Abstract
Kütle sitometrisi ağır metal etiketler, iyi sitometrisi geleneksel floresan bazlı akışıyla mümkün olanın ötesine parametreleri ve derin analiz için imkânlar artırılmıştır ölçüde olan bir yaklaşımla konjuge antikorları kullanır. Herhangi bir yeni teknoloji olduğu gibi, yüksek kaliteli veri güvenilir nesil sağlamaya yardımcı kritik adımlar vardır. kütle sitometri analizi için hücre örneklerinin işleme için birden çok teknikler içerir optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur. Burada anlatılan yöntemleri kullanıcı ortak tuzaklardan kaçınmak ve yanlış verilere yol açabilir değişkenliği, minimize ederek tutarlı sonuçlar elde yardımcı olacaktır. Deneysel tasarım bilgilendirmek için, protokol ve araştırılmaktadır sisteminin biyolojide yeni bulgular ortaya çıkarmada bu etkinliği açısından isteğe bağlı veya alternatif aşamalar arkasındaki mantık kaplıdır. Son olarak, temsilci veri teknikleri présente beklenen sonuçları göstermek için sunulmuşturBurada d.
Introduction
Sitometri büyük hücre popülasyonları arasında, bir tek hücre düzeyinde birden, antikor hedefi ölçümünü sağlar. Geleneksel flüoresan bazlı akış sitometrisi olarak, ölçülebilir parametre sayısı parametreleri sayısı arttıkça daha karmaşık dengeleme hesaplamalar gerektirir birden florofor emisyon spektrumu arasındaki spektrum çakışmasının ile sınırlıdır. Bu kısıtlamalar, ağır metal-konjüge edilmiş antikorları tespit edilir ve büyük ölçüde eş zamanlı olarak toplanır parametre sayısını arttırmak ve her bir hücre için yüksek bir boyutsal protein bolluğu profilini elde etmek için bir uçuş (TOF) kütle spektrometresi zaman ile hesaplanır kütle sitometrisi tarafından ele alınmaktadır.
enstrümanın sitometrisi kütlenin çalışmaları bir temel anlayış kullanıcıya faydalıdır ve sorun giderme için gerekli olabilir. Daha kapsamlı bir ayar açıklaması ve kitlesel sitometrisi makinesini çalıştıran için,ilgili el yazması 1 'e bakınız. Kısaca, bir hücre numunesi, hücre yüzeyi markerleri sitoplazmik proteinleri, nükleer proteinler, kromatin bağlı proteinleri veya (Şekil 1i) 'in diğer epitopları hedefleyen metal konjuge bir antikor paneli ile etiketlenir. Sınıflandırılmış hücreler, bir otomatik numune alıcı ile makineye yüklenmiş, ya el ile enjeksiyon sureti ile bir zamanda bir ya da olduğu, 96 oyuklu bir plaka örnekler. Yüklü hücreler hücreler (Şekil 1ii) kapsül, sıvı damlacıkları spreyini üreten bir nebulizer aracılığıyla enjekte edilir. Hücreler, bir argon plazma lambasının iyonize böylece Bu sprey konumlandırılır. Bu iyonizasyon her bir hücre (Şekil 1iii) oluşturan bütün atomlardan müteşekkil bir partikül bulutu oluşturur. Bu partikül bulutu detektöre ettikçe, düşük atomik kütle atomu, bir dört kutuplu kütle filtre ile yüksek kütle iyonu ayrılır. Geri kalan, yüksek kütle iyonlarını dedektörü, abund devamHer bir izotopun formans (Şekil 1iv) ölçülür. detektör tarafından toplanan ham veriler, hücre olayları tanımlamak için kitle sitometrisi enstrüman yazılımı tarafından analiz edilir. Tanımlanan her bir hücre etkinliği için, her bir kanal tespit sinyali ölçülür ve bir çıkış .fcs dosyaya kaydedilir. ağır metal olarak birleştirilmiş antikorlarını tespit etmek için kullanılan seri kanal% 1'in altında en katılım% 0-4 arasında değişmektedir az spektral örtüşme sergiler. Çünkü kanallar arasında bu düşük çapraz konuşma, analiz 2 önce bir telafi matris veri dönüştürmek için genel olarak gereksizdir. Ancak, bakım, bu gibi, bir yüksek bolluk epitopa sahip bir antikor, bir düşük miktardaki bir antikor atanmış bir kanala sinyali katkıda bulunan bir kütle kanalına tahsis emin olmak için antikorların deneysel panelinin tasarımı sırasında alınmalıdır sinyal katkı alıcı kanalın bir yapay yüksek nüfus oluşturmak.
3, 4 boyanması ile oluştuğu bilinmektedir gibi bazı sabitleme hücre yüzeyi antikorlarıyla uygun boyama engelleyebilir. Canlı hücreler üzerinde hücre yüzey antikoru boyamasını gerçekleştirilmesi bazı antikorlar için gerekli olabilir, ama bu antikor bazlı barkod 6, 7, bir durum olduğu halde en çok barkod yöntemleri tespit 5 sonra gerçekleştirilir gibi antikor etiketleme önce barkod seçeneğine engeller olabilir.
hücre sayısının belirlenmesi analizi için hazırlanacak olduğunda, makine üzerine yüklenen hücrelerin sadece bir kısmı tespit edilecek biliyoruz ve veri üretmek için önemlidir. nebülizör torçta örnek spreyler, bu kayıp verimsizliklere esas kaynaklanmaktadır. Kesin yüzde kaybı% 50-85 arasında olabilir makine kurulumu ve hücre tipi ama sitometrisi kütlesine bağlıdır ve olmalıdeney tasarımı düşündü. Bu protokol, numune başına 2x10 6 hücreleri için optimize edilmiş ama daha küçük ya da daha büyük örneklerin işlenmesi için uyarlanabilir. Bu protokol, ancak örnek sayısı, bir deney içinde tutarlı tutulması önemlidir, 4 x 10 6, 1 x 10 6 örnek boyutları için, en az modifikasyon ile kullanılabilir. Hücre sayısındaki değişimler barkod ve antikor boyama yoğunluğunu etkileyebilir ve numuneler doğrudan karşılaştırılmalarını mümkün boyunca yaklaşık tutarlı tutulmalıdır.
tüm deneysel tasarımlar değilse böyle ölü hücre etiketleme ve DNA etiketleme gibi bazı uygulamalar ise, büyük çoğunluğunda yapılmalıdır. Sadece yüzey belirteçleri analiz eden deney ölü hücrelerin etiketlenmesi Rh103 kullanılarak elde edilebilir, ancak Rh103 bu boyama kaybına yol açtığı için geçirimli hale gereklidir deneyler için kaçınılmalıdır. geçirgenliği içeren deneyler için, sisplatin kullanılması tavsiye edilir Çizgi örnekler, antikor tüketimini azaltmak etme süresini azaltmak ve ortadan kaldırabilen örnek-örnek değişkenlik 9. barkod süreci menşe örnek için her hücre atamak için kullanılan tüm hücreler, benzersiz bir numuneye özgü kod uygulanmasını içerir. örnekleri barkod sonra antikor boyaması, tüm örnekler eşit boyanmış sağlayan bir yönteme önce toplanmış olabilir. Deneysel hatayı en aza indirmek için, barkodun ihtiyatlı ve doğrudan birbirlerine karşılaştırılacak hiçbir örnekleri havuz. Şu anda (aşağıya bakınız) burada sunulmaktadır ikisi analizi 5, 6, 7, sitometrisi kitle için örnek barkod için çeşitli yöntemler de mevcuttur. şu anda mevcut Reagen ile38, antikor hedefi bolluğu ölçmek S-fazı 10 hücreleri tespit canlı ve ölü hücreler 8 ayırt ve çok sayıda numune bir çoğullamalı deneyde hipoksi 11 hücresel seviyelerinin ölçülmesi mümkündür ts. Büyük hücre popülasyonları için yüksek bir parametre, tek bir hücre veri toplamak için bu yeteneği yüksek ölçüde heterojen bir hücre popülasyonlarının iyileştirilmiş profil sağlar ve daha önce, yeni biyolojik anlayış, 12, 13, 14, 15, 16, bir dizi üretti. Yorumlanabilir bilgilere elde edilen kompleks veri Damıtma Kapsayan Ağaç Yoğunluk Normalize Olayların Gelişimi (maça) 17 ve vişne 18 de dahil olmak üzere bilgisayar algoritmaları kullanımını gerektirmiştir. Bu makale erişilebilir bir sunarnasıl genel tasarım ve deney sitometri bir kitle yürütmek ve veri sitometrisi kitlenin temel analizini tanıtır için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Hasat
- Primer doku hasat hücrelerin
Not: Primer doku hasat hücreleri için tarif edilen işlem, fare meme tümör dokusu için özel olarak uygulanabilir ve başka kaynaklardan, birincil dokular için uygulanabilir olmayabilir.- 5 mg hiyaluronidaz ve doku gramı başına 10 ml DMEM / F12 ortamında 30 mg kolajenaz çözülmesiyle sindirim tamponu hazırlayın işlenecek. sindirim tampon sterilize filtre.
- Fare ve kayıt tümör ağırlığından birincil meme bezi tümörü izole edin.
- en az 5 dakika süreyle 10. neşter ile dokusunu inceltmek.
- sindirim tamponu (doku gramı başına 10 ml tampon) uygun hacme kıyılmış doku ekleyin.
- 37 ° C'de 1-3 saat boyunca 100 rpm'de sindirim tamponu içinde kıyılmış doku çalkalayın.
- 50 ml'lik bir tüp içine 0.4 um'lik bir filtre boyunca hücrelerin geçirilerek tek bir hücre süspansiyonu elde edilir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleriC. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- Yeniden süspanse 4 ml DMEM / F12 içinde topak, 5 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe transfer.
- Doku kültüründen hasat hücrelerin
- Plakayı ya da oda sıcaklığında, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yapışık hücre şişesi.
Not: hasat hücreleri için tarif edilen teknik, insan embriyonik kök hücre (HESC) kültürü hücrelerinin yapışık özellikle geçerlidir. Bununla birlikte, tarif edilen protokol kalan diğer kültürlenmiş hücre çizgileri, yapışkan olmayan hatları ve primer hücreler geniş çapta uygulanabilir. - yapışkan hücrelerden tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için optimize edilmiş bir ısıtılmış (37 ° C), tripsin ve diğer enzimatik sindirim reaktif ekleyin. Üreticinin protokolü takip edin.
Not: tripsin ve diğer enzimatik ayrılma reaktif hücre işaretçileri etkileme potansiyeli vardır. - 37 ° C'de inkübasyona bırakılır2-5 dakika hücreleri ayırmak için ° C. yüksek confluency kültürler için, hafifçe hücreleri ayırmak yardımcı olmak için plakayı dokunun.
- 5 mL'lik yuvarlak tabanlı tüp içine levhadan tamamen müstakil hücreleri aktarın ve yavaşça hücreleri ayırmak için 1 ml pipet kullanılarak pipetleyin.
Not: Tüm adımlar, alternatif olarak, bir 96 yuvalı yuvarlak tabanlı plaka içinde gerçekleştirilebilir örneklerin çok sayıda işlem için. 96 oyuklu bir formatta örneklerinin işlemden geçirilmesi için tüm yıkamalar 250 uL'lik bir hacimde gerçekleştirilir. Toplam hacim 300 uL aşmayacak şekilde diğer adımlarda açıklanan miktarlar ayarlanabilir. - (PBS içinde% 0.5 BSA ve% 0.02 sodyum azit) eşit hacimde yıkama tamponu ile enzimatik sindirim reaksiyon ajanı söndürüldü.
NOT: Sodyum azid tehlikeli kimyasaldır. Uygun güvenlik önlemleri kendi üretim ve taşıma bakımından uyulmalıdır. - 37 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- süspanse edin1 ml serumsuz ortamdaki hücreler.
- bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. tripan mavisi ve bir hemositometrede transfer veya otomatik hücre sayım sisteminde bilinen bir orana kısım seyreltin.
- Plakayı ya da oda sıcaklığında, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yapışık hücre şişesi.
- S-faz nüfus Etiketleme
NOT: S-fazı etiketleme olmayan gerçekleştirilecekse 1.4 kök devam edin.- Her 2 x 10 6 hücre analiz edilmesi için serumsuz DMEM F12 veya diğer uygun ortam içinde 10 uM 5-İyodo-2'-deoksiüridin, 1 mL (DUK) hazırlayın.
- Her 2 x 10 6 hücre için serumsuz ortam içinde 10 uM Idu 500 uL ekleyin.
Not: DUK etiketleme serum ihtiva eden ortam içinde yapılabilir olmakla birlikte, serbest protein, ölü hücrelerin uygun etiketleme önlenmesi, sisplatin ile reaksiyona girer. Serum içeren ortam etiketleme DUK sırasında kullanılan, ek bir yıkama aşaması serumsuz ortam sisplatin ölü / canlı sta öncesinde serum proteinleri uzaklaştırmak için gerekli olan biradencilik. - Yavaşça 1 mL pipet ile pelet yeniden süspanse edin.
- hafif sallama ile 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- Canlı / Ölü etiketleme
- Her bir örnek için serumsuz DMEM-F12 ya da hücre tipi, uygun ortam içinde 50 uM sisplatin 500 uL hazırlar.
Not: DUK S-fazı nüfusun etiketleme değildir yapılacak ise, 4 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon örnekleri. sisplatin ekleyerek tekdüze canlı / ölü etiketleme için çözümlerin daha çabuk karışmasını sağlayan önce hücrelerin tekrar asılı. - Örnekler 2 x 10 6 hücre başına 50 uM sisplatin 500 uL ekleyin.
- sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 dakika için oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
- Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- İki kez yıkayın numuneleri500 uL yıkama tamponu ile aşırı sisplatin kaldırın.
- İki kez 500 uL PBS ile yıkayın numuneler aşırı protein kaldırmak için.
- Her bir örnek için serumsuz DMEM-F12 ya da hücre tipi, uygun ortam içinde 50 uM sisplatin 500 uL hazırlar.
- Numune sabitleme
- 500 ul PBS içerisinde yeniden süspanse örneği.
- % 2'lik bir nihai konsantrasyona PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için.
Not: 6.9 arasında olan pH seviyesini ve 0.44 um filtre içinden geçmesi, toz,% 4 PFA taze hazırlayın. PBS içinde% 4 PFA, iki haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. genellikle ölçülen kütle kanallarında parazite yol açabileceği metal kirleticiler içerir olarak, özel olarak, test edilinceye ampuller verilen önceden yapılmış formalin, kaçının. PFA alt konsantrasyonu yeterli olduğu ve antikor bağlanması ile tespit etkisini en aza indirmek için yardım ancak ampirik olarak test edilmelidir olabilir. - sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle yüzer wi aspirethout topağına zarar.
- PBS ile yıkayın örnekleri PFA çözüm kaldırın.
NOT: Bu adımda numuneler 4 ° C'de kısaca saklanabilir. 4 ° C'de uzun süreli depolama örneğinin bozulmasına neden ve azaltılmış lekeleme olabilir.
2. Barkodlama
NOT: Monoizotopik sisplatin barkodlama ve paladyum barkod kullanan için metodoloji aynı anda sunulurken, ya bağımsız kullanılabilir veya deney için gerekli değilse tamamen kaçınılmalıdır.
- Monoizotopik Cisplatin Barkodlanması
NOT: Canlı / Ölü boyama kanalları bakım örtüşen itimat sisplatin barkodlama ve sisplatin canlı hücrelerde bu arka plan sisplatin Canlı / Ölü boyanma sağlamak için alınması gereken bu yana sisplatin barkod doğruluğu engel olabilecek bu şekilde en aza indirilir.- PBS içinde 200 uM ila 1 mM monoizotopik sisplatin stok çözeltileri ile seyreltilir.
- e içinACH benzersiz sisplatin barkod bu barkod alan her 2 x 10 6 hücre için 500 ul PBS ile 1.5 ml tüp hazırlanır.
- Her benzersiz barkod 200 nM nihai konsantrasyona geçerli her Monoizotopik sisplatin eklemek hazırlamak için.
- 2 x 10 6 hücre başına 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Her bir örnek için, karşılık gelen barkod çözeltisinin eşit hacim.
- sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri fazla sisplatin kaldırın.
- paladyum Barkodlama
Not: Paladyum barkod reaktifleri, hazırlanan 5 ya da ticari olarak satın alınabilir.- kısmi Geçicipermeabilization 19
NOT: reaktif hücre zarlarını geçmek ve sağlam hücre etiket için palladyum şelasyon barkod kısmi geçirgenliği gerektirir.- 500 uL PBS ile yıkayın örnekler.
- 500 uL PBS artı% 0.02 saponin ile yıkayın örnekler.
- kalıntı hacme yeniden süspanse pelet.
- Paladyum barkodu sistemi.
- 1 ml buzla soğutulmuş PBS artı% 0.02 saponin paladyum barkod reaktifi 100x stokunu.
- Hızla yeniden süspansiyon haline getirilmiş numune için seyreltilmiş barkod reaktifmi.
- sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
- Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu.
- kısmi Geçicipermeabilization 19
3. Hücre Yüzeyi Boyama
NOT: Hücre yüzey boyama öncesinde tespit canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu thei için afinite kaybeder antikorlar için gerekli olabilirtespit sonrasında R epitopu. Bazı hücre numuneleri, örneğin arka planı azaltmak için önceki antikor etiketleme lökositlerin Fc engellenmesi gibi ek bloke yararlanabilir. Optimum bloke ampirik olarak belirli bir numune tipi için belirlenmelidir.
- Hücre yüzeyi antikor boyama paneli hazırlayın.
- 1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre yüzeyi antikorun 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın.
NOT: titrasyon deneyi ile empirik deney öncesinde her bir antikor için seyreltme çalışma belirler. - eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine Bölünmüş hücre yüzeyi antikor havuzu lekelenmesine.
- Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tampon 500 ul hazırlayın.
- 1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre yüzeyi antikorun 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın.
- Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine Hücre yüzeyi lekelenmesi uygulayın.
NOT: ens içinBirden fazla numune boyunca ure tutarlı Antikor etiketleme dikkatli bir numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için son derece önemlidir. Aşağıdaki adımlar, antikor ilave edildikten sonra son numune hacimleri tek biçimli olduğu sağlayarak bu kıvam elde etmek amacı.- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- 50 uL 200 uL pipet seti ile, parçalara ayrılır, hücre yüzey antikoru havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer kalan çözelti çıkarın.
- Pipet ucu içine hava çizmeden alikot tüp tüm sıvı kadar Pipet.
- Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder.
- örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon.
- 1 için numune inkübesürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında h.
- iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri tüm serbest antikor, yıkanıp emin olmak için.
- 500 uL PBS ile yıkayın örnekler.
- 500 ul PBS içinde hücre pelletini.
- PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için.
- bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin.
4. hücre geçirgenliği ve hücre içi boyanması
- Hücre permeabilization
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- Pelet ayrışmış kadar yavaşça girdap oluşturarak kalıntı hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
Not: MeOH birbirlerine yapışmasını hücreleri neden olur eklenmesi ve kısmen örnek kaybına neden olan bir ince film üretmek için önce hücreleri ayırmak için başarısızlık. - Hemen 1 ml, 2 x 10 6 100% MeOH ilave </ Sup> hücreler ve karıştırmak için hafifçe pipet.
Not: diğer geçirgenleştirilmesi yöntemleri MeOH ile ikame edilebilir ve bazı hücre tipleri için uygun geçirgenliği elde etmek için gerekli olabilir. hala tutarlı geçirgenliği sağlarken, bazı hücre kaynakları için bir% 0.1 Triton X-100, geçirgenliği için PBS çözeltisi içinde% 0.2 Tween-20 veya% 0.1 saponin, daha iyi bir hücre bütünlüğünü muhafaza edebilir. - geçirgenliği için 4 ° C'de 24 saat, en fazla en az 1 saat süre ile veya en fazla inkübe edin.
Not: MeOH örnekleri -80 ° C'de en fazla 1 aya kadar saklanabilir Bu adımda. - 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- Her MeOH örnek permeabilize kullanılan ml yıkama tamponu 1 mL ekleyin. Yavaşça hücre pelletini.
- 500 uL yıkama tamponu ile iki kez örnek yıkayın.
- Hücre içi antikoru boyama paneli hazırlayın.
- 1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre içi antikoru 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın.
- eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine hücre içi antikoru havuzu bölme.
- Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tamponu 500 uL hazırlayın.
- Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine intraselüler boyama uygulayın.
Not: dikkatle numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemli olan çok sayıda numune tutarlı antikor etiketleme sağlamak.- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- 50 uL ayarlanmış 200 uL pipetle numunelere hücre yüzeyi antikor havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer çözeltisi kalan kaldır.
- Pipetkadar alikot tüp içindeki sıvı tüm pipet içine hava çekmek olmadan.
- Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava 50 uL bir toplam numune hacmi için yıkama tamponu hazırlanması, tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder.
- örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon.
- sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için inkübe edin.
- Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu.
- 500 uL PBS ile yıkayın örnekler.
5. İridyum Etiketleme
- Fix numuneleri
- 500 ul PBS içinde yeniden süspanse örnekleri.
- PBS içinde% 4 PFA 500 uL ekleyin.
- sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika içinde en az inkübe edin.
- DNA iridyum etiketleme uygulayın
- örnekler 500 uL 62.5 nM iridyum PFA solüsyonu ekleyin.
NOT: overstaining önlemek için 2.000: permeabilize hücreleri kullanılarak deneyler için, bir son 1 seyreltme için 500x Ir191 / 193 stok seyreltin. - sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
Not: güçlü Ir193 sinyalleri Pt194 kütle kanala katkı olumsuz barkod kalitesini etkileyebilir çünkü monoizotopik sisplatin barkodu performans daha uzun, 15 dakika boyunca iridyum ile örnekleri inkübe yoksa. - 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- iki kez süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde 500 uL% 0.1 BSA ile yıkayın örnekler.
NOT: Bir kere mümkünse biz 24 saat içinde numuneleri çalıştırmanızı öneririz hazırladı. Hazırlanan numuneler, 4 ° C'de kısa süreli saklanabilirancak bakım bozulmasını önlemek için alınmalıdır. bu alet temizleme azalacaktır makinesinin püskürtme odası ve örnekleyici konileri birikimini azaltmak gibi son yıkama BSA'sız süzülmüş deiyonize su içinde yapılmalıdır mümkünse. HESC için, BSA boru yüzeyine yapışmasını örnek kaybını önlemek için de dahil olmak üzere iken, bu yıkama işlemi gerekmektedir.
- örnekler 500 uL 62.5 nM iridyum PFA solüsyonu ekleyin.
6. Acquisition'ın Örnekleri hazırlayın
- hücre sayımı
- süzülmüş deiyonize su içinde 500 uL% 0.1 BSA içinde yeniden süspanse hücreleri ve 35 um hücre filtresi kapağı boyunca taze tüpe filtre.
NOT: son yıkar için BSA seviyesini düşürmek Kitle sitometrisi püskürtücü kalıntısından azalır. Yapışmayan hücreler yıkanır ve süzülmüş deiyonize su içinde yeniden süspanse edilebilir. - mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. bilinen bir orana kısım seyreltintripan mavisi (hücre görselleştirme yardım etmek için) ve bir hemositometrede veya otomatik hücre sayımı sistemine aktarılır.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
- süzülmüş deiyonize su içinde 500 uL% 0.1 BSA içinde yeniden süspanse hücreleri ve 35 um hücre filtresi kapağı boyunca taze tüpe filtre.
- Hazırlama ve yük örnekleri
- Kalibrasyon boncuklar buzdolabından çıkarın ve yeniden süspansiyon haline getirilmesi şiddetle çalkalanır hazırlamak.
- otomatik numune alıcı sitometri kütlesi kullanılarak örnekleri çalışan, daha sonra analiz edilecek olan arzu edilen hücre sayısını eklemek numune plakasının her oyuğuna kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 uL ekleyin. kılavuzu enjeksiyon ile çalışan örnekleri örneklemek için kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 mcL ise, süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde numunenin seyreltilmesi karıştırın ve Kütle sitometrisi örnek enjeksiyon portuna yük örneği. Uygun numune seyreltme analiz edilen hücre tipine bağlı olarak değişebilir, ancak, 10 6 bir seyreltme 1 genel olarak uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol geniş yalnızca küçük değişiklikler ile kültürlenen ve primer hücre örneklerinin çeşitli uygulanabilir. örneğin barkod veya hücre yüzeyi boyama gibi bazı elemanlar, gerekli olmadığında deney gereksinimlerine bağlı olarak, bir modüler şekilde gerçekleştirilebilir. bütünüyle Kullanılan bu protokol ölü hücre dışlama, S-fazı nüfus tanımlanması için etiketlenmiş ve 38 kadar, antikor hedefi ölçümü için boyanmış numunelerin sitometri birden fazla mesaj göndermiş kütle hazırlanmasını sağlar.
Bu protokol (Şekil 2) anlatılan yöntemlere göre üretilen Beklenen Sonuçlar Şekil 3'te gösterilmektedir. verilerin toplanması sırasında, kalibrasyon boncuk yoğunluğuna dayalı sinyal yoğunluğu normalleştirilmesi kütle sitometrisi yazılımı içinde gerçekleştirilebilir. normalleştirme sonra, ilk veri prosedürüne sontek hücreler üzerinde kalibrasyon boncuklar, kapı çıkarın ve ölü hücreleri çıkarmak için ssing veri akış sitometri analiz edebilen bir yazılım kullanılarak el ile yapılabilir. Kalibrasyon taneciklerin çıkarılması Ir191 + Ce140- popülasyonu (Şekil 3A), ya da bir MATLAB tabanlı algoritma 20 geçitleme el ile gerçekleştirilebilir. Ir193 ve Etkinlik uzunluğu (Şekil 3B) iki eksenli arsa üzerinde yolluk, yıkıntıları ve hücre çoklular kaldırılırken tek hücreli olaylar (siyah hatları, Şekil 3B) kapılı edilebilir. Ölü hücrelerin Sisplatin etiketleme hücre ölümü miktarını belirlemek için kullanılabilir; düşük (Şekil 3D), ve ölü hücrelerin daha yüksek (Şekil 3E) miktarları ile numune örnekleridir gösterilmiştir. Ölü hücreler Pt198 + popülasyonu (Şekil 3E) kapalı yolluk ile verilerden çıkarılabilir. Numunelerin Barkod, monoizotopik sisplatin ya da paladyum reaktifler, sa ayrılığını sonuçlarla olupsağlar hücreleri barkod parametreleri (Şekil 3C), içinde örnek olarak şunlar verilebilir, orijinal numune kimliğinden atanacak. Örneğin DUK etiketleme gibi isteğe bağlı ek yöntemler, örneğin, belirli bir popülasyonlarının saptanmasına izin, S-fazı hücreleri (Şekil 3F). Başlangıç normalleştirme debarcoding ve yolluk sonra, yüksek boyutsal veriler, veri analizi ve görselleştirme 18 sitometri kütlesi için tasarlanmış kürek şeklindeki eleman 17 de dahil olmak üzere algoritmaları ve birçok diğerleri çeşitli kullanılarak analiz edilebilir. , Kürek algoritmalar doğrudan yüksek boyutlu durumda görülemedi çünkü yorumlamak zordur, yüksek boyutsal veriler, almak ve görsel yorumlama (Şekil 3G) daha uygun olan bir veri düşük boyutlu bir gösterimini üretmek.
Şekil 1: Ölçme sitometrisi kitlenin temel ilkeleri. sitometri analizi kütle hücre örneklerinin hazırlanması elemanlarının lantanid serisinden çoğunlukla metal izotoplarla etiketlenmiş antikorlar ile lekeleme hücreleri ile ilgilidir. Bu şemada spesifik bir epitopa karşı yükseltilmiş, her bir antikor, bir izotop yüzeyi, sitoplazmik lokalize nükleer ya da kromatin potansiyel olarak kullanılabilir olan epitoplara karşı bu Samaryum 154. Antikorlar gibi tek bir atomik kütle, sahip ile etiketlenir. Etiketli hücreler enjekte edilmiş ve bunlar, bir argon plazma lambasının iyonize tek hücreli damlacıklar halinde nebulizer sitometri kütle içinden püskürtülür. Daha büyük atomik kütle iyonu bolluğu detektör tarafından ölçülen ise elde edilen partikül bulutu bir dört kutuplu kütle filtre düşük kütle atomu sıyrılır. Her bir tek kütle iyonu ölçülen miktar bağlantılı antikorun hedef epitopunun hücresel bolluk karşılık gelir. teorik l iken100 parametrelerin IMIT Bu metodoloji kullanılarak niceliksel olarak belirtilmiştir, şu anda ticari olarak temin edilebilen reaktifler, hücre başına 40 parametrelerin saptanmasına izin verir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: deneysel prosedür ve isteğe bağlı olarak adımlar Akışı diyagramı. Kitle sitometri hücrelerini biraz protokolde yer alan önemli adımların Tasvir. İsteğe bağlı adımlar turuncu kutular ile gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,: Sitometri analizi m eşek oluşturulan verilerin örneği. (A) hücreleri (yüksek Ir191, düşük Ce140), tanelerin ayrılması (düşük Ir191, yüksek Ce140) ve boncuk hücre çiftleri (yüksek Ir191, yüksek Ce140) gösteren iki eksenli arsa. Olay uzunluğu v Ir193 beklenen görünümünü gösteren (B), iki eksenli bir arsa. Hücre artıkları ve hücre çoklular kaldırır tek hücre Yolluk gösterilmiştir. (C), iki eksenli arsa sisplatin barkod iki kütle kanalları, örneğin bir görüntüyü göstermektedir. (D - D) düşük seviyedeki (D) ve ölü hücrelerin oranı yüksek (E) olan numuneler için sisplatin canlı / ölü boyama Örnek verileri. (F) iki eksenli S fazındaki hücrelerin ayırt DUK ile etiketlenmiş H9 HESC hücrelerinin arsa ve daha fazla hücre döngüsü ayırt Siklin B1 karşı bir antikor. (G Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol başarıyla çeşitli kültürlenmiş hücre çizgileri (H1 ve H9 HESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) ve birincil doku örnekleri (fare kemik iliği, fare embriyonik karaciğer, fare yetişkin işlenmesi için kullanılan edilmiştir karaciğer, fare tümör). Bağımsız kaynağı, hücre durumunu muhafaza sitometrisi kütle analizi için uygun olmalıdır, ancak bir protokol optimizasyon gerektirebilir ise tek hücre halinde ayrılabilir bir doku. Bazı epitoplar kullanılan spesifik ayrışma, fiksasyon ve permeabilization tedavileri etkilenebilir ve bu yöntemler örnek özgü optimizasyonu geçmesi gerekebilir dikkat etmek önemlidir. Düşük sinyal bir antikor için görülürse, canlı hücreler üzerinde hücre yüzeyi etiketlenmesi performans geçirimli hale yöntemleri değiştirilmesi ya da sabitleme süresi azaltılarak geliştirilmesi mümkün olabilir.
Mümkün olduğunda deneysel tasarım içinde, th barkod dahilE örnek işleme akışı hücresi ve antikor konsantrasyonunda seviyesinde örnekler arasında tutarlılık sağlar. barkod olmadan, büyük bir dikkatle örnek işleme kontrol altına almak için bile, antikor konsantrasyonu ve hücre konsantrasyonu küçük farklılıklar örnekler arasında tanıtılacak muhtemeldir. Belirli epitoplar için pozitif hücrelerin yüzdeleri örnekleri arasında değişik olabilirler Dahası, etkili bir antikor-için-epitopa oranı zorunlu olarak toplam antikor konsantrasyonu potansiyel antikor boyama tutarsızlıklara yol açan, tutarlı bir vaziyette kalsa dahi, örnekler arasında farklılık gösterebilir. yüksek parametre Deney ve bakım veri analizi sırasında alınmadığı takdirde biyolojik olarak anlamlı olarak yanlış olabilir zaman tek bir kanal gözlemleyerek genellikle küçük ise Bu varyasyonlar, büyük ölçüde bileşik hale gelebilir.
Deney sitometrisi bir kütleden elde edilen verilerin analizi birçok biçim ve COMPUTA bir dizi sunartional yaklaşımlar, bu uygulama için özellikle adapte edilmiştir. Kitle için yararlı algoritmalar hakkında kapsamlı bir araştırma sağlarken veri analizi sitometri bu yazının kapsamı dışındadır, başarılı bir şekilde kullanılmışlardır yaklaşımlar vurgulanır ve ilgilenen okuyucular bu konuyu 21, 22, 23 kaplayan çoklu kaynaklara yönlendirilir. veri sitometrisi kütlesinin analizi için en yaygın olarak kullanılan, şu anda mevcut yaklaşımların ikisi Yoğunluğu Ağacı Progression Kapsayan olan Olaylar (SPADE) ve vişne normalleştirmek. SPADE benzer işaretleyici ifade eden hücrelerde gruplarından kümeleri meydana getiren ve bir düğüm olarak, her küme temsil eder. Bu düğümler içindeki düğümler bir hat (Şekil 3G) ile bağlı bir maça ağaç halinde düzenlenir. vişne arasında iki boyutlu bir gösterimini oluşturmak için bir algoritma 24 gömülmesi t-Dağıtılmış stokastik Komşu kullanmaktadırve yüksek boyutsal veriler genel veri yapısını koruyarak. SPADE ve vişne Hem MATLAB yazılır, kaynak kodu ücretsiz olarak dağıtılmaktadır ve MATLAB ile kullanıcılar tarafından çalıştırılabilir. Ayrıca, SPADE bağımsız bir sürümü mevcut.
Kitle sitometrisi şu anda parametrelerin yüksek sayıya toplanmasına imkan tanır iken, floresan etiket bazlı sitometrisi bazı uygulamalar için daha iyi bir yaklaşım olabilir. Floresan akış sitometrisi kadar sitometrisi kütlesi 500-1000 göre 5 x 10 4, saniyede daha fazla hücre analiz ve antikorları 25 daha fazla kullanılabilir doğrulamıştır. Böyle Hyperspektral sitometri 26 ve yeni fluorophores herkes için bir alternatif sitometri 27 yapmak floresan akış ama çok yüksek parametre deneyleri olarak sitometri floresan akışında diğer yenilikler arasında. , Daha önce RNA, 28 ölçü, sadece mümkün olan ilave tekniklerfloresans bazlı akış sitometri son protein ve RNA 29 aynı anda tespit izin sitometrisi kütlesine adapte edilmiştir. Mevcut izotopların ve reaktiflerin Gelecek genişleme daha tamamen ölçülebilir izotopların kütle penceresini kullanmak ve sitometrisi kütle ile mümkün profilleme derinliğini genişleyecektir ölçülebilir hücresel özellikleri repertuarını genişletmek için.
kütle sitometri ile eş zamanlı olarak analiz edilebilir parametrelerin çoğu büyük ölçüde araştırılabilir deneysel sorular genişler. Bu makale ve beraberindeki video protokol daha etkili bir şekilde araştırmalarını ilerletmek için kitle sitometrisi yararlanmak isteyen araştırmacılar sağlayacaktır umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37 °C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37 °C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25 mg/mL in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20 °C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5 mL round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5 mL 35 μm filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
References
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
- Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
- Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
- Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
- Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
- Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
- Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
- Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
- Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
- Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
- van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
- Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
- Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
- Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
- Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).
