Summary
الاستفادة من الأورام المستمدة من المريض في نموذج ما قبل السريرية تحت الجلد هو وسيلة ممتازة لدراسة فعالية علاجات جديدة، واكتشاف العلامات البيولوجية التنبؤي، والمخدرات مسارات المقاومة. هذا النموذج، في عملية التنمية المخدرات، أمر أساسي في تحديد مصير العديد من العلاجات المضادة للسرطان جديدة قبل التحقيق السريري.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو مساهم كبير في وفيات السرطان في الولايات المتحدة. في عام 2015، كان هناك ما يقدر ب 132700 حالة جديدة من اتفاقية حقوق الطفل مع 49700 حالة وفاة 1. على الرغم من أن التشخيص في المرضى الذين يعانون من مرض محلية ممتازة، والمرضى الذين يعانون من مرض متقدم لها نتائج سيئة، مما يجعل هذا أولوية رئيسية في تطوير علاجات جديدة. وعلى الرغم من مستوى نظم العلاج الكيميائي الرعاية والبيولوجية الحديثة التي يتم نشرها ضد هذا المرض، كان هناك فقط زيادة تدريجية في البقاء على قيد الحياة. وفقا لذلك، وهناك جهدا كبيرا في فهم مسارات سائق المعنية في تسهيل نمو الورم في هذا المرض. حددت أطلس شبكة السرطان الجينوم مؤخرا العديد من الممرات الرئيسية التي تورطت في اتفاقية حقوق الطفل التقلبات وتشمل: WNT، فسفوإينوزيتيد 3-كيناز (PI3K)، RAS، وتحويل عامل النمو β (TGF- β) وTP53 2. جنبا إلى جنب، مع التحقيقات التي تصف بعد التمديدوقد أشعلت مسارات لها أن تحفيز النمو في لجنة حقوق الطفل تطوير علاجات جديدة تهدف إلى تحسين كبير في البقاء على قيد الحياة في هذه الفئة من السكان المريض 3-5. وقد تم استخدام نماذج ما قبل السريرية في تطوير العقاقير الأورام أساسيا في هذه العملية في توقع النشاط السريري لهذه المركبات الجديدة.
وقد استخدمت النماذج قبل السريرية المختلفة في عملية تطوير العقاقير. وبالنظر إلى أن النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا قبل السريرية وتخليد كانت خطوط الخلايا غير ناجحة في تحديد النشاط السريري لعلاج الأورام الجديدة، إلى حد كبير بسبب عدم قدرتها على عكس تعقيد الأورام البشرية، أنشئت المستمدة من المريض ورم طعم أجنبي (PDTX) نماذج. أكبر ميزة لهذا النموذج هو أن الورم التباين لا يزال قائما، ويعكس بشكل وثيق الخصائص الجزيئية وقابلية التنسيل من منشأ الورم المريض 6-9. توفر نماذج PDTX ممتازة في الجسم الحيمنصة قبل السريرية لدراسة وكلاء الرواية، ومسارات المقاومة للأدوية، واستراتيجيات التوافقية، وسرطان الخلايا الجذعية علم الأحياء 10.
ويتضح لمحة عامة عن عملية PDTX في الشكل 1. وهي تبدأ في العيادة، بالتراضي المرضى للسماح لبعض من أنسجة الورم الزائدة لاستخدامها لهذا البحث. وبعد ذلك، في عملية جراحية، وحقق قطعة من ورم من قبل الطبيب الشرعي ووضعها في وسائل الإعلام ليتم نقلها إلى أفراد البحث. مباشرة بعد ذلك، يتم قطع جزء من الورم الى قطع صغيرة وزرع في الفئران العوز المناعي تحت الجلد. مرة واحدة ينمو الورم، وpassaged ذلك إلى أجيال مختلفة من الفئران من أجل الحفاظ على الورم 10. عادة، بعد جيل F3 الورم يمكن توسيعها إلى دراسة العلاج حيث يتم تقييم مركبات جديدة و / أو العلاجات التوافقية. باستخدام الجيل التالي تسلسل (Exome تسلسل، RNA تسلسل وSNP مجموعة) المؤشرات الحيوية التنبؤية المحتملة اكتشافالطبعة التي تساعد في اختيار المرضى الذين قد لا يحقق استفادة من علاج معين.
الأهداف الأسمى استخدام نماذج PDTX هي: 1) تقييم فعالية علاجات جديدة وكيل واحد أو في تركيبة و2) تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية للحساسية أو مقاومة قبل التحقيق السريري. في هذه المخطوطة، ونحن نقدم منهجية في بدء والحفاظ على بنك CRC PDTX وتوفير مزايا وقيود من هذا النموذج في اكتشاف تطوير الأدوية.
الشكل 1. نظرة عامة على البروتوكول النموذجي CRC PDTX. تم تلقي المريض المستمدة ورم من الجراحة وحقن مباشرة في الفئران عارية athymic تحت الجلد. مرة واحدة ينمو الورم يتم توسيعه إلى الأجيال اللاحقة وتوسعت في نهاية المطاف للدراسات العلاج. RESPO العلاجويتم تقييم NSES ويتم تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية التي قد تساعد في اختيار المريض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تم الحصول على عينات الورم الغدي القولون والمستقيم المستمدة من المريض من بالتراضي المرضى في مستشفى جامعة كولورادو وفقا لبروتوكول المعتمد من قبل مجلس المراجعة المؤسسية متعددة كولورادو (08-0439). تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان تحت بروتوكولات الحيوانية المعتمدة من قبل جامعة كولورادو دنفر المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC، بروتوكول # 51412 (06) 1E و 96813 (04) 1E).
1. استلام وتحضير الدم للمرضى
- جمع 1-2 مل من الدم في أنبوب فصل الدم / خلية تحتوي على سترات الصوديوم (مراحل أنبوب شملت والبلازما، الخلايا اللمفاوية والفرقة الوحيدات، التدرج الكثافة السوائل، حاجز هلام، وكريات الدم الحمراء والعدلات). الحذر، اتبع الإرشادات طريق الدم المرضي مع الدم أو الأنسجة.
ويمكن استخدام PBMCs والبلازما للدراسات المستقبلية التي قد تشمل: مذكرة مقارنة الاختلاف الجيني سلالة الجرثومية مع الطفرات السرطانية، عزل circulaالخلايا السرطانية تينغ، وتقييم خلية الحمض النووي مجانا (cfDNA)، والبروتينات دراسة والرنا الميكروية، وما إلى ذلك. - أجهزة الطرد المركزي أنبوب الفصل / خلايا الدم في 2500 x ج لمدة 15 دقيقة مع عدم وجود فرامل في RT.
- جمع الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs في الخلايا اللمفاوية والفرقة الوحيدات من الأنبوب) ووضعها في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل (واضح، autoclavable، الدناز، ريبونوكلياز، ومولد الحمى الحرة)، وملء إلى الجزء العلوي من أنبوب مع الفوسفات معقمة المالحة (PBS).
- أجهزة الطرد المركزي في 2300 x ج لمدة 3 دقائق على RT لتشكيل بيليه من PBMCs في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك، إزالة طاف بعناية. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة لغسل بيليه وأجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 30 ثانية ثم قم بإزالة طاف.
- استخدام ماصة لجمع البلازما من الأنبوب فصل الدم / خلية (في المرحلة البلازما من الأنبوب) في قارورة المبردة 1.5 مل العقيمة (الدناز وريبونوكلياز الحرة، لا الحمض النووي البشري، الذيفان الداخلي مجانا) ووضع البلازما وبيليه من لPMBC إلى -80 درجة مئوية وreezer للتخزين.
2. استلام وتحضير المريض عينة ورم
- إعداد إما RPMI أو وسائل الإعلام DMEM مع 1: 100 (10٪) من البنسلين، الستربتوميسين والأحماض الأمينية غير الأساسية، 1: 1000 (1٪) Plasmocin، و 10٪ المعطل مصل بقري جنيني (وسائل الإعلام كاملة) وإضافة 20 - 25 مل إلى كوب جمع معقم للعينة الورم.
- استرداد عينة ورم في كوب معقمة تحتوي على وسائل الإعلام كاملة على الجليد أو الحفاظ على 4 درجات مئوية.
ملاحظة: عينة الورم هو قطعة من نسيج الورم الزائدة المرضى التي يتم إزالتها من قبل الجراح ومعالجتها من قبل الطبيب الشرعي، ووضعها في كوب جمع العقيمة مع وسائل الإعلام كاملة. الحذر، اتبع الإرشادات طريق الدم المرضي مع الدم أو الأنسجة. أيضا، من الناحية المثالية لحقن خمسة الفئران، وينبغي أن يكون الورم حوالي 1 سم مكعب. - جلب عينة الورم إلى منشأة الحيوان عن طريق الحقن في الفئران المناعة.
ملاحظة: فمن الأفضل لمعالجة عينة ورم في أقرب وقت ممكن.- في غطاء تدفق الصفحي، ضع عينة ورم في طبق قطع بلاستيكية معقمة من الكأس الورم. استخدام مقص تعقيمها الصغيرة وملقط ليقتطع 10 - قطعة 12 حوالي 3 × 3 × 3 مم ومكان في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تعقيمها مليئة 300 ميكرولتر من هلامي حل البروتين الخليط. إبقاء الأنبوب على الجليد.
- كأولوية حقن الورم في الفئران، ولكن إذا كان هناك أي ورم خلفها، وجمع فلاش المجمدة قارورة (FF)، الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من أكواب (FFPE)، وقارورة الورم قابلة للحياة.
- لFF، وجمع قطع صغيرة من أنسجة الورم من قارورة معقمة المبردة لمزيد من التحليل مثل البروتين، RNA، أو عزل الحمض النووي. وضع FF على الفور إلى ديوار النيتروجين السائل وتخزين على المدى الطويل في الفريزر -80 درجة مئوية.
- لFFPE، إذا كان هناك ما يكفي من الورم ومكان 3 قطع صغيرة في كوب من الفورمالين 10 مل 10٪ وعملية إلى كتل جزءا لا يتجزأ من البارافين مرة واحدة وكان الورم في الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل.
ملاحظة: 24 ساعة ويستندمن اقتراحاتنا الأنسجة الأساسية 11. - وأخيرا، وضع الورم المتبقية في أنبوب المبردة. جعل وسائل الإعلام قابلة للحياة من خلال إضافة 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لإكمال الإعلام. التالي، إضافة 1 مل إلى أنبوب المبردة وتخزينها على الجليد. ملاحظة: لا تبقي على الجليد لفترات طويلة من الزمن.
- قطع أي ورم بقايا الى قطع صغيرة مثالي سوف تكون كافية لمدة 10 الأورام ليتم حقنه في الفئران 5 في المستقبل. ثم، وضع أنبوب الورم قابلا للتطبيق على الجليد حتى يمكن وضعها في وعاء تجميد الآيزوبروبيل الكحول (تجمد ببطء الورم 1 درجة مئوية في كل مرة) وضعت في الفريزر -80 درجة مئوية لضمان أن الأورام لا تموت خلال عملية التجميد.
ملاحظة: للحصول على التخزين على المدى الطويل تتم إزالة الأورام (بعد 2-3 أيام) ووضعها في كبير ديوار النيتروجين السائل. يرجى ملاحظة أنه يجب ألا يسمح أنابيب قابلة للحياة إلى ذوبان الجليد ما لم يتم اتخاذ بها لحقن في الفئران.
- قطع أي ورم بقايا الى قطع صغيرة مثالي سوف تكون كافية لمدة 10 الأورام ليتم حقنه في الفئران 5 في المستقبل. ثم، وضع أنبوب الورم قابلا للتطبيق على الجليد حتى يمكن وضعها في وعاء تجميد الآيزوبروبيل الكحول (تجمد ببطء الورم 1 درجة مئوية في كل مرة) وضعت في الفريزر -80 درجة مئوية لضمان أن الأورام لا تموت خلال عملية التجميد.
3.حقن المريض المستمدة Xenografts ورم
- استخدام خمسة 6 - الذكور 8 أسابيع من العمر و / أو أنثى الفئران عارية athymic (T-خلية الناقصة) لكل ورم مشتقة المريض منفصل. ضخ ما مجموعه 10 الأورام (2 الحقن في الماوس) تحت الجلد (SQ).
ملاحظة: تم تعيينه الورم البشري الأصلي كما F0 ومن ثم حقنه مرة واحدة في الفئران الجيل القادم هو F1. أيضا، استخدام الملقط تعقيمها، مقص، وtrocars لكل يزدرع فريدة من نوعها. - قطع حمولة من الورم من الحل بروتين خليط هلامي إلى تعقيمها 12 trocars G والتأكد من أن الورم دفعت بالكامل في مبزل.
- في العقيمة الصفحي غطاء تدفق، ضع 5 الفئران في مربع التخدير التي يتصل بها جهاز الأيزوفلورين التخدير (التي في معدل الأولي من 5٪ الأيزوفلورين، 3-4٪ أكسجين، و2-3٪ الأيزوفلورين لصيانة التخدير) وفلتر الفحم (يمتص الغاز الزائد).
ملاحظة: ينبغي أن يكون فني من ذوي الخبرة قادرة على تنفيذ الإجراء بأكمله علىقفص من 5 الفئران غضون ما يقرب من 5 مجموع دقيقة (تقريبا 30 ثانية في الماوس). لذلك لا تستخدم عادة الدعم الحرارية الإضافية وتزييت العين. لأقل من الأفراد ذوي الخبرة أو أثناء التدريب، فمن المستحسن جدا أن الأفراد إما تنفيذ الإجراء على أقل الحيوانات في وقت واحد و / أو استخدام الاحترار التشحيم وسادة / العين أثناء إجراء إذا كان سيتم تخدير الحيوانات أطول من 5 دقائق. ويستند الإجراءات بناء على معايير IACUC في جامعتنا.
- في العقيمة الصفحي غطاء تدفق، ضع 5 الفئران في مربع التخدير التي يتصل بها جهاز الأيزوفلورين التخدير (التي في معدل الأولي من 5٪ الأيزوفلورين، 3-4٪ أكسجين، و2-3٪ الأيزوفلورين لصيانة التخدير) وفلتر الفحم (يمتص الغاز الزائد).
- قرصة اصبع القدم الماوس لضمان الفأر لم يعد يستجيب، ثم أخذ الماوس من خارج منطقة الجزاء الأيزوفلورين. ضع الماوس على حقل نظيفة لحقن الأورام في منطقة الرقبة ظهري المتوسطة وانزلاق مبزل أسفل تحت الجلد حتى يتم الوصول إلى منطقة الجناح مع تعقيمها 12 trocars G.
- تقديم ورم واحد تحت الجلد على كل جانب من الجناح الفأر. قرصة الورم عندما يتم سحبها مبزل بها، وضمان أن الورم يبقى في منطقة الجناح المطلوب. وجنرال الكتريكlatinous خليط من البروتين يصلب مع درجة حرارة الجسم الماوس، وبتغليف الورم لحوالي 1 أسبوع لمساعدة ورم ينمو وثبته على النسيج الضام مربع. الآفة التي أدلى بها مبزل ليست أكبر من 4 مم وليس هناك حاجة لإغلاق الجلد بدبابيس.
ملاحظة: لدينا الأطباء البيطريين تحديد لا حاجة لإغلاق استنادا إلى حجم صغير جدا من الآفة، سريع وقت الشفاء (ظهرية الأوسط منطقة الرقبة يقلل أي توتر الجلد أو الاستمالة من آفة)، أي التهابات لاحظت، والرصد الدقيق للحيوانات خلال هذه الفترة الزمنية .
- تقديم ورم واحد تحت الجلد على كل جانب من الجناح الفأر. قرصة الورم عندما يتم سحبها مبزل بها، وضمان أن الورم يبقى في منطقة الجناح المطلوب. وجنرال الكتريكlatinous خليط من البروتين يصلب مع درجة حرارة الجسم الماوس، وبتغليف الورم لحوالي 1 أسبوع لمساعدة ورم ينمو وثبته على النسيج الضام مربع. الآفة التي أدلى بها مبزل ليست أكبر من 4 مم وليس هناك حاجة لإغلاق الجلد بدبابيس.
- قبل أن الفأر هو مستيقظا تماما حقن ميلوكسيكام 2 ملغ / كغ SQ (ألم الدواء) بعيدا عن موقع الحقن السرطانية. بعد ذلك، ضع الماوس في قفص، ورصد حتى الفأر هو مستيقظا ويتحرك.
ملاحظة: لا تترك للشفاء الحيوانات غير المراقب حتى مستيقظا تماما. ويستند الجرعة ميلوكسيكام على معايير IACUC في جامعتنا.- وبعد ذلك، كرر نفس الإجراء مع 4تبقى الفئران ومراقبة التنفس.
ملاحظة: يرجى ملاحظة أن هذا هو الإجراء سريع جدا والفئران يستيقظ في وقت قريب جدا بعد حقن ميلوكسيكام، ولكن ضبط الأيزوفلورين حسب الحاجة. في كل مرة يتم أخذ الماوس خارج، تتحول إلى أسفل الأيزوفلورين. سوف ميلوكسيكام تستمر 24 ساعة وسوف الآفات من trocars شفاء تماما في 1 أسبوع.
- وبعد ذلك، كرر نفس الإجراء مع 4تبقى الفئران ومراقبة التنفس.
4. صيانة المريض المستمدة ورم البنك طعم أجنبي
- مراقبة نمو وصحة الفئران مرة واحدة في الأسبوع على الأقل. استخدام جداول البيانات (أو غيرها من نظام تتبع) لتتبع أحجام الورم، جيل الورم، وتاريخ حقن الورم، وصحة الفئران.
ملاحظة: إذا فقدت الفئران 15٪ من وزن الجسم الأصلي، وانخفاض عشرات حالة الجسم (≥ 2)، وتقرحات الورم، والأورام وصلت إلى 2000 مم 3 أو مجموع أورام 3000 مم 3، أو هي غث (منحنية والبرد، والخمول، الخ .) بأي شكل من الأشكال، يصرح باستخدامها الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربون أو تخدير تليها خلع عنق الرحم مثلطريقة econdary. الموت ببطء عبر التخدير والتفكك عنق الرحم إذا جمع الورم، يصرح باستخدامها إلا الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربون والتفكك عنق الرحم. - عندما كان الورم حوالي 1،500-2،000 مم 3 تخدير الفئران كما هو موضح أعلاه ثم القيام خلع عنق الرحم إلى الموت ببطء.
- تأكد من أن الماوس لا يوجد لديه ضربات القلب. استئصال الورم SQ مع مقص وملقط تعقيمها.
ملاحظة: السماح للأورام لتنمو لمدة تصل إلى 1 سنة و إذا كانت في نظر أي ورم ثم الموت ببطء الفئران عبر CO 2، تليها خلع عنق الرحم كوسيلة الثانوي. - مرور أفضل الورم المتزايد في الجيل القادم (ويعرف أيضا باسم مجموعة جديدة من 5 الفئران). استخدام الإرشادات المذكورة أعلاه لجمع 10-12 الأورام للمرور ومن ثم جمع الورم المتبقية كما هو موضح أيضا أعلاه.
ملاحظة: جمع العديد من أنابيب قابلة للحياة من المهم جدا في الأجيال الأولى (F1 - F8). ولجمع عدة أنابيب قابلة للحياة، وأنابيب FF، و1 FFPE في generatأيون. - الحفاظ على الفئران المتبقية حتى جيل جديد من الفئران لديها نمو الورم ما يقرب من 300 مم 3. عندما تكون الفئران المتبقية الأورام التي تكون كبيرة، والاستمرار في جمع كما هو موضح أعلاه.
- تأكد من أن الماوس لا يوجد لديه ضربات القلب. استئصال الورم SQ مع مقص وملقط تعقيمها.
- تواصل الأورام المرور وجمع في كل مرحلة حتى F15. في هذه المرحلة، واتخاذ أنبوب قابل للحياة من أقرب جيل محتمل من النيتروجين السائل، والسماح ذوبان الجليد على الجليد واتبع إجراءات حقن الورم المذكورة أعلاه.
ملاحظة: الأورام التي تنمو من أنابيب قابلة للحياة وقتا أطول لتنمو في الفئران مقارنة يمر من جيل إلى جيل، حتى أن تبقي في الاعتبار عند التخطيط. إذا لم تعد هناك حاجة إلى نموذج PDTX معين في أي ممر، الموت ببطء، وجمع الورم، لضمان جمع العديد من أنابيب قابلة للاستخدام في المستقبل.
5. التنموية العلاج مع المريض المستمدة Xenografts ورم
ملاحظة: معظم الأورام في الجيل F3 لها حركية نمو جيدة (تنمو بشكل أسرع وأكثر المشتركnsistent)، ومن ثم انتقل إلى PDTX دراسات نجاعة الأدوية.
- عندما يكون الورم المطلوب هو كبير جدا (1500 - 2000 مم 3)، اتبع الإجراءات المذكورة أعلاه لجمع الورم للتوسع في المبلغ المطلوب من الفئران.
- اعتمادا على فرضية يجري اختبار تحديد عدد الأورام حاجة في مجموعة العلاج.
ملاحظة: 1 مل من هلامي حل بروتين خليط يمكن أن يصلح ما يقرب من 30 قطعة ورم صغير (اعتمادا على مورفولوجيا الورم) لحقن في الفئران.
- اعتمادا على فرضية يجري اختبار تحديد عدد الأورام حاجة في مجموعة العلاج.
- تحقق الفئران بأورام الأسبوعية وعند معظم الأورام صغيرة واضح (تقريبا بين 50-300 mm³) قياس الأورام مع الفرجار لتحديد حجم الورم. حجم الورم = [width² (أصغر القياس) × طول (قياس أكبر)] X 0.52.
ملاحظة: الحل بروتين خليط هلامي تحيط القطع ورم حقنها لمدة أسبوع، ثم بعد نمو الورم لمدة أسبوع سوف تكون دقيقة. - استخدام وحدات التخزين ورم بين 50-300 mm³ ون متوسط اليسار والأورام الصحيحة. ثم بطريقة عشوائية في مجموعات العلاج مع 10 الأورام في مجموعة ومتوسط مجموعة ضمن أعداد قليلة من بعضها البعض. بعد ذلك، فرز الفئران إلى مجموعات والبدء في دراسة العلاج المطلوب.
- جرعة الفئران مع المخدرات (الجدول الزمني يتوقف على المخدرات)، وزن وقياس (ورم) مرتين في الأسبوع. في نهاية الدراسة، الموت ببطء الفئران عن طريق التخدير وخلع عنق الرحم وجمع الورم للتحليل الدوائية في المستقبل في المختبر.
ملاحظة: تستمر الدراسة لمدة 30 يوما اعتمادا على حجم الورم السيارة وصحة الفئران.
6. تنظيم بنك PDTX
- الحفاظ على شكل موثقة جيدا لمنع تكرار البحث والاستخدام المناسب للحيوانات.
ملاحظة: هذا هو المفتاح لبنك PDTX ناجحة.- استخدام جداول البيانات لتتبع الورم من المريض البشري في العيادة، لالفئران في البنك PDTX، والعلاج، والبيانات، وما يتم جمعها. ملاحظة: هذا يشمل التجميد، دوار النيتروجين السائل، وتخزين FFPE كذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التشابه بين الطفرات المشتركة في نماذج CRC PDTX وTCGA
ونحن التحقيق ما إذا كانت نسبة من الطفرات المشتركة (KRAS، تلك السلطات، BRAF، PIK3CA، APC، CTNNB1 وTP53) في البنك CRC PDTX كانت ممثلة في وتيرة الطفرة ينظر في عدد السكان CRC المريض. كما هو مبين في الشكل 2A (TCGA) و (ب) (CRC PDTX البنك)، كانت وتيرة الطفرات في هذه الجينات مشابهة جدا بين TCGA (ن = 276 مريضا) والبنك CRC PDTX (ن = 59 مريضا CRC). وكان أكبر الفرق الذي لوحظ في جين APC حيث كان ينظر فرق 23٪. وتشير هذه النتائج إلى أن الطفرات الشائعة التي لوحظت في عدد السكان CRC المريض وممثلة تمثيلا جيدا في نموذج CRC PDTX.
تقييم استقرار الردود المعاملة بين مختلفأجيال
في هذا النموذج CRC PDTX، شرعنا في تحديد ما إذا كانت آثار العلاج كانت متشابهة بين مختلف الأجيال. تم توسيع الأورام في الفئران عارية athymic (10 الأورام / مجموعة) وفعالية من مستوى وكلاء رعاية مثل ستوكسيماب (0.4 ملغ / IP الماوس مرتين في الأسبوع) وإرينوتيكان (15 ملغ / كغ IP مرة واحدة في الأسبوع) تم فحص في 4 فريدة نماذج CRC PDTX في جيلين منفصلة. كما هو موضح في الشكل 3A وباء، CRC026 (F3) كان أكثر مقاومة للعلاج ستوكسيماب، في حين CRC010 (F6) عرضت حساسية العلاج. وقد لوحظت نتائج مشابهة عندما تم علاج هذه إإكسبلنتس لجنة حقوق الطفل في أجيال مختلفة؛ CRC026 (F9) كان مقاوما وCRC010 (F7) كانت حساسة لستوكسيماب. لتحديد مدى فعالية من إرينوتيكان في نموذج PDTX، ونحن التحقيق آثار العلاج على نمو الورم في 2 نماذج CRC PDTX. في حين CRC098 (F8) كانت مقاومة للعلاج إرينوتيكان، CRC036 (F5) عرضت حساسية (الشكل 3C و D). كما لوحظ مع ستوكسيماب، والمعاملة مع إرينوتيكان في أجيال مختلفة لم تقم بتغيير الاستجابة للعلاج في هذه الأورام. CRC098 (F12) كان مقاوما وCRC036 (F10) كانت حساسة للإرينوتيكان (الشكل 3C و D). على الرغم من أن حركية نمو الأورام غير المعالجة كانت مختلفة في بعض الأحيان بين الأجيال، ظلت مساعي المعالجة لإرينوتيكان وستوكسيماب نفسه، مما يدل على استقرار هذا النموذج في تقييم العلاجات المضادة للسرطان.
التحقيق في مكون ستروما في نموذج CRC PDTX
المقبل، ونحن مهتمون في تحديد ما إذا كان يتألف المكون سدى في هذا النموذج يزدرع CRC من خلايا فأر المستمدة الإنسان و / أو. كنا ثنائي اللون كوت-1 FISH الفحص التي تتألف من الماوسسرير-1 الحمض النووي (fluorophore الأخضر) والبشري سرير-1 الحمض النووي (fluorophore الأحمر) لتحديد الماوس والخلايا البشرية في 10 إإكسبلنتس CRC منفصلة بين F0 والأجيال F1 25. كما هو مبين في الشكل 4A، في الجيل F1 يتم استبدال سدى البشري عن طريق سدى الماوس، منذ يحاط الورم البشري الآن من قبل جميع سدى الماوس. وكانت هذه النتائج واضحة في كل إإكسبلنتس CRC 10 التي تعرضت لكوت-1 FISH بين F0 وF1 الأجيال. بالإضافة إلى كوت-1 FISH، ونحن التحقيق مستويات البروتين من الماوس وHGF البشري وبروابط VEGF في الأجيال F0 و F1 باستخدام الماوس وELISAs الإنسان لهذه بروابط. كما هو معروض في الشكل 4B و C، في حين يتم استبدال جميع حقوق الإنسان مستمد HGF في الجيل F0 مع HGF الماوس في الجيل F1، وتألفت VEGF يجند كل من الفأر والإنسان في الجيل F1. معا هذه التجارب تشير إلى أن في نموذج الفأر CRC PDTX أن سدى الماوس يتفوق سدى البشري في الالجيل F1 الإلكترونية وبروابط يفرز قد تختلف فيما يتعلق إنسان و / أو الماوس مشتقة.
الشكل 2. مقارنة بين الطفرات المشتركة في الضفة PDTX اتفاقية حقوق الطفل وTCGA لاحظنا ترددات طفرة مماثلة جدا بين TCGA (A) ونموذج اتفاقية حقوق الطفل PDTX (ب) فيما يتعلق KRAS، تلك السلطات، BRAF، PIK3CA، CTNNB1 وTP53 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. آثار ستوكسيماب وإرينوتيكان العلاج على نمو الورم. (A) CRC026 عرض مقاومة ستوكسيماب عندما evaluATED في F3 وF9 أجيال و (ب) أظهرت CRC010 حساسية لستوكسيماب في الأجيال F6 وF7. (C) أظهرت CRC098 مقاومة إرينوتيكان في الأجيال F8 و F12، بينما كان (D) CRC036 حساسة للإرينوتيكان في F5 والأجيال F10. تمثل كل نقطة من نقاط البيانات في المتوسط 10 الأورام في مجموعة العلاج. عولجت فئران مع ستوكسيماب (100 IP ميكرولتر 400 ميكروغرام / الماوس) مرتين في الأسبوع، وإرينوتيكان (100 IP ميكرولتر 20 ملغ / كلغ) وأعطيت جرعات مرة واحدة في الأسبوع. البيانات المقدمة كما يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. مكونات تقييم الفأر والخلايا السرطانية في F0 وF1 الأجيال. (A) المزدوج جC ن تم استخدام الأسماك لالبشري سرير-1 الحمض النووي (الحمراء)، والماوس سرير-1 الحمض النووي (الأخضر) للتحقيق في الخلافات بين الأورام في الجيل F0 وF1. يتم استبدال سدى البشري (F0) من خلال سدى الماوس (F1) في CRC098 وCR174 (مقياس = 20x و). وقد تم تحديد الخلايا الميتة عن طريق خفض أو عدم وجود دابي إقحام ومضان أحمر. وكان التحقيق في الماوس وHGF البشري والتعبير يجند VEGF بواسطة ELISA (الماوس وELISAs الإنسان) بين F0 وF1. (ب) تم استبدال HGF الإنسان عن طريق الماوس في الجيل F1 و (C) الفأر والإنسان عامل نمو بطانة الاوعية واضحا في الجيل F1 (بيكوغرام / ملليلتر [بغ / مل]). البيانات المقدمة كما يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم PDTX منصة اكتشاف الأدوية وتحسين نموذج لأوجه القصور في نماذج ما قبل السريرية الأخرى التي لا يمكن الاعتماد عليها في التنبؤ النشاط السريري للمركبات جديدة. الأهم من ذلك، أورام في هذا النموذج هي مستقرة من الناحية البيولوجية، في الحفاظ على إمكانية النقيلي، وتظهر استجابة مماثلة المخدرات من جيل إلى جيل. في هذا النموذج، يتم حقن المريض المستمدة الأورام في الفئران عارية athymic، passaged، وتستخدم بعد ذلك في التقييم العلاجي. هناك العديد من الخطوات الهامة لبنك PDTX الناجحة التي تشمل: 1) فريق السريري متماسك لتحديد المرضى / موافقة ولإزالة والإجمال من أنسجة الورم لنموذج PDTX و2) مجموعة بحثية قوية مع مختبر ممتاز والحيوان الفني مهارات لحقن الأورام، وتنظيم وصيانة البنك PDTX ومراقبة صحة الفئران. وهناك ميزة هامة في نماذج PDTX لدينا هو حقن الأورام مع إجراء مبزل. طريقة بديلة للمكعبtting جيب الورم ومن ثم خياطة أو باستخدام مقاطع الجلد هو أكثر استهلاكا للوقت للأفراد، يتطلب المزيد من المسكنات للفئران، ورصد المنطقة قص الجرح خياطة أو. الإجراء مبزل يتطلب أقل التدريب، سريع جدا، الفئران تحت التخدير لوقت أقل، وهناك حاجة أقل عقاقير مضادة للألم. لذلك، في تجربتنا بضخ الأورام مع trocars هو أفضل طريقة مقابل الطرق البديلة. وهذه العوامل تؤثر تأثيرا كبيرا في النجاح العام للبنك PDTX وفي عملية اكتشاف الأدوية. على الرغم من أن هذا النموذج في الجسم الحي إلى حد كبير أكثر تكلفة من وكلاء اختبار في الثقافات خط الخلايا السرطانية، ونماذج PDTX توفر نهجا أكثر أهمية سريريا في المركبات اختبار الأورام.
في البنك CRC PDTX، تلقينا 99 عينات الأورام التي تم حقنها في الفئران عارية athymic. كان هناك 68 من أصل 99 (68.7٪ معدل اتخاذ) الأورام التي نمت في الفئران وتم تمريرها إلى أجيال متعددة. هناكهي عدة أسباب لماذا بعض الأورام التي تلقيناها لم تنمو في الفئران. على سبيل المثال، تلقينا في بعض الأحيان فقط قطعة صغيرة جدا من الأنسجة التي سمحت لنا فقط ليحقن الماوس واحد فقط يقلل من فرص إقامة الورم. وثمة قضية أخرى في بعض الأحيان أن تلقينا أنسجة المريض التي كانت طبيعية ولم تحتوي على خلايا الورم واضحة على الشريحة H & E. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لبعض سوء نوعية الأنسجة يكون راجعا إلى تلقي الورم necrosed بالفعل حيث كان هناك استجابة المريض للعلاج. وبالتالي، فمن المهم أن يكون فريقا جراحيا وعلم الأمراض يمكن الاعتماد عليها عند الاطلاق الورم. النظر في بعض هذه القضايا، وكنا قادرين على تأسيس واحدة من أكبر البنوك CRC PDTX الأورام مشروحة بشكل كامل فيما يتعلق الطفرات، التعبير الجيني، والخصائص السريرية، مما يجعل هذا نموذجا قيما لتقييم علاجات جديدة مع الهدف النهائي تحسين نتائج المرضى.
العديد البيولوجية والتوافقيةوقد تم التحقيق العلاجات في هذا النموذج بهدف تحديد فعالية وآليات المقاومة للأدوية، فضلا عن آثار العلاج على السكان سرطان الخلايا الجذعية. درست مجموعتنا فعالية العديد من مثبطات مسار البيولوجية الجديدة باستخدام هذا النموذج قبل السريرية 12-18، التي وفرت معلومات قيمة حول مزيد من التطوير السريري لهذه المركبات. وقد حدد الكثير من هذه الدراسات المؤشرات الحيوية التنبؤية 12-14،17،18 التي قد تساعد في اختيار المريض في التجارب السريرية في المستقبل. وبالإضافة إلى ذلك، زادت من تحديد دراسات أخرى آليات مقاومة العلاج باستخدام هذا النموذج، الأمر الذي أدى إلى تطوير تركيبات منطقية 19-24. على سبيل المثال، أظهرت BARDELLI وزملاؤه 19 أن العلاج ستوكسيماب يسببها MET التضخيم وأن الأرصاد قد يكون آلية الكامنة وراء مقاومة العلاج لستوكسيماب في اتفاقية حقوق الطفل. 19 وفي دراسة منفصلة، Bertotti وآخرون. 20حددت HER2 كهدف في الأورام اتفاقية حقوق الطفل التي كانت مقاومة للستوكسيماب. وأخيرا، نحن ومجموعة أخرى قد أظهرت أن العلاج مع مثبط الشق المسار في تركيبة مع إرينوتيكان خفضت السكان الخلية الجذعية السرطانية والأورام تكرار CRC بعد توقف العلاج 25،26. معا، هذه الدراسات تثبت قدرتها الهائلة على استخدام نماذج PDTX في عملية تطوير العقاقير التي قد تؤثر بشكل كبير على زيادة تطوير مركبات جديدة.
على الرغم من المزايا الرئيسية باستخدام المريض المستمدة الأورام في تحديد فعالية مركبات جديدة، وهناك العديد من القيود في هذا النموذج. كما هو مبين تجريبيا في هذه الورقة، يتم استبدال سدى الإنسان من الورم منشؤها (F0) مع سدى الماوس في الجيل F1 في نموذج CRC PDTX. اعتمادا على الهدف المخدرات معين، وهذا قد يكون مشكلة عندما بروابط الماوس غير قادرة على تفعيل مستقبلات (ق) على الخلايا السرطانية البشرية. لinstancه، وتبين لنا أنه في الجيل F1، مشتق HGF من سدى الماوس وحددت الدراسات أن الماوس HGF غير قادر على تفعيل ظيفيا البشري مستقبلات ج-الأرصاد 27،28. ونتيجة لذلك، مثبطات ج-الأرصاد قد لا تظهر آثار النمو المضادة للورم في هذه النماذج PDTX. في الواقع، وقد وضعت أنسنة الفئران HGF SCID لمعالجة هذه المشكلة المحتملة 28. وثمة عيب آخر من استخدام الأورام تحت الجلد هو عدم القدرة على دراسة آثار العلاج على إمكانات النقيلي من الأورام. باستخدام نماذج مثلي، على الرغم من أن أكثر صعوبة من الناحية الفنية لإنشاء ونمو الورم صورة، ومن المرجح أن توفير فهم أفضل للآثار العلاج على ورم خبيث. والقيد الأخير من هذا النموذج هو عدم القدرة على التحقيق في دور جهاز المناعة في بالتالي يؤدي إلى نمو الورم وظيفتها في تسهيل مقاومة للعلاج. وعلاوة على ذلك، مع نشاط ممتاز من المناعية أثبتت مؤخرا في العيادة، وذلك باستخدام immunodeficieالإقليم الشمالي الفئران يمنع التحقيق وكلاء المستهدفة المناعي. وفقا لذلك، وضعت نماذج الماوس أنسنة لمعالجة هذه القيود، والتي قد توفر قيمة في فهم الدور الأساسي للتفاعلات المناعة للورم وكذلك السماح للتحقيق في المناعية في تركيبة مع الرواية وغيرها من المركبات المعتمدة.
وفي الختام، ونحن نقدم طريقة لتطوير والحفاظ على نموذج اتفاقية حقوق الطفل PDTX التي لا تقدر بثمن في تحديد فعالية العلاج، المؤشرات الحيوية التنبؤية ومسارات المقاومة للأدوية وكلاء المضادة للسرطان الرواية. على الرغم من أن هذا النموذج التحديات الكامنة، وفائدة هذا النموذج أنه يلخص عن كثب التجانس الورم الورم الأصلي، والذي يقدم التحقيق أكثر دقة وذات الصلة سريريا من علاجات جديدة قبل التقييم السريري. والتقييم المستقبلي للتأثير السريري في تطوير العقاقير من هذا النموذج PDTX قبل السريرية تحدد في نهاية المطاف قوة هذانموذج في توقع النشاط السريري من العلاجات في السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109 (3), 667-675 (2013).
- Hubbard, J., Grothey, A. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer. Curr Opin Oncol. 22 (4), 374-380 (2010).
- van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435 (7044), 959-963 (2005).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18 (19), 5314-5328 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. , American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
- Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18 (9), 2704-2714 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138 (1), 195-205 (2016).
- Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16 (16), 4165-4177 (2010).
- Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6 (33), 34561-34572 (2015).
- Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35 (2013).
- Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136 (8), 1967-1975 (2015).
- Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9 (12), 3351-3362 (2010).
- Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3 (6), 658-673 (2013).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1 (6), 508-523 (2011).
- Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120 (2015).
- Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18 (4), 1051-1062 (2012).
- Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9 (11), e113037 (2014).
- Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).
- Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).
- Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).
- Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).
- Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).
