Summary
इस रिपोर्ट में एक घन प्रोटोकॉल का वर्णन पूर्ण मोटाई माउस त्वचा बायोप्सी स्पष्ट है, और 3 डी में एकल कक्ष संकल्प पर प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न, proliferating कोशिकाओं, और sebocytes कल्पना करने के लिए। इस विधि त्वचा शरीर रचना विज्ञान और विकृति का सही आकलन सक्षम बनाता है, और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों में असामान्य एपिडर्मल phenotypes की।
Abstract
त्वचा हमारे अस्तित्व के लिए आवश्यक है। बाहरी एपिडर्मल परत interfollicular एपिडर्मिस, जो इस तरह के बालों के रोम और पसीने की ग्रंथियों के रूप में एक स्तरीकृत स्क्वैमस हमारे शरीर, और एपिडर्मल उपांग के सबसे को कवर उपकला है के होते हैं। एपिडर्मिस जीवन भर और चोट के जवाब में उत्थान आए। यह बेसल एपिडर्मल स्टेम / पूर्वज सेल आबादी कि कसकर कई नियामक एपिडर्मिस के भीतर और एपिडर्मिस और डर्मिस के बीच सक्रिय तंत्र द्वारा विनियमित रहे हैं K14 व्यक्त रूप से सक्षम है। यह लेख एक सरल विधि का वर्णन पूर्ण मोटाई माउस त्वचा बायोप्सी स्पष्ट है, और K14 प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न कल्पना करने के लिए, Ki67 कोशिकाओं proliferating लेबल, नील लाल लेबल sebocytes, और 3 डी में एकल कक्ष संकल्प पर DAPI परमाणु लेबलिंग। इस विधि सटीक आकलन और त्वचा शरीर रचना विज्ञान और विकृति की मात्रा का ठहराव, और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों में असामान्य एपिडर्मल phenotypes के लिए सक्षम बनाता है। घन प्रोटोकॉल वें हैई सबसे अच्छा तरीका एकल कक्ष संकल्प पर पूर्ण मोटाई त्वचा बायोप्सी में आणविक और सेलुलर बातचीत की जांच करने के लिए तिथि करने के लिए उपलब्ध है।
Introduction
त्वचा हमारे अस्तित्व के लिए आवश्यक है। यह तीन मुख्य परतों बाहरी एपिडर्मिस, डर्मिस और हाइपोडर्मिस के होते हैं। एपिडर्मिस एक अत्यधिक पुनर्योजी ऊतक है। यह एक स्क्वैमस स्तरीकृत उपकला ज्यादातर केरेटिनकोशिकाओं से मिलकर है। केरेटिनकोशिकाएं बेसल परत में पैदा होते हैं, और suprabasal परतों के माध्यम से ऊपर की ओर ले जाते हैं जबकि फर्क है, और अंततः वे अपने जन्म के बाद एक महीने के बारे में बाहरी श्रृंगित परत में बहा रहे हैं। एपिडर्मिस बालों के रोम और चिकना ग्रंथियों सहित उपांग की एक संख्या विकसित करता है। बालों के रोम भी जीवन 1 भर में एक चक्रीय फैशन में पुनर्जन्म। एपिडर्मिस के पुनर्योजी क्षमता स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं कि interfollicular एपिडर्मिस और बाल कूप 2 के बेसल परत में स्थित हैं की उपस्थिति से सक्षम है।
कई संकेत दे रास्ते एपिडर्मल विकास और उत्थान में फंसाया गया है। इनमें से कुछ के भीतर होते हैंकेवल इस तरह का हाथी मार्ग के रूप में एपिडर्मिस। अन्य संकेत घटनाओं डर्मिस और एपिडर्मिस 3 के बीच जगह ले लो। उदाहरण के लिए, डर्मिस से Wnt संकेतों बाल कूप विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है, और वे ऐनाजेन को सक्रिय करने की शुरुआत में चमड़े का papilla द्वारा स्रावित होते हैं बाल कूप उभार के स्टेम / पूर्वज सेल प्रसार और बाल कूप विकास 4। यह सेलुलर और आणविक तंत्र है कि एपिडर्मल विकास और उत्थान नियंत्रण बेहतर समझने के लिए कैसे वे इस तरह के त्वचा कैंसर के रूप में पुनर्जन्म का त्वचा रोग में परेशान किया जा सकता है समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
यह लेख एक सी लियर का वर्णन है, यू बी बारिश मैं maging कॉकटेल और सी omputational विश्लेषण (घन) प्रोटोकॉल 5-7 nobstructed पूरे माउंट त्वचा की तैयारी स्पष्ट है, और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल कक्ष संकल्प पर 3 आयामों में प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न कल्पना करने के लिए। घन विधि त्वचा का विसर्जन शामिलदो aminoalcohol आधारित रासायनिक कॉकटेल में ऊतक। ये समाधान त्वचा के नमूने में अपवर्तक सूचकांक समायोजित, ऊतक पारदर्शी और प्रोटीन बरकरार छोड़ रहा है, एकल कोशिका संकल्प पर immunodetection की इजाजत दी।
interfollicular एपिडर्मिस में और बाल कूप में इस घन प्रोटोकॉल, बेसल का प्रयोग और keratinocyte आबादी proliferating विरोधी Keratin14 (K14) और विरोधी Ki67 एंटीबॉडी का उपयोग wildtype चूहों के पूर्ण मोटाई त्वचा बायोप्सी में imaged थे। wildtype त्वचा बायोप्सी में वसामय ग्रंथियों भी नील लाल धुंधला का उपयोग कल्पना थे। अन्त में, wildtype और hyperplastic YAP2-5SA-ΔC त्वचा बायोप्सी में बेसल keratinocyte आबादी 8 की तुलना में थे।
इस घन प्रोटोकॉल एकल कक्ष संकल्प पर पूर्ण मोटाई त्वचा बायोप्सी में प्रोटीन अभिव्यक्ति के दृश्य आकलन सक्षम बनाता है, और एपिडर्मल शरीर रचना विज्ञान और आनुवंशिक रूप से संशोधित की त्वचा में रूपात्मक दोष सराहना करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैचूहों, और एपिडर्मल विकास और उत्थान अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए।
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Protocol
आचार कथन: पशु विषयों को शामिल सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी ACEC प्रोटोकॉल 13 / 64B के तहत पशु की देखभाल और आचार समिति (ACEC) UNSW ऑस्ट्रेलिया में के दिशा निर्देशों का पालन करें।
1. पारदर्शी माउस त्वचा के ऊतकों की तैयारी
नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी चूहों एक C57BL / 6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर थे
- माउस त्वचा के ऊतकों का संग्रह।
- नम्रता से ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों euthanize।
- ध्यान से एक trimmer देखभाल त्वचा घाव करने के लिए नहीं के साथ प्रासंगिक त्वचा क्षेत्र से बाल हटा दें।
- धो त्वचा फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) में 70% इथेनॉल के साथ शुद्ध करना।
- संदंश के साथ पृष्ठीय गर्दन की त्वचा लिफ्ट और कैंची से चीरा बनाते हैं।
- पृष्ठीय माउस त्वचा (लगभग 1.5 x 4 सेमी) के एक बड़े क्षेत्र काटना।
- एक फिल्टर पेपर पर नीचे समतल त्वचा डर्मिस साइड, और नमूने के पूर्वकाल पीछे की ओर रुख का ध्यान करते हैं।
- त्रिविच्छेदित त्वचा के आसपास मीटर फिल्टर पेपर, और पीबीएस में हौसले से तैयार 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान के साथ भरा एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रात भर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ठीक करें, या।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पीबीएस में धो त्वचा 2 एक्स 5 मिनट।
नोट: निम्न (1.1.10 - 1.1.12) ऊतक की लंबी अवधि के भंडारण के लिए वैकल्पिक कदम उठाए हैं। - कमरे के तापमान पर 1 घंटे की धोने चरणों के दौरान एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में इथेनॉल (25%, 50% से 70%) की एकाग्रता में वृद्धि के साथ पीबीएस में विच्छेदित त्वचा निर्जलीकरण।
- आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पीबीएस में 70% इथेनॉल में निर्जलित त्वचा स्टोर।
- समाशोधन से पहले 4 घंटे, कमरे के तापमान पर 1 घंटे की धोने चरणों के दौरान एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में इथेनॉल (70%, 50%, 25%, 0%) की एकाग्रता में कमी के साथ पीबीएस में त्वचा के ऊतक rehydrate।
- माउस त्वचा बायोप्सी समाशोधन
- 3.85 छ यूरिया और 3.85 ग्राम एन, एन, एन भंग द्वारा CUBIC1 समाशोधन समाधान तैयार है ',' एन70 डिग्री सेल्सियस - -tetrakis (2-hydroxypropyl) एक हीटर 60 करने के लिए सेट पर आसुत जल 5.38 मिलीलीटर में ethylenediamine। एक गर्म दोषी प्रयोग करें।
- 2.31 छ पॉलीथीन ग्लाइकोल मोनो-P-isooctylphenyl आकाश / ट्राइटन X-100 के समाधान के लिए जोड़ने के बाद यह स्पष्ट हो गया है और कमरे के तापमान को ठंडा हो गया।
- अनुमानित आयाम 0.2 x 0.5 सेमी की बायोप्सी में एक तेज धार के साथ माउस त्वचा में कटौती, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में CUBIC1 समाशोधन समाधान के 5 मिलीलीटर में डूब। बालों के रोम के दृश्य का अनुकूलन करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि बायोप्सी की लंबी पक्ष नमूने की Antero पीछे दिशा के साथ कट जाता है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक संकरण ओवन में एक घूर्णन मंच पर रखें।
- 7 दिनों के बाद समाशोधन समाधान बदलें। ताजा CUBIC1 समाधान का उपयोग करने से पहले तैयार करें।
- 7 दिनों के बाद ऊतक की पारदर्शिता की जाँच करें। यदि आवश्यक हो, CUBIC1 समाशोधन समाधान में बायोप्सी छोड़ जब तक ऊतक पूरी तरह से पारदर्शी है।
- एक बार त्वचा बायोप्सी पारदर्शी है,CUBIC1 समाधान निकालें, और ऊतकों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए 4 बार धोने के लिए 1 × पीबीएस के 4 मिलीलीटर जोड़ें।
- त्वचा के ऊतकों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 20% w / पीबीएस में वी सुक्रोज में धो लें।
- एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम इष्टतम काटना तापमान (OCT) यौगिक बढ़ते में ऊतक रुक।
नोट: यह कदम बाद के चरणों में एंटीबॉडी प्रवेश के लिए बायोप्सी की पारगम्यता में वृद्धि होगी।
2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
- 3 घंटा - 2 के लिए कमरे के तापमान को 1.2.9 से ऊतक) पिघलना।
- कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब में धो ऊतक अक्टूबर यौगिक हटा दें।
- एक 2 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण बायोप्सी, और 1 मिलीलीटर खरगोश विरोधी Keratin14 या खरगोश विरोधी Ki67 एंटीबॉडी में ऊतक सेते हैं, दोनों पतला 1: एक प्रकार के बरतन पर 3 दिन के लिए PBST (पीबीएस + 0.1% ट्राइटन-X100) में 100 एक 37 में सी ओवन °।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, एक के लिए स्थानांतरण बायोप्सीएन डी ऊतक 4 गुना 6 घंटे के लिए PBST के 5 मिलीलीटर में एक प्रकार के बरतन पर एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में धो लें।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक प्रकार के बरतन पर PBST में 100 और 3 दिन सेते हैं: एक 2 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण बायोप्सी, 1 पतला एंटीबॉडी Alexa594 1 मिलीलीटर विरोधी खरगोश जोड़ें।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण बायोप्सी, और ऊतक 4 बार एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक प्रकार के बरतन पर PBST की 5ml में 6 घंटे के लिए धो लें।
- एक 2 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण बायोप्सी, जोड़ने के 1 मिलीलीटर 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) परमाणु counterstain समाधान (1: 1,000) PBST में और एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक प्रकार के बरतन पर रातोंरात सेते हैं।
- DAPI counterstaining समाधान निकालें, और 2 मिलीलीटर ट्यूब PBST के 1 मिलीलीटर जोड़ने के ऊतक एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक प्रकार के बरतन पर 6 घंटे के लिए 4 बार धोने के लिए।
नोट: वैकल्पिक कदम: बायोप्सी कम से कम 3 सप्ताह के लिए 0.02% सोडियम azide के साथ 1x पीबीएस में अंधेरे में रखा जा सकता है।
3. नील लाल धुंधला
- 1 मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए dimethylsulfoxide (DMSO) में नील लाल पाउडर भंगजी / मिलीलीटर
- 1 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1 मिलीलीटर पीबीएस के लिए 1 μl नील लाल समाधान जोड़ें।
- 1.2.9 से पिघलना ऊतक) 2 के लिए कमरे के तापमान को - 3 घंटा, और कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए 5 मिलीलीटर पीबीएस से धो लें।
- एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए बायोप्सी स्थानांतरण, और कमरे के तापमान पर 2.5 घंटे के लिए 1 मिलीलीटर नील लाल धुंधला समाधान में ऊतक डूब।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4 बार 1 मिलीलीटर PBST के साथ 2 मिलीलीटर ट्यूब में त्वचा बायोप्सी धो लें।
- 2 मिलीलीटर ट्यूब से PBST समाधान निकालें DAPI परमाणु counterstaining समाधान (1: 1000) के 1 मिलीलीटर जोड़ने PBST में और कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते हैं।
- DAPI counterstaining समाधान निकालें, और कमरे के तापमान पर 6 घंटे के लिए त्वचा के ऊतकों को 4 बार धोने के लिए 2 मिलीलीटर ट्यूब में PBST के 1ml जोड़ें।
नोट: वैकल्पिक कदम: बायोप्सी कम से कम 3 सप्ताह के लिए 0.02% सोडियम azide के साथ 1x पीबीएस में अंधेरे में रखा जा सकता है।
4. इमेजिंग
- CUBIC2 समाशोधन समाधान है, जो 50 शामिल तैयार% (W / v) सुक्रोज, 25% (डब्ल्यू / वी) यूरिया, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, और 0.1% (वी / वी) ट्राइटन X-100।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में 24 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में 1 मिलीलीटर CUBIC2 समाधान में त्वचा के ऊतकों को सेते हैं। यह कदम ऊतक के अपवर्तनांक भी होगा।
- ऊतक की स्पष्टता की जाँच करें। एक बार जब यह स्पष्ट है, एक गिलास coverslip पर अपनी अब तरफ पूरे त्वचा बायोप्सी (0.2 x 0.5 सेमी) की स्थिति, इस तरह के बालों के रोम की लंबाई की दिशा coverslip सतह के समानांतर है कि (# 1 24 x 60 मिमी)
नोट: वैकल्पिक कदम: एंटीबॉडी से सना हुआ बायोप्सी के बारे में 7 दिनों के लिए CUBIC2 समाधान में संग्रहित किया जा सकता है। नील लाल दाग बायोप्सी केवल अप करने के लिए 1 दिन के लिए CUBIC2 समाधान में संग्रहित किया जा सकता है, और जितनी जल्दी हो सके imaged किया जाना चाहिए। - इमेजिंग कक्ष तैयार (चित्रा 1)
नोट: इमेजिंग कक्ष की तैयारी के लिए आवश्यक उपभोग्य हैं: नीले कील, आटा या इसी तरह खेलते हैं, और 2 coverslips (24 x 50 मिमी) (एफigure 1 ए)।- नीले रंग के हमले के दो पतली स्ट्रिप्स (व्यास लगभग 1 मिमी x 2 सेमी), और दो coverslips (चित्रा 1 बी) तैयार करें।
- एक कवर पर्ची पर नीले रंग की कील स्ट्रिप्स प्लेस, त्वचा बायोप्सी (चित्रा 1 सी) के लिए पर्याप्त जगह की इजाजत दी। 4.4.3)
- CUBIC2 समाधान की एक बूंद (चित्रा 1 सी) में coverslip पर स्ट्रिप्स के बीच में त्वचा बायोप्सी रखें।
- दूसरी coverslip (चित्रा -1) के साथ त्वचा बायोप्सी कवर।
- घुड़सवार त्वचा बायोप्सी के साथ इमेजिंग चैम्बर एक confocal खुर्दबीन के मंच पर रखें और हल्के मार्ग में ऊतक चलते हैं।
- नमूना एक पारा या हलोजन प्रकाश स्रोत और मानक epifluorescence फिल्टर (जैसे, DAPI / GFP / CY3 / Cy5) का उपयोग ब्याज की fluorescently दाग क्षेत्रों की पहचान करने के लिए स्कैन।
- एक 10X और 20x उद्देश्य (एनए 0.75) और मानक confocal प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक का उपयोग (जैसे।, डीए के साथ ब्याज की छवि क्षेत्रोंपीआई दाग नमूने एक 405 एनएम लेजर के साथ रोशन और 425 के बीच प्रतिदीप्ति संकेत इकट्ठा - 475 एनएम, और एलेक्सा स्त्राव 594 या नील लाल दाग के नमूनों के साथ एक 561 एनएम लेजर के साथ रोशन और 570 के बीच प्रतिदीप्ति संकेत इकट्ठा - 620 एनएम)।
- उत्पन्न माइक्रोस्कोप Z ढेर छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र की छवि जेड ढेर (उदा।, इमेजिंग के रूप में नीचे वर्णित सॉफ्टवेयर 4.13 एनआईएस तत्वों का उपयोग)।
- इष्टतम लेजर शक्ति और पीएमटी एचवी सुनिश्चित / ऑफसेट सेटिंग्स नमूना प्रतिदीप्ति इकट्ठा करने के लिए चयनित किया गया है।
- "अधिग्रहण नियंत्रण" से "एनडी अधिग्रहण" उपकरण पट्टी खोलें।
- "जेड श्रृंखला सेटअप" टैब का चयन करें (सुनिश्चित करें कि सभी अन्य टैब अचयनित कर रहे हैं)।
- समय रहते स्कैनिंग, नमूना के शीर्ष करने के लिए ध्यान केंद्रित करने और "टॉप" बटन दबाएँ।
- नमूने के नीचे करने के लिए ध्यान केंद्रित करने और "नीचे" बटन दबाएँ।
- इनपुट के लिए आवश्यक कदम आकार (या प्रेस अनुकूलित कदम आकार बटन)।
- पूर्वएसएस बटन "अब भागो"।
- व्यक्तिगत झगड़ा छवि के ढेर के रूप में परिणामी जेड ढेर (प्रति छवि Z ढेर 1 fluorochrome) को बचाओ।
- छवि के जेड के ढेर का उपयोग 3 डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ब्याज की 3 डी की मात्रा क्षेत्रों के पुनर्निर्माण के लिए (जैसे।, Imaris x 64 7.2.3 के रूप में नीचे वर्णित का उपयोग)।
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर शुरू करो।
- चुनें 3 डी की मात्रा पीढ़ी के लिए उपकरण पट्टी में "पार" बटन।
- ओपन पहली रंग छवि Z ढेर (जैसे।, DAPI)।
- अतिरिक्त रंग चैनल, fluorochrome प्रति एक चैनल जोड़ने के लिए 'चैनल जोड़ने' उपकरण का उपयोग करें। इस प्रकार एक नमूना दोनों DAPI और एलेक्सा स्त्राव 594 fluorochromes युक्त दो चैनलों की आवश्यकता होगी।
- ऊपर 4.7 में निर्धारित के रूप में सही पिक्सेल (voxel) आयाम (xyz) स्थापित करने के लिए, "छवि गुण" उपकरण का उपयोग करें।
- जरूरत के रूप में "प्रदर्शन समायोजन" उपकरण चैनल रंग बदलने के लिए उपयोग करें (जैसे, DAPI चैनल नीले रंग के लिए, सेट एलेक्सा स्त्राव लाल को 594 चैनल)।
- पुलिस कोछवि खिड़की में 3 डी की मात्रा विपक्षी, क्लिक करें और खींचें मात्रा के रूप में आवश्यक कंप्यूटर माउस का उपयोग करें।
- उपकरण पट्टी में "स्नैपशॉट" उपकरण का उपयोग करें 3 डी छवि के स्क्रीन शॉट्स उत्पन्न करते हैं।
- उपकरण पट्टी में "एनीमेशन" उपकरण का उपयोग करें 3 डी नमूना रोटेशन की फिल्में उत्पन्न करते हैं।
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Representative Results
वयस्क wildtype चूहों के पूर्ण मोटाई पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी स्पष्ट किया गया, एक एंटीबॉडी बाध्यकारी बेसल keratinocyte मार्कर Keratin14 (K14) के साथ दाग, और नाभिक DAPI धुंधला समाधान (चित्रा 2 और मूवी 1) के साथ counterstained थे।
DAPI पॉजिटिव नाभिक नमूना (चित्रा 2A, सी) के दौरान दिखाई दे रहे थे, और K14 धुंधला विशेष रूप से interfollicular एपिडर्मिस की एक सेल मोटी परत बेसल में दिखाई दे रहा था, और चिकना ग्रंथियों (काले तारों), के बाहरी जड़ शीथ रूपरेखा बालों के रोम, और माध्यमिक बाल रोगाणु (चित्रा 2 बी, सी) में, जैसा कि पहले 9 प्रकाशित किया। K14 धुंधला तीव्रता interfollicular एपिडर्मिस, बाहर का बाल कूप और माध्यमिक बाल रोगाणु (सफेद तारों) में उच्च था, और यह बाल कूप (चित्रा -2 में बीयू) के उभार के क्षेत्र में अपेक्षाकृत कम थी। त्वचीय papillae भी थे स्पष्ट रूप से visiblDAPI लेबलिंग के माध्यम से ई (चित्रा -2 में तीर)।
वयस्क wildtype चूहों के टेलोजन में proliferating कोशिकाओं, पूर्ण मोटाई पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी कल्पना करने के लिए स्पष्ट किया गया था और एक विरोधी Ki67 एंटीबॉडी के साथ दाग, और नाभिक DAPI समाधान (चित्रा 3, और मूवी 2) के साथ counterstained थे।
Proliferating केरेटिनकोशिकाओं बेसल interfollicular एपिडर्मिस (चित्रा -3 सी में IFE) में पाया गया, और संयोग भूमि में बालों के रोम के, लेकिन उभार के क्षेत्र (चित्रा -3 सी में बीयू) में नहीं (चित्रा -3 सी में है)।
वयस्क wildtype चूहों के ऐनाजेन में वसामय ग्रंथियों, पूर्ण मोटाई पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी कल्पना करने के लिए स्पष्ट किया गया था और नील रेड कि sebocytes की वसा की मात्रा लेबल के साथ दाग, और नाभिक DAPI धुंधला समाधान (चित्रा 4 और मूवी 3) के साथ counterstained थे। नील लाल सकारात्मक sebaceouएस ग्रंथियों बालों के रोम (चित्रा 4C में एसबी) के Isthmus क्षेत्र में मनाया गया, दिखा रहा है कि घन प्रोटोकॉल काफी इन वसा युक्त संरचनाओं की आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं करता। अप्रत्याशित रूप से, बाल शाफ्ट भी नील लाल (चित्रा 4C में एचएस) के साथ लेबल रहे थे।
बेसल केरेटिनकोशिकाओं 8 में एक अति सक्रिय याप उत्परिवर्ती प्रोटीन व्यक्त YAP2-5SA-ΔC ट्रांसजेनिक चूहों की एपिडर्मिस में रूपात्मक परिवर्तन कल्पना करने के लिए, वयस्क wildtype और YAP2-5SA-ΔC ट्रांसजेनिक littermate चूहों के पूर्ण मोटाई पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी स्पष्ट किया है और साथ दाग थे विरोधी K14 एंटीबॉडी, और नाभिक DAPI समाधान (चित्रा 5, और मूवी 4 (wildtype) और मूवी 5 (YAP2-5SA-ΔC)) के साथ counterstained थे।
YAP2-5SA-ΔC ट्रांसजेनिक त्वचा में, interfollicular एपिडर्मिस के hyperplasia (ऊपर डबल चित्रा 4F में तीर 8 वर्णित बालों के रोम, अब थे और असामान्य बालों के रोम (चित्रा 5F में कम डबल तीर) में proximally K14-लेबल सेल जनता दिखाया गया है, बढ़े हुए स्टेम सेल आबादी का प्रतिनिधित्व।
चित्रा 1: इमेजिंग कक्ष की तैयारी। एक: इमेजिंग कक्ष की तैयारी के लिए आवश्यक उपभोज्य, नीले कील हैं आटा या इसी तरह की है, और 2 coverslips (24 x 50 मिमी) खेलने बी:। नीले कील (व्यास लगभग 2 मिमी x 2 सेमी) के दो पतली स्ट्रिप्स तैयार है, और दो coverslips सी:। एक कवर पर्ची पर प्लेस नीले कील स्ट्रिप्स, त्वचा बायोप्सी के लिए पर्याप्त जगह की इजाजत दी। दो स्ट्रिप्स के बीच में CUBIC2 समाधान की एक बूंद में त्वचा बायोप्सी की जगह डी:। नीले कील स्ट्रिप्स पर जगह दूसरे coverslip त्वचा बायोप्सी कवर करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: वयस्क wildtype चूहे की टेलोजन में पृष्ठीय त्वचा की K14 / DAPI लेबल आईएनजी एक वयस्क wildtype माउस एक K14 एंटीबॉडी (बी में लाल, सी) के साथ लेबल की टेलोजन में एक पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी के 3 डी की मात्रा पुनर्निर्माण, और DAPI परमाणु counterstain। (ए, सी में नीला)। K14 धुंधला interfollicular एपिडर्मिस (IFE), Isthmus और चिकना ग्रंथियों (काले तारों), और माध्यमिक बाल रोगाणु (सफेद तारांकन) में मजबूत, और उभाड़ना में अपेक्षाकृत कम है क्षेत्र (बीयू)। स्केल 50 माइक्रोन सलाखों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। (बी, सी में लाल) एडल्ट wildtype चूहे एक वयस्क wildtype माउस एक Ki67 एंटीबॉडी के साथ लेबल के एक पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी के 3 डी की मात्रा पुनर्निर्माण की टेलोजन में पृष्ठीय त्वचा की Ki67 लेबलिंग, और DAPI परमाणु counterstain (ए में नीले, सी)। Proliferating Ki67 पॉजिटिव केरेटिनकोशिकाओं बेसल interfollicular एपिडर्मिस (IFE) में स्पष्ट कर रहे हैं, और संयोग भूमि क्षेत्र (है) में है, लेकिन टेलोजन बाल कूप के उभार के (बीयू) में नहीं है। स्केल 50 माइक्रोन सलाखों।rget = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 4: वयस्क wildtype चूहे की ऐनाजेन में पृष्ठीय त्वचा के नील लाल धुंधला एक वयस्क wildtype माउस नील लाल (बी में लाल, सी), और DAPI परमाणु counterstain (नीले रंग में साथ लेबल की ऐनाजेन में एक पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी के 3 डी की मात्रा पुनर्निर्माण। ए, सी)। नील लाल धुंधला sebocytes (एसबी) और बाल शाफ्ट (एचएस) में दिख रहा है। स्केल 50 माइक्रोन सलाखों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
आकृति5: रूपात्मक असामान्यताएं YAP2-5SA-ΔC एपिडर्मिस वयस्क wildtype (ए - सी) के पृष्ठीय त्वचा बायोप्सी के 3 डी की मात्रा पुनर्निर्माण में और YAP2-5SA-ΔC ट्रांसजेनिक littermate चूहों (डी - एफ) में एक K14 एंटीबॉडी के साथ लेबल (लाल। बी, सी, ई, एफ), और DAPI परमाणु counterstain (ए में नीले, सी, डी, एफ)। YAP2-5SA-ΔC एपिडर्मिस की एपिडर्मल हाइपरप्लासिया interfollicular एपिडर्मिस और बालों के रोम में (एफ में शीर्ष डबल तीर), जो विशेषता स्टेम / पूर्वज सेल जनता proximally (एफ में कम डबल तीर) 8 प्रदर्शन में स्पष्ट है। स्केल 50 माइक्रोन सलाखों। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।
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Discussion
नियामक त्वचा विकास और homeostasis को नियंत्रित तंत्र सबसे अधिक ऊतक सेक्शनिंग और histological धुंधला या लेबलिंग एंटीबॉडी के साथ है, जो केवल त्वचा आकृति विज्ञान, सेल आबादी या प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक प्रतिबंधित प्रशंसा के लिए सक्षम बनाता का उपयोग कर 2 डी में अध्ययन कर रहे हैं। तरीकों की एक संख्या में एपिडर्मल पूरे mounts 10-13 में 3 आयामों में एकल कक्ष संकल्प पर कोशिकाओं और प्रोटीन के स्थानिक संगठन के दृश्य में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है। इनमें से कुछ तथापि विशेष रूप से बालों त्वचा का उपयोग डर्मिस, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है से एपिडर्मिस की जुदाई शामिल है, और अक्सर ऊतकों को नुकसान और बालों के रोम का टूटना में परिणाम है। इसके अलावा, एपिडर्मिस और डर्मिस impairs सेलुलर और आणविक बातचीत है कि भ्रूण के विकास और ऊतक homeostasis के दौरान उन दोनों के बीच घटित अध्ययन करने की जुदाई।
'फ्लैट माउंट दृष्टिकोण' एक और तरीका है, जहां पूर्ण मोटाई माउसत्वचा विच्छेदित है और immunostained, और फिर लोबान बेंजोएट और बेंजाइल अल्कोहल (BBBA) का उपयोग करते समय immunofluorescent संकेतों 14 संरक्षण को स्पष्ट किया। इस विधि से डर्मिस एपिडर्मिस की तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण जुदाई की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, BBBA बेहद जहरीला है, यह कुछ फ्लोरोसेंट प्रोटीन denatures, और यह माइक्रोस्कोप उद्देश्यों contaminates, ऊतक में सेलुलर और आणविक बातचीत की जांच करने के लिए आवश्यक नमूने के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति नहीं है।
इस रिपोर्ट में एक घन प्रोटोकॉल 5-7 बताता है कि किसी भी वांछित संरचनात्मक क्षेत्र और उम्र से पूर्ण मोटाई माउस त्वचा बायोप्सी अपेक्षाकृत सुरक्षित और सस्ता अभिकर्मकों का उपयोग स्पष्ट करने के लिए। यह तकनीकी रूप से सरल प्रोटोकॉल पूर्ण मोटाई त्वचा एकल कक्ष के प्रस्ताव पर तीन आयामों में DAPI के साथ counterstained बायोप्सी, सक्षम करने में immunofluorescence द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति और प्रसार पैटर्न के दृश्य की अनुमति देता अभूतपूर्व और बेहद सटीक qualitative आकलन और प्रोटीन अभिव्यक्ति, प्रसार, ऊतक आकृति विज्ञान और बाल कूप आयामों की मात्रा। इस विधि को भी स्पष्टीकरण की प्रक्रिया के दौरान ऊतक लिपिड को हटाने के बावजूद नील लाल धुंधला का उपयोग sebocytes के दृश्य के लिए उपयुक्त है। इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण सीमा कुशलता से बाध्यकारी है और यह त्वचा स्पष्टीकरण प्रक्रिया का उपयोग कर उनके संबंधित लक्ष्य प्रोटीन के दृश्य की अनुमति एंटीबॉडी की उपलब्धता है। इसके अलावा, उत्पन्न छवि और फिल्मों फ़ाइलों बड़े हैं, और इस तरह शक्तिशाली प्रोसेसर और पर्याप्त डेटा भंडारण अंतरिक्ष के साथ कंप्यूटर के रूप में अच्छा आईटी संसाधनों आवश्यक हैं।
प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम त्वचा बायोप्सी की तैयारी है। बरकरार बाल कूप शरीर रचना विज्ञान कल्पना, त्वचा बायोप्सी के उन्मुखीकरण को ध्यान में रखा जाना चाहिए, और बायोप्सी की लंबाई बालों के रोम की लंबाई की दिशा के समानांतर कटौती की जानी चाहिए। इसके अलावा, छोटे और बहुत पतली स्कीn बायोप्सी माइक्रोस्कोपी के लिए सही ढंग से माउंट करने के लिए मुश्किल हो जाता है। बड़ी बायोप्सी स्पष्ट करने के लिए और अधिक समय की आवश्यकता होगी, और एंटीबॉडी प्रवेश प्रतिजन का पता लगाने कलाकृतियों में उत्पन्न समस्याओं उठाना हो सकता है। इसलिए यह कटौती करने के लिए सलाह दी जाती है, स्पष्ट और प्रयोग के प्रति दाग कई बायोप्सी है।
यह कसकर नलियों को सील करते हुए गर्म करने की प्रक्रिया है, जो अभिकर्मक सांद्रता में परिवर्तन में परिणाम के दौरान सामग्री के वाष्पीकरण को रोकने घन समाधान तैयार करने और बिगड़ा ऊतक समाशोधन का कारण हो सकता करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। अगले महत्वपूर्ण कदम है कि ऊतक समाशोधन प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट किया जाएगा। 7 दिनों के बाद, CUBIC1 समाधान पुराने एक जगह करने के लिए नए सिरे से तैयार करने की आवश्यकता होगी।
भविष्य में, अधिक एंटीबॉडी की पहचान की जाएगी कि घन त्वचा स्पष्टीकरण प्रक्रिया के साथ संगत कर रहे हैं, और विश्लेषण visualizing और एपिडर्मल और मेलानोसाईट (स्टेम) सेल मार्कर की मात्रा का ठहराव के लिए बढ़ाया जा सकता हैऔर त्वचीय प्रोटीन। इस तकनीक को भी उत्परिवर्ती चूहों और डर्मिस और बीच संकेतन बातचीत सहित ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मॉडल, की त्वचा में असामान्य और सामान्य एपिडर्मल जीव विज्ञान अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र की व्याख्या में त्वचा विकृति और शरीर रचना विज्ञान, और सहायता के 3 डी अध्ययन में एक मौलिक भूमिका निभानी होगी एपिडर्मिस।
घन प्रोटोकॉल 5-7 अन्य कशेरुकी पशु मॉडल की त्वचा के लिए लागू होने की संभावना है, और मानव त्वचा पंच बायोप्सी करने के लिए है। हल्की चादर माइक्रोस्कोपी बड़ा त्वचा के नमूनों में एपिडर्मल शरीर रचना विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न, और बाल कूप चक्र चरणों की प्रगति के दृश्य के लिए सक्षम हो जाएगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम जानवर प्रयोग के साथ समर्थन के लिए ऑस्ट्रेलियाई जैव संसाधन (Garvan संस्थान, ऑस्ट्रेलिया), जैव संसाधन केन्द्र (UNSW ऑस्ट्रेलिया) और पशु की देखभाल और आचार समिति को धन्यवाद। इस काम के लिए ऑस्ट्रेलिया की राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (परियोजना अनुदान APP1062720) द्वारा समर्थित किया गया। डॉ सीजर पी Canales एक CONICYT-Becas चिली छात्रवृत्ति (# 72101076) के प्राप्तकर्ताओं है। श्री Bassem Akladios UNSW ऑस्ट्रेलिया द्वारा विश्वविद्यालय के अंतर्राष्ट्रीय स्नातकोत्तर पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
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