Summary
Dit rapport beschrijft een KUBIEKE protocol om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen, delende cellen, en sebocyten bij de enkele resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen.
Abstract
De huid is essentieel voor overleving. De buitenste epidermale laag bestaat uit de interfolliculaire epidermis, wat een meerlagig plaveiselepitheel die het grootste deel van ons lichaam en epidermale aanhangsels zoals de haarfollikels en zweetklieren. De epidermis ondergaat regeneratie gedurende het hele leven en in reactie op letsel. Dit wordt mogelijk gemaakt door K14 expressie basale epidermale stamcellen / voorlopercellen cel populaties die strak worden gereguleerd door meerdere regulerende mechanismen actief binnen de epidermis en tussen de opperhuid en de lederhuid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren K14 eiwit expressie patronen, Ki67 gelabeld delende cellen, Nile Red label sebocyten en DAPI nucleaire etikettering op één resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie en kwantificering van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen. De CUBIC protocol is the best beschikbare methode tot op heden de moleculaire en cellulaire interacties in de volledige dikte van de huid biopsieën bij enkele resolutie cel te onderzoeken.
Introduction
De huid is essentieel voor overleving. Het bestaat uit drie lagen van de buitenste epidermis, de dermis en de hypodermis. De epidermis is een zeer regeneratief weefsel. Het is een geschubde gelaagd epitheel, bestaat voornamelijk uit keratinocyten. Keratinocyten worden geboren in de basale laag, en omhoog bewegen door de suprabasale lagen terwijl differentiëren, en ze uiteindelijk worden afgeworpen in de buitenste laag verhoornde ongeveer een maand na hun geboorte. De epidermis ontwikkelt een aantal aanhangsels waaronder de haarfollikels en talgklieren. De haarzakjes ook regenereren op een cyclische manier gedurende het hele leven 1. De regeneratieve capaciteit van de epidermis wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van stamcellen en cellen die zich bevinden in de basale laag van de epidermis en interfolliculaire haarfollikel 2.
Veel signaalroutes zijn betrokken bij epidermale ontwikkeling en regeneratie. Sommige van deze optreden binnenalleen de epidermis, zoals de Hedgehog pathway. Andere signalering evenementen plaats tussen dermis en epidermis 3. Zo worden Wnt signalen van de dermis belangrijk geacht voor haarfollikel ontwikkeling, en ze worden uitgescheiden door de dermale papilla bij het begin van anagen activeren haarfollikel uitstulping stam / voorlopercellen celproliferatie en haarzakje groei 4. Het is belangrijk om de cellulaire en moleculaire mechanismen die epidermale ontwikkeling en regeneratie controle beter te begrijpen hoe ze regeneratieve huidziekte kan worden verstoord zoals huidkanker begrijpen.
Dit artikel beschrijft een C Lear, U nobstructed B regen I maging cocktails en C omputational analyse (KUBIEKE) protocol 5-7 op hele berg voorbereidingen huid te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen in 3 dimensies op één resolutie cel door confocale microscopie. De KUBIEKE methode houdt onderdompelen van de huidweefsel in twee-aminoalcohol gebaseerde chemische cocktails. Deze oplossingen stellen de brekingsindex in de huid monster, waardoor het weefsel transparante en de eiwitten intact, waardoor immunodetectie op enkele resolutie cel.
Gebruik van deze CUBIC protocol, de basale prolifererende keratinocyten in de populaties interfolliculaire epidermis en in haarfollikels werden afgebeeld in volledige dikte huid biopten van wildtype muizen met behulp van anti-Keratin14 (K14) en anti-Ki67-antilichamen. Talgklieren in wild-type huid biopten werden ook gevisualiseerd met behulp van Nile Red kleuring. Ten slotte is de basale keratinocyten bevolking in wild-type en hyperplastische YAP2-5SA-ΔC huid biopsieën werden vergeleken 8.
Dit CUBIC protocol maakt visuele beoordeling van eiwitexpressie in volledige dikte van de huid biopsieën bij enkele resolutie cel, en is een belangrijk instrument om epidermale anatomie en morfologische gebreken in de huid van genetisch gemodificeerde waarderenmuizen, en de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen epidermale ontwikkeling en regeneratie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle procedures waarbij proefdieren volgen de richtlijnen van de Animal Care en Ethische Commissie (ACEC) bij UNSW Australië onder goedgekeurde ACEC protocol 13 / 64B.
1. Bereiding van de transparante muis huidweefsel
Opmerking: Alle muizen die in deze studie werden op een C57BL / 6 genetische achtergrond
- Het verzamelen van de muis huidweefsel.
- Humaan euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie.
- Verwijder haren voorzichtig uit de betreffende huid met een trimmer verzorgen van de huid niet te verwonden.
- Was de huid te ontsmetten met 70% ethanol in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Til dorsale nekvel met een pincet en maak incisie met een schaar.
- Ontleden een groot gebied van de dorsale huid van muizen (ongeveer 1,5 x 4 cm).
- Plat huid dermis naar beneden op een filter papier en noteer de anterior-posterior oriëntatie van het monster.
- Trim filterpapier rond de ontleed huid, en plaats in een 15 ml buis gevuld met vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in PBS.
- Oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht in de koelkast bij 4 ° C.
- Was de huid 2 x 5 minuten in PBS in een 15 ml buis.
Opmerking: de volgende (1.1.10 - 1.1.12) zijn optionele stappen voor langdurige opslag van weefsel termijn. - Uitdrogen huid ontleed in PBS met toenemende concentratie ethanol (25%, 50% 70%) in een 15 ml buis gedurende 1 uur-wasstappen bij kamertemperatuur.
- WINKEL vochtarme huid in 70% ethanol in PBS in een 15 ml buis bij 4 ° C tot verder gebruik.
- 4 uur voor clearing, hydrateren huidweefsel in PBS met afnemende concentratie aan ethanol (70%, 50%, 25%, 0%) in een 15 ml buis gedurende 1 uur-wasstappen bij kamertemperatuur.
- Wissen van de muis huid biopsieën
- Bereid de CUBIC1 clearingoplossing door het oplossen van 3,85 g ureum en 3,85 g N, N, N ', N'tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine in 5,38 ml gedestilleerd water op een verwarmer ingesteld op 60 - 70 ° C. Gebruik een hot roerder.
- Voeg 2,31 g polyethyleenglycol-mono-p-isooctylfenylether / Triton X-100 aan de oplossing zodra duidelijk is en heeft tot kamertemperatuur afgekoeld.
- Snijd de muis huid met een scherp scheermesje in biopten van ongeveer de afmetingen 0,2 x 0,5 cm, en dompel in 5 ml CUBIC1 clearing oplossing in een buis van 15 ml. Om de visualisatie van haarfollikels optimaliseren zorgen dat de langste zijde van de biopsie langs de antero-posterieure richting van het monster wordt gesneden.
- Plaats op een roterend platform in een hybridisatie oven bij 37 ° C.
- Verander de clearing oplossing na 7 dagen. Bereid verse CUBIC1 oplossing voor gebruik.
- Controleer de transparantie van het weefsel na 7 dagen. Eventueel laat biopten in CUBIC1 clearingoplossing totdat het weefsel volledig transparant.
- Zodra de huidbiopsie transparant,Verwijder de CUBIC1 oplossing en voeg 4 ml van 1 x PBS om het weefsel 4 keer wassen gedurende 6 uur bij 37 ° C.
- Was het huidweefsel in 20% w / v sucrose in PBS in een 15 ml buis gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Freeze het weefsel in montage medium Optimal Cutting Temperatuur (LGO) verbinding in een 15 ml buis 's nachts in een -80 ° C vriezer.
Opmerking: Deze stap zal de permeabiliteit van de biopsie voor antilichaam penetratie in de volgende stappen te verhogen.
2. immunofluorescentiekleuring
- Ontdooien weefsel van 1.2.9) tot kamertemperatuur gedurende 2-3 uur.
- Wassen weefsel in de 15 ml buis met 5 ml PBS gedurende 8 uur bij kamertemperatuur LGO Verbinding verwijderen.
- Overdracht biopten een 2 ml buisje en incubeer weefsel in 1 ml konijnen-anti-Keratin14 of konijn anti-Ki67 antilichamen, zowel verdund 1: 100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) gedurende 3 dagen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
- Overdracht biopten een 15 ml buis, eennd wassen weefsel 4 keer gedurende 6 uur in 5 ml PBST op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
- Overdracht biopten een 2 ml buisje, voeg 1 ml anti-konijn alexa594 secundair antilichaam verdund 1: 100 in PBST en incubeer 3 dagen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
- Overdracht biopten een 15 ml buis en was 4 keer weefsel 6 uur in 5 ml PBST op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
- Overdracht biopten een 2 ml buisje, voeg 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tegenkleuring nucleaire oplossing (1: 1000) in PBST en overnacht incuberen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
- Verwijderen DAPI tegenkleuring oplossing en voeg 1 ml PBST naar 2 ml buis weefsel 4 keer gedurende 6 uur was op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
Opmerking: Optionele stap: Biopsieën kunnen in het donker worden opgeslagen in 1x PBS met 0,02% natriumazide gedurende minstens 3 weken.
3. Nile Red kleuring
- Lossen Nile Red poeder in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml
- Voeg 1 ul Nile Red oplossing van 1 ml PBS tot een eindconcentratie van 1 ug / ml.
- Ontdooien weefsel van 1.2.9) tot kamertemperatuur gedurende 2-3 uur, en was met 5 ml PBS gedurende 8 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Transfer biopten een 2 ml buisje en dompel weefsel in 1 ml Nile Red kleuroplossing gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de huid biopten in 2 ml buis met 1 ml PBST 4 keer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijderen PBST oplossing van 2 ml buis, voeg 1 ml DAPI tegenkleuring nucleaire oplossing (1: 1000) in PBST en incubeer overnacht bij kamertemperatuur.
- Verwijderen DAPI tegenkleuring oplossing en voeg 1 ml PBST in 2 ml buis het huidweefsel 4 keer wassen gedurende 6 uur bij kamertemperatuur geroerd.
Opmerking: Optionele stap: Biopsieën kunnen in het donker worden opgeslagen in 1x PBS met 0,02% natriumazide gedurende minstens 3 weken.
4. Imaging
- Bereid de CUBIC2 clearing oplossing, die 50 bevat% (W / v) sucrose, 25% (w / v) ureum, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol en 0,1% (v / v) Triton X-100.
- Incubeer het huidweefsel in 1 ml CUBIC2 oplossing in een 2 ml buis op een schudder gedurende 24 uur in een 37 ° C oven. Deze stap wordt de brekingsindex van het weefsel gelijk te.
- Controleer de helderheid van het weefsel. Zodra duidelijk is, plaatst de gehele huid biopsie (0,2 x 0,5 cm) aan de lange zijde op een glazen dekglaasje, zodat de richting van de lengte van de haarfollikels evenwijdig aan de dekglaasje oppervlak (# 1 24 x 60 mm)
Opmerking: Optionele stap: Antilichaam-bevlekte biopsieën kunnen CUBIC2 oplossing bewaard gedurende ongeveer 7 dagen. Nile rood gekleurde biopten kunnen alleen worden opgeslagen in CUBIC2 oplossing tot 1 dag, en zo spoedig mogelijk worden afgebeeld. - Bereid beeldvorming kamer (figuur 1)
Opmerking: verbruiksartikelen die nodig zijn voor de voorbereiding van de beeldvorming kamer zijn: blauwe tack, spelen deeg of vergelijkbaar, en 2 dekglaasjes (24 x 50 mm) (FIGUUR 1A).- Bereid twee dunne stroken blauwe tack (diameter van ongeveer 1 mm x 2 cm), en twee dekglaasjes (Figuur 1B).
- Plaats blauwe tack strips op een dekglas, zodat voldoende ruimte voor de huid biopsie (figuur 1C). 4.4.3)
- Plaats huidbiopsie tussen strips op het dekglaasje in een druppel CUBIC2 oplossing (figuur 1C).
- Bedek de huid biopsie met de tweede dekglaasje (figuur 1D).
- Plaats de beeldvorming kamer met gemonteerde huidbiopsie op het podium van een confocale microscoop en zet het weefsel in het licht pad.
- Scan de monster met behulp van een kwik of halogeen lichtbron en standaard epifluorescentie filters (bijvoorbeeld DAPI / GFP / CY3 / CY5) aan fluorescerend gebrandschilderde regio's van belang te identificeren.
- Afbeelding regio's van belang met behulp van een 10x en 20x objectief (NA 0,75) en standaard confocale fluorescentie beeldvormende technieken (bv. Met DAPI gekleurd monsters verlichten met een 405 nm laser en het verzamelen van fluorescentie-signaal tussen 425-475 nm, en met Alexa Fluor 594 of Nile Red-gekleurd monsters verlichten met een 561 nm laser en het verzamelen van fluorescentie-signaal tussen 570-620 nm).
- Genereer afbeelding Z-stacks van elke regio van belang met behulp van microscoop Z-stack beeldacquisitie software (bijv., Met behulp van NIS elementen imagingsoftware 4.13 zoals hieronder beschreven).
- Zorgen voor een optimale laservermogen en de PMT HV / Offset instellingen zijn geselecteerd om te proeven fluorescentie te verzamelen.
- Open de "ND Acquisition" toolbar van "Acquisition Controls".
- Selecteer het tabblad "Z-serie Setup" (ervoor zorgen dat alle andere tabbladen zijn niet geselecteerd).
- Terwijl levende scannen focus naar de bovenzijde van het monster en de "top" knop.
- Focus op de onderkant van het monster en druk op de "Bottom" knop.
- Input verplichte stap grootte (of druk geoptimaliseerd stapgrootte knop).
- Press de "Run nu" knop.
- Spaar resulterende Z-stacks als individuele Tiff beeld stacks (1 fluorochroom per beeld Z-stack).
- Gebruik beeld Z-stacks 3D volume interessante gebieden gebruiken 3D analysesoftware reconstrueren (bv., Middels Imaris x64 7.2.3 zoals hieronder beschreven).
- Start analysesoftware.
- Kies "Overtref" knop in toolbar voor 3D volume generatie.
- Open de eerste afbeelding in kleur Z-stack (bijv., DAPI).
- Gebruik de 'add channel' hulpmiddel om extra kleur kanalen, één kanaal per fluorochroom toe te voegen. Zo een monster dat zowel DAPI en Alexa Fluor 594 fluorochromen zullen twee kanalen nodig.
- Gebruik de "Eigenschappen afbeelding" tool om de juiste pixel (voxel) afmetingen set (XYZ), zoals bepaald in 4.7 hierboven.
- Gebruik "weergaveaanpassing" tool om het kanaal kleuren te veranderen als dat nodig is (bijvoorbeeld, ingesteld DAPI kanaal naar blauw, Alexa Fluor 594 kanaal naar rood).
- om poPositioneer het 3D-volume in het venster beeld, gebruik maken van de computer muis te klikken en het volume te slepen, zoals vereist.
- Gebruik de "Snapshot" tool in de werkbalk om screenshots van het 3D-beeld te genereren.
- Gebruik de "Animation" tool in de toolbar om films van 3D monster rotatie te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volledige dikte dorsale huid biopten van volwassen wildtype muizen werden opgehelderd, gekleurd met een antilichaam bindend basale keratinocyten marker Keratin14 (K14), en de kernen werden tegengekleurd met DAPI kleuring oplossing (figuur 2 en Film 1).
DAPI-positieve kernen werden zichtbaar in het monster (Figuur 2A, C) en K14 kleuring zichtbaar uitsluitend in één cel dikke basale laag van de interfolliculaire epidermis, en waarin de talgklieren (zwart sterretjes), de buitenste wortelschacht omhulsels van haarfollikels en in de secundaire kiemen haar (Figuur 2B, C), zoals eerder gepubliceerd 9. K14 kleuringsintensiteit was hoog in de interfolliculaire epidermis, het distale haarfollikel en de secundaire haren kiemen (witte sterretjes) en het was relatief laag in het gebied van de uitstulping haarfollikel (Bu figuur 2C). De dermale papillen waren ook duidelijk visible door middel van etikettering DAPI (pijl in figuur 2C).
Om prolifererende cellen, volledige dikte dorsale huid biopten visualiseren telogene volwassen wildtype muizen werden helder en gekleurd met een anti-Ki67 antilichamen en kernen werden tegengekleurd met DAPI oplossing (figuur 3 en Film 2).
Prolifererende keratinocyten werden gedetecteerd in de basale interfolliculaire epidermis (IFE in figuur 3C), en in de isthmus (Is figuur 3C) van de haarfollikels, maar niet in het bultgebied (Bu figuur 3C).
Om talgklieren volledige dikte dorsale huid biopten visualiseren anagene volwassen wildtype muizen werden helder en gekleurd met Nile Red dat het vetgehalte van sebocyten labels en kernen werden tegengekleurd met DAPI kleuroplossing (figuur 4 en Film 3). Nile Red-positieve sebaceous klieren werden waargenomen in de isthmus gebied van de haarfollikels (SB in figuur 4C), waaruit blijkt dat de kubische protocol geen significante invloed op de morfologie van deze vetbevattende structuren. Onverwacht, werden haar schachten ook het label met Nile Red (GS in Figuur 4C).
Om de morfologische veranderingen in de epidermis van YAP2-5SA-ΔC transgene muizen die een hyperactieve YAP mutante eiwit in de basale keratinocyten 8 visualiseren, werden volledige dikte dorsale huid biopten van volwassen wild-type en YAP2-5SA-ΔC transgene muizen nestgenoot verduidelijkt en gekleurd met de anti-K14 antilichaam en kernen werden tegengekleurd met DAPI-oplossing (figuur 5, en Movie 4 (wildkleur) en Movie 5 (YAP2-5SA-ΔC)).
In de YAP2-5SA-ΔC transgene huid, de hyperplasie van de interfolliculaire epidermis (top dubbele pijlen in figuur 4F figuur 5F), die het vergrote stamcelpopulaties, zoals eerder beschreven 8.
Figuur 1: Voorbereiding van de Imaging Kamer. A: Verbruiksgoederen die nodig is voor de voorbereiding van de beeldvorming kamer zijn blauw tack, spelen deeg of vergelijkbaar, en 2 dekglaasjes (24 x 50 mm) B:. Bereiden twee dunne stroken blauwe tack (diameter van ongeveer 2 mm x 2 cm), en twee dekglaasjes C:. Place blauwe tack strips op een dekglas, zodat voldoende ruimte voor de huid biopsie. Plaats de huidbiopsie van een druppel CUBIC2 oplossing tussen de twee stroken D:. Place tweede dekglaasje op blauwe tack strips de huidbiopsie dekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: K14 / DAPI Label ing dorsale huid in telogen van Adult Wildtype muizen 3D volume reconstructie van een dorsale huid biopsie telogene van een volwassen wildtype muis gelabeld met een K14 antilichaam (Rood in B, C) en DAPI nucleaire tegenkleuring. (blauw in A, C). K14 kleuring is sterk in de interfolliculaire epidermis (IFE), de landengte en de talgklieren (zwarte sterretjes), en de secundaire haar kiemen (witte asterisk) en een relatief laag in de bobbel area (Bu). Schaal bars 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Ki67 Labeling dorsale huid in telogen van Adult Wildtype muizen 3D volume reconstructies van een dorsale huidbiopsie van een volwassen wildtype muis gelabeld met Ki67 antilichaam (Rood in B, C) en DAPI nucleaire tegenkleuring (blauw in A, C). Prolifererende Ki67-positieve keratinocyten zijn duidelijk in de basale interfolliculaire epidermis (IFE), en in de isthmus gebied (Is), maar niet in de uitstulping (Bu) van de telogen haarfollikel. Schaalbalken 50 urn.rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Nile Red kleuring van Dorsal Skin in Anagen van Adult Wildtype Muizen 3D-volume reconstructie van een dorsale huid biopsie in anagene van een volwassen wild-type muis gelabeld met Nile Red (rood in B, C) en DAPI nucleaire tegenkleuring (blauw in. A, C). Nile Red kleuring zichtbaar in sebocyten (SB) en de haarschacht (HS). Schaal bars 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur5: morfologische afwijkingen in de YAP2-5SA-ΔC Epidermis 3D-volume reconstructies van dorsale huid biopten van volwassen wild-type (A - C) en YAP2-5SA-ΔC transgene littermate muizen (D - F) gelabeld met een K14 antilichaam (rood in. B, C, E, F) en DAPI nucleaire tegenkleuring (blauw in A, C, D, F). De epidermale hyperplasie van de YAP2-5SA-ΔC epidermis blijkt in de interfolliculaire epidermis (bovenste dubbele pijlen in F) en in de haarfollikels, waar de karakteristieke stam / voorlopercellen celmassa's proximaal (lagere dubbele pijlen in F) 8 weergegeven. Schaal bars 50 pm. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Film 1. Klik hier om dit filmpje te downloaden.
Movie 2. Klik hier om dit filmpje te downloaden.
Movie 3. Klik hier om dit filmpje te downloaden.
01movie4.jpg "/>
Movie 4. Klik hier om dit filmpje te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De regulerende mechanismen die de ontwikkeling en homeostase huid worden meestal bestudeerd in 2D behulp van weefsel snijden en histologische kleuring of merken met antilichamen, die slechts een beperkte appreciatie huid morfologie, celpopulaties of eiwitexpressie mogelijk maakt. Een aantal werkwijzen zijn ontwikkeld om visualisatie van de ruimtelijke organisatie van cellen en eiwitten op één resolutiecel verbeteren 3 dimensies epidermale whole mounts 10-13. Sommige van deze echter gescheiden van de epidermis van de dermis, dat technisch uitdagend omvatten vooral gebruikt behaarde huid en vaak tot weefselbeschadiging en scheuren van de haarfollikels. Verder scheiding van de epidermis en dermis afbreuk bestuderen van de cellulaire en moleculaire interacties die optreden tussen hen tijdens embryonale ontwikkeling en weefsel homeostase.
De 'flat mount approach' is een andere methode waarbij de volledige dikte muishuid wordt ontleed en immunostained, gehouden en daarna met behulp van benzylbenzoaat en benzylalcohol (BBBA) met behoud van immunofluorescentie signalen 14. Deze methode niet de technisch moeilijke scheiding van de epidermis van de dermis vereist. Echter, BBBA is zeer giftig, maar denatureert sommige fluorescerende eiwitten, en het vervuilt microscoop doelstellingen, niet toe te staan voor de hoge-resolutie beeldvorming van de vereiste om cellulaire en moleculaire interacties in het weefsel te onderzoeken monsters.
Dit rapport beschrijft een KUBIEKE protocol 5-7 om de volledige dikte muis huid biopten van elke gewenste anatomische regio en leeftijd met behulp van relatief veilige en goedkope reagentia te verduidelijken. Deze technisch eenvoudig protocol maakt visualisatie van eiwit expressie en proliferatie patronen met immunofluorescentie in volledige dikte van de huid biopsieën tegengekleurd met DAPI in drie dimensies op één resolutie cel, waardoor een ongekende en zeer nauwkeurige qualitative beoordeling en kwantificering van eiwitexpressie proliferatie weefselmorfologie en haarfollikel afmetingen. Deze methode is ook geschikt voor visualisatie van sebocyten gebruik Nile Red kleuring ondanks de verwijdering van weefsel lipiden tijdens de verduidelijking procedure. Een belangrijke beperking van deze werkwijze is de beschikbaarheid van antilichamen efficiënt binden en waardoor visualisatie van hun doeleiwitten middels Deze achtergrond ophelderingsprocedures. Bovendien, de gegenereerde afbeelding en films bestanden groot zijn, en goede IT-bronnen zoals computers met krachtige processors en voldoende data opslagruimte essentieel.
Een kritische stap in de procedure is het bereiden van de huid biopten. Intacte haarfollikel anatomie visualiseren, moet de oriëntatie van de huidbiopsie in aanmerking genomen, en de lengte van de biopten moet parallel worden gesneden aan de richting van de lengte van de haarfollikels. Bovendien, kleine en zeer dunne skin biopten zijn moeilijk volledig te kunnen monteren voor microscopie. Grotere biopten zal meer tijd nodig hebben om te wissen, en kunnen antilichamen penetratie problemen resulteert in de opsporing van antigeen artefacten met zich meebrengen. Het is daarom aan te raden om te snijden, duidelijke en vlek meerdere biopten per experiment.
Het is ook belangrijk om stevig de buizen af te dichten wanneer het de Cubic oplossingen om verdamping van de inhoud tijdens het verwarmingsproces, waardoor veranderingen in reagensconcentraties voorkomen, doch verminderde weefsel clearing veroorzaken. De volgende belangrijke stap is dat het weefsel zal worden verduidelijkt bij 37 ° C om het reinigingsproces te bespoedigen. Na 7 dagen, zal de CUBIC1 oplossing moet vers worden bereid zijn om de oude te vervangen.
In de toekomst, zullen antilichamen worden geïdentificeerd die compatibel is met de kubische huid verduidelijking procedure zijn en analyses kunnen worden uitgebreid tot het visualiseren en kwantificeren van epidermale melanocyten en (stam) celmarkers en dermale eiwitten. Deze techniek zal ook een fundamentele rol in 3D studies van de huid pathologie en anatomie, en hulp spelen in de ontrafeling van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen abnormaal en normaal epidermale biologie in de huid van mutante muizen en transgene reporter muismodellen, inclusief signalering interacties tussen de lederhuid en de epidermis.
De kubische protocol 5-7 is ook bruikbaar voor de huid van andere gewervelde diermodellen en menselijke huid punch biopsieën. Light sheet microscopie zal visualisatie van de epidermale anatomie, eiwit expressie patronen, en de progressie van de haarfollikel fasen in te schakelen in grotere huidmonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Australische Bio-Resources (Garvan Institute, Australië), de biologische rijkdommen Centre (UNSW Australië) en de Animal Care & Ethische Commissie voor ondersteuning bij dierproeven. Dit werk werd ondersteund door de National Health en Medical Research Council of Australia (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales is ontvangers van een CONICYT-Becas Chile beurs (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios is een ontvanger van de Universiteit International Postgraduate Award van UNSW Australië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
