Summary
Utilisant des tumeurs provenant de patients dans un modèle préclinique sous-cutanée est une excellente façon d'étudier l'efficacité de nouvelles thérapies, la découverte de biomarqueurs prédictifs et les voies résistantes aux médicaments. Ce modèle, dans le processus de développement de médicaments, est essentielle pour déterminer le sort de nombreuses thérapies anticancéreuses avant investigation clinique.
Introduction
Le cancer colorectal (CRC) est un facteur important de décès par cancer aux États-Unis. En 2015, il y avait environ 132,700 nouveaux cas de CRC avec 49.700 décès 1. Bien que le pronostic chez les patients présentant une maladie localisée est excellente, les patients ayant une maladie avancée ont des résultats médiocres, ce qui en fait une priorité majeure dans le développement de nouvelles thérapies. Malgré le niveau de régimes de soins de chimiothérapie et les produits biologiques plus récents qui sont déployés contre cette maladie, il y a eu seulement une augmentation progressive de la survie globale. Par conséquent, il existe un effort significatif dans la compréhension des voies pilotes impliqués dans la facilitation de la croissance tumorale dans cette maladie. L'Atlas Réseau Cancer Genome a récemment identifié de nombreuses voies principales qui sont impliqués dans CRC dysrégulation et comprennent: WNT, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), RAS, facteur de croissance transformant β (TGF - β) et TP53 2. Ensemble, les enquêtes décrivant otses voies qui potentialisent la croissance des CRC ont enflammé le développement de nouvelles thérapies visant à améliorer de manière significative la survie dans cette population de patients 3-5. Utilisant des modèles précliniques en oncologie développement de médicaments ont joué un rôle essentiel dans ce processus pour prédire l'activité clinique de ces nouveaux composés.
Différents modèles pré-cliniques ont été utilisés dans le processus de développement de médicaments. Considérant que les modèles animaux transgéniques précliniques et des lignées cellulaires immortalisées ont échoué dans la détermination de l'activité clinique de nouvelles thérapies en oncologie, en grande partie en raison de leur incapacité à refléter la complexité des tumeurs humaines, xénogreffe de tumeur du patient dérivés (PDTX) modèles ont été établis. Le plus grand avantage de ce modèle est que l' hétérogénéité de la tumeur reste intacte et reflète étroitement les caractéristiques moléculaires et clonalité de l'origine de la tumeur du patient 6-9. Modèles PDTX fournissent un excellent in vivoplateforme préclinique pour l' étude de nouveaux agents, les voies de résistance aux médicaments, les stratégies combinatoires, et souches du cancer de la biologie cellulaire 10.
Un aperçu général du processus PDTX est illustrée à la figure 1. Il commence dans la clinique, des patients consentants pour permettre une partie de leur tissu tumoral en excès doit être utilisé pour cette recherche. Ensuite, à la chirurgie, un morceau de la tumeur est majoré par un pathologiste et mis en médias pour être transportés au personnel de recherche. Immédiatement après cela, une partie de la tumeur est découpée en petits morceaux et transplantés par voie sous- cutanée dans des souris immunodéficientes. Une fois que la tumeur se développe, elle est soumise à un passage dans les différentes générations de souris afin de maintenir la tumeur 10. En règle générale, après la génération F3 de la tumeur peut être étendue dans une étude de traitement, où de nouveaux composés et / ou des thérapies combinatoires sont évaluées. Utilisant des biomarqueurs prédictifs potentiels Next Gen Seq (Exome Seq, ARN Seq et SNP array) sont découvrired qui aident à la sélection des patients qui peuvent tirer profit d'un traitement particulier.
Les objectifs généraux de l'utilisation de modèles de PDTX sont: 1) évaluer l'efficacité de nouveaux traitements en monothérapie ou en association et 2) identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité ou de la résistance avant investigation clinique. Dans ce manuscrit, nous fournissons la méthodologie dans l'initiation et le maintien d'une banque CRC PDTX et de fournir les avantages et les limites de ce modèle dans la découverte de développement de médicaments.
Figure 1. Vue d' ensemble du modèle de protocole CRC PDTX. Un patient tumeur dérivé est reçu de la chirurgie et immédiatement injecté dans des souris nude athymiques sous - cutanée. Une fois que la tumeur se développe, il est élargi dans les générations suivantes et finalement élargi pour les études de traitement. Traitement respoNSE sont évalués et biomarqueurs prédictifs sont identifiés qui peuvent aider à la sélection des patients. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
Déclaration d'éthique: échantillons de tumeur adénocarcinome colorectal patients dérivés ont été obtenus auprès de patients consentants à l'Université de Colorado Hospital, conformément à un protocole approuvé par le Conseil d'examen institutionnel Multiple Colorado (08-0439). Tous les travaux des animaux a été réalisée dans des protocoles d'animaux approuvés par l'Université du Colorado Denver Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC, Protocole # 51412 (06) 1E et 96813 (04) 1F).
1. Réception et préparation de sang du patient
- Collecter 1 - 2 ml de sang dans un tube de séparation du sang / cellulaire contenant du citrate de sodium (phases de tubes inclus sont le plasma, les lymphocytes et la bande de monocytes, le liquide à gradient de densité, une barrière de gel, et les erythrocytes et les neutrophiles). Attention, suivre les directives du sang Borne Pathogène avec le sang ou les tissus.
Nota: Les PBMC et de plasma peuvent être utilisées pour des études ultérieures qui peuvent inclure: la comparaison d'une variation génétique germinale des mutations tumorales, isolant circules cellules tumorales ting, l' évaluation de l' ADN de cellules libres (cfDNA), les protéines d' examen et microARN, etc. - Centrifuger la / cellule tube de séparation du sang à 2500 g pendant 15 min sans frein à température ambiante.
- Recueillir les cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP en lymphocytes et monocytes bande de tubes) et de mettre dans un tube de 1,5 ml (clair, autoclavable, DNase, RNase, et apyrogène), et remplir la partie supérieure du tube avec stérile Phosphate-Buffered une solution saline (PBS).
- Centrifuger à 2300 g pendant 3 min à température ambiante pour former un culot de PBMCs au fond du tube. Ensuite, retirer le surnageant avec précaution. Ajouter 1 ml de PBS stérile pour laver le culot et centrifuger à 3000 xg pendant 30 secondes, puis retirer le surnageant.
- Utiliser une pipette pour recueillir le plasma du tube de séparation de sang / cellule (en phase plasma d'un tube) dans une fiole cryogénique de 1,5 ml stérile (DNase et RNase, aucun ADN humain, une endotoxine libre) et de mettre le plasma et le culot de PBMC ce en -80 ° C freezer pour le stockage.
2. Réception et préparation des patients tumeur échantillon
- Préparer une ou l'autre RPMI ou milieu DMEM avec 1: 100 (10%) de pénicilline-streptomycine et des acides aminés non essentiels, 1: 1000 (1%) Plasmocin et 10% inactivé de sérum bovin fœtal (en milieu complet) et ajouter 20 à 25 ml à un récipient de collecte stérile pour le spécimen de tumeur.
- Récupérer l'échantillon de la tumeur dans une tasse stérile contenant un milieu complet sur la glace ou de conserver à 4 ° C.
Note: L'échantillon de tumeur est un fragment de tissu tumoral du patient en excès qui est éliminée par un chirurgien, traitée par un pathologiste, et placé dans un récipient de collecte stérile avec un milieu complet. Attention, suivre les directives du sang Borne Pathogène avec le sang ou les tissus. De plus, idéalement d'injecter cinq souris, la tumeur doit être d'environ 1 cm³. - Amener l'échantillon de tumeur à l'animalerie pour l'injection dans des souris immunodéprimées.
Remarque: Il est préférable de traiter l'échantillon de tumeur le plus tôt possible.- Dans une hotte à flux laminaire, placer l'échantillon de la tumeur dans une boîte stérile de coupe en plastique de la coupe de tumeur. Utilisez autoclavé-petits ciseaux et des pinces pour couper dans 10-12 environ 3 x 3 x 3 mm morceaux et le placer dans un tube de 1,5 ml autoclavé rempli de 300 pi de gélatineuse solution de mélange de protéines. Gardez le tube sur la glace.
- Comme une priorité d'injecter une tumeur dans des souris, mais s'il y a une tumeur reste, rassembler le flash gelé flacons (FF), fixés au formol paraffine (FFPE) les coupes, et un flacon de tumeur viable.
- Pour FF, de recueillir de petits morceaux de tissus tumoraux à partir d'un flacon cryogénique stérile pour une analyse ultérieure telle qu'une protéine, un ARN, ou l'isolement de l'ADN. Placez FF immédiatement dans un dewar d'azote liquide et stocker à long terme dans un -80 ° C congélateur.
- Pour FFPE, s'il y a assez tumeur, lieu 3 petits morceaux dans une tasse de formaline 10 ml de 10% et le processus en paraffine blocs embarqués une fois la tumeur a été dans le formol pendant au moins 24 heures.
Remarque: 24 h est baséau large de nos suggestions histologie de base 11. - Enfin, placer la tumeur restante dans un tube cryogénique. Faire des médias viables en ajoutant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour compléter les médias. Ensuite, ajoutez 1 ml à un tube cryogénique et de stocker sur la glace. Note: Ne pas garder sur la glace pendant de longues périodes de temps.
- Couper toute tumeur restant en petits morceaux qui seront idéalement être suffisant pour 10 tumeurs à injecter dans 5 souris à l'avenir. Ensuite, placez le tube de tumeur viable sur la glace jusqu'à ce qu'il puisse être placé dans un récipient de congélation d'alcool isopropylique (gèle lentement la tumeur 1 ° C à la fois) et mis en -80 ° C congélateur pour veiller à ce que les tumeurs ne meurent pas au cours de la processus de congélation.
Remarque: Pour le stockage à long terme, les tumeurs sont prélevées (après 2 - 3 jours) et on les place dans un grand vase Dewar d'azote liquide. S'il vous plaît noter que les tubes viables ne devraient pas être autorisés à dégeler à moins qu'il est sorti d'injecter à des souris.
- Couper toute tumeur restant en petits morceaux qui seront idéalement être suffisant pour 10 tumeurs à injecter dans 5 souris à l'avenir. Ensuite, placez le tube de tumeur viable sur la glace jusqu'à ce qu'il puisse être placé dans un récipient de congélation d'alcool isopropylique (gèle lentement la tumeur 1 ° C à la fois) et mis en -80 ° C congélateur pour veiller à ce que les tumeurs ne meurent pas au cours de la processus de congélation.
3.L'injection de patients dérivées de xénogreffes tumorales
- Utilisez cinq 6 - 8 semaine vieux mâle et / ou des souris nude athymiques femelles (T-cellule déficiente) pour chaque tumeur dérivé du patient séparé. Injecter un total de 10 tumeurs (2 injections par souris) sous-cutanée (SQ).
Note: La tumeur humaine d'origine est désigné comme F0, puis une fois injecté dans les souris de la prochaine génération est F1. En outre, l'utilisation de pinces autoclaves, des ciseaux, et trocarts pour chaque explant unique. - pièces de charge de la tumeur de la solution de mélange de protéines gélatineuse dans autoclavées 12 G trocarts et veiller à ce que la tumeur est complètement poussé dans le trocart.
- Dans une hotte à flux laminaire stérile, placer 5 souris dans une boîte d'anesthésie qui est connectée à une machine isoflurane anesthésique (a commencé au taux initial de 5% d'isoflurane, 3 - 4% d'oxygène, et 2 - 3% d'isoflurane pour le maintien de l'anesthésie) et le filtre à charbon (absorbe l'excès de gaz).
Note: Un technicien expérimenté devrait être en mesure d'effectuer toute la procédure surune cage de 5 souris à l'intérieur d'environ 5 min (environ 30 sec par souris). Par conséquent, le soutien thermique supplémentaire et la lubrification des yeux ne sont généralement pas utilisés. Pour les individus moins expérimentés ou pendant la formation, il est fortement recommandé que les individus soit effectuer la procédure sur moins d'animaux à un moment et / ou utiliser une lubrification pad / oculaire de réchauffement durant la procédure si les animaux seront anesthésiés plus de 5 min. La procédure est fondée sur des normes IACUC à notre université.
- Dans une hotte à flux laminaire stérile, placer 5 souris dans une boîte d'anesthésie qui est connectée à une machine isoflurane anesthésique (a commencé au taux initial de 5% d'isoflurane, 3 - 4% d'oxygène, et 2 - 3% d'isoflurane pour le maintien de l'anesthésie) et le filtre à charbon (absorbe l'excès de gaz).
- Pincez un orteil de la souris pour assurer la souris ne répond plus, puis prendre la souris hors de la boîte isoflurane. Placer la souris sur un champ propre à injecter des tumeurs de la région dorsale du cou milieu et glissant avec la voie sous-cutanée trocart vers le bas jusqu'à ce que la région du flanc est atteint avec autoclavé 12 g trocarts.
- Fournir une sous-cutanée de la tumeur de chaque côté du flanc de la souris. Pincer la tumeur lorsque le trocart est retiré, en veillant à ce que la tumeur reste dans la région de flanc souhaitée. Le gemélange de protéines latinous durcit avec la température du corps de la souris et encapsule la tumeur pendant environ 1 semaine pour aider la tumeur à croître et à le fixer sur le tissu conjonctif SQ. La lésion faite par le trocart est pas supérieure à 4 mm, et il n'y a pas besoin de fermer la peau avec des agrafes.
Note: Nos vétérinaires déterminées aucune fermeture est besoin en fonction de très petite taille de la lésion, le temps de guérison rapide (région dorsale du cou milieu réduit toute tension de la peau ou le toilettage de la lésion), aucune infection noté, et une surveillance étroite des animaux au cours de cette période de temps .
- Fournir une sous-cutanée de la tumeur de chaque côté du flanc de la souris. Pincer la tumeur lorsque le trocart est retiré, en veillant à ce que la tumeur reste dans la région de flanc souhaitée. Le gemélange de protéines latinous durcit avec la température du corps de la souris et encapsule la tumeur pendant environ 1 semaine pour aider la tumeur à croître et à le fixer sur le tissu conjonctif SQ. La lésion faite par le trocart est pas supérieure à 4 mm, et il n'y a pas besoin de fermer la peau avec des agrafes.
- Avant la souris est SQ (médicaments contre la douleur) complètement éveillé injection de méloxicam 2 mg / kg à distance du site d'injection de la tumeur. Ensuite, placez la souris dans la cage et surveiller jusqu'à ce que la souris est éveillé et en mouvement.
Remarque: Ne laissez pas la récupération des animaux sans surveillance jusqu'à ce que complètement éveillé. dosage Meloxicam est basé sur les normes IACUC à notre université.- Ensuite, répétez la même procédure avec le 4restante souris et contrôler leur respiration.
Remarque: S'il vous plaît noter que ceci est une procédure très rapide et les souris se réveillent très tôt après l'injection Meloxicam, mais ajuster isoflurane au besoin. Chaque fois que la souris est sortie, baissez le isoflurane. Le Meloxicam va durer 24 heures et les lésions des trocarts va guérir complètement en 1 semaine.
- Ensuite, répétez la même procédure avec le 4restante souris et contrôler leur respiration.
4. Maintenance du patient dérivées tumeur xénogreffe Bank
- Surveiller la croissance et la santé des souris au moins une fois par semaine. Utiliser une feuille (ou un autre système de suivi) pour suivre les tailles des tumeurs, la génération de la tumeur, la date de l'injection de la tumeur, et la santé de la souris.
Remarque: Si les souris ont perdu 15% de leur poids corporel initial, faible score de condition corporelle (≥ 2), ont ulcérations tumorales, des tumeurs atteignant 2.000 mm 3 ou tumeurs au total 3000 mm 3, ou sont maladifs (recroquevillée, froid, léthargie, etc .) de quelque manière, les souris sont euthanasiées par CO₂ ou anesthésiés suivie par dislocation cervicale queméthode SECONDAIRE. Euthanasier via l'anesthésie et la dislocation cervicale si la collecte tumeur, les souris autrement sont euthanasiés par CO₂ et dislocation cervicale. - Lorsqu'une tumeur est d' environ 1500-2000 mm 3 anesthésier la souris comme décrit ci - dessus, puis effectuer la dislocation cervicale pour euthanasier.
- Vérifiez que la souris n'a pas de pouls. Exciser la tumeur SQ avec des ciseaux et des pinces autoclavés.
NOTE: Laisser les tumeurs de croître jusqu'à 1 an et si aucune tumeur est vu alors euthanasier les souris via CO 2, suivie par dislocation cervicale comme méthode secondaire. - Passage le meilleur de la tumeur de plus en plus dans la prochaine génération (aka une nouvelle série de 5 souris). Utilisez les instructions ci-dessus pour recueillir 10 - 12 tumeurs pour le passage et ensuite recueillir les restes de la tumeur comme décrit également ci-dessus.
Note: La collecte de nombreux tubes viables est très important dans les premières générations (F1 - F8); donc recueillir plusieurs tubes viables, tubes FF et 1 FFPE par generation. - Gardez les souris restantes jusqu'à ce qu'une nouvelle génération de souris a la croissance tumorale d'environ 300 mm 3. Lorsque les souris restantes ont des tumeurs qui sont grandes, continuer à recueillir comme décrit ci-dessus.
- Vérifiez que la souris n'a pas de pouls. Exciser la tumeur SQ avec des ciseaux et des pinces autoclavés.
- Continuer à des tumeurs de passage et de recueillir à chaque étape jusqu'à F15. À ce stade, prendre un tube viable de la première génération possible hors de l'azote liquide et laisser décongeler sur la glace et suivre les procédures tumorales d'injection décrites ci-dessus.
Remarque: Les tumeurs qui se développent à partir de tubes viables prennent plus de temps à se développer chez la souris par rapport à la transmission de génération en génération, donc gardez cela à l'esprit lors de la planification. Si un modèle de PDTX particulier ne sont plus nécessaires à tout passage, euthanasier et de recueillir la tumeur, afin d'assurer de nombreux tubes viables sont collectés pour une utilisation future.
5. Developmental Therapeutics avec des patients dérivées xénogreffes tumorales
Note: La plupart des tumeurs à la génération F3 ont une bonne cinétique de croissance (une croissance plus rapide et plus consistent), par conséquent, procéder à PDTX études d'efficacité des médicaments.
- Lorsque la tumeur désirée est très grande (1.500 - 2.000 mm 3), suivre les procédures ci - dessus pour recueillir la tumeur de se développer dans la quantité désirée de souris.
- En fonction de l'hypothèse testée à déterminer le nombre requis de tumeurs par groupe de traitement.
Note: 1 ml de solution gélatineuse mélange de protéines d'environ 30 pièces en forme de petites tumeurs peuvent (en fonction de la morphologie de la tumeur) pour l'injection à des souris.
- En fonction de l'hypothèse testée à déterminer le nombre requis de tumeurs par groupe de traitement.
- Vérifiez les souris avec des tumeurs hebdomadaires et quand la plupart des tumeurs sont visiblement petite (environ entre 50 - 300 mm³) mesurer les tumeurs avec étriers pour déterminer le volume de la tumeur. Le volume des tumeurs = [width² (mesure la plus petite) x longueur (mesure la plus grande)] x 0,52.
Remarque: La solution du mélange de protéines gélatineux entoure les morceaux de tumeur injectées pendant une semaine, puis après la croissance tumorale d'une semaine sera exacte. - Utiliser les volumes de tumeur entre 50 - 300 mm³ et lan moyenne de la tumeur gauche et droite. Ensuite randomiser en groupes de traitement de 10 tumeurs par groupe et une moyenne du groupe, au sein de quelques chiffres de l'autre. Ensuite, trier les souris en groupes et de commencer l'étude de traitement souhaité.
- Dose souris avec la drogue (calendrier dépendant drogue), peser et mesurer (tumeur) deux fois par semaine. A la fin de l'étude, euthanasier les souris par l'anesthésie et la dislocation cervicale et de recueillir la tumeur pour l'analyse pharmacodynamique future dans le laboratoire.
Note: L'étude dure 30 jours en fonction de la taille et de la santé des souris tumeur du véhicule.
6. Organisation d'une banque PDTX
- Gardez une forme bien documentée pour éviter la répétition de la recherche et l'utilisation appropriée des animaux.
NOTE: Ceci est la clé d'une banque de PDTX réussie.- Utilisez des feuilles de calcul pour garder la trace d'une tumeur du patient humain dans la clinique, à des souris dans la banque PDTX, les traitements, les données, et ce qui est collecté. Note: ceci inclut congélateur, dewars d'azote liquide, Et le stockage de FFPE ainsi.
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Representative Results
Similitudes de mutations communes dans les modèles CRC PDTX et l'TCGA
Nous avons examiné si le pourcentage de mutations communes (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 et TP53) dans la banque CRC PDTX étaient représentatives de la fréquence de mutation observée dans la population des patients CRC. Comme le montre la figure 2A (TCGA) et B (CRC PDTX banque), la fréquence des mutations dans ces gènes étaient très semblables entre le TCGA (n = 276 patients) et la banque CRC PDTX (n = 59 patients CRC). La plus grande différence observée était dans le gène APC par lequel une différence de 23% a été observée. Ces résultats suggèrent que les mutations communes observées dans la population de patients CRC est bien représentée dans le modèle CRC PDTX.
Evaluation de la stabilité des réponses de traitement entre les différentsgénérations
Dans ce modèle CRC PDTX, nous avons cherché à déterminer si les effets du traitement étaient similaires entre les différentes générations. Les tumeurs ont été développées dans les souris nues athymiques (10 tumeurs / groupe) et l'efficacité de la norme des agents de soins tels que le cetuximab (0,4 mg IP / souris deux fois par semaine) et de l'irinotécan (15 mg / kg IP une fois par semaine) ont été examinés en 4 modèles CRC PDTX uniques dans deux générations distinctes. Comme cela est illustré sur la figure 3A et B, CRC026 (F3) est plus résistant à un traitement cetuximab, tandis que CRC010 (F6) présentait une sensibilité de traitement. Des résultats similaires ont été observés lorsque ces explants CRC ont été traités dans différentes générations; CRC026 (F9) était résistant et CRC010 (F7) est sensible au cetuximab. Pour déterminer l'efficacité de l'irinotécan dans le modèle PDTX, nous avons étudié les effets du traitement sur la croissance tumorale en 2 modèles CRC PDTX. Alors que CRC098 (F8) était résistant au traitement irinotecan, CRC036 (F5) présentaient une sensibilité (figure 3C et D). Comme on l'a observé avec le cétuximab, le traitement avec l'irinotecan dans différentes générations n'a pas changé la réponse au traitement dans ces tumeurs; CRC098 (F12) était résistant et CRC036 (F10) est sensible à l' irinotécan (figure 3C et D). Bien que la cinétique de tumeurs non traitées de croissance était parfois différente entre les générations, les réponses au traitement à l'irinotécan et cetuximab est resté le même, ce qui indique la stabilité de ce modèle dans l'évaluation des thérapies anti-cancéreuses.
Etude de la composante Stroma dans le modèle CRC PDTX
Ensuite, nous nous sommes intéressés à déterminer si le composant de stroma dans ce modèle explant CRC était composé de cellules de souris dérivées humaine et / ou. Nous avons utilisé une double couleur Cot-1 FISH test qui consistait à la sourisCot-1 DNA (fluorophore vert) et humain Cot-1 DNA (fluorophore rouge) pour déterminer la souris et les cellules humaines dans 10 explants CRC séparés entre générations F0 et F1 25. Comme on le voit sur la figure 4A, dans la génération F1 stroma humain est remplacé par le stroma de la souris, puisque la tumeur humaine est maintenant entouré de tous stroma de la souris. Ces résultats étaient évidents dans les 10 explants CRC qui ont été soumis à Cot-1 FISH entre les générations F0 et F1. En plus de Cot-1 FISH, nous avons étudié les niveaux de souris et HGF humain et ligands VEGF protéines dans les générations F0 et F1 à l'aide de la souris et ELISA humaines pour ces ligands. Comme le montre la figure 4B et C, alors que tous les humains dérivés HGF dans la génération F0 est remplacé par HGF de la souris dans la génération F1, ligand VEGF consistait à la fois humain et de souris dans la génération F1. L'ensemble de ces expériences suggèrent que, dans le modèle de souris CRC PDTX que le stroma de la souris dépasse le stroma humain èmee génération F1 et les ligands sécrétés peuvent varier par rapport à l'être humain et / ou la souris dérivées.
Figure 2. Comparaison des mutations communes dans le PDTX Bank CRC et le TCGA. Nous avons observé des fréquences de mutation très similaires entre le TCGA (A) et le modèle CRC PDTX (B) par rapport à KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 et TP53 . S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les effets du cetuximab et de traitement irinotécan sur la croissance tumorale. (A) CRC026 affiche une résistance au cetuximab lorsque évaATED dans les générations F3 et F9 et (B) CRC010 présentaient une sensibilité au cetuximab dans les générations F6 et F7. (C) CRC098 a montré une résistance à l' irinotecan dans les générations F8 et F12, tandis que (D) CRC036 était sensible à l' irinotecan dans le F5 et les générations F10. Chaque point de données représente une moyenne de 10 tumeurs par groupe de traitement. Les souris ont été traitées avec le cetuximab (100 ul IP 400 ug / souris) deux fois par semaine et de l'irinotécan (100 ul IP 20 mg / kg) a été administrée une fois par semaine. Les données présentées comme moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Composants d' évaluation de la souris et cellulaires tumorales dans les générations F0 et F1. (A) Dual-color FISH pour le lit-1 ADN humain (rouge) et de la souris lit-1 ADN (vert) a été utilisé pour étudier les différences entre les tumeurs de la génération F0 et F1. stroma humain (F0) est remplacé par le stroma de la souris (F1) dans CRC098 et CR174 (échelle = 20x). Les cellules nécrotiques ont été identifiés par la réduction ou l'absence de DAPI intercalation et la fluorescence rouge. Étude des souris et HGF humain VEGF et l' expression du ligand par un test ELISA (souris et des tests ELISA humains) entre F0 et F1. (B) , le HGF humain a été remplacé par la souris dans la génération F1 et (C) humain et de souris VEGF étaient évidents dans la génération F1 (picogrammes / millilitre [pg / ml]). Les données présentées comme moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La PDTX plate-forme de découverte de médicaments offre un modèle amélioré aux insuffisances des autres modèles précliniques qui sont peu fiables pour prédire l'activité clinique des nouveaux composés. Fait important, les tumeurs de ce modèle sont biologiquement stable, conservent un potentiel métastatique, et présentent la même réactivité médicaments de génération en génération. Dans ce modèle, dérivées patient tumeurs sont injectées dans des souris nude athymiques, repiquées, et ensuite utilisées dans l'évaluation thérapeutique. Il y a plusieurs étapes critiques pour une banque de PDTX réussie qui comprennent: 1) une équipe clinique cohérente pour identifier les patients / de consentement et pour l'enlèvement et extrapolation de tissu tumoral pour le modèle PDTX et 2) un groupe de recherche solide avec un excellent laboratoire et animaux technique compétences pour injecter des tumeurs, l'organisation et la maintenance de la banque PDTX et la surveillance de la santé des souris. Un avantage significatif dans nos modèles de PDTX injecte des tumeurs avec la procédure de trocart. La méthode alternative de cuPrép une poche de la tumeur, puis suturer ou à l'aide des clips de la peau est plus de temps pour le personnel, nécessite des analgésiques plus pour les souris, et la surveillance de la plaie suturée ou zone écrêtée. La procédure de trocart nécessite moins de formation, est très rapide, les souris sont sous anesthésie pendant moins de temps et moins de médicaments contre la douleur sont nécessaires. Par conséquent, dans notre expérience injectant des tumeurs avec des trocarts est la meilleure méthode par rapport aux méthodes alternatives. Ces facteurs vont influencer de manière significative le succès global de la banque PDTX et dans le processus de découverte de médicaments. Bien que ce modèle in vivo est considérablement plus coûteux que les essais en cultures de lignées de cellules cancéreuses, les modèles PDTX offrent une approche plus pertinente sur le plan clinique dans les composés tests en oncologie.
Dans la banque CRC PDTX, nous avons reçu 99 échantillons de tumeurs qui ont été injectés dans des souris nude athymiques. Il y avait 68 sur 99 (taux de participation de 68,7%) des tumeurs qui se sont développées chez les souris et ont été transmises en plusieurs générations. LàPlusieurs raisons expliquent pourquoi certaines tumeurs que nous avons reçues ne poussent chez des souris. Par exemple, nous avons parfois reçu que très petits morceaux de tissu qui ne nous a permis d'injecter dans une seule souris diminuer les chances d'établir une tumeur. Un autre problème était que, parfois, nous avons reçu les tissus du patient qui était normal et ne contenait pas de cellules tumorales évidentes sur la diapositive H & E. En outre, une certaine qualité de tissu pauvre peut être dû à la réception d'une tumeur déjà nécrosée où il y avait une réponse du patient au traitement. Par conséquent, il est important d'avoir une équipe chirurgicale et pathologie fiable lorsque l'extrapolation de la tumeur. Compte tenu de certaines de ces questions, nous avons été en mesure d'établir l'une des plus grandes banques CRC PDTX de tumeurs entièrement annotés par rapport à des mutations, l'expression des gènes, et les caractéristiques cliniques, ce qui en fait un modèle précieux pour l'évaluation de nouvelles thérapies dans le but ultime d'améliorer les résultats des patients.
De nombreuses biologique et combinatoiresthérapies ont été étudiées dans ce modèle avec l'objectif de déterminer l'efficacité, les mécanismes de résistance aux médicaments, ainsi que les effets du traitement sur la population de cellules souches du cancer. Notre groupe a examiné l'efficacité de nombreux nouveaux inhibiteurs de la voie biologique en utilisant ce modèle préclinique 12-18, qui a fourni des informations précieuses sur la poursuite du développement clinique de ces composés. Plusieurs de ces études ont identifié des marqueurs prédictifs 12-14,17,18 qui peuvent aider à la sélection des patients dans les essais cliniques futurs. En outre, d' autres études ont en outre déterminé les mécanismes de résistance au traitement à l' aide de ce modèle, qui a conduit à l'élaboration de combinaisons rationnelles 19-24. Par exemple, Bardelli et ses collègues 19 ont démontré que le traitement cetuximab induit MET amplification et que Met peut être un mécanisme sous - jacent de la résistance au traitement au cetuximab dans CRC. 19 Dans une étude séparée, Bertotti et al. 20Her2 identifié comme cible dans les tumeurs CRC qui étaient résistants à cetuximab. Enfin, nous et un autre groupe a montré que le traitement avec un inhibiteur de la voie Notch en combinaison avec irinotecan réduit la CRC population de cellules souches cancéreuses et la tumeur récidive après traitement a été interrompu 25,26. Ensemble, ces études démontrent la puissance potentielle de l'utilisation de modèles de PDTX dans le processus de développement de médicaments qui peuvent influer de manière significative le développement de nouveaux composés.
Malgré les avantages majeurs à l'aide des patients provenant des tumeurs dans la détermination de l'efficacité des nouveaux composés, il existe plusieurs limites à ce modèle. Comme montré expérimentalement dans le présent document, le stroma humain de l'origine tumorale (F0) est remplacé par le stroma de la souris à la génération F1 dans le modèle CRC PDTX. En fonction de la cible de médicament en particulier, cela peut être un problème lorsque des ligands de souris sont incapables d'activer le récepteur (s) sur les cellules tumorales humaines. Pour instance, nous montrons que , dans la génération F1, HGF est dérivé du stroma de la souris et des études ont déterminé que la souris HGF est incapable d'activer fonctionnellement le récepteur c-Met humain 27,28. Par conséquent, les inhibiteurs de c-Met peuvent ne pas présenter des effets de croissance anti-tumoraux dans ces modèles PDTX. En effet, des souris SCID humanisées HGF ont été développés pour résoudre ce problème potentiel 28. Un autre inconvénient de l'utilisation de tumeurs sous-cutanées est l'incapacité d'étudier les effets du traitement sur le potentiel métastatique des tumeurs. En utilisant des modèles orthotopique, bien que techniquement plus difficile à établir et la croissance image de la tumeur, sera probablement offrir un meilleur aperçu des effets du traitement sur les métastases. Une dernière limite de ce modèle est l'incapacité d'examiner le rôle du système immunitaire dans la potentialisation de la croissance des tumeurs et sa fonction pour faciliter la résistance au traitement. En outre, avec l'excellente activité d'immunothérapies récemment démontré dans la clinique, en utilisant immunodeficiesouris nt empêche l'enquête des agents ciblés immunitaires. En conséquence, les modèles de souris humanisées ont été développés pour répondre à ces limitations, qui peuvent apporter une valeur dans la compréhension du rôle fondamental des interactions immunitaires tumorales ainsi que de permettre à l'enquête de immunothérapies en combinaison avec d'autres composés nouveaux et approuvés.
En conclusion, nous fournissons une méthode sur le développement et le maintien d'un modèle CRC PDTX qui est inestimable dans la détermination de l'efficacité thérapeutique, les biomarqueurs prédictifs et les voies de résistance aux médicaments des agents anti-cancéreux nouveaux. Bien que ce modèle a des défis inhérents, l'utilité de ce modèle est qu'il récapitule étroitement l'hétérogénéité de la tumeur de la tumeur d'origine, qui offre une enquête plus précise et cliniquement pertinente de nouvelles thérapies avant l'évaluation clinique. l'évaluation future de l'impact clinique dans le développement de médicaments de ce modèle de PDTX préclinique déterminera finalement la puissance de cettemodèle pour prédire l'activité clinique de thérapies contre le cancer.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
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