protein Fluoreszenzfarbstoff (Spur 2), zwei Banden beobachtet; Fahrspur in Spur 2, jetzt mit einer Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff (Spur 3) abgebildet wird, zwei Banden beobachtet; und Fluoreszenzsignal überlag von gefärbten Komplex in den Bahnen 2 und 3 (Bahn 4). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Optimierung der TAP - Methode. (A) Western - Blot - Analyse der Verbesserung der komplexen Qualität, etikettiert folgende TAP - Untereinheit Snu71 mit α-TAP - Antikörper sondiert. Mehrere proteolysiertes Banden sichtbar sind zunächst (Spur 1) , aber Verbesserungen reduzieren die Menge der unteren Bänder erheblich (Bahnen 2 und 3). (B) Eine repräsentative SDS - Gel mit einem fluoreszierenden Protein - Gel - Färbung gefärbt. Gel löst 12 der 17 Proteinuntereinheiten des Komplexes. Identität des Proteins in den Banden wurde durch Massenspektrometrie etabliert. Bitte hier klicken , um eine larg anzuzeigener Version dieser Figur.

Abbildung 4. Probenqualität in den Stadien in der TAP - Methode ermittelt durch Negative Stain Elektronenmikroskopie Beurteilung durch eine Negativfärbung - Elektronenmikroskopie komplexer nach. (A) die ^1. Stufe des TAP, (B) der ^2. Stufe von TAP; (C ) Komplex destabilisiert. Maßstabsbalken, 125 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Auswirkungen auf die Probenqualität Zusatzstoffe in TAP Methode Puffer Lanes . 1 - 4 sind die ersten vier Eluierungen des letzten oder ^2. Stufe der TAP Reinigung von complex in Gegenwart von gereinigtem: (A) das nicht-ionische Waschmittel Nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten), (B) das zwitterionische Waschmittel 3 - [(3- Cholamidopropyl) dimethylammonium] -1-propansulfonat (CHAPS), analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten), (C) Glycerin, analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten); und (D) kein Additiv, analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten). Maßstabsbalken, 50 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Visualisierung von TAP - Methode gereinigt Complex. (A) nach oben, ein repräsentatives Bild eines negativen Fleck Elektronen microscopy (EM) mikroskopische Aufnahme. Beobachtet ist ein Rasen von ähnlich geformten Teilchen, zwei sind eingerahmt, durch die optimierte TAP-Verfahren gereinigt. Unten, eine Auswahl der Klasse Mittelwerte der Partikel genommen, die Partikelscheidungsmerkmale hervorzuheben. Maßstabsbalken, 50 nm. (B) nach oben, ein repräsentatives Bild eines Kryo-EM mikroskopische Aufnahme. Beobachtete sind Bereiche höherer Kontrast repräsentativ für Teilchen, boxed zwei solche Regionen zu sehen. Unten, Klasse Mittelwerte von ausgewählten Teilchen in glasigen Eis gefroren. Maßstabsbalken, 50 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die TAP-Methode verwendet zwei Tags, die eine Notwendigkeit für strenge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten leichen. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Darüber hinaus markiert einzelne TAP ORFs von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind, so dass man jeden Hefestamm mit einem markierten Proteins für jede Hefe-Komplex erhalten. Erhaltung der Integrität eines Komplexes und die Verfügbarkeit einer Ressource Verwendung verschiedener tagged Protein-Untereinheiten in einer Anlage für die Reinigung sind zwei Vorteile für die Verwendung des TAP Verfahren zur Reinigung eines nativen Komplexes zu testen. Jedoch wurde die ursprüngliche TAP-Methode Protokoll nicht, um sicherzustellen, entwickelt, dass der Komplex gereinigt kompositionell und strukturell homogen ist. Die TAP-Verfahren wurde deshalb geändert worden ist, wie oben beschrieben, um dieses Ziel zu erreichen.

VerschiedeneSchritte in TAP-Methode bewertet wurden, die optimale Vorgehensweise und Bedingungen zu schaffen, eine Zusammensetzung und strukturelle homogene Komplex zu reinigen. Eine frühe kritische Schritt ist Zell-Lyse. Dieser Schritt erfordert ein Gleichgewicht zwischen einem Wunsch nach einer hohen Ausbeute und damit maximale Lyse, während sichergestellt wird, daß der Komplex von hoher Qualität erhalten, das heißt, homogen ist . Verschiedene Ansätze zur Lyse Hefezellen wurden untersucht, darunter mit einem Wulst-Beater, hohe schiere Flüssigkeit Prozessor und Kugelmühle. Verwendung des weniger teuren Kaffeemühle war weniger effizient als die alternative Methoden (40-60% Lyse), aber der Komplex isoliert und gereinigt erschien monodisperse während mehrere dieser Ansätze erschien ein Aggregationsgrad entweder perturb Partikelintegrität oder verursachen. Am Ende wurden lysiert eine signifikante Anzahl von Zellen nicht, um eine hohe Qualität sicherzustellen Komplex erhalten wurde. Während 40 - 60% Lyse für die Hefe U1 snRNP ideal ist, Optimierung vorgeschlagen wird, wenn dieses Protokoll eine Anwendung neue biologische Komplex.

Es war wichtig, die Schritte des Verfahrens zu identifizieren, die Reinigung zu beschleunigen könnte, um sicherzustellen, dass komplexe Integrität nicht durch zelluläre Proteasen kompromittiert wurde, -Untereinheit Dissoziation infolge der Verdünnung und verlängert Inkubation bei 18 ° C während der TEV-Protease-Spaltung. Eine einfache Schrittzeit effiziente Reinigung zu erreichen war, um sicherzustellen, dass Lipide nicht tragen mehr als aus dem frühen Lysat Klärung, da Lipide Fluss während der Schwere Reinigung behindern. Andere Schritte enthalten eine optimale Balance der Menge Harz und Spaltengröße / Abmessungen identifizieren, um eine effiziente Reinigung und einen maximalen Durchsatz zu erzielen. Ein besonders kritischer Schritt war Zeit von Spalten Spaltung durch TEV-Protease zu reduzieren. Die TEV - Protease verwendet wurde , im Haus gereinigt , es war Protease / nukleasefreiem und bei einer hohen Konzentration ¹⁷ zu gewährleisten. Signifikante Mengen von TEV-Protease wurden in weniger als einer Stunde zu erhalten, eine vollständige Spaltung verwendet.

ontent "> In ersten Proteolyse TAP purifications beobachtet wurde. Die Proteolyse während der Reinigung effizient durch Arbeiten begrenzt werden kann, das Hinzufügen einer Batterie von Inhibitoren, einschließlich in den Reinigungs hohen Salz Wäschen. Eine breite Palette von Protease-Inhibitoren in der ersten Hälfte der Reinigung zugeführt stark verbesserte Protein und komplexer die Stabilität des TAP markiert. Zusätzlich Proteolyse durch Erhöhung der einwertige Konzentration von 300-500 mM während der Zelllyse und IgG Reinigungsschritte minimiert wurde. Selbst bei den obigen Modifikationen an der TAP-Methode eluierte Fraktionen des CBP-Affinitätsharz in ihrem Grad der kompositorischen Homogenität variiert. So selektive Bündelung von Fraktionen aus der zweiten, CBP Chromatographieschritt ab, gerechtfertigt ist.

Ein Aspekt der TAP-Methode, die insbesondere Fokus erhalten, war die Bedeutung des nicht-ionischen Detergens NP-40 bis zu komplexen Reinigung und bei einer Konzentration oberhalb seiner CMC. Das Vorhandensein von NP-40 bei einer Konzentration von 0,08% oder höher hatte eine Gesamtvorteilhafte Wirkung auf komplexe Integrität und die Endausbeute. Die scheinbare positive Wirkung (en) von NP-40 kann teilweise zur Verringerung der nicht-spezifischen Wechselwirkungen zwischen Harz und dem Komplex zurückzuführen sein. Während NP-40 eine vorteilhafte Wirkung bei der Reinigung zu haben scheint, könnte es ohne dass komplexe Aggregations Nachreinigung entfernt werden.

Schließlich kritisch, die TAP-Methode für die strukturelle Studie wurden mehrere komplementäre Assays zur Optimierung verwendet, um die Integrität und Homogenität des Komplexes zu bewerten. Dazu gehörten Lichtstreuung, SDS und native PAGE sondiert den TAP-Antikörper durch Western-Blot und / oder gefärbt mit Fluoreszenzfarbstoffen, sowie negative stain Elektronenmikroskopie. Die Änderungen an den TAP-Verfahren hierin detailliert, ergab eine homogene Komplex in ausreichender Menge für die Elektronenmikroskopie. Weitere Änderungen müssen insbesondere für andere Komplexe, an die TAP-Verfahren hergestellt werden, eine davon abhaltenmung der Bedeutung von NP-40.

Zusammenfassend kann die TAP-Reinigungsverfahren verwendet werden, makromolekulare Komplexe aus einer eukaryotischen Quelle geeigneter Qualität für die Strukturuntersuchung, um erfolgreich zu reinigen. Wir haben ein geeigneter Ansatz für die Reinigung des S. etabliert cerevisiae U1 snRNP und detailliert die Schritte , sowie die Gründe für viele dieser Änderungen übernommen. Für andere Komplexe, schlagen wir vor, dass der Prüfer in ähnlicher Weise die Schritte in dem Protokoll zu erkunden, die ausreichende Mengen und Qualität komplexer ergeben kann. Die Schritte, die umfassen Zelllyse untersucht werden sollten, Salz und additive Art und Konzentrationen einschließlich Detergens und Empfindlichkeit des Komplexes an Calcium- und Metallchelator EGTA. Ferner ist es von entscheidender Bedeutung für Langzeitstudien, dass der Komplex eingefroren und aufgetaut werden können, ohne Struktur stören. Wichtig ist, dass man mehrere alternative Möglichkeiten, die Struktur des Komplexes zu untersuchen, während und nach der Reinigung. Einheimische einnd SDS-PAGE, negativen Fleck EM und Lichtstreuung haben uns gut gedient in unserer Untersuchung, wie am besten zu einem homogenen Komplex mit dem TAP-Verfahren zu reinigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain	Open Biosystems	YSC1177	This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder	Mr. Coffee	IDS77	Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperature controlled shaker
Novex gel system	Thermo Fisher Scientific
IgG resin	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)			Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7326008	Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels
PageRuler protein standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31341	Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium
Dialaysis units	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids	Electron Microscopy Sciences	G400-CP