Summary
Denne rapport beskriver en CUBIC protokol at afklare fuld tykkelse mus hud biopsier, og visualisere protein ekspressionsmønstre, prolifererende celler og sebocytter på enkelt celle opløsning i 3D. Denne metode giver nøjagtig vurdering af hudens anatomi og patologi, og af unormale epidermale fænotyper i genetisk modificerede mus linjer.
Abstract
Huden er afgørende for vores overlevelse. Det ydre epidermale lag består af interfollicular epidermis, hvilket er en stratificeret pladeepitel dækker det meste af vores krop, og epidermale vedhæng såsom hårsækkene og svedkirtler. Epidermis undergår regenerering hele livet og som svar på skade. Dette er aktiveret af K14-udtrykkende basale epidermale stamceller / stamceller populationer, der er tæt reguleret af flere reguleringsmekanismer aktive inden overhuden og mellem epidermis og dermis. Denne artikel beskriver en enkel metode til at afklare fuld tykkelse mus hud biopsier, og visualisere K14 protein ekspressionsmønstre, Ki67 mærket prolifererende celler, Nile Red mærkede sebocytter, og DAPI nukleare mærkning på enkelt celle opløsning i 3D. Denne metode giver nøjagtig vurdering og kvantificering af hudens anatomi og patologi, og af unormale epidermale fænotyper i genetisk modificerede mus linjer. CUBIC protokollen er the bedste metode til rådighed til dato for at undersøge molekylære og cellulære interaktioner i fuld tykkelse hud biopsier på enkelt celle opløsning.
Introduction
Huden er afgørende for vores overlevelse. Det består af tre hovedlag de ydre epidermis, dermis og hypodermis. Epidermis er en meget regenerativ væv. Det er en skællede stratificeret epitel, består hovedsagelig af keratinocytter. Keratinocytter er født i det basale lag, og bevæger sig opad gennem suprabasallagene mens differentiere, og i sidste ende de er udgydt i det ydre forhornede lag omkring en måned efter deres fødsel. Epidermis udvikler en række af vedhæng herunder hårsækkene og talgkirtler. De hårsækkene også regenerere i en cyklisk måde gennem hele livet en. Regenereringsevne af epidermis er aktiveret ved tilstedeværelsen af stamceller og progenitorceller, der er placeret i det basale lag af epidermis og interfollicular hårsækken 2.
Mange signalveje er blevet impliceret i epidermal udvikling og regeneration. Nogle af disse forekommer indenkun epidermis, såsom pindsvineoverføringsvejen. Andre signalering begivenheder finder sted mellem dermis og epidermis 3. For eksempel er Wnt signaler fra dermis menes at være vigtigt for hårsækken udvikling, og de udskilles af den dermale papil ved begyndelsen af anagen at aktivere hårsækken bule stamceller / progenitor celleproliferation og hårsækken vækst 4. Det er vigtigt at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer epidermal udvikling og regeneration for bedre at forstå, hvordan de kan forstyrres i regenerativ hudsygdom såsom hudkræft.
Denne artikel beskriver en C lear, U nobstructed B regn I maging cocktails og C omputational analyse (CUBIC) protokol 5-7 for at afklare hele mount hud præparater, og visualisere protein ekspressionsmønstre i 3 dimensioner ved enkelt celle beslutning konfokal mikroskopi. CUBIC metode indebærer nedsænkning af hudenvæv i to aminoalkohol-baserede kemiske cocktails. Disse løsninger justere brydningsindekserne i huden prøven, hvorefter vævet gennemsigtig og proteinerne intakt, så immunodetektion på enkelt celle opløsning.
Brug af denne CUBIC protokol, den basale og prolifererende keratinocytter populationer i interfollicular epidermis og i hårsækken blev afbildet i fuld tykkelse hud biopsier af vildtypemus anvendelse af anti-Keratin14 (K14) og anti-Ki67-antistoffer. Talgkirtlerne i vildtype hudbiopsier blev også visualiseret under anvendelse Nile Red-farvning. Endelig blev de basale keratinocytter befolkninger i vildtype og hyperplastiske YAP2-5SA-ΔC hud biopsier sammenlignet 8.
Denne CUBIC protokol muliggør visuel vurdering af protein-ekspression i fuld tykkelse hud biopsier på enkelt celle opløsning, og er et vigtigt redskab til at sætte pris på epidermal anatomi og morfologiske defekter i huden af genetisk modificeredemus, og til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer bag epidermal udvikling og regeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle procedurer, der involverer dyr fag følger retningslinjerne fra Animal Care og etiske komité (ACEC) på UNSW Australien under godkendte ACEC protokol 13 / 64B.
1. Fremstilling af det transparente Mouse hudvæv
Bemærk: Alle mus anvendt i denne undersøgelse, var på en C57BL / 6 genetisk baggrund
- Indsamling af muse hudvæv.
- Humant aflive musene ved cervikal dislokation.
- Fjern forsigtigt hår fra det pågældende hudområde med en trimmer pas på ikke at sår på huden.
- Vask huden til dekontaminering med 70% ethanol i phosphatpufret saltvand (PBS).
- Løft dorsale hals huden med en pincet og gøre indsnit med en saks.
- Dissekere et stort område af dorsal musehud (ca. 1,5 x 4 cm).
- Flatten huden dermis nedad på et filtrerpapir, og gøre opmærksom på anterior-posterior orientering af prøven.
- Trim filterpapir omkring dissekeret hud, og anbringes i et 15 ml rør fyldt med frisk fremstillet 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning i PBS.
- Fix i 1 time ved stuetemperatur, eller natten over i køleskab ved 4 ° C.
- Vask huden 2 x 5 min i PBS i et 15 ml rør.
Bemærk: Følgende (1.1.10 - 1.1.12) er valgfrie trin for langtidsopbevaring af væv. - Dehydrer dissekeret hud i PBS med stigende koncentration af ethanol (25%, 50% 70%) i et 15 ml rør i 1-hr vasketrin ved stuetemperatur.
- Opbevar dehydreret hud i 70% ethanol i PBS i et 15 ml rør ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
- 4 timer før clearing, rehydrere hudvæv i PBS med faldende koncentration af ethanol (70%, 50%, 25%, 0%) i et 15 ml rør i 1-hr vasketrin ved stuetemperatur.
- Rydning af mus hud biopsier
- Forbered CUBIC1 clearing opløsning ved at opløse 3,85 g urinstof og 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin i 5,38 ml destilleret vand på et varmelegeme sættes til 60 - 70 ° C. Brug en varm omrører.
- Tilføj 2,31 g polyethylenglycol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 til opløsningen, når den er klar og er afkølet til stuetemperatur.
- Skær musen huden med en skarp barberblad i biopsier af omtrentlige dimensioner 0,2 x 0,5 cm, og nedsænkes i 5 ml CUBIC1 clearing opløsning i et 15 ml rør. For at optimere visualisering af hårsækkene, sikre, at den lange side af biopsiinstrumentet er skåret langs antero-posterior retning af prøven.
- Placer på en roterende platform i en hybridiseringsovn ved 37 ° C.
- Ændre clearing opløsning efter 7 dage. Forbered frisk CUBIC1 opløsning før anvendelse.
- Tjek gennemsigtigheden af vævet efter 7 dage. Hvis det er nødvendigt, efterlade biopsier i CUBIC1 clearing løsning, indtil vævet er helt gennemsigtig.
- Når hudbiopsi er transparent,fjerne CUBIC1 opløsning, og der tilsættes 4 ml 1 × PBS for at vaske vævet 4 gange i 6 timer ved 37 ° C.
- Vask huden væv i 20% vægt / volumen sucrose i PBS i et 15 ml rør i 4 timer ved 37 ° C.
- Frys vævet i monteringsmedium Optimal Cutting Temperatur (OLT) forbindelse i et 15 ml rør natten over i en -80 ° C fryser.
Bemærk: Dette trin vil øge biopsi permeabilitet for antistof penetration i efterfølgende trin.
2. Immunfluorescensfarvning
- Tø væv fra 1.2.9) til stuetemperatur til 2 - 3 timer.
- Vask væv i 15 ml rør med 5 ml PBS i 8 timer ved stuetemperatur for at fjerne OCT-forbindelse.
- Overfør biopsier til et 2 ml rør, og inkuber væv i 1 ml kanin-anti-Keratin14 eller kanin-anti-Ki67-antistof, både fortyndet 1: 100 i PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) i 3 dage på en ryster i en 37 ° C varm ovn.
- Overfør biopsier til et 15 ml rør, ennd vask væv 4 gange i 6 timer i 5 ml PBST på en ryster i en 37 ° C varm ovn.
- Overfør biopsier til et 2 ml rør, tilsættes 1 ml anti-kanin Alexa594 sekundært antistof fortyndet 1: 100 i PBST og inkuber 3 dage på en ryster i en 37 ° C varm ovn.
- Overfør biopsier til et 15 ml rør og vask væv 4 gange i 6 timer i 5 ml PBST på en ryster i en 37 ° C varm ovn.
- Overfør biopsier til et 2 ml rør, der tilsættes 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) nuklear kontrastfarve opløsning (1: 1000) i PBST og inkuberes natten over på en shaker i en 37 ° C varm ovn.
- Fjern DAPI modfarvning opløsning, og der tilsættes 1 ml PBST til 2 ml rør til at vaske væv 4 gange i 6 timer på et rysteapparat i et 37 ° C varm ovn.
Bemærk: Eventuelt trin: Biopsier kan opbevares i mørke i 1 x PBS med 0,02% natriumazid i mindst 3 uger.
3. Nile Red Farvning
- Nile Red pulver i dimethylsulfoxid (DMSO) opløses til en slutkoncentration på 1 mg / ml
- Tilsæt 1 pi Nile Red-opløsning til 1 ml PBS til en slutkoncentration på 1 ug / ml.
- Tø væv fra 1.2.9) til stuetemperatur til 2 - 3 timer, og vask med 5 ml PBS i 8 timer ved stuetemperatur.
- Overfør biopsier til et 2 ml rør, og nedsænke væv i 1 ml Nile Red farveopløsning i 2,5 timer ved stuetemperatur.
- Vask hudbiopsier i 2 ml rør med 1 ml PBST 4 gange i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern PBST-opløsning fra 2 ml rør, tilsættes 1 ml DAPI nuklear kontrastfarvning opløsning (1: 1.000) i PBST og inkuberes natten over ved stuetemperatur.
- Fjern DAPI modfarvning opløsning, og der tilsættes 1 ml PBST i 2 ml rør til at vaske hudvævet 4 gange i 6 timer ved stuetemperatur.
Bemærk: Eventuelt trin: Biopsier kan opbevares i mørke i 1 x PBS med 0,02% natriumazid i mindst 3 uger.
4. Imaging
- Forbered CUBIC2 clearing løsning, som indeholder 50% (Vægt / volumen) sucrose, 25% (vægt / volumen) urinstof, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, og 0,1% (volumen / volumen) Triton X-100.
- Inkubér hudvævet i 1 ml CUBIC2 opløsning i et 2 ml rør på et rysteapparat i 24 timer i en 37 ° C varm ovn. Dette trin vil udjævne brydningsindekset af vævet.
- Kontroller klarhed af vævet. Når det er klart, placere hele hudbiopsi (0,2 x 0,5 cm) på sin lange side på et dækglas, således at retningen af længden af hårsækkene er parallel med dækglasset overflade (# 1 24 x 60 mm)
Bemærk: Eventuelt trin: Antibody-farvede biopsier kan lagres i CUBIC2 opløsning i omkring 7 dage. Nile Red-farvede biopsier kan kun opbevares i CUBIC2 opløsning i op til 1 dag, og bør afbildes så hurtigt som muligt. - Forbered imaging kammer (figur 1)
Bemærk: forbrugsartikler kræves til fremstilling af afbildningskammeret er: blå tack, spille dej eller lignende, og 2 dækglas (24 x 50 mm) (Figur 1A).- Forbered to tynde strimler af blå tack (diameter ca. 1 mm x 2 cm) og to dækglas (figur 1b).
- Placer blå tack strimler på én dækglas, hvilket giver tilstrækkelig plads til hudbiopsi (figur 1C). 4.4.3)
- Placer hudbiopsi i mellem strimler på dækglasset i en dråbe CUBIC2 opløsning (figur 1C).
- Dæk hudbiopsi med det andet dækglas (figur 1D).
- Placer afbildningskammeret med den monterede hudbiopsi på scenen af et konfokalt mikroskop og flytte vævet ind i lyset pathway.
- Scan prøven ved hjælp af en kviksølv eller halogen lyskilde og standard epifluorescens filtre (f.eks DAPI / GFP / CY3 / CY5) for at identificere fluorescens farvede områder af interesse.
- Regioner Billede af interesse ved hjælp af en 10X og 20X mål (NA 0,75) og standard konfokal fluorescens imaging teknikker (f.eks., Med DAPI farvede prøver belyse med en 405 nm laser og indsamle fluorescens signal mellem 425-475 nm, og med Alexa Fluor 594 eller Nile Red-farvede prøver belyse med en 561 nm laser og indsamle fluorescens signal mellem 570-620 nm).
- Generer billede Z-stakke af hver region af interesse ved hjælp af mikroskop Z-stack erhvervelse billede software (f.eks. Ved hjælp NIS elementer imaging software 4.13 som beskrevet nedenfor).
- Sikre optimal laser magt og PMT HV / Offset indstillinger er blevet udvalgt til at indsamle prøven fluorescens.
- Åbn "ND Acquisition" værktøjslinjen fra "Acquisition Controls".
- Vælg fanebladet "Z-serien Setup" (sikre alle andre faner er fravalgt).
- Mens levende scanning, fokus til toppen af prøven og tryk på knappen "Top".
- Fokus til bunden af prøven og trykke på "Bottom" knappen.
- Input krævede trin størrelse (eller tryk optimeret trin knappen størrelse).
- Press på "Kør nu" knappen.
- Gem resulterende Z-stakke som individuel TIFF-billede stakke (1 fluorokrom pr billede Z-stack).
- Bruge Image Z-stakke at rekonstruere 3D volumendatamængde regioner af interesse under anvendelse af 3D analyse software (f.eks. Ved anvendelse af Imaris x64 7.2.3 som beskrevet nedenfor).
- Start analysesoftware.
- Vælg "overgå" -knappen i værktøjslinjen til 3D volumen generation.
- Åben første farve Z-stabel (f.eks., DAPI).
- Brug 'add kanalen "værktøj til at tilføje yderligere farvekanaler, én kanal pr fluorokrom. Således en prøve indeholdende både DAPI og Alexa Fluor 594 fluorochromer vil kræve to kanaler.
- Brug "Billedegenskaber" værktøj til at indstille korrekt pixel (voxel) dimensioner (XYZ), som bestemt i 4,7 ovenfor.
- Brug "Display Adjustment" værktøj til at skifte kanal farver efter behov (f.eks sætte DAPI kanal til blå, Alexa Fluor 594 kanal til rød).
- Til pomensætning 3D volumen i vinduet billedet, bruger computeren musen til at klikke og trække volumen efter behov.
- Brug "Snapshot" værktøj i værktøjslinjen for at generere skærmbilleder af 3D-billedet.
- Brug "Animation" i værktøjslinjen for at generere film af 3D prøve rotation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fuld tykkelse dorsale hud biopsier af voksne vildtypemus blev klaret, farvet med et antistof bindende basal keratinocyt markør Keratin14 (K14), og kerner blev modfarvet med DAPI-farvning opløsning (figur 2 og Movie 1).
DAPI-positive kerner var synlige i hele prøven (figur 2A, C), og K14-farvning var synlig udelukkende i én celle tykt basale lag af de interfollicular epidermis, og skitserer talgkirtlerne (sorte asterisker), hvis yderste rod skeder hårsækkene, og i de sekundære hår bakterier (figur 2B, C), som tidligere offentliggjort 9. K14 farvningsintensitet var høj i de interfollicular epidermis, den distale hårsækken og de sekundære hår bakterier (hvide asterisker), og det var forholdsvis lav i bule område af hårsækken (Bu i figur 2C). Den dermale papiller var også tydeligt visible gennem DAPI mærkning (pil i figur 2C).
At visualisere prolifererende celler, fuld tykkelse dorsale hud biopsier i telogen af voksne vildtypemus blev klaret og farvet med et anti-Ki67-antistof, og kerner blev modfarvet med DAPI-opløsning (figur 3, og Movie 2).
Prolifererende keratinocytter blev påvist i de basale interfollicular epidermis (IFE i figur 3C), og i isthmus (Er i figur 3C) i hårsækkene, men ikke i fremspringsregionen (Bu i figur 3C).
At visualisere talgkirtler, fuld tykkelse dorsale hud biopsier i anagen af voksne vildtypemus blev klaret og farvet med Nile Red, som mærker fedtindholdet i sebocytter, og kerner blev modfarvet med DAPI-farvning opløsning (figur 4 og Movie 3). Nile Red-positive sebaceous kirtler blev observeret i landtangen region i hårsækkene (SB i figur 4C), der viser, at CUBIC protokol ikke væsentligt påvirker morfologi af disse fedtholdige strukturer. Uventet blev hår skakter også mærket med Nile Red (HS i figur 4C).
For at visualisere de morfologiske ændringer i epidermis af YAP2-5SA-ΔC transgene mus, der udtrykker en hyperaktiv YAP mutant protein i basale keratinocytter 8, blev fuld tykkelse dorsale hud biopsier af voksne vildtype og YAP2-5SA-ΔC transgene kuld mus afklaret og farves med anti-K14-antistof, og kerner blev modfarvet med DAPI-opløsning (figur 5, og Movie 4 (vildtype) og Movie 5 (YAP2-5SA-ΔC)).
I YAP2-5SA-ΔC transgene hud, den hyperplasi af de interfollicular epidermis (øverst dobbelt pile i figur 4F figur 5F), der repræsenterer de forstørrede stamcelle befolkninger, som tidligere beskrevet 8.
Figur 1: Forberedelse af Imaging Afdeling. A: forbrugsartikler kræves til fremstilling af afbildningskammeret er blå tack, spille dej eller lignende, og 2 dækglas (24 x 50 mm) B:. Forberede to tynde strimler af blå tack (diameter på ca. 2 mm x 2 cm), og to dækglas C:. Place blue tack strips på en dækglas, hvilket giver tilstrækkelig plads til hudbiopsi. Placer hudbiopsi i en dråbe CUBIC2 opløsning i mellem de to strimler D:. Anbring andet dækglas på blå tack strimler til at dække hudbiopsi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: K14 / DAPI Label ing af Dorsal Skin i telogen Adult vildtypemus genopbygning 3D volumen af en dorsal hudbiopsi i telogen af en voksen vildtype mus mærket med et K14-antistof (Rød i B, C), og DAPI nuklear kontrastfarve. (blå i A, C). K14 farvningen er stærk i interfollicular epidermis (IFE), landtangen og talgkirtler (sorte asterisker) og de sekundære hår bakterier (hvid asterisk), og relativt lav i bule område (Bu). Scale bars 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Ki67 Mærkning af Dorsal Skin i telogen Adult vildtypemus 3D volumendatamængde rekonstruktioner af en dorsal hud biopsi af en voksen vildtype mus mærket med et Ki67-antistof (Rød i B, C), og DAPI nuklear kontrastfarve (blå i A, C). Prolifererende Ki67-positive keratinocytter er tydelige i de basale interfollicular epidermis (IFE), og i isthmus region (Is), men ikke i udbulingen (Bu) af telogen hårsækken. Scale bars 50 um.rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Nile Red Farvning af Dorsal Skin i anagen Adult vildtypemus genopbygning 3D volumen af en dorsal hudbiopsi i anagen af en voksen vildtype mus mærket med Nile Red (rød i B, C), og DAPI nuklear kontrastfarve (blå i. A, C). Nile Red-farvning er synlig i de sebocytter (SB) og i håret (HS). Scale bars 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur5: morfologiske abnormiteter i YAP2-5SA-ΔC Epidermis 3D volumen rekonstruktioner af dorsale hud biopsier af voksne vildtype (A - C) og YAP2-5SA-ΔC transgene kuld mus (D - F) er mærket med en K14-antistof (rød i. B, C, E, F), og DAPI nuklear kontrastfarve (blå i A, C, D, F). Den epidermal hyperplasi af YAP2-5SA-ΔC epidermis er tydelig i de interfollicular epidermis (øverst dobbelt pile i F) og i hårsækkene, som viser de karakteristiske stængel / stamceller masser proksimalt (lavere dobbelte pile i F) 8. Scale bars 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Klik her for at downloade denne film.
Movie 2. Klik her for at downloade denne film.
Movie 3. Klik her for at downloade denne film.
01movie4.jpg "/>
Movie 4. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De regulatoriske mekanismer, der styrer hud udvikling og homeostase er mest almindeligt undersøgt i 2D ved hjælp af væv sektionering og histologisk farvning eller mærkning med antistoffer, som gør det muligt kun en begrænset forståelse af huden morfologi, cellepopulationer eller protein udtryk. Et antal fremgangsmåder er blevet udviklet for at forbedre visualisering af den rumlige organisation af celler og proteiner ved enkelt celle opløsning i 3 dimensioner i epidermale hele underlag 10-13. Nogle af disse dog involvere separation af epidermis fra dermis, som er teknisk udfordrende især ved hjælp behårede hud, og ofte resulterer i vævsskade og sprængning af hårsækkene. Også, adskillelse af epidermis og dermis svækker studerer de cellulære og molekylære samspil, der opstår mellem dem under fosterudviklingen og vævshomeostase.
Den "flad mount tilgang" er en anden metode, hvor fuld mus tykkelsehud dissekeres og immunfarvet, og klares derpå ved hjælp benzylbenzoat og benzylalkohol (BBBA) samtidig bevare immunfluorescerende signaler 14. Denne metode kræver ikke teknisk udfordrende adskillelse af epidermis fra dermis. Men BBBA er stærkt toksisk, det denaturerer nogle fluorescerende proteiner, og det forurener mikroskop mål, ikke giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af de nødvendige prøver for at undersøge cellulære og molekylære interaktioner i vævet.
Denne rapport beskriver en CUBIC protokol 5-7 for at afklare fuld tykkelse mus hud biopsier fra enhver ønsket anatomisk område og alder ved hjælp af relativt sikre og billige reagenser. Dette teknisk enkel protokol tillader visualisering af protein udtryk og spredning mønstre ved immunfluorescens i fuld tykkelse hud biopsier modfarvet med DAPI i tre dimensioner på enkelt celle opløsning, der gør det muligt uden fortilfælde og meget nøjagtig qualitative vurdering og kvantificering af proteinekspression, proliferation, vævsmorfologi og hårsækken dimensioner. Denne metode er også egnet til visualisering af sebocytter ved hjælp Nile Red-farvning til trods for fjernelsen af vævslipider under afklaring procedure. En vigtig begrænsning ved denne metode er tilgængeligheden af antistoffer effektivt bindende og tillader visualisering af deres respektive målproteiner ved hjælp af denne hud afklaringsforløb. Desuden genereret billede og film filer er store, og gode IT-ressourcer såsom computere med kraftfulde processorer og rigelig data lagerplads er afgørende.
Et kritisk trin i proceduren er forberedelsen af huden biopsier. At visualisere intakt hårsækken anatomi, bør tages orienteringen af hudbiopsi i betragtning, og længden af biopsier skal skæres parallelt med retningen af længden af hårsækkene. Desuden lille og meget tynd skin biopsier er vanskelige at montere korrekt til mikroskopi. Større biopsier vil kræve mere tid til at rydde, og kan medføre antistof penetration problemer resulterer i antigen-afsløring artefakter. Det er derfor tilrådeligt at skære, klar og pletten flere biopsier per eksperiment.
Det er også vigtigt at stramt forsegle rørene samtidig forbereder de kubiske løsninger for at undgå fordampning af indholdet under opvarmningsprocessen, hvilket resulterer i ændringer i reagenskoncentrationer og kan forårsage forringet væv clearing. Det næste vigtige skridt er, at vævet vil blive præciseret ved 37 ° C for at fremskynde clearingen. Efter 7 dage, vil CUBIC1 løsning skal være forberedt frisk til at erstatte den gamle.
I fremtiden vil flere antistoffer blive identificeret, der er kompatible med CUBIC hud afklaring procedure, og analyser kan udvides til at visualisere og kvantificering af epidermal og melanocyt (stilk) celle markørs og dermale proteiner. Denne teknik vil også spille en afgørende rolle i 3D studier af hudens patologi og anatomi, og støtte i opklaringen af cellulære og molekylære mekanismer bag unormal og normal epidermal biologi i huden på muterede mus og transgene reporter musemodeller, herunder signalering interaktioner mellem dermis og epidermis.
CUBIC protokol 5-7 sandsynligvis vil være gældende for huden på andre hvirveldyr dyremodeller, og til humane hud Hulning biopsier. Lys ark mikroskopi vil muliggøre visualisering af epidermal anatomi, protein ekspressionsmønstre, og progression af trinnene hårsækken cyklus i større hudprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Australian Bio-Ressourcer (Garvan Institute, Australien), den biologiske ressourcer Centre (UNSW Australien) og Animal Care & etiske komité for støtte med dyreforsøg. Dette arbejde blev støttet af National Health og Medical Research Council of Australia (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales er modtagere af en CONICYT-Becas Chile stipendium (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios er en modtager af University International Postgraduate Award af UNSW Australien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
