Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Abstract

approcci purificazione per affinità sono riusciti ad isolare complessi native per la caratterizzazione proteomica. eterogeneità strutturale e un grado di eterogeneità composizionale di un complesso di solito non impediscono progressi nel condurre tali studi. Al contrario, un complesso destinato caratterizzazione strutturale deve essere purificato in uno stato che è sia per composizione e strutturalmente omogeneo, nonché ad una maggiore concentrazione di quanto richiesto per proteomica. Recentemente, ci sono stati progressi significativi nell'applicazione di microscopia elettronica per la determinazione della struttura di grandi complessi macromolecolari. Questo ha accresciuto interesse per approcci per purificare complessi nativi di qualità sufficiente e quantità per la determinazione strutturale di microscopia elettronica. Il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) è stato ottimizzato per estrarre e purificare un 18-subunità, ~ 0.8 MDa assemblaggio ribonucleoproteico dal lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

Molti importanti processi cellulari sono svolte da grande proteina e proteina-RNA complessi ^1. Un collo di bottiglia di eseguire studi biofisici e strutturali tali complessi loro è ottenere una adeguata qualità (cioè, l'omogeneità) e ad una idonea concentrazione. Isolare un complesso da una fonte nativa ha molti vantaggi, tra cui trattenere rilevanti modificazioni post-trascrizionali e / o traslazione di subunità e assicurare il corretto assemblaggio complesso. Tuttavia, grandi complessi cellulari sono spesso presenti in una cellula ad un basso numero di copia e la purificazione devono essere altamente efficiente e verificarsi in condizioni fisiologiche vicino per assicurare l'integrità complesso è mantenuta. Purificare un complesso da una fonte eucariotica è particolarmente impegnativo e può essere finanziariamente proibitivo. Così, le strategie o metodi che siano efficienti e producono un complesso omogeneo sono altamente desiderata.

Una strategia che è statasuccesso nel purificare complessi nativi di cellule eucariotiche per la loro caratterizzazione iniziale è il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) ^2,3. Il metodo TAP è stato inizialmente concepito per purificare una proteina nativa dal lievito in erba (S. cerevisiae) in complesso con l'interazione fattore (s) ^2. Il metodo utilizzato TAP due tag, ogni tag fusa in tandem per la stessa sequenza del gene della proteina-codifica. I tag sono stati selezionati in modo da bilanciare la necessità di rigorosa e selettiva legame una resina di affinità con un desiderio di mantenere condizioni quasi soluzione fisiologica. Questo equilibrio serve a preservare l'interazione stabile (s) della proteina tag con l'interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Il tag TAP genomicamente incorporata è stata posta alla fine (C-terminale) di un gene codificante e consisteva di una sequenza codificante per un Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguita da Protein A - un'aggiunta di poco più di 20 kDa la targhetta proteina. CBP è breve, 26 amminoacidi, e riconosciuti dal ~ 17 kDa proteina calmodulina (CaM) in presenza di calcio con una K _D dell'ordine di 10 ^-9 M ^4. Il tag Proteina A è maggiore, costituito da due ripetizioni di 58 residui con una breve linker tra le ripetizioni. Ogni ripetizione acid 58 amino è riconosciuto da immunoglobulina G (IgG) con K _D ~ 10 ^-8 M ^5. Tra questi due tag è stato incorporato un sito di riconoscimento per il TEV proteasi, un endopeptidasi dal virus Tobacco Etch ^6,7. Come illustrato in figura 1, nella prima fase affinità del metodo TAP etichettato proteina è fissata su una resina IgG tramite la proteina A. La proteina marcata è eluito su colonna di scissione dopo l'aggiunta del TEV proteasi, sito-specifica tra cleaving i due tag. Questo è un passo necessario come l'interazione di IgG e proteina A è molto forte e solo può essere adeguatamente perturbata in condizioni denaturanti soluzione. In mancanza di un Protein Un tag, la proteina si lega alla resina CaM in presenza di calcio e eluita da questa resina con aggiunta di EGTA ione metallico chelante (acido tetraacetico etilenglicole) (Figura 1).

Subito dopo l'introduzione del metodo TAP, è stato utilizzato in uno studio su larga scala per generare un 'map' di interazioni complesse S. cerevisiae ^8. È importante sottolineare che, come conseguenza di questo sforzo un intero telaio di lievito-TAP Tagged Open Reading (ORF) biblioteca, così come TAP individuo etichettato ORF ⁹ sono disponibili da una fonte commerciale. Così, si può ottenere un ceppo di lievito con una proteina codificata per qualsiasi complesso lievito. Il metodo TAP anche stimolato modifiche o varianti del tag TAP, tra cui: il suo utilizzo per la purificazione di complessi provenienti da altri eucariotica così come le cellule batteriche ^10,11; la progettazione di un "tag raggruppati", in cui la proteina A e CBP sono posti su differenti proteine ^​​12; e la tags cambiato, in modo da accogliere la necessità del ricercatore, come la sensibilità del complesso Ca ²⁺ o EGTA ^13.

I recenti progressi sia in strumentazione e metodologie hanno portato a progressi significativi nell'applicazione di microscopia elettronica (EM) per la determinazione della struttura, che hanno portato in alto, nei pressi di immagini atomiche risoluzione di complessi macromolecolari ^14. La risoluzione ottenibile di un complesso di EM, tuttavia, resta subordinata alla qualità del complesso in esame. Questo studio ha utilizzato l'approccio tag TAP per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un 18-subunità (~ 0,8 MDA) a basso numero di copie complesso ribonucleoproteico che fa parte del spliceosome ^15,16. Un certo numero di passi sono stati compiuti per purificare questo complesso tale che è omogenea e di una concentrazione adeguata. Potenziali problemi riscontrati nelle varie fasi della purificazione sono descritti e strategie adottate per superare challEnges evidenziati. Valutando con attenzione e ottimizzando passi nella purificazione, l'U1 snRNP purificato è di una qualità e ad un quantitativo adatto per macchia negativa e (crio-EM) studi di elettroni crio microscopia. Un metodo ottimizzato protocollo TAP per la purificazione di complessi native per studi strutturali è descritta nel presente documento.

Protocol

Nota: Il seguente protocollo è stato ideato per la purificazione di un complesso da 4 L di coltura cellulare, a circa 40 g di peso umido di cellule. Una volta preparato, tutti i buffer devono essere conservati a 4 ° C ed utilizzati entro un mese della loro preparazione. Ridurre gli inibitori della proteasi e agenti vengono aggiunti ai buffer appena prima dell'uso.

1. Preparazione di tutta la cella estratto per Tandem Affinity Purification

1. La crescita di S. cellule cerevisiae
   1. Streak TAP desiderata contrassegnata S. ceppo cerevisiae da stoccaggio (-80 ° C) su un destrosio lievito peptone (YPD) piatto. Incubare per 3 - 5 giorni (30 ° C), fino a quando le cellule di lievito appaiono bianchi e soffici.
   2. Seminare una striscia di circa 2 mm ² delle cellule fresche dalla piastra in 10 ml supporti YPD in 50 ml conica in polipropilene provetta da centrifuga. Agitare la provetta a 180 giri al minuto (rpm) per una notte (30m ° C).
   3. Seminare 2 ml di sopracultura notte per litro di supporti YPD in 2 L Erlenmeyer o beuta. Agitare a 180 rpm (30 ° C). Monitorare la crescita delle cellule ad una densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ fino fase logaritmica tardiva, OD ₆₀₀ di 1,8 a 2, tipicamente 20 - 24 ore.
2. Raccolta S. cellule cerevisiae
   1. Celle di raccolta per centrifugazione a 5.400 xg per 15 minuti (4 ° C).
   2. decantare rapidamente il supernatante e mantenere le cellule a 4 ° C o su ghiaccio.
   3. Sospendere ogni litro di pellet con 2 ml refrigerati Lysis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazolo, pH 8,0; 10% glicerolo; 0,1% v / v NP-40). Sospendere le cellule da vorticoso e / o ripetere pipettaggio utilizzando una pipetta 10 ml sierologico.
      Nota: L'importanza di NP-40 in quanto riguarda la qualità e la complessa analisi post-purificazione è discusso qui di seguito.
   4. Trasferire la sospensione cellulare in un vuoto da 50 ml conica in polipropilene tubo da centrifuga kEPT sul ghiaccio. Lavare ogni bottiglia centrifuga con ulteriori 2 ml di tampone di lisi e raffreddato aggiungere alla sospensione cellulare nel tubo 50 ml.
   5. Determinare il peso umido del pellet cellulare pesando il tubo e sottraendo il peso del tubo vuoto, nonche la aggiunto Lysis Buffer.
      Nota: Un litro di coltura cellulare avente un diametro esterno ₆₀₀ di 1,8 è di circa 10 g.
   6. Creare un bagno di azoto liquido in un 50 ml provetta da centrifuga conica polipropilene. Disegnare cellule sospese in una siringa da 5 ml. Collegare un ago 16 G alla siringa. Bloccare la sospensione cellulare facendolo passare attraverso la siringa / ago per generare cellule "goccioline". Tasso di congelamento dovrebbe essere di circa 1 min / ml.
   7. Conservare le goccioline di cellule congelate (-80 ° C) o procedere alla lisi.
3. Lisi Cellule e lisato Chiarimento
   1. Lyse le cellule di lievito con un macinino da caffè. cellule Lisare otto a nove volte con 25 secondi di rettifica scoppi, mentre agitando il csmerigliatrice Offee. Prima dell'uso, pre-raffreddare il macinacaffè con azoto liquido. Ogni due turni di rettifica, aggiungere uno strato superficiale di azoto liquido per il macinino e lasciare evaporare.
   2. Mescolare con una spatola di azoto liquido refrigerato come necessario per mantenere le cellule di aggregazione. Fare attenzione per evitare lo scongelamento delle cellule, che può risultare in aggregazione delle cellule. Le cellule dovrebbero apparire come una polvere bianca dopo lisi. Un pellet massima cellulare da 4 L di coltura di lievito (~ 40 g) può essere terra alla volta.
      Nota: Osservazioni sul metodo di lisi sono discussi di seguito.
   3. Valutare il grado di lisi delle cellule utilizzando un emocitometro o metodo di conteggio delle cellule alternativo. Per fornire un'adeguata analisi, prendere i seguenti esempi: (1) prima di lisi; (2) dopo quattro turni di lisi; e (3) dopo lisi. Per controllare questi campioni, prendere una piccola quantità di cellule con una spatola di azoto raffreddato liquido e posto in una provetta da 1,5 ml.
   4. Una volta che le cellule sono scongelati, pipetta da 5 ml di cellulee mescolare con 495 ml di acqua. Se 40 - si osserva il 60% lisi delle cellule, procedere al passo successivo nel protocollo.
      Nota: Osservazioni sul effetto di lunghi periodi di lisi sono discussi di seguito.
   5. Una volta adeguata lisi si osserva, negozio lisate cellule (-80 ° C) o passare alla fase successiva.
   6. Preparare due provette da 50 ml per centrifuga conica polipropilene ciascuna con 15 ml tampone di lisi, tra 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), 1 mM ditiotreitolo (DTT), e un cocktail disponibile in commercio di inibitori delle proteasi.
      Nota: Se si osserva proteolisi significativo, considerare l'uso di una proteasi ceppo carente.
   7. Utilizzare una spatola di azoto liquido refrigerato per raccogliere la polvere delle cellule lisato congelato nei preparati provette da 50 ml. Aggiungere la polvere di cellule / solido incrementale al Lysis Buffer, contenente sia un riducente e inibitore della proteasi (s).
   8. Ruotare i tubi 50 ml dolcemente RT modo da scongelare / sciogliere le cellule, ma anche per prevenire la formazione di bolle. UNs la polvere di cellule / dissolve solidi, aggiungere delle cellule ulteriore solido / polvere.
   9. Riempire ciascuno dei due tubi 50 ml fino ognuno ha circa 20 g di cellule o di tutte le cellule aggiunti. Continuare scongelamento / dissoluzione fino a quando non ci sono grumi di cellule congelate osservati nei tubi da 50 ml. Questo dovrebbe durare circa 50 minuti.
   10. Centrifugare il lisato cellulare sospeso per 20 minuti a 25.000 xg (4 ° C). cellule ben lisate possono presentare una piccola quantità di precipitato nero.
   11. Trasferire i 50 ml di surnatante in policarbonato tubi ultra-centrifuga (26.3 ml tubi usati) e aggiungere 10 ml 200 mm PMSF ad ogni provetta piena.
   12. Centrifuga per 1 ora a 100.000 xg (4 ° C). Quattro strati devono essere visibili, dal basso verso l'alto: (1) un disco chiaro pellet, contenente complessi ribosomiale; (2) una morbida pallina ricchi di lipidi; (3) un grande livello giallastra trasparente contenente più di proteine ​​e complessi solubili della cellula; e (4) uno strato superiore 'squamosa' costituito da lipidi.
   13. Eseguire tutte le spassi ubsequent in una stanza fredda (4 ° C). Rimuovere la maggior quantità di alto strato lipidico 'squamosa' possibile, utilizzando una pipetta 1 ml e scartare. Utilizzare una pipetta ml sierologico 10 di recuperare la maggior parte del colore giallo, strato trasparente.
   14. Recuperare gli ultimi ml di questo strato con una pipetta 1 ml per evitare di disturbare i due strati inferiori. Da 40 g pellet cellulare bagnato, circa 48 ml di strato centrale è in genere recuperati e 8 ml di strato lipidico rimossi / scartati.
       Nota: flusso purificazione colonna è fortemente ostacolato dalla presenza di lipidi, che può anche ridurre la qualità del complesso, discusso sotto.

2. Purificazione passo Colonna 1: IgG cromatografia

1. Resina Equilibration e rilegatura
   1. Preparare una 300 ml IgG Sepharose liquami per 40 g di pellet. Tagliare l'estremità di una punta pipetta 1 ml per facilitare il pipettaggio il liquame. Lavare / equilibrare la resina IgG tre volte, ogni volta con 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 5 mM imidazolo, pH 8; 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, una tavoletta inibitore della proteasi per 50 Volume ml).
      1. Spin a pellet a 160 g (4 ° C) tra i lavaggi e rimuovere il surnatante.
   2. Ruotare la resina IgG con il surnatante fase intermedia e due mini compresse inibitore della proteasi per 40 g di cellule, utilizzando un rotatore appropriata, per 2 ore (4 ° C). Questa è la soluzione lotto IgG.
   3. Preparare due 10 ml colonne poli-prep uso tagliando la fine della colonna per produrre un taglio piatto. Per accelerare l'imballaggio e lavaggio della colonna mediante flusso per gravità, caricare un massimo di 200 ml di resina IgG imballato o ~ 25 ml della soluzione di lotto IgG per 10 ml di colonna.
   4. Versare la soluzione lotto IgG nella colonna e lasciar sedimentare per gravità. Se sedimentazione richiede più di 30 minuti, non più probabile era contaminazione lipidico quando recuperare la fase centrale dalla centrifuga tUBE.
   5. Lavare la colonna imballato con quattro successive 10 ml volumi di IgGD150 tampone.
2. Sulla colonna di fenditura TEV
   1. Sigillare la parte inferiore della colonna e aggiungere 1 ml di IgGD150 tampone e 100 ml di TEV proteasi (0,6 mg / ml magazzino, mutante variante S219V di TEV prodotto in-house). Sigillare la parte superiore della colonna e miscelare per 20 min (18 ° C) utilizzando un miscelatore termico, agitando a 750 rpm. resina Risospendere e mescolare ancora per 20 minuti, ripetere una volta di più, per un totale di 1 ora di incubazione.
      Nota: E 'fondamentale per mantenere il tempo di incubazione al minimo.
   2. Riportare la colonna 4 ° C ed eluire la proteina / complesso per gravità. Eluire il volume morto con altri 200 ml di IgGD150 tampone.

3. colonna di purificazione Fase 2: Calmodulina affinità e cromatografia

1. Resina Equilibration e rilegatura
   1. Preparare 200 ml di resina di affinità Calmodulina per 40 g di cellulepellet. Lavare la resina tre volte, ogni volta con 5 ml Calmodulin Binding Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 5 mM imidazolo, pH 8; 2 mM CaCl _2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo), centrifugazione a 160 xg (4 ° C) a pellet per ogni lavaggio.
   2. Per ogni eluato 1 ml IgG, aggiungere 3 volumi di Calmodulina Binding Buffer. Per mantenere il livello di calcio costante, aggiungono CaCl ₂ e β-mercaptoetanolo per spiegare la mancanza di tali componenti, l'eluizione IgG. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 2 mm CaCl ₂ e 10 mm β-mercaptoetanolo.
   3. Aggiungere il campione alla resina Calmodulin e legarsi per 1 ora (4 ° C) usando un rotatore tubo.
2. Imballaggio ed eluendo da Calmodulina Resina
   1. Preparare una colonna poli-prep 2 ml per 100 microlitri slurry Calmodulin tagliando la fine della colonna per creare un'apertura piatta. Caricare non più di 100 ml Calmodulina liquami per colonna per minimizzare la quantità di resina campione viene a contatto con durante l'eluizione.
   2. Riempire la colonna per gravità e lavare la resina nella colonna tre volte con 5 ml Calmodulin Binding Buffer.
   3. Eluire proteina con aggiunta di 200 microlitri Calmodulina tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 5 mM imidazolo, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo). Ripetere sei volte l'aggiunta di 200 ml di tampone di eluizione calmodulina.
   4. Per eluizioni 1 a 3, applicare il volume della colonna e raccogliere immediatamente l'eluato. Per eluizione 4, sigillare il fondo della colonna e incubare con tampone di eluizione per 2,5 minuti e poi unseal e si eluisce per gravità. Per eluizione 5, incubare per 5 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire. Per eluizione 6, incubare per 10 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire.
      Nota: L'integrità del complesso può variare tra eluizioni / frazioni (vedere la sezione rappresentativa risultati) <./ Li>
   5. Dializzare eluizioni 2 a 6 singolarmente notte utilizzando un metodo di dialisi micro appropriata. Dializzare frazioni contro Dialysis tampone (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 5 mM imidazolo, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanolo).
      Nota: NP-40 non passa sensibilmente, se non del tutto, attraverso la membrana di dialisi.

4. Le analisi post-depurazione per valutare la qualità Complex

1. Native Gel e argento colorazione
   1. Preparare un 4 - gel nativo prefabbricati 16% per l'analisi del complesso secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare un apposito standard di proteine ​​di peso molecolare e carico 15 ml di ciascuna delle Calmodulina eluizione / frazioni dializzati sul gel.
   2. Elettroforesi il gel a 150 V per circa 3 ore (4 ° C).
   3. Argento macchia il gel per valutare la qualità di ciascuna delle sei eluizioni. In alternativa, utilizzare commerciale ugualmente sensibilimacchia fluorescente (s). In questa fase, la concentrazione del complesso è più probabile di sotto del livello di rilevamento per Coomassie blue colorazione.
2. Ulteriori Gel Metodi di analisi
   1. Per rilevare la proteina mediante Western blotting, risolvere il complesso da SDS o PAGE nativo e quindi sondare il gel per l'epitopo Calmodulina Binding Peptide (CBP) utilizzando un anticorpo tag TAP secondo le istruzioni del produttore.
   2. Utilizzando un colorante fluorescente specifico (s), confermare la presenza e l'integrità delle proteine ​​e / o acido nucleico in un complesso di rubinetto depurata. Fare attenzione che non viene rilevato alcun sovrapposizione spettrale tra queste macchie.
3. Negativo visualizzazione Stain Electron Microscopy
   1. Utilizzare le griglie di carbonio continue glow-scaricata a -15 mA per 30 secondi, in 30 minuti di applicazione complessa.
   2. Applicare 3 ml di TAP purificato complesso (tipicamente ad una concentrazione di 1 nM) alla griglia. Incubare per un minuto. blot fROM lato della griglia per rimuovere l'eccesso di buffer.
   3. Lavare due volte con 20 gocce microlitri di acqua deionizzata. macchia laterale tra un lavaggio.
   4. Applicare griglia per un 50 microlitri negativo goccia macchia e incubare per un min. Si raccomanda di colorazione con acetato di uranile (2%) o uranile formiato (0,75%).
      Attenzione: sali e soluzioni di uranile sono debolmente radioattivo e contengono metalli pesanti. Questi dovrebbero essere maneggiati con cura e tutto il materiale che entra in contatto con queste soluzioni devono essere smaltiti secondo le linee guida consigliate rifiuti istituzionali.
   5. Applicare griglia per un fresco 50 ml goccia macchia negative, senza assorbente. Incubare per un minuto, poi il lato macchia, e infine asciugare all'aria e visualizzare.
4. Cryo Microscopia Elettronica (crio-EM) Visualizzazione
   1. Eseguire crio-EM con TAP purificato complesso, anche se l'ottimizzazione può essere necessario, secondo il protocollo del produttore.
      Nota: Presenza di detersivo a concentrazioni alte may impedire il progresso e è discusso qui di seguito.

5. stoccaggio Complex

1. Preparazione complesso per bagagli
   1. Concentrare il complesso, se necessario, utilizzando un filtro centrifugo avente un peso molecolare di cut-off appropriato per il complesso. Spin a 14000 g per incrementi di 1 min fino a raggiungere la concentrazione desiderata.
      Nota: concentrazione NP-40 aumenterà in concentrazione durante concentrazione, in quanto non passa attraverso la membrana del filtro nè dialisi.
   2. Flash congelare il complesso in 30 aliquote microlitri in azoto liquido o ghiaccio secco raffreddato bagno di etanolo e poi conservare a -80 ° C.
2. La rimozione post-purificazione opzionale di detersivo

Nota: La presenza di un detergente tipo NP-40 e ad una concentrazione superiore a quella della sua concentrazione critica micellare può ostacolare o inibire il progresso per alcune applicazioni. Le conseguenze della sua rimozione dal protoCol così come la sostituzione con altri additivi o co-solventi sono discussi di seguito. Se nessun NP-40 è desiderato, una possibilità è quella di utilizzare una applicazione commerciale per la rimozione, ad esempio Bio-perline.

1. Pre-equilibrare disponibili in commercio detergenti assorbire perline in Dialisi buffer. Mescolare cinque perle per 30 ml di complesso (di solito a 10 concentrazioni nM).
2. Incubare perline equilibrate dal punto 5.2.1 con TAP complesso purificato per 15 min in ghiaccio. Utilizzare complesso entro poche ore dalla rimozione di detersivo.

Representative Results

Un metodo TAP modificata è stata usata per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un complesso ribonucleoproteina 18 subunità. Una purificazione TAP iniziale del complesso seguendo il ^2,3 protocollo pubblicato ha prodotto un complesso che è apparso eterogenea, la migrazione di tre bande su un argento macchiate gel di poliacrilammide nativo (Figura 2A). Molteplici cicli di ottimizzazione del metodo TAP, ha prodotto un complesso che migrato principalmente come una singola banda su gel nativo indicativo di un gruppo più omogenea (Figura 2A). Utilizzando coloranti fluorescenti colorare per proteine ​​e acidi nucleici, si è stabilito che il complesso purificato aveva entrambe biopolimeri presente (Figura 2B).

Il complesso purificato è stato analizzato anche mediante SDS PAGE e Western blotting utilizzando un anticorpo tag TAP (Figura 3A). Coerentemente con i Native risultato gel, il complesso purificato secondo il protocollo pubblicato esposto proteolisi del TAP etichettato proteina (Snu71). La quantità di proteolisi, tuttavia, è stato significativamente ridotto con modificazioni del metodo TAP. Quasi tutti i diciassette proteine ​​del complesso U1 snRNP sono stati risolti mediante SDS PAGE e positivamente identificati con spettrometria di massa MALDI (Figura 3B). Oltre nativa e SDS PAGE, qualità complesso è stata valutata in diverse fasi della purificazione mediante microscopia macchia elettrone negativo (Figura 4). Le particelle monodisperse osservate nella Figura 4A e B, ma di assenza dal 4C sono esempi di buon campione per lo studio strutturale. Questo metodo di analisi ha fornito una visione critica quanto riguarda l'impatto delle modifiche al metodo di TAP.

Il metodo TAP prevede l'inserimento del detergente non ionico NP-40 e ad una concentration sopra quello della sua concentrazione micellare critica (CMC). La robustezza dei metodi per valutare la qualità del complesso descritto nel protocollo sono ben dimostrato da un esperimento in cui la zwitterionica CHAPS tensioattivo, glicerolo o no co-solvente sono stati sostituiti per NP-40 in tutti i buffer (Figura 5). Con PAGE nativo e EM macchia negativo, l'U1 snRNP appare più omogenea e stabile nel NP-40 con la diminuzione della stabilità da CHAPS a glicerolo a nessun co-solvente aggiunto. Potrebbe essere che la snRNP U1 lievito ha una faccia idrofoba e la presenza di NP-40 impedisce l'aggregazione ricoprendo questa superficie. Purtroppo, NP-40 non può essere rimosso mediante dialisi e concentrando il complesso sarà poi concentrare la NP-40. Mentre l'alto NP-40 non sembra perturbare il complesso, ha un impatto negativo il congelamento della particella in ghiaccio vitreo per crio-EM e grandi aggregati micellari simili sono stati osservati. Detergenti perline assorbenti sono stati utilizzati con successo per rimuovi la maggioranza della NP-40 dal campione U1 snRNP senza apparire di influenzare il complesso strutturalmente.

Dopo la purificazione del complesso con le modifiche descritte nel protocollo, un complesso adatto sia colorazione negativa e crioconservati EM è stato ottenuto, come evidenziato dalle immagini del prato delle particelle e medie classe rappresentativi distintivi (Figura 6).

Figura 1. Panoramica di Tandem Affinity Purification (TAP) Metodo. (A) Schema del metodo di TAP in due fasi. Complesso di interesse (grigio) comprende un TAP etichettato subunità (nero; U1 snRNP subunità Snu71) genomicamente fusa con una sequenza comprendente un Calmodulina Binding Peptide (CBP, verde), un sito di riconoscimento per la proteasi specifico del sito TEV (blu), e due IgG vincolanti regioni della proteina A (Pr A , Rosso). Nel primo passaggio, lisato cellulare viene incubato con una resina IgG e il complesso viene mantenuto attraverso la sua interazione con la proteina A sequenza. Il complesso viene rilasciato dalla resina mediante scissione TEV mediata. Nella seconda fase, il complesso viene incubato con una resina Calmodulina, un Ca ²⁺ reazione dipendente. Il complesso viene rilasciato tramite aggiunta di Ca ²⁺ chelante EGTA. (B) Western blot dopo un TAP etichettato proteina attraverso le fasi di purificazione illustrati in (A). Sono stati prelevati campioni di lisato cellulare, dopo la prima fase, e dopo il 2 ° fase del metodo TAP. La proteina reattiva osservata nel lisato cellulare migra più velocemente dopo il 1 ° passo, seguendo TEV proteasi scissione e quindi la perdita della proteina Una sequenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. L'ottimizzazione del metodo TAP. Argento (A) macchiato gel nativo di TAP purificato complessi. PAGINA nativo di: standard di proteine ​​(corsia 1); complessi purificato secondo il metodo originale TAP ³ (corsia 2), tre bande constatato (punte di freccia); tre eluizioni consecutivi dalla stessa purificazione TAP seguenti modifiche al buffer, due bande osservate (punte di freccia) (corsie 3 - 5); ulteriori modifiche al metodo di TAP, che producono principalmente una singola banda complessa migrazione a ~ 800 kDa (corsia 6). (B) Analisi della composizione di un complesso purificato colorando una sola corsia gel con proteine ​​e macchie reattivi RNA. PAGINA nativo di: standard di proteine ​​(corsia 1) macchiato con una macchia fluorescente delle proteine; complesso ripreso con macchia proteina fluorescente (corsia 2), due bande osservate; stessa corsia in corsia 2, ora ripreso con una macchia fluorescente acido nucleico (corsia 3), due bande osservate; e segnale fluorescente sulaici del complesso colorato in corsie 2 e 3 (corsia 4). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Ottimizzazione del metodo TAP. (A) Analisi Western Blot di miglioramento della qualità complesso, a seguito di TAP tagged subunità Snu71 sondato con l'anticorpo α-TAP. Diverse bande proteolyzed sono visibili inizialmente (corsia 1), ma miglioramenti riducono la quantità di bande inferiori considerevolmente (corsie 2 e 3). (B) un rappresentante gel SDS macchiato con una fluorescente macchia gel proteico. Gel risolve 12 dei 17 subunità proteiche del complesso. Identità di proteine ​​nelle bande è stato istituito con la spettrometria di massa. Clicca qui per visualizzare un largversione er di questa figura.

Figura 4. Qualità di esempio nelle fasi del metodo TAP Valutazione effettuta da Negative Stain Electron Microscopy Valutazione da negativo al microscopio elettronico a macchia di dopo complesso:. (A) 1 ^° fase di TAP; (B) la fase 2 ^° di TAP; (C ) complesso destabilizzato. Barra di scala, 125 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Impatto sulla qualità del campione di additivi presenti nel metodo alfanumerico buffer Lanes 1 -. 4 sono i primi quattro eluizioni del passo finale o 2 ^° di TAP purificazione della complex purificato in presenza di: (A) il non-ionico detergente nonil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analizzato mediante PAGE nativa (in alto) e colorazione negativa EM (inferiore); (B) il detergente zwitterionico 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), analizzato da PAGE nativo (in alto) e macchia negativa EM (in basso), (C) glicerolo, analizzato da PAGE nativo (in alto) e EM macchia negativo (in basso); e (D) senza additivi, analizzato da PAGE nativo (in alto) e macchia negativa EM (in basso). Barra della scala, 50 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Visualizzazione del metodo di rubinetto depurata Complex. (A) alto, un'immagine rappresentativa di un elettrone microsco macchia negativopy (EM) al microscopio. Osservato è un prato di particelle di forma simile, due sono inscatolato, purificato con il metodo TAP ottimizzato. In basso, una selezione delle medie di classe prese delle particelle che mettono in risalto le caratteristiche distintive delle particelle. Barra della scala, 50 nm. (B) superiore, un'immagine rappresentativa di una microfotografia crio-EM. Osservati sono regioni di maggior rappresentante contrasto delle particelle, vedere due queste regioni in scatola. In basso, medie classe di particelle selezionate congelate in ghiaccio vitreo. Barra della scala, 50 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il metodo TAP utilizza due tag che bilanciano la necessità di rigorosa e selettiva legame con una resina di affinità con un desiderio di mantenere vicino a condizioni di soluzioni fisiologiche. Questo equilibrio serve a preservare l'interazione stabile (s) della proteina tag con l'interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Inoltre, TAP individuo etichettato ORF sono disponibili da una fonte commerciale, in modo che si può ottenere qualsiasi ceppo di lievito con una proteina codificata per qualsiasi complesso lievito. Preservare l'integrità di un complesso e la disponibilità di una risorsa per testare uso di differenti subunità proteiche targhette in un complesso di purificazione sono due vantaggi per utilizzando il metodo TAP per purificare un complesso nativa. Tuttavia, il protocollo del metodo TAP originale non è stato concepito per assicurare che il complesso purificato è composizionale e strutturalmente omogeneo. Il metodo TAP è stato quindi modificato, come specificato in precedenza, per raggiungere questo obiettivo.

variopassi nel metodo TAP sono stati valutati per stabilire l'approccio ottimale e le condizioni per purificare un compositiva e complesso omogeneo strutturale. Un passo fondamentale precoce è la lisi cellulare. Questo passaggio richiede un equilibrio tra il proprio desiderio di un alto rendimento e la massima lisi, mentre assicurando che il complesso ottenuto è di alta qualità, cioè, omogenea. Diversi approcci per cellule di lievito lisi sono state esplorate, anche utilizzando una perlina-battitore, alta processore fluido pura, e mulino a sfere. Uso del macinacaffè meno costosa era meno efficiente rispetto ai metodi alternativi (40 - 60% di lisi), ma il complesso isolato e purificato apparso monodisperse mentre molti di questi approcci sembravano sia integrità particelle perturbare o provocare un grado di aggregazione. Alla fine, un numero significativo di cellule non sono state lisate in modo da garantire complesso di alta qualità è stato ottenuto. Mentre 40 - 60% lisi è l'ideale per la snRNP U1 lievito, l'ottimizzazione è suggerito in sede di applicazione di questo protocollo a un nuovo complesso biologico.

Era fondamentale individuare le fasi del metodo che potrebbero accelerare purificazione per assicurare che l'integrità complesso non è stata compromessa da proteasi cellulari, subunità di dissociazione a causa della diluizione, ed esteso incubazione a 18 ° C durante TEV proteasi clivaggio. Un semplice passo per ottenere il tempo di purificazione efficace era quello di assicurare che i lipidi non portavano sopra dei primi del chiarimento lisato, dal momento che i lipidi ostacolare il flusso durante la purificazione gravità. Altri passi inclusi individuando un equilibrio ottimale tra le quantità di resina e di colonna di formato / dimensioni per raggiungere la purificazione efficiente e una portata massima. Un passo particolarmente critico è stato quello di ridurre i tempi di on colonna di scissione da TEV proteasi. La proteasi TEV utilizzato è stato purificato in casa per garantire che siano proteasi / nucleasi gratuito e ad alta concentrazione ^17. Quantità significative di TEV proteasi sono stati usati per ottenere la completa scissione in meno di un'ora.

è stata osservata ontent "> In primo purificazioni TAP proteolisi. proteolisi durante la purificazione può essere limitata da lavorare in modo efficiente, aggiungendo una batteria di inibitori, compreso nella purificazione alte lavaggi sale. Una vasta gamma di inibitori della proteasi forniti nella prima metà della purificazione notevolmente migliorata la stabilità del TAP etichettato proteine ​​e complesso. Inoltre, proteolisi è stato minimizzato aumentando la concentrazione monovalente di 300 a 500 mM durante la lisi cellulare e gradini IgG di purificazione. Anche con le modifiche di cui sopra al metodo TAP, successiva eluizione frazioni al largo della resina di affinità CBP variato nel loro grado di omogeneità compositiva. Così, messa in comune selettivo delle frazioni a partire dal secondo, passo cromatografia CBP, è giustificata.

Un aspetto del metodo di TAP che ha ricevuto particolare attenzione è stata l'importanza del detergente non ionico NP-40 per la purificazione complesso e ad una concentrazione superiore al suo CMC. La presenza di NP-40 ad una concentrazione di 0,08% o superiore ha avuto un effetto benefico complessiva sull'integrità complesso e la resa finale. L'effetto benefico apparente (s) di NP-40 può essere dovuto in parte alla riduzione interazioni non specifiche tra resina e complesso. Mentre NP-40 sembra avere un effetto benefico durante la purificazione, che possa essere rimosso dopo purificazione senza causare aggregazione complessa.

Infine, fondamentale per ottimizzare il metodo TAP per studio strutturale erano diverse analisi complementari utilizzate per valutare l'integrità e l'omogeneità del complesso. Questi light scattering incluso, SDS PAGE e nativo sondate utilizzando l'anticorpo TAP mediante Western blot e / o tinto con coloranti fluorescenti, così come la microscopia macchia elettrone negativo. Le modifiche apportate al metodo TAP descritto nel presente documento, ha prodotto un complesso omogeneo in quantità sufficienti per la microscopia elettronica. Ulteriori modifiche possono essere necessario apportare al metodo di TAP per altri complessi, in particolare un deterrenteminazione dell'importanza di NP-40.

In sintesi, il metodo di purificazione TAP può essere usato con successo per purificare complessi macromolecolari da una fonte eucariotico di qualità adatta per studio strutturale. Abbiamo stabilito un metodo adatto per la purificazione del S. cerevisiae U1 snRNP e dettaglio le misure adottate, nonché la logica per molti di questi cambiamenti. Per gli altri complessi, si suggerisce che il ricercatore allo stesso modo di esplorare i passaggi nel protocollo, che possono produrre quantità e la qualità del complesso adeguate. I passi che devono essere esaminati includono la lisi cellulare, il sale e il tipo di additivo e le concentrazioni tra cui un detergente, e la sensibilità del complesso di calcio e chelante metallo EGTA. Inoltre, è fondamentale per gli studi a lungo termine che il complesso può essere congelati e scongelati senza perturbare la struttura. Importante, si dovrebbe avere diversi modi alternativi per saggiare la struttura del complesso durante e dopo la purificazione. Native unND SDS PAGE, EM macchia negativo, e diffusione della luce ci hanno servito bene nella nostra indagine del modo migliore per purificare un complesso omogeneo utilizzando il metodo TAP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain	Open Biosystems	YSC1177	This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder	Mr. Coffee	IDS77	Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperature controlled shaker
Novex gel system	Thermo Fisher Scientific
IgG resin	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)			Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7326008	Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels
PageRuler protein standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31341	Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium
Dialaysis units	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids	Electron Microscopy Sciences	G400-CP