Summary
Utnytte pasient avledet svulster i en subkutan preklinisk modell er en utmerket måte å studere effekten av nye behandlingsformer, prediktiv biomarkører, og resistente veier. Denne modellen, i stoffet utviklingsprosessen, er avgjørende for å bestemme skjebnen til mange nye anti-kreft terapi før klinisk undersøkelse.
Introduction
Tykktarmskreft (CRC) er en betydelig bidragsyter til kreftdødsfall i USA. I 2015 var det anslagsvis 132,700 nye tilfeller av CRC med 49,700 dødsfall 1. Selv om prognosen hos pasienter med lokalisert sykdom er utmerket, pasienter med avansert sykdom har dårlige resultater, noe som gjør dette til en stor prioritet i utviklingen av nye behandlingsformer. Til tross for standard of care kjemoterapeutiske regimer og nyere biologiske som er utplassert mot denne sykdommen, har det vært bare en trinnvis økning i total overlevelse. Følgelig er det en betydelig innsats i å forstå driver trasé som er involvert i å tilrettelegge tumorvekst i denne sykdommen. Kreft Genome Atlas Network har nylig identifisert en rekke hovedveier som er innblandet i CRC feilregulering og inkluderer: WNT, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), RAS, transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) og TP53 to. Sammen med undersøkelser som beskriver othennes veier som forsterker veksten i CRC har antent utviklingen av nyere behandlingsformer rettet mot betydelig bedre overlevelse hos denne pasientgruppen 3-5. Utnytte prekliniske modeller i onkologi narkotika utvikling har vært viktig i denne prosessen i å forutsi den kliniske aktiviteten til disse nye forbindelser.
har vært benyttet ulike prekliniske modeller i narkotika utviklingsprosessen. Tatt i betraktning at prekliniske transgene dyremodeller og foreviget cellelinjer har vært mislykket i å bestemme den kliniske aktiviteten av nye kreftbehandlinger, hovedsakelig på grunn av deres manglende evne til å reflektere kompleksiteten i menneskelige svulster, er det etablert pasient-avledet tumor xenograft (PDTX) modeller. Den største fordelen med denne modellen er at svulsten heterogenitet forblir intakt og tett reflekterer de molekylære egenskaper og klonalitet av opprinnelses pasienten svulst 6-9. PDTX modeller gir en utmerket in vivopreklinisk plattform for å studere nye midler, narkotika motstand trasé, kombinatoriske strategier, og kreft stamcellebiologi 10.
En generell oversikt over PDTX fremgangsmåten er illustrert i figur 1. Det begynner i klinikken, samtykker pasienter til å tillate noen av deres overskytende tumorvevet som skal brukes for denne forskningen. Deretter ved kirurgi, er en del av svulsten spilte av en patolog og satt i media for å bli transportert til forskning personell. Umiddelbart etter dette, er en del av tumoren skåret i små biter og transplantert inn i immundefekte mus subkutant. Når tumoren vokser, blir det passert inn i forskjellige generasjoner av mus for å opprettholde den tumor 10. Typisk, etter at F3 generasjon tumoren kan utvides inn i en behandlingsstudie hvor nye forbindelser og / eller kombinatoriske behandlinger vurderes. Utnytte Next Gen Seq (Exome Seq, RNA Seq og SNP array) potensielle prediktive biomarkører er oppdageed at ved utvelgelse av pasienter som kan stamme nytte av en bestemt behandling.
De overordnede målene for hjelp PDTX modeller er å: 1) evaluere effekten av nye behandlingsformer som monoterapi eller i kombinasjon og 2) identifisere prediktive biomarkører av følsomhet eller resistens før klinisk undersøkelse. I dette manuskriptet, gir vi den metodikken i initiering og vedlikehold av en CRC PDTX bank og gi fordeler og begrensninger av denne modellen i legemiddelutvikling oppdagelse.
Figur 1. Oversikt over CRC PDTX Model Protocol. En pasient som stammer svulsten er mottatt fra kirurgi og umiddelbart injisert i atymiske hårløse mus subkutant. Når svulsten vokser den er utvidet til etterfølgende generasjoner, og til slutt utvidet for behandlingsstudier. behandling Responses vurderes og prediktive biomarkører er identifisert som kan hjelpe til pasientens valg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Pasient-avledet tykktarms adenokarsinom vevsprøver ble oppnådd fra samtykkende pasienter ved University of Colorado Hospital i samsvar med en protokoll godkjent av Colorado Multiple Institutional Review Board (08-0439). Alle dyr arbeidet ble utført under dyre protokoller godkjent av University of Colorado Denver Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, protokoll # 51412 (06) 1E og 96813 (04) 1E).
1. Mottak og Forbereder Pasient Blood
- Samle 1 - 2 ml blod i blod / celle separasjon rør som inneholder natriumsitrat (tube faser inkludert er plasma, lymfocytter og monocytter band, tettshetsgradient væske, gel barriere, og erytrocytter og nøytrofile). Forsiktig Følg Blood Borne patogen retningslinjer med blod eller vev.
Merk: PBMC og plasma kan brukes for fremtidige studier som kan omfatte: sammenligne kimcellelinje genetisk variasjon med kreft mutasjoner, isolere opplagskapstumorceller, evaluere celle gratis DNA (cfDNA), undersøke proteiner og microRNAs, etc. - Sentrifuger blod / celleseparasjonsrøret ved 2500 xg i 15 min med ingen brems ved RT.
- Samle perifere mononukleære blodceller (PBMC i lymfocytter og monocytter band av rør) og satt i en 1,5 ml mikrosentrifugerør (klar, kan autoklaveres, DNase, RNase og pyrogen gratis), og fyll opp til toppen av røret med sterilt fosfatbufret saltvann (PBS).
- Sentrifuger ved 2300 x g i 3 minutter ved romtemperatur for å danne en pellet av PBMC ved bunnen av røret. Deretter fjerner supernatanten forsiktig. Tilsett 1 ml steril PBS for å vaske pelleten og sentrifuger ved 3000 xg i 30 sek og deretter fjerne supernatanten.
- Bruk en pipette til å samle plasma fra blod / celle separasjon tube (i plasma fase av rør) i en 1,5 ml steril kryogene hetteglass (DNase og RNase gratis, ingen menneskelig DNA, endotoksin gratis) og sette plasma og pellet av PMBC sin inn i en -80 ° C freezer for lagring.
2. Mottak og Forbereder Pasient Tumor Sample
- Forbered enten RPMI eller DMEM media med 1: 100 (10%) av Penicillin-streptomycin og ikke-essensielle aminosyrer, 1: 1000 (1%) Plasmocin, og 10% inaktivert Fetal Bovine Serum (komplett media) og tilsett 20 - 25 ml til en steril oppsamlingskopp for tumor prøven.
- Hent tumorprøve i en steril kopp inneholder komplett medie på is eller holde ved 4 ° C.
Merk: tumorprøve er et stykke av overskytende pasientens tumor vev som er fjernet ved en kirurg, behandlet av en patolog, og plassert i en steril oppsamlingskopp med komplett medium. Forsiktig Følg Blood Borne patogen retningslinjer med blod eller vev. Også, ideelt for å injisere fem mus, må tumoren være omtrent 1 cm³. - Ta svulsten prøven til dyret anlegg for injisering i immunkompromitterte mus.
Merk: Det er best å behandle tumorprøve så snart som mulig.- I en laminær hette, plassere tumorprøve i en steril plast cutting tallerken fra svulsten cup. Bruk autoklaveres-liten saks og pinsett til å skjære i 10 - 12 ca 3 x 3 x 3 mm biter og legg i en autoklaveres 1,5 ml mikro rør fylt med 300 ul geléaktige proteinblanding løsning. Hold røret på is.
- Som en prioritet injisere svulst i mus, men hvis det er noen svulst overs, samle flash frosset hetteglass (FF), formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) kopper og en levedyktig svulst hetteglass.
- For FF, samle små biter av tumorvev fra en steril kryogenisk hetteglass for videre analyse som protein, RNA eller DNA. Plasser FF umiddelbart til en flytende nitrogen Dewar og lagre langsiktig i en -80 ° C fryser.
- For FFPE, hvis det er nok svulst, plass 3 små brikker i et 10 ml 10% formalin cup og prosess i parafin innebygde blokker gang svulsten har vært i formalin i minst 24 timer.
Merk: 24-timers er basertav våre Histologi Kjerne forslag 11. - Til slutt, legg de resterende svulst i en kryogenisk tube. Gjør levedyktige media ved å tilsette 10% dimetylsulfoksid (DMSO) for å fullføre media. Deretter tilsett 1 ml til en kryogenisk rør og lagre på is. Merk: Ikke holde på is i lange perioder av gangen.
- Skjær eventuelt resterende tumor i små biter som ideelt sett vil være nok for 10 tumorer å bli injisert inn i 5 mus i fremtiden. Deretter plasserer den levedyktig tumor røret på is inntil den kan bli plassert i en Isopropylalkohol frysebeholder (langsomt fryser svulsten 1 ° C på en gang) og plassert i -80 ° C fryseren for å sikre at tumorene ikke dør i løpet av fryseprosessen.
Merk: For langtidslagring svulstene er fjernet (etter 2 - 3 dager) og plassert i en stor flytende nitrogen Dewar. Vær oppmerksom på at levedyktige rør ikke bør få lov til å tine mindre det blir tatt ut til å injisere i mus.
- Skjær eventuelt resterende tumor i små biter som ideelt sett vil være nok for 10 tumorer å bli injisert inn i 5 mus i fremtiden. Deretter plasserer den levedyktig tumor røret på is inntil den kan bli plassert i en Isopropylalkohol frysebeholder (langsomt fryser svulsten 1 ° C på en gang) og plassert i -80 ° C fryseren for å sikre at tumorene ikke dør i løpet av fryseprosessen.
3.Injeksjon av Avledet Pasient tumorxenotransplantater
- Bruk fem 6-8 uker gamle mannlige og / eller kvinnelige atymiske nakne mus (T-celle mangel) for hver enkelt pasient avledet tumor. Sprøyt totalt 10 svulster (2 injeksjoner per mus) subkutant (SQ).
Merk: Den opprinnelige menneskelige svulst er utpekt som F0 og deretter en gang injisert i mus neste generasjon er F1. Også bruke autoklaveres tang, saks, og trokarer for hver unike eksplantering. - Laste stykker av svulst fra den geléaktige proteinblandingen løsning i autoklaveres 12 G trokarer og sørge for at svulsten er fullstendig skjøvet inn i trokaren.
- I et sterilt laminær strømningshette, plassere 5 mus i en anestesi boks som er koblet til en isofluran anestesi maskin (startet ved utgangshastighet på 5% isofluran med 3 - 4% oksygen, og 2 - 3% isofluran for opprettholdelse av anestesi) og kullfilter (absorberer overflødig gass).
Merk: En erfaren tekniker bør være i stand til å utføre hele fremgangsmåten videreet bur av 5 mus i ca 5 min total (omtrent 30 sek per mus). Derfor ytterligere termisk støtte og øye smøring ikke anvendes generelt. For mindre erfarne personer eller under trening, er det sterkt anbefalt at personer enten utføre prosedyren på mindre dyr på en gang og / eller bruke en oppvarming pad / øye smøring under prosedyren hvis dyrene blir bedøvet lenger enn 5 min. Prosedyren er basert på IACUC standarder på vårt universitet.
- I et sterilt laminær strømningshette, plassere 5 mus i en anestesi boks som er koblet til en isofluran anestesi maskin (startet ved utgangshastighet på 5% isofluran med 3 - 4% oksygen, og 2 - 3% isofluran for opprettholdelse av anestesi) og kullfilter (absorberer overflødig gass).
- Klem en mus tå for å sikre at musen ikke lenger er responsive, og deretter ta musen ut av isofluran boksen. Plasser musen på en ren feltet for å injisere svulster på midten ryggnakkeregionen og skyve troakarnål ned subkutant til flanken regionen er nådd med autoklaveres 12 G trokarer.
- Levere en tumor subkutant til hver side av musens flanke. Klem svulsten når trokaren er trukket ut, slik at svulsten forblir i ønsket flanke regionen. den gelatinous proteinblanding stivner med musen kroppstemperatur og omslutter svulsten for ca en uke for å hjelpe svulsten vokser og fest den til SQ bindevev. Lesjonen laget av trokaren er ikke større enn 4 mm, og det er ikke nødvendig å lukke huden med stifter.
Merk: Våre veterinærer bestemmes ingen stenging er nødvendig basert på svært liten størrelse på lesjonen, (reduserer alle hud spenning eller stell av lesjon midten ryggnakkeregionen), ingen infeksjoner bemerket, og tett oppfølging av dyrene i denne tidsperioden rask helbredelse tid .
- Levere en tumor subkutant til hver side av musens flanke. Klem svulsten når trokaren er trukket ut, slik at svulsten forblir i ønsket flanke regionen. den gelatinous proteinblanding stivner med musen kroppstemperatur og omslutter svulsten for ca en uke for å hjelpe svulsten vokser og fest den til SQ bindevev. Lesjonen laget av trokaren er ikke større enn 4 mm, og det er ikke nødvendig å lukke huden med stifter.
- Før musen er helt våken inject Meloksikam 2 mg / kg SQ (smertestillende medikamenter) vekk fra området av svulst injeksjon. Deretter plasserer musen inn i buret og overvåke inntil musen er våken og flytting.
Merk: Ikke la utvinne dyr uten tilsyn før helt våken. Meloksikam dosering er basert på IACUC standarder på vårt universitet.- Deretter gjentar du samme prosedyre med 4resterende mus og overvåke deres puste.
Merk: Vær oppmerksom på at dette er en veldig rask prosedyre og mus våkne opp ganske snart etter Meloxicam injeksjon, men justere Isofluran etter behov. Hver gang en mus er tatt ut, skru ned isofluran. Den Meloxicam vil vare 24 timer og lesjoner fra trokarer vil fullstendig leget i en uke.
- Deretter gjentar du samme prosedyre med 4resterende mus og overvåke deres puste.
4. Vedlikehold av Avledet Pasient Tumor Xenotransplantat Bank
- Overvåk vekst og helse hos mus minst en gang per uke. Bruk et regneark (eller andre sporingssystem) for å spore tumor størrelser, svulst generasjon, dato for svulst injeksjon, og helsen til mus.
Merk: Hvis mus har mistet 15% av sin opprinnelige kroppsvekt, lav kroppskondisjon score (≥ 2), har kreft sår, svulster nå 2000 mm 3 eller totalt svulster 3000 mm 3, eller er sykelig (krum, kulde, slapphet, etc .) i en hvilken som helst måte, blir musene avlivet via CO₂ eller bedøves etterfulgt av cervikal dislokasjon så somecondary metode. Avlive via anestesi og halshugging hvis samle svulst, er ellers mus avlives via CO₂ og halshugging. - Når en svulst er omtrent 1,500-2,000 mm 3 bedøve mus som beskrevet ovenfor, og deretter utføre cervikal dislokasjon å avlive.
- Kontroller at musen har ingen hjerteslag. Eksisere SQ svulst med autoklaveres saks og pinsett.
MERK: Tillat svulster til å vokse i opptil 1 år og hvis ingen svulst er sett så avlive mus via CO 2, etterfulgt av cervical forvridning som en sekundær metode. - Passasje best voksende tumor inn i den neste generasjon (aka et nytt sett av fem mus). Bruk instruksjonene ovenfor for å samle 10 - 12 svulster for bestått og deretter samle left svulst som også er beskrevet ovenfor.
Merk: Samle mange levedyktige rør er svært viktig i de tidlige generasjonene (F1 - F8); derfor samle flere levedyktige rør, FF rør, og en FFPE per generation. - Holde de resterende mus inntil en ny generasjon av mus som har tumorvekst på ca 300 mm3. Når gjenværende mus har svulster som er store, fortsette å samle inn, som beskrevet ovenfor.
- Kontroller at musen har ingen hjerteslag. Eksisere SQ svulst med autoklaveres saks og pinsett.
- Fortsett til passasje svulster og samle på hvert trinn til F15. På dette punkt, kan en levedyktig rør av tidligst mulig ut fra flytende nitrogen og la generasjon tine på is og følge tumor-injeksjon av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor.
Merk: Svulster som vokser fra levedyktige rør tar lengre tid å vokse i mus sammenlignet passerer fra generasjon til generasjon, så hold det i tankene når du planlegger. Hvis en bestemt PDTX modellen ikke lenger er nødvendig til enhver passasje, avlive og samle svulst, for å sikre mange levedyktige rør samles for fremtidig bruk.
5. Utviklings Therapeutics med Avledet Pasient tumorxenotransplantater
Merk: De fleste svulster på F3 generasjonen har gode vekstkinetikk (vokse raskere og mer samarbeidnsistent), derfor fortsette å PDTX narkotika effektstudier.
- Når den ønskede tumor er meget store (1500 - 2000 mm 3), følger fremgangsmåten ovenfor for å samle tumor for å ekspandere inn i ønsket mengde mus.
- Avhengig av hypotesen som testes bestemme antall svulster som trengs per behandlingsgruppe.
Merk: 1 ml av gelatinøse proteinblanding løsning kan tilnærmet form 30 små tumorstykker (avhengig av tumor morfologi) for injisering i mus.
- Avhengig av hypotesen som testes bestemme antall svulster som trengs per behandlingsgruppe.
- Sjekk mus med svulster ukentlige og når de fleste svulster er synlig liten (ca mellom 50-300 mm³) måle svulster med calipers å bestemme tumorvolumet. Tumor volum = [width² (minste måling) x lengde (største måling)] x 0,52.
Merk: Den geléaktige proteinblanding løsning omgir de injiserte kreft stykker for en uke, og etter én uke tumorvekst vil være nøyaktig. - Bruk tumorvolum mellom 50 - 300 mm³ ogn gjennomsnitt venstre og høyre svulster. Deretter random i behandlingsgrupper med 10 tumorer pr gruppe og en gruppe gjennomsnitt i løpet av noen få tall av hverandre. Deretter sortere musene i grupper og begynne ønsket behandlingsstudie.
- Dose musene med narkotika (tidsplan avhengig av narkotika), veie og måle (tumor) to ganger per uke. På slutten av studien, avlive mus via anestesi og halshugging og samle svulst for fremtidig farmakodynamisk analyse i laboratoriet.
Merk: Studien varer i 30 dager, avhengig av kjøretøyets tumorstørrelse og helse for mus.
6. Organisering av PDTX bank
- Hold en veldokumentert skjema for å hindre gjentatt av forskning og hensiktsmessig bruk av dyr.
MERK: Dette er nøkkelen til en vellykket PDTX bank.- Bruke regneark til å holde styr på en svulst fra human pasient i klinikken, til mus i PDTX bank, behandlinger av data, og det som er oppsamlet. Merk: Dette inkluderer fryser, flytende nitrogen dewarsOg FFPE lagring også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Likheter av Vanlige Mutasjoner i CRC PDTX Modeller og TCGA
Vi undersøkt om andelen av vanlige mutasjoner (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 og TP53) i CRC PDTX banken var representant til mutasjonsfrekvens sett i CRC pasientpopulasjonen. Som vist i figur 2A (TCGA) og B (CRC PDTX bank), frekvensen av mutasjoner i disse genene var svært like mellom TCGA (n = 276 pasienter) og CRC PDTX bank (n = 59 CRC-pasienter). Den største forskjellen observert var i APC genet der en 23% forskjell ble sett. Disse resultatene tyder på at vanlige mutasjoner observert i CRC pasientpopulasjonen er godt representert i barnekonvensjonen PDTX modell.
Evaluering av Stabilitet av behandlingstiltak mellom ulikegenerasjoner
I denne CRC PDTX modellen, setter vi ut for å avgjøre om behandlingseffekter var lik mellom forskjellige generasjoner. Svulster ble utvidet i atymiske nakne mus (10 svulster / gruppe) og effekt av standarden på pleiemidler som cetuximab (0,4 mg / mus IP to ganger per uke) og irinotecan (15 mg / kg IP en gang per uke) ble undersøkt i 4 unike CRC PDTX modeller i to separate generasjoner. Som illustrert på figur 3A og B, CRC026 (F3) var mer resistent mot behandling med cetuximab, mens CRC010 (F6) utviste behandling følsomhet. Lignende funn ble observert når disse CRC explants ble behandlet i ulike generasjoner; CRC026 (F9) var resistent og CRC010 (F7) var følsom overfor cetuximab. For å bestemme effekten av irinotecan i PDTX modell, undersøkte vi behandlingseffekter på tumorvekst i 2 CRC PDTX modeller. Mens CRC098 (F8) var resistent mot irinotecan behandling, CRC036 (F5) viste følsomhet (Figur 3C og D). Som ble observert med cetuximab, behandling med irinotecan i forskjellige generasjoner ikke endre behandlingsrespons i disse svulstene; CRC098 (F12) var resistent og CRC036 (F10) var følsom for irinotecan (Figur 3C og D). Selv om vekstkinetikk av ubehandlede tumorer var noen ganger forskjellig mellom generasjoner, og behandlingstiltak til irinotecan og cetuximab forble det samme, noe som indikerer stabiliteten av denne modellen i vurderingen av anti-kreft terapi.
Gransking av Stroma Component i CRC PDTX Model
Deretter var vi interessert i å avgjøre om stroma komponent i dette CRC explant modellen var omfattet av menneskelige og / eller mus avledet celler. Vi brukte en dual-color Cot-en FISH analyse som besto av musCot-1 DNA (grønn fluorophore) og human Cot-1 DNA (rød fluoroforen) for å finne mus og humane celler i 10 separate CRC explants mellom F0 og F1 generasjoner 25. Som vist i figur 4A, i F1-generasjonen det menneskelige stroma erstattes av mus stroma, ettersom det humane tumor nå er omgitt av alle mus stroma. Disse funnene var tydelig i alle 10 CRC explants som ble utsatt for Cot-en FISH mellom F0 og F1 generasjoner. I tillegg til Cot-en FISH, vi undersøkt protein nivåer av mus og menneskelig HGF og VEGF-ligander i F0 og F1 generasjoner ved hjelp av mus og menneske ELISA for disse ligander. Som vist i figur 4B og C, mens alle humant avledet HGF i F0 generasjon er erstattet med mus HGF i F1-generasjonen, VEGF ligand besto av både human og mus i F1-generasjonen. Sammen disse eksperimentene tyder på at i barnekonvensjonen PDTX musemodell at musen stroma overgår den menneskelige stroma i the F1 generasjonen og de ligander utskilt kan variere i forhold til det å være menneske og / eller mus avledet.
Figur 2. Sammenligning av vanlige Mutasjoner i CRC PDTX Bank og TCGA. Vi har observert svært like mutasjon frekvenser mellom TCGA (A) og CRC PDTX modellen (B) med hensyn til KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 og TP53 . klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Virkningene av cetuximab og irinotecan Behandling på tumorvekst. (A) CRC026 vises motstand mot cetuximab når de vurdertererte i F3 og F9 generasjoner og (B) CRC010 utstilt følsomhet overfor cetuximab i F6 og F7 generasjoner. (C) CRC098 viste motstand mot irinotecan i F8 og F12 generasjoner, mens (D) CRC036 var følsom for irinotecan i F5 og F10 generasjoner. Hvert datapunkt representerer et gjennomsnitt av 10 tumorer pr behandlingsgruppe. Mus ble behandlet med cetuximab (100 ul IP 400 ug / mus) to ganger i uken og irinotecan (100 ul IP 20 mg / kg) ble dosert en gang i uken. Data presentert som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Evaluering av mus og tumorcellekomponenter i F0 og F1 generasjoner. (A) Dual-color FISH for det humane cot-1 DNA (rød) og mus cot-1 DNA (grønn) ble anvendt for å undersøke forskjeller mellom tumorer i F0 og F1-generasjonen. Menneskelig stroma (F0) erstattes av mus stroma (F1) i CRC098 og CR174 (skala = 20x). Nekrotiske celler ble identifisert ved nedsatt eller manglende DAPI innskyting og rød fluorescens. Undersøkelse av mus og menneskelig HGF og VEGF ligand uttrykk ved ELISA (mus og menneske ELISA) mellom F0 og F1. (B) Menneskelig HGF ble erstattet av mus i F1-generasjonen og (C) menneske og mus VEGF var tydelig i F1-generasjonen (pikogram / ml [pg / ml]). Data presentert som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den PDTX drug discovery plattformen tilbyr en forbedret modell for svakhetene i andre prekliniske modeller som er upålitelig i å forutsi klinisk aktivitet av nye forbindelser. Viktigere, svulster i denne modellen er biologisk stabil, beholde metastatisk potensial, og viser lignende stoff respons fra generasjon til generasjon. I denne modellen blir pasient avledet tumorer injisert i atymiske nakne mus, passert, og senere brukt i terapeutisk vurdering. Det er flere viktige skritt for en vellykket PDTX bank som inkluderer: 1) en sammenhengende klinisk team for å identifisere / samtykke pasienter og for fjerning og innbringende av svulstvev for PDTX modell og 2) et sterkt forskningsmiljø med utmerket laboratorium og dyr teknisk ferdigheter for å injisere svulster, organisering og vedlikehold av PDTX bank og overvåke helsen til mus. En vesentlig fordel i våre PDTX modeller er injisere svulster med trokaren prosedyren. Den alternative fremgangsmåte for cutte opp en svulst lomme og deretter sy eller bruke hudklemmer er mer tidkrevende for personell, krever mer smertestillende medikamenter for mus, og overvåking av sys eller såret klippet området. Trokaren prosedyre krever mindre opplæring, er svært rask, mus er under anestesi for mindre tid og mindre smertestillende medikamenter er nødvendig. Derfor, i vår erfaring injisere tumorer med trokarer er den beste metoden i forhold til alternative metoder. Disse faktorene vil vesentlig påvirke den totale suksessen av PDTX banken og i drug discovery prosessen. Selv om dette in vivo modellen er betydelig mer kostbart enn å teste midler i kreftcellelinje kulturer, PDTX modellene har en mer klinisk relevant tilnærming i testing onkologi forbindelser.
I CRC PDTX banken, har vi mottatt 99 tumorprøver som ble injisert i atymiske nakne mus. Det var 68 av 99 (68,7% take rate) svulster som vokste i mus og ble vedtatt i flere generasjoner. Derer flere grunner til at noen svulster som vi fikk ikke vokser i mus. For eksempel, vi noen ganger fikk bare svært små biter av vev som bare mulig for oss å injisere i bare ett muse redusere sjansene for å etablere en svulst. Et annet problem var at til tider fikk vi pasientens vev som var normal og ikke inneholde kreftceller tydelig på H & E lysbilde. I tillegg kan noen dårlig kvalitet vev være grunn til å motta allerede necrosed svulst hvor det var et pasientens respons på behandlingen. Derfor er det viktig å ha en pålitelig operasjons og patologi lag når innbringende tumoren. Vurderer noen av disse spørsmålene, har vi vært i stand til å etablere en av de største CRC PDTX bredden av fullt kommenterte svulster med hensyn til mutasjoner, genekspresjon, og kliniske egenskaper, noe som gjør dette til en verdifull modell for evaluering av nye behandlingsformer med det endelige målet å forbedre pasientens utfall.
Mange biologiske og kombinatorisketerapi har blitt undersøkt i denne modellen med sikte på å bestemme effekt, narkotika resistensmekanismer, samt behandlingseffekter på kreftstamcellepopulasjonen. Vår gruppe har undersøkt effekten av en rekke nye biologiske pathway hemmere ved hjelp av denne preklinisk modell 12-18, noe som har gitt verdifull innsikt i videre kliniske utviklingen av disse forbindelsene. Mange av disse studiene har identifisert prediktive biomarkører 12-14,17,18 som kan hjelpe i pasientens valg i fremtidige kliniske studier. I tillegg har andre studier videre fastslått mekanismer for behandling motstand ved hjelp av denne modellen, noe som har ført til utvikling av rasjonelle kombinasjoner 19-24. For eksempel, Bardelli og kolleger vist at 19 cetuximab behandling indusert MET forsterkning og som oppnås kan være en underliggende mekanisme for behandling motstand mot cetuximab i CRC. 19 I en separat studie, Bertotti et al. 20identifisert Her2 som et mål i CRC svulster som var resistente mot cetuximab. Endelig har vi og en annen gruppe vist at behandling med en Notch pathway inhibitor i kombinasjon med irinotecan redusert CRC kreftstamcelle befolkning og tumor tilbakefall etter seponering 25,26. Sammen utgjør disse studiene viser den potensielle kraften av å utnytte PDTX modeller i stoffet utviklingsprosess som kan ha betydelig innvirkning på videre utvikling av nye forbindelser.
Til tross for de store fordeler ved å bruke pasient avledet tumorer i å bestemme effekt av nye forbindelser, er det flere begrensninger i denne modellen. Som vist eksperimentelt i denne artikkelen, er den menneskelige stroma fra opprinnelses tumor (F0) erstattet med musen stroma på F1-generasjonen i CRC PDTX modell. Avhengig av den spesielle legemiddel målet, kan dette være et problem når mus ligandene er i stand til å aktivere reseptoren (e) på humane tumorceller. for instance, viser vi at i F1-generasjonen, er HGF avledet fra mus stroma og studier har vist at mus HGF er ute av stand til funksjonelt å aktivere det humane c-Met-reseptoren 27,28. Som et resultat, kan c-Met-inhibitorer ikke utviser antitumorvekstvirkningene på disse PDTX modellene. Faktisk har humaniserte HGF SCID-mus blitt utviklet for å løse dette potensielle problem 28. En annen ulempe med å bruke subkutane svulster er manglende evne til å studere behandlingseffekter på metastatisk potensial av svulster. Ved hjelp ortotopiske modeller, men mer teknisk vanskelig å etablere og bilde tumorvekst, vil trolig gi bedre innsikt i behandlingseffekter på metastasering. En endelig begrensning av denne modellen er den manglende evne til å undersøke rollen av immunsystemet i potentumorvekst og dens funksjon i å tilrettelegge resistens mot behandling. Dessuten, med den utmerkede aktivitet av immunterapier nylig demonstrert i klinikken, ved hjelp av immunodeficient mus hindrer etterforskningen av immun målrettede midler. Følgelig har humanisert musemodeller er utviklet for å løse disse begrensningene, som kan gi verdi i å forstå grunnleggende rolle immun-tumor interaksjoner samt tillate for etterforskningen av immunterapi i kombinasjon med andre roman og godkjente forbindelser.
I konklusjonen, gir vi en metode på å utvikle og opprettholde en CRC PDTX modell som er uvurderlig i å bestemme terapeutisk effekt, prediktive biomarkører og narkotika motstand veier av nye kreftlegemidler. Selv om denne modellen har iboende utfordringer, nytten av denne modellen er at den nøye rekapitulerer svulsten heterogenitet av den opprinnelige svulsten, som tilbyr en mer presis og klinisk relevant undersøkelse av nye behandlingsformer før klinisk evaluering. Future evaluering av den kliniske effekten i legemiddelutvikling av denne preklinisk PDTX modellen til slutt vil bestemme kraften i dennemodell for å forutsi den kliniske aktiviteten til behandling i kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109 (3), 667-675 (2013).
- Hubbard, J., Grothey, A. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer. Curr Opin Oncol. 22 (4), 374-380 (2010).
- van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435 (7044), 959-963 (2005).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18 (19), 5314-5328 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. , American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
- Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18 (9), 2704-2714 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138 (1), 195-205 (2016).
- Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16 (16), 4165-4177 (2010).
- Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6 (33), 34561-34572 (2015).
- Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35 (2013).
- Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136 (8), 1967-1975 (2015).
- Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9 (12), 3351-3362 (2010).
- Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3 (6), 658-673 (2013).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1 (6), 508-523 (2011).
- Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120 (2015).
- Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18 (4), 1051-1062 (2012).
- Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9 (11), e113037 (2014).
- Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).
- Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).
- Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).
- Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).
- Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).
