Abstract
Massa gebruikt cytometrie antilichamen geconjugeerd met zware metalen labels, een benadering die sterk het aantal parameters en mogelijkheden voor diepgaande analyse vormt dan mogelijk is met conventionele fluorescentie gebaseerde stroomcytometrie is toegenomen. Zoals met elke nieuwe technologie, zijn er kritische stappen die bijdragen aan een betrouwbare generatie van kwalitatief hoogwaardige data. Hier voorgesteld is een geoptimaliseerd protocol dat meerdere technieken opneemt voor verwerking van celmonsters voor massa-cytometrie analyse. De hier beschreven methoden zal helpen de gebruiker voorkomende valkuilen te vermijden en het bereiken van consistente resultaten door het minimaliseren van variabiliteit, wat kan leiden tot onjuiste gegevens. Experimenteel ontwerp kennis, is de ratio optionele of alternatieve stappen in het protocol en de werkzaamheid bij het blootleggen van de kennis op de biologie van het systeem dat wordt onderzocht afgedekt. Ten slotte is representatieve gegevens gepresenteerd om de verwachte resultaten van de technieken presente illustrerenHier d.
Introduction
Cytometrie maakt de gelijktijdige meting van verschillende antilichaam doelen op een enkele cel niveau in grote populaties van cellen. In traditionele fluorescentie gebaseerde doorstroomcytometrie, wordt het aantal parameters dat kan worden gekwantificeerd beperkt door spectrale overlap tussen het emissiespectrum van meerdere fluoroforen, die steeds complexer compensatieberekeningen als het aantal parameters toeneemt vereist. Deze beperkingen worden aangepakt massa cytometrie, waarbij heavy metal-geconjugeerde antilichamen gedetecteerd en gekwantificeerd vluchttijd (TOF) massaspectrometrie om het aantal parameters gelijktijdig verzamelde sterk worden vergroot en op een hoge dimensionele eiwit-overvloed profiel van elke individuele cel.
Een fundamenteel begrip van de werking van de massa cytometrie instrument is gunstig voor de gebruiker en kan essentieel zijn voor het oplossen van problemen. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van tuning en het runnen van een massa cytometrie machine,Zie het verwante manuscript 1. In het kort wordt een celmonster gelabeld met een panel van metaal geconjugeerde antilichamen gericht celoppervlak markers, cytoplasmische eiwitten, kerneiwitten, chromatine-gebonden eiwitten of andere epitopen van belang (figuur 1i). De gelabelde cellen worden geladen op de machine, hetzij een voor een handmatig injectie of via een autosampler dat monsters van een 96-wells plaat. De geladen cellen worden geïnjecteerd via een vernevelaar, waarbij een nevel van vloeistofdruppeltjes inkapselen van de cellen (figuur 1ii) genereert. Deze spray is gepositioneerd dat de cellen worden geïoniseerd door een argon plasmatoorts. Deze ionisatie genereert deeltjeswolk omvattende alle samenstellende atomen van elke cel (figuur 1iii). Aangezien deze deeltjeswolk reist naar de detector worden lage atoommassa atomen gescheiden van de hoge massa ionen door vierpool massa filter. De resterende hoge massa ionen blijft de detector, waarbij de abundance van elke isotoop gekwantificeerd (figuur 1iv). De ruwe gegevens verzameld door de detector, worden geanalyseerd door de massa cytometrie instrumentsoftware naar cel gebeurtenissen te identificeren. Voor elke geïdentificeerde cel geval wordt de in elk kanaalsignaal gekwantificeerd en opgeslagen met een uitgang .fcs bestand. De massa kanalen voor het opsporen van zware metalen geconjugeerde antilichamen vertonen een minimale spectrale overlap, dat varieert van 0-4% meeste bijdragen dan 1%. Vanwege deze lage overspraak tussen kanalen, het in het algemeen onnodig om de gegevens om te zetten met een compensatie voor de analyse matrix 2. Er moet echter bij het ontwerp van de experimentele panel van antilichamen worden gelet dat een antilichaam met hoogabondante epitoop niet is toegewezen aan een massa kanaal signaal bijdraagt aan een kanaal toegewezen aan een laagabondante antilichaam, omdat dit maak een kunstmatig hoge populatie in het kanaal ontvangen van het signaal bijdrage.
3, 4. Uitvoeren celoppervlak antilichaam kleuring van levende cellen noodzakelijk zijn voor sommige antilichamen, maar de mogelijkheid uitsluit barcodes vóór antilichaammerking de meeste barcodes werkwijzen worden uitgevoerd na fixatie 5 hoewel antilichaam gebaseerde barcoding 6, 7 is een uitzondering.
De bepaling van het aantal cellen te bereiden voor analyse, is het belangrijk te weten dat slechts een fractie van de cellen op het apparaat geladen wordt gedetecteerd en te produceren. Dit verlies is vooral te wijten aan inefficiëntie wanneer de vernevelaar sprays het monster bij de toorts. Het exacte percentage verlies is afhankelijk van de massa cytometrie machine setup en celtype, maar kan variëren van 50-85% bedraagt en moet wordenoverwogen bij het ontwerpen van het experiment. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 2x10 6 cellen per monster, maar kan worden aangepast voor het verwerken van kleinere of grotere steekproefomvang. Dit protocol kan worden gebruikt met minimale wijzigingen voor steekproefomvang van 1 x 06-04 oktober x 10 6, maar het is essentieel dat steekproefomvang overeenstemming binnen een experiment worden bewaard. Veranderingen in celaantal kan invloed hebben op de intensiteit van barcodes en antilichaamkleuring en ruwweg overeen worden bewaard in monsters direct te vergelijken.
Sommige procedures, zoals dode cellen en labeling DNA labeling dient in de overgrote meerderheid uitgevoerd, zoniet allemaal proefopzetten. De etikettering van dode cellen in experimenten analyse alleen oppervlaktemerkers kan worden bereikt met behulp Rh103, maar Rh103, te vermijden voor experimenten waarbij permeabilisatie nodig omdat het resulteert in kleuring verlies. Voor experimenten met permeabilisatie, is het raadzaam om cisplatine gebruiken Barcodes monsters kan verminderen consumptie antilichaam acquisitietijd verminderen en elimineren van monster tot monster variabiliteit 9. De werkwijze omvat het aanbrengen van barcodes unique sample-specifieke code voor alle cellen, die wordt gebruikt om elke cel toe te wijzen aan het monster van herkomst. Na barcodes de monsters vóór antilichaamkleuring, een proces waarbij alle monsters zijn gelijk gekleurd worden samengevoegd. Experimentele fouten te minimaliseren, is het verstandig om barcode en alle monsters die rechtstreeks worden vergeleken met elkaar bundelen. Momenteel bestaan er verschillende werkwijzen voor barcodes monsters voor massa-cytometrie analyse 5, 6, 7, waarvan er twee worden hier gepresenteerd (zie hieronder). Met de huidige beschikbare Reagents is het mogelijk om de overvloed van 38 antilichaamdoelen kwantificeren, te identificeren cellen in S-fase 10 onderscheiden levende en dode cellen 8 en meet cellulaire niveaus van hypoxie 11 in een gemultiplexte experiment meerdere monsters. Dit vermogen om hoge parameter eencellige verzamelen van grote celpopulaties maakt verbeterde profilering zeer heterogene celpopulaties en heeft reeds een aantal nieuwe biologische inzichten 12, 13, 14, 15, 16 gevormd. Het destilleren van de resulterende complexe gegevens interpreteerbaar is het gebruik van algoritmes zoals spanning tree progressie van Density genormaliseerde Events (SPADE) 17 en viSNE 18 vereist. Dit artikel presenteert een toegankelijkeoverzicht van hoe het ontwerpen en uitvoeren van een massa cytometrie experiment en introduceert fundamentele analyse van de massa cytometrie data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Oogsten
- Oogsten van cellen uit primair weefsel
OPMERKING: De werkwijze beschreven voor het oogsten van cellen uit primair weefsel is specifiek van toepassing op muis borst tumor weefsel en mogelijk niet van toepassing zijn primaire weefsels uit andere bronnen.- Bereid digestie buffer door oplossen van 5 mg hyaluronidase en 30 mg collagenase in 10 ml DMEM / F12-medium per gram weefsel te verwerken. Filter steriliseren spijsvertering buffer.
- Isoleer primaire tumor borstklier van muizen en opnemen tumorgewicht.
- Gehakt weefsel met # 10 scalpel gedurende minstens 5 minuten.
- Voeg gehakt weefsel geschikt volume digestiebuffer (10 ml buffer per gram weefsel).
- Schud gehakt weefsel in digestiebuffer bij 100 rpm gedurende 1-3 uur bij 37 ° C.
- Enkele celsuspensie te verkrijgen door het passeren cellen door 0,4 urn filter in een 50 ml buis.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 °; C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer pellet in 4 ml DMEM / F12 en overbrengen in 5 mL ronde bodem buis.
- Het oogsten van cellen uit weefselkweek
- Was plaat of de kolf van hechtende cellen met calcium en magnesium vrij fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
Opmerking: De techniek beschreven voor het oogsten van cellen is specifiek van toepassing op menselijke embryonale stamcellen (hESC) kweekcellen hechtend. De rest van het beschreven protocol is breed toepasbaar op andere gekweekte cellijnen, niet-hechtende lijnen en primaire cellen. - Voeg verwarmde (37 ° C) trypsine of andere enzymatische digestie reagentia geoptimaliseerd voor het bereiken van een enkele celsuspensie van de hechtende cellen. Volg de protocol van de fabrikant.
OPMERKING: trypsine en andere enzymatische dissociatie reagentia hebben het potentieel om cellulaire markers beïnvloeden. - Incubeer de plaat 37° C gedurende 2-5 minuten om cellen los te maken. Voor hoge confluentie culturen Tik de plaat voorzichtig los om de cellen.
- Transfer vrijstaande cellen van de plaat in een 5 ml rondbodemkolf buis en voorzichtig pipetteren met een 1 ml pipet aan cellen dissociëren.
OPMERKING: Bij het verwerken van grote aantallen monsters alle stappen kunnen ook worden uitgevoerd in een 96 well plaat met ronde bodem. Onderzoek van de monsters in een well formaat 96 Alle wassingen kan worden uitgevoerd bij een volume van 250 pl. De andere stappen beschreven volumes kunnen worden aangepast zodat het totale volume niet meer dan 300 pl. - Schrik de enzymatische digestie reagens met een gelijk volume wasbuffer (0,5% BSA en 0,02% natriumazide in PBS).
NB: Natriumazide is een gevaarlijke chemische stof. De juiste voorzorgsmaatregelen in acht worden genomen voor de voorbereiding en behandeling. - Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeercellen in 1 ml serumvrij medium.
- Aantal cellen door overdracht 10 pi van de celsuspensie op een 1,5 ml microcentrifugebuis. Verdund monster met een bekende verhouding in trypan blauw en overbrengen in een hemocytometer of geautomatiseerde cel telsysteem.
- Was plaat of de kolf van hechtende cellen met calcium en magnesium vrij fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
- Labeling van S-fase bevolking
OPMERKING: als S-fase labeling niet te worden uitgevoerd gaan tot stam 1.4.- Bereid 1 ml 10 uM 5-jood-2'-deoxyuridine (IDU) in serumvrij DMEM F12 of andere geschikte media voor elke 2 x 10 6 cellen te analyseren.
- Voeg 500 ul van 10 uM IDs uit serumvrij medium per 2 x 10 6 cellen.
OPMERKING: Hoewel IDU labeling kan worden uitgevoerd in medium dat serum, zal vrij proteïne reageren met cisplatine, zodat deze niet goed labeling van dode cellen. Als medium dat serum bevat wordt gebruikt tijdens het labelen IDU een additionele wasstap is serumvrij medium moet serumeiwitten te verwijderen vóór cisplatine levende / dode staining. - Voorzichtig mengen korrels met 1 ml pipet.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C onder voorzichtig schommelen.
- Levend / Dead labeling
- Voor elk monster te bereiden 500 pl 50 pM cisplatine in serumvrij DMEM-F12 of celtype geschikte media.
Opmerking: Als het kenmerken van de S-fase bevolking IDU niet wordt uitgevoerd, resuspendeer monsters in een concentratie van 4 x 10 6 cellen / ml. Resuspenderen van de cellen voor het toevoegen van cisplatine in staat stelt sneller mengen van oplossingen voor uniforme levend / dood labeling. - Voeg 500 ul van 50 uM cisplatine per 2 x 10 6 cellen monsters.
- Incuberen bij kamertemperatuur (KT) gedurende 1 minuut op een orbitale schudder onder constant mengen.
- Schrik de cisplatine met een gelijk volume wasbuffer.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Spoelmonsters tweemaalmet 500 ui wasbuffer gewassen om overmaat cisplatine te verwijderen.
- Spoelmonsters tweemaal met 500 pl PBS om overmaat eiwit te verwijderen.
- Voor elk monster te bereiden 500 pl 50 pM cisplatine in serumvrij DMEM-F12 of celtype geschikte media.
- sample fixatie
- Resuspendeer monster in 500 pl PBS.
- Voeg gelijk volume 4% PFA in PBS om een uiteindelijke concentratie van 2%; pipet te mengen.
OPMERKING: Bereid 4% PFA vers van poeder, de pH instellen op 6,9 en door een 0,44 urn filter. 4% PFA in PBS kunnen tot twee weken worden bewaard bij 4 ° C. Voorkomen premade formaline in ampullen geleverd, tenzij specifiek getest door, aangezien vaak metaalverontreinigingen die kunnen interfereren met de gemeten massa kanalen. Lagere concentratie van PFA voldoende zijn en om het effect van fixatie op antilichaambinding minimaliseren maar moet empirisch worden getest. - Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Decanteren of voorzichtig zuig het supernatant without verstoring van de pellet.
- Wassen monsters met PBS PFA oplossing te verwijderen.
OPMERKING: Bij deze stap monsters kan kort worden bewaard bij 4 ° C. Langdurige opslag bij 4 ° C kan leiden tot degradatie van het monster en verminderde kleuring.
2. Barcoding
Opmerking: Als methode voor het gebruiken monoisotopisch cisplatine barcodes en palladium barcodes gelijktijdig gepresenteerd, ofwel onafhankelijk worden gebruikt of geheel vermeden indien niet vereist het experiment.
- Monoisotopisch Cisplatin barcodes
OPMERKING: Omdat cisplatine barcoding en cisplatine Levend / Dead kleuring vertrouwen op overlappende kanalen zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de achtergrond cisplatine Levend / Dead kleuring in de levende cellen wordt geminimaliseerd, omdat dit kan interfereren met de nauwkeurigheid van de cisplatine barcode.- Verdun 1 mM monoisotopisch cisplatine voorraadoplossingen tot 200 uM in PBS.
- voor each unieke barcode cisplatine stelt een 1,5 ml buis met 500 ui PBS per 2 x 10 6 cellen ontvangen die barcode.
- Ter voorbereiding elke unieke barcode toe te voegen elke toepasselijke monoisotopisch cisplatine tot een uiteindelijke concentratie van 200 nM.
- Resuspendeer cellen in 500 pl PBS per 2 x 10 6 cellen.
- Voeg een gelijk volume van de corresponderende streepjescode oplossing aan elk monster.
- Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op een schudapparaat onder constant mengen.
- Blus cisplatine met een gelijk volume wasbuffer.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Spoelmonsters tweemaal met 500 ui wasbuffer gewassen om overmaat cisplatine te verwijderen.
- palladium barcodes
OPMERKING: Palladium barcoding reagentia kunnen zowel bereid 5 of commercieel gekocht.- voorbijgaande gedeeltelijkepermeabilisatie 19
OPMERKING: Palladium chelatie barcodes vereist partiële permeabilisatie van de reagentia door het celmembraan passeren en robuust etiket van de cel.- Spoelmonsters met 500 pi PBS.
- Spoelmonsters met 500 pi PBS plus 0,02% saponine.
- Resuspendeer pellet in restvolume.
- Breng palladium barcoding.
- 100x verdunde stock palladium barcodes reagens in 1 ml ijskoude PBS plus 0,02% saponine.
- Voeg snel verdunde barcode reagens geresuspendeerd monster.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder bij onder constant mengen.
- Spoelmonsters tweemaal met 500 ul wasbuffer.
- voorbijgaande gedeeltelijkepermeabilisatie 19
3. celoppervlakkleuring
OPMERKING: celoppervlakkleuring kan worden uitgevoerd op levende cellen voorafgaand aan de fixatie. Dit kan nodig zijn om antilichamen die affiniteit verliezen their epitoop na fixatie. Sommige mobiele monsters kunnen profiteren van extra blokkeren, zoals Fc blokkeren voor leukocyten, voorafgaand aan het antilichaam labeling om de achtergrond te verminderen. Optimale blokkering moet empirisch worden bepaald voor specifieke monster.
- Bereid celoppervlak antilichaamkleuring paneel.
- Combineer 0,5 gl of empirisch bepaalde hoeveelheid van elk 0,5 mg / ml celoppervlak antilichaam per monster in een 1,5 ml buis. Voeg wasbuffer eventueel volume te brengen tot 10 pi per monster. Meng door pipetteren.
OPMERKING: Bepaal werken verwatering voor elk antilichaam voorafgaand aan empirisch experimenteren door titratie experiment. - Gespleten celoppervlak antilichaampoel even in een 1,5 ml buis voor elk monster te worden gemerkt.
- Bereid 500 pl wasbuffer in een 1,5 ml buis voor elk monster.
- Combineer 0,5 gl of empirisch bepaalde hoeveelheid van elk 0,5 mg / ml celoppervlak antilichaam per monster in een 1,5 ml buis. Voeg wasbuffer eventueel volume te brengen tot 10 pi per monster. Meng door pipetteren.
- Breng celoppervlakkleuring om monsters in genormaliseerd volume voor alle monsters.
LET OP: Om ensure consistente antilichaam labeling meerdere monsters is het essentieel om het monstervolume en de antilichaamconcentratie zorgvuldig controleren. De volgende stappen proberen dit consistentie door ervoor te zorgen dat de uiteindelijke monstervolumes nadat het antilichaam is toegevoegd uniform.- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Met een 200 pl pipet ingesteld op 50 pl, verwijdert overgebleven oplossing uit monster pellet overgebracht in een buis van de gealiquoteerde celoppervlak antilichaampoel.
- Pipet alle vloeistof in het monster buis zonder daarbij lucht in de pipetpunt.
- Houd de pipet zuiger te voorkomen waardoor lucht beweegt de punt in een voorbereide buis van 500 pi wasbuffer en de plunjer los.
- Weer toevoegen van de inhoud van de pipetpunt het monster en resuspendeer het monster in de vloeistof met voorzichtig pipetteren.
- Incubeer de monsters gedurende 1h bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
- Spoelmonsters tweemaal met 500 ui wasbuffer dat alle vrije antilichaam wordt weggewassen.
- Spoelmonsters met 500 pi PBS.
- Resuspendeer de celpellet in 500 ui PBS.
- Voeg gelijk volume 4% PFA in PBS; pipet te mengen.
- Incubeer gedurende 10 minuten op een rondschudapparaat.
4. celpermeabilisatie en intracellulaire kleuring
- celpermeabilisatie
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer cellen in restvolume door voorzichtig vortexen totdat de pellet wordt gedissocieerd.
OPMERKING: Niet cellen voorafgaand aan het toevoegen van MeOH resulteert in cellen elkaar hechten en het vervaardigen van een dunne film die resulteert in deelmonsters verlies dissociëren. - Onmiddellijk voeg 1 ml 100% MeOH per 2 x 10 6 </ Sup> cellen en voorzichtig pipet te mengen.
OPMERKING: Andere permeabilisatie werkwijzen kan vervangen MeOH en kan nodig zijn om optimale permeabilisatie bereiken voor bepaalde celtypen. Voor sommige celbronnen 0,1% Triton X-100, 0,2% Tween-20 en 0,1% saponine in PBS oplossing permeabilisatie kan celintegriteit beter handhaven terwijl toch consistente permeabilisatie. - Incubeer monsters gedurende ten minste 1 uur en tot maximaal 24 uur bij 4 ° C gedurende permeabilisatie.
LET OP: Bij deze stap samples in MeOH kan worden opgeslagen voor maximaal 1 maand bij -80 ° C. - Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Voeg 1 ml wasbuffer per ml MeOH gebruikt om het monster permeabel. Voorzichtig resuspendeer celpellet.
- Was monster tweemaal met 500 ul wasbuffer.
- Bereid intracellulaire antilichaam kleuring paneel.
- Combineer 0,5 gl of empirisch bepaalde hoeveelheid van elk 0,5 mg / ml antilichaam intracellulair per monster in een 1,5 ml buis. Voeg wasbuffer eventueel volume te brengen tot 10 pi per monster. Meng door pipetteren.
- Split intracellulaire antilichaamverzameling even in een 1,5 ml buis voor elk monster.
- Bereid 500 ul wasbuffer in een 1,5 ml buis voor elk monster.
- Breng intracellulaire kleuring om monsters in genormaliseerd volume voor alle monsters.
Opmerking: Voor een betrouwbare antilichaam labeling meerdere monsters is het essentieel om het monstervolume en de antilichaamconcentratie zorgvuldig controleren.- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Met 200 pi pipet wordt 50 pl verwijderen resterende oplossing uit monster pellet overgebracht in een buis van de gealiquoteerde celoppervlak antilichaampoel.
- Pipetalle vloeistof in het monster buis zonder daarbij lucht in de pipetpunt.
- Houd de pipet zuiger te voorkomen waardoor lucht beweegt de punt in een voorbereide buis van 500 pi wasbuffer en de plunjer los opstelling wasbuffer voor een totaal monstervolume van 50 ul.
- Weer toevoegen van de inhoud van de pipetpunt het monster en resuspendeer het monster in de vloeistof met voorzichtig pipetteren.
- Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
- Spoelmonsters tweemaal met 500 ul wasbuffer.
- Spoelmonsters met 500 pi PBS.
5. Iridium Labeling
- fix monsters
- Resuspendeer monsters in 500 ul PBS.
- Voeg 500 ul van 4% PFA in PBS.
- Incubeer gedurende minimaal 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
- Breng Iridium etikettering van DNA
- Voeg 500 ul 62,5 nM iridium PFA oplossing voor samples.
LET OP: Voor experimenten met gepermeabiliseerde cellen, verdunnen de 500x Ir191 / 193 voorraad voor een uiteindelijke verdunning van 1: 2.000 tot overstaining voorkomen. - Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
OPMERKING: Bij het uitvoeren monoisotopisch cisplatine barcodes niet monsters met iridium incuberen langer dan 15 minuten sinds Ir193 sterke signalen kunnen bijdragen aan het Pt194 massa kanaal en negatieve invloed barcodes kwaliteit. - Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Spoelmonsters tweemaal met 500 gl 0,1% BSA in gefilterd gedeïoniseerd water.
LET OP: Na bereiding we raden u monsters binnen 24 uur indien mogelijk. Bereide monsters kunnen worden opgeslagen op korte termijn bij 4 ° C,maar zorg moeten worden genomen om degradatie te voorkomen. Indien mogelijk eindspoelingen worden uitgevoerd in gefilterd gedeïoniseerd water zonder BSA omdat dit de afzetting op de sproeikamer samplerprimitieven kegels van de machine die instrument reiniging afneemt zal afnemen. Voor hESCs is het noodzakelijk deze wasbeurten uitvoeren terwijl inclusief BSA monster verlies plakken aan het buisoppervlak te vermijden.
- Voeg 500 ul 62,5 nM iridium PFA oplossing voor samples.
6. Bereid Monsters voor Acquisition
- tellen cellen
- Resuspendeer cellen in 500 gl 0,1% BSA in gefilterd gedeïoniseerd water en filter in een nieuwe buis door een 35 urn zeef cel cap.
Opmerking: Het verlagen van de BSA-niveau voor de eindspoelingen vermindert het residu op Mass cytometrie vernevelaar. Niet hechtende cellen worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in gedeïoniseerd water gefilterd. - Aantal cellen door overdracht 10 pi van de celsuspensie op een microcentrifugebuis. Verdund monster met een bekende verhouding intrypan blauw (om te helpen bij celvisualisatie) en overbrengen naar een hemocytometer of geautomatiseerde cel telsysteem.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer cellen in 500 gl 0,1% BSA in gefilterd gedeïoniseerd water en filter in een nieuwe buis door een 35 urn zeef cel cap.
- Voorbereiden en load samples
- Ter voorbereiding kalibratie korrels te verwijderen uit de koelkast en schud krachtig mengen.
- Als running monsters met behulp van een massa cytometrie autosampler, voeg 50 ul van kalibratie kralen aan elk putje van de monsterplaat voeg het gewenste aantal cellen te analyseren. Indien monsters lopen door handmatige injectie voeg 50 ul van kralen kalibratie monsters, verdund monster in gefilterd gedeïoniseerd water, meng en laden monster in Mass cytometrie monster injectiepoort. De juiste verdunning van het monster kan variëren afhankelijk van het celtype geanalyseerd, maar een verdunning van 10 6 1 algemeen geschikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hier gepresenteerde kunnen algemeen worden toegepast op een grote verscheidenheid van gekweekte primaire en celmonsters met slechts geringe modificaties. Afhankelijk van de vereisten van het experiment kan worden uitgevoerd op een modulair wanneer bepaalde elementen, zoals barcodes of celoppervlakkleuring, niet nodig. Gebruikt in zijn geheel dit protocol maakt de bereiding gemultiplexte massa cytometrie monsters gelabeld voor dood voor cellen, S-fase identificatie van populaties en gekleurd voor kwantificering van maximaal 38 antilichaamdoelen.
Verwachte resultaten geproduceerd door de in dit protocol (figuur 2) methoden weergegeven in figuur 3. Bij het verzamelen van gegevens kan normalisatie van signaalintensiteit op basis van de kraal intensiteit kalibratie worden uitgevoerd binnen de massa cytometrie software. Na normalisatie, eerste gegevens processing kalibratie korrels, poort verwijderen van enkele cellen en het verwijderen van dode cellen kunnen handmatig worden uitgevoerd met elke software kan analyseren flowcytometrie data. Verwijdering van kalibratie kralen kan handmatig worden uitgevoerd door gating op Ir191 + Ce140- populatie (Figuur 3A) of een MATLAB gebaseerde algoritme 20. Eencellige evenementen (zwart overzicht, figuur 3B) kan worden afgesloten tijdens het verwijderen van puin en cel multipletten, door poorten op de biaxiale perceel van Ir193 en Event Length (Figuur 3B). Cisplatin etikettering van dode cellen kunnen worden gebruikt om de hoeveelheid celdood te kwantificeren; voorbeeld voorbeelden van monsters met lage (Figuur 3D) en hoger (figuur 3E) hoeveelheden dode cellen. Dode cellen kunnen uit de gegevens verwijderd worden door afsnijden van de Pt198 + populatie (Figuur 3E). Barcoding monsters, of met mono-isotopische cisplatine of palladium reagentia resulteert in onderlinge onafhankelijkheid van de samples binnen de barcode parameters (figuur 3C), die cellen toestaat om hun oorspronkelijke monster identiteit wordt toegewezen. Optionele aanvullende werkwijzen zoals IDU etikettering, maken de detectie van specifieke populaties, bijvoorbeeld S-fase cellen (Figuur 3F). Na de eerste normalisering debarcoding en gating, kan de hoge dimensionale data worden geanalyseerd onder toepassing van verschillende algoritmes SPADE 17 en verscheidene anderen bedoeld voor massale cytometrie data-analyse en visualisatie 18. Algoritmen, zoals SPADE neemt de hoge dimensionale data, welke moeilijk te interpreteren omdat het niet direct kan worden gevisualiseerd in de hoogdimensionale toestand kan zijn, en genereert een lagere dimensionale weergave van de gegevens, die meer ontvankelijk voor visuele interpretatie (Figuur 3G).
Figuur 1: Basis principes van massa cytometry meting. Bereiding van celmonsters voor massa-cytometrie analyse omvat kleurende cellen met antilichamen gemerkt met metaalisotopen voornamelijk uit de lanthanide reeks elementen. In dit schema elk antilichaam opgewekt tegen een specifiek epitoop gemerkt met een isotoop bezit een unieke atoommassa, zoals samarium 154. Antilichamen tegen epitopen die oppervlakte cytoplasmatische nucleaire chromatine of gelokaliseerd kan eventueel worden gebruikt. Gemerkte cellen worden geïnjecteerd en gesproeid door de massa cytometrie Vernevelinrichting eencellige druppeltjes wanneer zij worden geïoniseerd door een argon plasmatoorts. Het verkregen deeltjeswolk is ontdaan van geringe massa atomen door vierpool massa filter terwijl de overvloed van grotere atoommassa ionen worden gemeten door de detector. De gemeten hoeveelheid van elke unieke massa-ion overeen met de cellulaire abundantie van de bijbehorende antilichaam doelepitoop. Terwijl een theoretische lIMIT van meer dan 100 parameters kunnen worden gekwantificeerd onder toepassing van deze methode, de huidige commercieel verkrijgbare reagentia mogelijk detectie van meer dan 40 parameters per cel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: workflow diagram van experimentele procedure en optionele stappen. Weergave van de belangrijkste stappen van het protocol voor het bereiden van cellen massa cytometrie. Optionele stappen worden aangegeven door oranje vakken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
figuur 3Voorbeeld van data gegenereerd uit m kont cytometrie analyse. (A) Biaxial grafiek die de scheiding van cellen (hoog Ir191, laag Ce140), korrels (Ir191 laag, hoog Ce140) en bead-cellen wambuizen (hoge Ir191 hoge Ce140). (B) Biaxial plot toont verwacht uiterlijk van Ir193 vs Event lengte. Gating van enkele cellen die de cellulaire puin en cel multipletten verwijdert wordt getoond. (C) Biaxial grafiek die voorbeeld van twee massa kanalen van cisplatine barcode. (D - E) Voorbeeld data van cisplatine Levend / dood kleuring voor monsters met een laag percentage (D) en een hoog percentage (E) van dode cellen. (F) Biaxial stuk H9 hESC cellen gemerkt met IDU aan cellen in S-fase te onderscheiden en een antilichaam tegen cycline B1 verder onderscheiden celcyclus. (G Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde is met succes toegepast voor het verwerken van verschillende gekweekte cellijnen (H1 en H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) en monsters primair weefsel (muisbeenmerg, muis embryonale lever, muis volwassen lever, muizentumor). Ongeacht de bron, elk weefsel dat kan worden gedissocieerd tot losse cellen met behoud van de cellulaire toestand vatbaar zijn voor analyse met massa- cytometrie moet zijn, maar kunnen een protocol optimalisatie vereisen. Het is belangrijk op te merken dat sommige epitopen kunnen worden beïnvloed door de specifieke dissociatie, fixatie en permeabilisatie behandelingen gebruikt en deze werkwijzen moet mogelijk monsterspecifieke optimalisatie ondergaan. Als lage signaal wordt waargenomen voor een antilichaam is het mogelijk om te verbeteren door het uitvoeren celoppervlak labeling op levende cellen, verandert permeabilisatie werkwijzen of verminderen fixatietijd.
Indien mogelijk binnen proefopzet, inclusief barcodes in the monster verwerkingsworkflow consistentie tussen monsters op het niveau van cel en antilichaamconcentratie. Zonder barcodes, zelfs wanneer grote zorg wordt genomen om monster verwerking controleren, is het waarschijnlijk dat kleine variaties in de antilichaamconcentratie en celconcentratie wordt geïntroduceerd tussen monsters. Zoals de percentages cellen positief voor specifieke epitopen waarschijnlijk variëren tussen monsters, de effectieve antilichaam aan epitoop verhouding kan noodzakelijkerwijs verschillen tussen monsters zelfs indien de totale antilichaamconcentratie consistente wordt gehouden, kan leiden tot inconsistenties in antilichaamkleuring. Deze variaties, maar meestal ondergeschikte bij het waarnemen van een enkel kanaal kan raken aanzienlijk groter wanneer het uitvoeren van een hoog-parameter experimenten en kunnen worden geïnterpreteerd als biologisch betekenisvol als men niet in gegevensanalyse wordt genomen.
Analyse van de verkregen gegevens uit een massa cytometrie experiment kan vele vormen en een aantal computa nementionele benaderingen zijn specifiek aangepast voor deze toepassing. Terwijl het verstrekken van een uitputtend overzicht van nuttige algoritmen voor massa-cytometrie data-analyse valt buiten het bestek van dit manuscript, benaderingen die met succes zijn gebruikt worden gemarkeerd en geïnteresseerde lezers zijn gericht op meerdere resources met betrekking tot dit onderwerp 21, 22, 23. Twee van de meest grote schaal wordt toegepast, op dit moment beschikbare benaderingen voor de analyse van de massa cytometrie gegevens Spanning Tree Progressie van Density normaliseren Events (SPADE) en viSNE. SPADE vormt clusters van groepen cellen met gelijke merkerexpressie en vertegenwoordigt elke cluster als een knooppunt. Deze knooppunten zijn gerangschikt in een spade boom waar soortgelijke knooppunten zijn verbonden door een leiding (Figuur 3G). viSNE maakt gebruik van de t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding algoritme 24 een tweedimensionale representatie van het genererende hoge afmetinggegevens met behoud van de algemene gegevensstructuur. Zowel SPADE en viSNE zijn geschreven in MATLAB, de broncode vrij beschikbaar is en kan worden uitgevoerd door de gebruikers met MATLAB. Daarnaast is een stand-alone versie van SPADE beschikbaar is.
Terwijl de massa cytometrie momenteel maakt collectie van het hoogste aantal parameters, kan fluorescent label gebaseerd cytometrie een betere aanpak zijn voor sommige toepassingen. Fluorescentiestromingscytometrie Meer analyseren cellen per seconde tot 5 x 10 4 tegenover 500-1000 voor massa-cytometrie en heeft meer beschikbare gevalideerde antilichamen 25. Aanvullende verbeteringen in fluorescentie flowcytometrie, zoals hyperspectrale cytometry 26 en nieuwe fluoroforen 27 make fluorescentie flowcytometrie een levensvatbaar alternatief voor iedereen, maar zeer hoge parameter experimenten. Aanvullende technieken zoals het meten van RNA 28 voorheen alleen mogelijkop fluorescentie gebaseerde doorstroomcytometrie zijn onlangs aangepast aan massa cytometrie mogelijk maakt gelijktijdige detectie van eiwitten en RNA 29. Toekomstige uitbreiding van de beschikbare isotopen en reagentia vollediger gebruik van de massa raam van meetbare isotopen en vergroten het repertoire van meetbare cellulaire kenmerken de diepte van de profilering mogelijke massa cytometrie breiden.
Het grote aantal parameters die tegelijkertijd massa- cytometrie geanalyseerd worden sterk vergroot de experimentele vragen die kunnen worden onderzocht. We hopen dat dit artikel en de bijbehorende video protocol geïnteresseerde onderzoekers in staat zal stellen om efficiënter te benutten massa cytometrie om hun onderzoek te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37 °C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37 °C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25 mg/mL in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20 °C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5 mL round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5 mL 35 μm filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
References
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
- Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
- Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
- Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
- Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
- Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
- Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
- Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
- Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
- Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
- van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
- Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
- Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
- Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
- Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).
